DE1445615B

DE1445615B - Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure und Desacetyl-7-aminocephalosporansäurelacton

Info

Publication number: DE1445615B
Authority: DE
Inventors: Bruno Dr. Binningen; Vischer Ernst Dr. Basel; Bickel Hans Dr. Binningen; Bosshardt Rolf Dr.; Urech Jakob Dr.; Basel; Fechtig (Schweiz)
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG

Description

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Es wurde gefunden, daß man 7-Aminocephalosporansäure und Desacetyl-7-aminocephalosporansäurelacton in guter Ausbeute dadurch herstellen kann, daß man Cephalosporin C bzw. Desacetylcephalosporin-C-lacton, worin die Aminogruppe in an sich bekannter Weise blockiert ist und die Carboxylgruppen in an sich bekannter Weise durch leicht abspaltbare Estergruppen geschützt sind, bei Zimmertemperatur oder unter Kühlen in Gegenwart eines tertiären Amins in an sich bekannter Weise mit Phosphorpentachlorid oder Phosphoroxychlorid reagieren läßt, das Gemisch in an sich bekannter Weise mit einem Alkohol behandelt und nach erfolgter Umsetzung mit wäßriger Säure in an sich bekannter

3°

35

40 Weise hydrolysiert und gegebenenfalls erhaltene Ester in an sich bekannter Weise spaltet.

Bevorzugt sind leicht abspaltbare Estergruppen von Alkoholen oder Phenolen. Aus den Estergruppen alkalisch leicht abspaltbare Alkohole und Phenole sind beispielsweise solche, die die Nitrogruppe, die Cyanogruppe, die Sulfogruppe oder veresterte Carboxylgruppen aufweisen, z. B. Cyanmethylalkohol, p-NitrophenoI, 2,4-Dinitrophenol und 2,4,6-Trinitrophenol. Weiter kommen hydrogenolytisch abspaltbare Alkohole, wie Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol, in Betracht. Besonders geeignet sind durch saure Hydrolyse leicht abspaltbare Alkohole, wie Tetrahydropyranol, tert.-Butylalkohol, oder Hydroxy-, Alkoxy-, Halogen-, Mercapto-, Phenyl-, AIkoxyphenol- oder tert.-Butylreste in α-Stellung aufweisende Alkanole, z. B. p-Methoxybenzylalkohol, Di - ρ - methoxyphenylmethanol, Triphenylmethanol und insbesondere Diphenylmethanol.

Die in den Ausgangsverbindungen enthaltene Aminogruppe ist z. B. durch Niederalkyl-, Aryl- oder Acylreste blockiert. Die Arylreste, beispielsweise Naphthyl- oder Phenylreste, können z. B. durch Halogenatome, Nitro-, Cyano-, Sulfo-, Carbamoyl-, veresterte Carboxyl-, Niederalkylcarbonyl- oder Niederalkoxycarbonylgruppen substituiert sein; besonders geeignet sind der 2,4-Dinitrophenyl-, der 2,4,6-Trinitrophenyl-, der 2,4-Dinitro-6-methoxyphenyl-, der 4-Cyanophenyl- und der 4-Carbomethoxyphenylrest. Als Acylreste kommen vor allem Niederalkanoylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, z. B. Acetyl, Propionyl, Butyryl, ferner Aroylreste, wie Benzoyl, sowie durch Nitro-, Cyano-, Sulfogruppen, Halogenatome, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen substituiertes Benzoyl, und vorzugsweise Ν,Ν-Phthaloyl, in Betracht; weiter können Arylniederalkanoylreste, wie Phenylacetyl, oder der Carbobenzoxy- oder tert.-Butyloxycarbonylrest oder auch der Benzol- oder Toluolsulfonylrest zur Blockierung der Aminogruppe verwendet werden.

Die Reaktion verläuft nach folgendem Schema:

CO_x

CO'

N — CH — (CH₂)₃ — CO — NH

COOR

CO
CO-

CH₇-O- COCH,

PCl₅, Pyridin

Cl

COOR

N — CH — (CH₂J₃ -C = N

COOR

CO
CO'

R₁OH OR₁

COOR

N — CH — (CH₂)₃ -C =
COOR

CH, — O — COCH,

COOR

C0\

H', H₂O

OR₁

Ν —CH-(CH₂)₃ —C = O + H₂N COOR

O COCHo

COOR

CH, — O — COCH,

COOH

R₁OH bedeutet in diesem Schema ein Alkanol, insbesondere Niederalkanol, wie Methanol, Äthanol, >ropanol oder Neopentylalkohol oder Benzylalkohol.

Als tertiäre Amine dienen z. B. Triäthylamin, Pyrilin und Dimethylanilin.

Die Hydrolyse der Iminoäther zu 7-Aminocephaloporansäureestern wird mit Wasser in Gegenwart von basischen oder sauren Katalysatoren durchgeführt. Als aure Katalysatoren verwendet man Mineralsäuren, vie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Borluorwasserstoffsäure, oder organische Säuren, wie rrifluoressigsäure und p-Toluolsulfonsäure, als basiche Katalysatoren Salze von schwachen Säuren mit vlkali- oder Erdalkalimetallen.

Bevorzugt ist die Spaltung des Benzhydrylesters nittels Trifluoressigsäure und Anisol, ferner die !paltung des Nitrobenzyl- oder Benzylesters mittels :atalytisch erregten Wasserstoffs.

In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperauren in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

674 mg (1 mMol) kristallisierter Phenylacetylcephaosporin-C-dibenzylester werden in 20 ml Methylenhlorid, enthaltend 674 mg (6 mMol) Pyridin, gelöst ind nach Versetzen mit einer Lösung von 308 mg 2 mMol) Phosphoroxychlorid in 15 ml Methylenchloid 16 Stunden bei 23° stehengelassen. Man versetzt ait 2 ml absolutem Äthanol und läßt weitere 6 Stunden tehen. Dann wird das Gemisch bei 0,1 Torr einge- !ampft und in 20 ml Dioxan mit 10 ml 5%iger, väßriger Phosphorsäure 19 Stunden bei 20° hydroysiert. Nach Verdünnen mit Wasser wird das Dioxan m Vakuum entfernt, die wäßrige Lösung mit festem "rikaliumphosphat auf pH 3,3 gestellt und dreimal ait Chloroform-Äther-(1:3) extrahiert. Die mit Phosihatpuffer pH 3,3 gewaschenen organischen Extrakte ieht man dreimal mit 3%iger Phosphorsäure aus. )er Chloroform-Äther-Auszug enthält 540 mg Ausangsmaterial (nachgewiesen durch Dünnschichtchroiatogramm an Silicagel in den Systemen I und II, vgl. Tabelle I). Aus der wäßrigen Lösung vom pH 3,3 lassen sich, nach Einstellung auf pH 8,5, mit Essigester 19,9 mg Cephalosporin-C-dibenzylester extrahieren (identifiziert im Dünnschichtchromatogramm in den Systemen I und II durch Vergleich mit authentischem Material, das man aus Cephalosporin C durch überführung in N-tert.-Butyloxycarbonyl-cephalosporin C, Veresterung zum Dibenzylester und Abspaltung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure erhält [vgl. Tabelle I]).

Der phosphorsaure, wäßrige Extrakt wird mit Trikaliumphosphat auf pH 8,5 gestellt und mit Essigester extrahiert. Man trocknet die organische Phase mit Natriumsulfat und dampft zur Trockne ein. Der Rückstand, 47 mg, ist gemäß Dünnschichtchromatogramm in den Systemen I und II einheitlich und besteht aus 7 - Amino - cephalosporansäurebenzylester (vgl. Tabelle I). Das IR-Absorptionsspektrum in Methylenchlorid zeigt unter anderem Banden bei 2,83 ηΐμ (NH₂-Gruppe), 5,62 ηΐμ (/S-Lactam) und 5,77 πΐμ (Ester), im Gegensatz zum Ausgangsmaterial aber keine Banden bei 2,98, 5,95 und 6,70 πΐμ.

Für den Strukturbeweis des 7-Amino-cephalosporansäure-benzylesters stellte man davon ein kristallines Derivat her, das mit authentischem Material identifiziert wurde: 400 mg (1,1 mMol) 7-Amino-cephalosporansäure-benzylester werden in 10 ml Methylenchlorid bei Gegenwart von 50 mg (0,6 mMol) Pyridin mit 126 mg (1,2 mMol) Chloräthylisocyanat 17 Stunden bei 22° reagieren gelassen. Man dampft im Vakuum ein, nimmt den Rückstand in Chloroform-Äther (1:3) auf und wäscht mit 5%iger wäßriger Phosphorsäure und 10%iger wäßriger Dikaliumhydrogenphosphatlösung. Der neutrale Extrakt gibt beim Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen im Vakuum 461 mg (90%) 7-(£-Chloräthylureido)-cephalosporansäure-benzylester, der aus Aceton-Äther farblose Nadeln bildet, F. 175 bis 177°; [a]f = +11° ± 1° (c = 1, Chloroform), UV-Absorptionsspektrum: ;._max 264 ηΐμ (ε = 8100). Das Produkt ist identisch mit einem aus 7-Amino-cephalosporansäure synthetisierten Material.

Tabelle I Dünnschichtchromatogramme an Silicagel

	N-Phenylacetyl-cephalosporin- C-di-benzylester	Cephalosporin-C-dibenzylester	7-Amino-cephalosporansäure- benzylester
System I:
n-Butanol-Essigsäure
(10 :1), gesättigt mit
Wasser .	Rf = 0,76	Rf = 0,52	Rf = 0,57
System II:
Benzol-Aceton (6:4)...	Rf = 0,58	Rf =0,16	Rf = 0,55
Indikator:
Ninhydrin-Collidin	Fleischfarben	Rotviolett	Graugelb
Indikator:
Jodstärke	positiv	positiv	positiv

Das Jodstärke-Reagens wird nach R. Thomas, Nature, 191, 1161 (1961), hergestellt.

Der 'Z-Amino-cephalosporansäure-benzylester wird durch Hydrierung in Eisessig und in Gegenwart von Palladiumkohle (10%) in 7-Amino-cephalosporansäure übergeführt.

Der als Ausgangsmaterial verwendete Phenylacetylcephalosporin-C-dibenzylester kann wie folgt hergestellt werden: 534mg (ImMoI) N-Phenylacetyl-cephalosporin C werden in 50 ml Dioxan mit 2,5 mMol Phenyldiazomethan in 15 ml Äther während 1 Stunde bei 22° verestert. Man dampft im Vakuum ein, nimmt in Chloroform—Äther (1:3) auf und wäscht mit 10%iger wäßriger Phosphorsäure, 10%iger wäßriger Dikaliumhydrogenphosphatlösung und gesättigter Kochsalzlösung. Die eingedampfte organische Phase wird mit Äther verrieben und gibt 539 mg in Äther schwerlöslichen N- Phenylacetyl-cephalosporin-C-dibenzylester, der aus Aceton kristallisiert wird, F. 156 bis 157°.

Beispiel 2

200 mg (0,3 mMol) kristallisierter N-Phenylacetylcephalosporin-C-dibenzylester werden in 13 ml Methylenchlorid bei 22° 4 Tage mit 100 mg (0,65 mMol) Phosphoroxychlorid und 158 mg (2 mMol) Pyridin unter Feuchtigkeitsausschluß und Stickstoffatmosphäre reagieren gelassen. Man versetzt mit 1 ml absolutem Alkohol und läßt weitere 7 Stunden stehen. Die wie im Beispiel 1 durchgeführte Aufarbeitung gibt 155 mg Ausgangsmaterial, 9,5 mg Cephalosporin-C-dibenzylester und 31,0 mg reinen 7-Amino-cephalosporansäure-benzylester.

In gleicher Weise werden der Dimethyl-, Diäthyl- und Di-n-butylester von N-Phenylacetyl-cephalosporin C in die entsprechenden 7-Amino-cephalosporansäureester übergeführt. Diese haben folgende Rf-Werte im Papiorchromatogramm, System I (n-Butanol-Essigsäure 10:1, gesättigt mit Wasser) zu Methylester: RfI = 0,13;Äthylester:RfI = 0,15; n-Butylester: RfI = 0,16; gelbbraune Färbung mit Ninhydrin-Collidin oder bioautographischer Nachweis mit Staph. aureus nach Besprühen mit 1 m-Pyridin in Aceton-Wasser (1:1) und l%igem Phenylacetylchlorid in Aceton. Das UV-Spektrum zeigt ein Maximum bei 263 ηΐμ (f = 8000).

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Diester werden durch Umsetzung von in Methanol gelöstem N-Phenylacetyl-cephalosporin C mit einer 5%igen ätherisehen Diazomethan-, Diazoäthan- oder Diazobutanlösung hergestellt. Die Rf-Werte der N-Phenylacetylcephalosporin-C-diester im Papierchromatogramm im System I (n-Butanol-Essigsäure [10:1], gesättigt mit Wasser) bzw. System III (n-Butanol, gesättigt mit Wasser + i% Eisessig) sind: Dimethylester: RfIII = 0,76; Diäthylester: Rf I = 0,85; Dibutylester: Rf III = 0,87 (bioautographischer Nachweis mit Staph. aureus). Die Spaltung der 7-Amino-cephalosporansäureester erfolgt nach Beispiel 1.

Beispiel 3

406 mg (0,59 mMol) kristalliner N-Carbobenzoxycephalosporin-C-dibenzylester werden in 20 ml Methylenchlorid zusammen mit 316 mg (4,0 mMol) Pyridin und 200 mg (1,3 mMol) Phosphoroxychlorid 88 Stunden bei 25° unter Feuchtigkeits- und Lichtausschluß stehengelassen. Dann versetzt man mit 2 ml absolutem Alkohol, läßt weitere 8 Stunden stehen gibt 1 ml Pyridin dazu und dampft im Vakuum einJ Zur Hydrolyse wird der Rückstand in 20 ml Dioxan und 10 ml 2%iger wäßriger Phosphorsäure aufgenommen und 15 Stunden bei 22° stehengelassen, Aufarbeitung wie im Beispiel 1 gibt 65 mg (0,179 mMol) reinen 7-Amino-cephalosporansäure-benzylester. Die Weiterverarbeitung erfolgt gemäß Beispiel 1.

Der als Ausgangsmaterial verwendete N-Carbobenzoxy-cephalosporin-C-dibenzylester wird wie folgt erhalten: 4,73 g (10 mMol) Cephalosporin-C-natriumsalz werden in 200 ml 10%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung gelöst, mit 150 ml Aceton und bei 0^c mit einer Lösung von 2,30 g (13,5 mMol) Chlorameisensäure-benzylester in 50 ml Aceton langsam versetzt. Man rührt weitere 30 Minuten bei 0°, 1 Stunde bei 22° und dampft sodann das Aceton im Vakuum ab. Die wäßrige Phase wird zuerst mit Essigester gewaschen, dann bei pH 2,0 unter Aussalzen (Natrium-_: chlorid) mit Essigester extrahiert. Der über Natriumsulfat getrocknete Extrakt gibt beim Eindampfer 4,437 g N-Carbobenzoxycephalosporin C. Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System I¹ Rf =0,30. j

4,42 g (8,05 mMol) N-Carbobenzoxy-cephalospo '■ rinC werden in 100ml Dioxan gelöst, mit 110ml einer Lösung von 19,8 mMol Phenyldiazomethan ir Dioxan versetzt und IV2 Stunden bei 22° reagieren ge lassen. Dann verdampft man im Vakuum zur Trockn« und verreibt den Rückstand mit Petroläther-Ätheij (1:1). Das Unlösliche wird in Chloroform-Äther (1: 3^

aufgenommen und mit 2 n-Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Man trocknet die organische Phase über Natriumsulfat, dampft ein (4,96 g) und kristallisiert aus Aceton—Äther. Man erhält so kristallinen N-Carbobenzoxy-cephalosporin-C-dibenzylester, F. 133 bis 135°.

Beispiel 4

216 mg (0,296 mMol) kristalliner N-2,4-Dinitrophenyl-cephalosporin-C-dibenzylester werden in 11 ml Methylenchlorid zusammen mit 158 mg (2,OmMoI) Pyridin und 100 mg (0,65 mMol) Phosphoroxychlorid 8 Tage bei 23° unter Feuchtigkeits- und Lichtausschluß stehengelassen. Nach Zugabe von 2 ml absolutem Alkohol läßt man v/eitere 8 Stunden stehen, versetzt mit 1 ml Pyridin und verdampft im Vakuum zur Trockne. Der Rückstand wird 16 Stunden bei 22° mit einem Gemisch von 20 ml Dioxan und 10 ml 3%iger wäßriger Phosphorsäure hydrolysiert. Zu Beispiel 1 analoge Aufarbeitung gibt 62 mg (0,171 mMol = 58%) reinen 7-Amino-cephalosporansäure-benzylester. Die Weiterverarbeitung erfolgt gemäß Beispiel 1.

Der als Ausgangsmaterial verwendete N-2,4-Dinitrophenyl-cephalosporin-C-dibenzylester kann wie folgt hergestellt werden: 11,63 g N-2,4-Dinitrophenyl-cephalosporin C werden in 125 ml Dioxan gelöst und bei 22° unter Rühren während 25 Minuten mit 250 ml einer 2%igen Lösung von Phenyldiazomethan in Äther versetzt. Nach beendeter Zugabe läßt man noch 20 Minuten stehen und engt dann im Vakuum weitgehend ein. Der in Chloroform aufgenommene Rückstand wird hierauf je dreimal mit 2 n-Salzsäure, 1 n-Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Trocknen der organischen Phase und Eindampfen liefern 15,54 g Rohprodukt. Durch Verreiben mit Äther entfernt man die in Äther löslichen Anteile (2,42 g). Die in Äther nicht löslichen Anteile (12,84 g) geben aus Aceton—Äther 9,98 g kristallinen N-2,4-Dinitrophenyl-cephalosporin-C-di-J benzylester, der nach Umkristallisation bei 109 bis 111° schmilzt; [a]S⁵ = +31,5° ± Γ (c = 1 in Chloroform).

In gleicher Weise werden der Dimethyl-, Diäthyl- und Di-n-butylester von N-2,4-Dinitrophenyl-cephalosporin C in den 7-Amino-cephalosporansäure-methyl-, -äthyl- bzw. -n-butylester übergeführt.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten Diester können durch Umsetzung einer methanolischen Lösung von N-2,4-Dinitrophenyl-cephalosporin C mit einer 5%igen ätherischen Lösung von Diazomethan, Diazoäthan oder Diazobutan hergestellt werden.

Die Rf-Werte der N^^-Dinitrophenyl-cephalosporin-C-diester im Papierchromatogramm in den Systemen I bzw. III sind: Dimethylester: Rf I = 0,73; RfIII = 0,76; Diäthylester: Rf I = 0,78; Dibutylester: RfI = 0,82, RfIII = 0,85. F. 103 bis 104°.

Beispiel 5

216 mg (0,296 mMol) kristalliner N-2,4-Dinitrophenyl-cephalosporin-C-dibenzylester werden in 11 ml Methylenchlorid zusammen mit 158 mg (2,OmMoI) Pyridin und 100 mg (0,65 mMol) Phosphoroxychlorid 8 Tage bei 20° unter Feuchtigkeitsausschluß im Dunkeln stehengelassen. Man versetzt mit 2 ml absolutem Alkohol, läßt weitere 8 Stunden stehen und gibt dann ein Gemisch von 26 ml Dioxan und 13 ml 5%iger wäßriger Phosphorsäure hinzu. Die im Vakuum bis zur Einphasigkeit vom Methylenchlorid befreite Lösung wird zur Hydrolyse 16 Stunden bei 22° stehengelassen. Man verdünnt mit Wasser, befreit im Vakuum vom organischen Lösungsmittel, stellt auf pH 3,3 und extrahiert mit Benzol-Essigester (2:1). Diese organische Phase wird mit 3%iger wäßriger Phosphorsäure ausgezogen und die Phosphorsäurelösung nach Einstellen des pH auf 8,5 mit Essigester extrahiert. Der über Natriumsulfat getrocknete und eingedampfte Essigesterextrakt enthält 53 mg (49%) reinen 7-Aminocephalosporansäure - benzylester. Weiterverarbeitung nach Beispiel 1.

■5 Beispiele

Nimmt man 2 ml Methanol statt 2 ml Äthanol für die im übrigen gleich wie im Beispiel 5 durchgeführte Reaktion und Aufarbeitung, so erhält man 59 mg (55%) 7-Amino-cephalosporansäure-benzylester.

Beispiel 7

203 mg (0,296 mMol) N-Phthaloyl-cephalosporin-C-dibenzylester werden in Methylenchlorid mit Pyridin und Phosphoroxychlorid wie im Beispiel 5 reagieren gelassen und wie dort hydrolysiert und aufgearbeitet. Man erhält 48 mg (45%) reinen 7-Aminocephalosporansäure-benzylester, der wie im Beispiel 1 weiterverarbeitet wird.

Der als Ausgangsstoff verwendete N-Phthaloylcephalosporin-C-dibenzylester kann wie folgt hergestellt werden: 473 mg (1 mMol) Cephalosporin C werden in 10 ml einer 10%igen, wäßrigen Dikaliumhydrogenphosphatlösung aufgenommen und das pH des Gemisches mit Trikaiiumphosphat auf 9 gestellt. Man gibt 4 ml Aceton, dann unter Rühren 6 ml Aceton, enthaltend 285 mg (1,3 mMol) N-Carbäthoxyphthalimid, zu und rührt 1 Stunde bei 22°, wobei das pH durch Zugabe von weiterem Trikaiiumphosphat konstant gehalten wird. Anschließend verdünnt man mit Wasser, stellt mit Phosphorsäure auf pH 7, entfernt das Aceton im Vakuum und wäscht die wäßrige Lösung 3mal mit Essigester aus. Sodann stellt man die wäßrige Phase mit Phosphorsäure auf pH 2 und extrahiert das Produkt mit Essigester. Der über Natriumsulfat getrocknete und eingedampfte Extrakt enthält 505 mg (93%) N-Phthaloyl-cephalosporin C.
Nach Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System I ist das Produkt einheitlich; Rf = 0,21 (farbloser Fleck auf violettem Untergrund nach Besprühen mit Jod-Stärke-Reagens; Ausführung: R. Thomas, Nature, 191,1161 [1961]).

5 g (9,16 mMol) N-Phthaloyl-cephalosporin C werden in 100 ml Dioxan gelöst, unter Rühren mit 160 ml einer ätherischen Lösung von 22 mMol Phenyldiazomethan versetzt und V₂ Stunde reagieren gelassen. Nach Zugabe von 2 ml Eisessig dampft man im Vakuum ein, nimmt in Chloroform-Äther (1:3) auf und wäscht nacheinander mit 5%iger wäßriger Phosphorsäure, 10%iger wäßriger Dikaliumphosphatlösung und gesättigter, wäßriger Kochsalzlösung. Die über Magnesiumsulfat getrocknete organische Phase gibt 8,52 g Eindampfrückstand, der zuerst mit Petroläther, dann mit Äther digeriert wird. Der in den beiden Lösungsmitteln unlösliche Rückstand (5,06 g) enthält N-Phthaloyl-cephalosporin-C-dibenzylester. Das Produkt ist nach Dünnschichtchromatogramm an

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ίο

Silicagel (System II: Rf = 0,74) einheitlich und absorbiert im UV-Absorptionsspektrum bei 264 ηΐμ (ε = 8200).

Beispiel 8

660 mg (1 mMol) N-Benzoyl-cephalosporin-C-dibenzylester werden in 40 ml' Methylenchlorid zusammen mit 593 mg (7,5 mMol) Pyridin und 368 mg (2,4 mMol) Phosphoroxychlorid 7 Tage bei 25° unter Licht- und Feuchtigkeitsausschluß stehengelassen, ίο Dann versetzt man mit 7 ml absolutem Äthanol, läßt weitere 8 Stunden stehen, gibt 3 ml Pyridin dazu und dampft im Vakuum ein. Zur Hydrolyse wird der Rückstand in 70 ml Dioxan und 35 ml 3%iger wäßriger Phosphorsäure aufgenommen und 15 Stunden bei 22° stehengelassen. Aufarbeitung wie im Beispiel 1 gibt 114 mg (32%) reinen 7-Amino-cephalosporansäure-benzylester, der wie im Beispiel 1 verarbeitet wird.

Der als Ausgangsstoff verwendete N-Benzoylcephalosporin-C-dibenzylester kann wie folgt hergestellt werden:

Eine Lösung von 5 g (10,5 mMol) Cephalosporin-C-natriumsalz in 150 ml 10%iger wäßriger Dikaliumhydrogenphosphatlösung wird mit 100 ml Aceton und bei 0 bis 5° langsam mit einer Lösung von 2,1 g (15 mMol) Benzoylchlorid in 21 ml Aceton versetzt. Man beläßt ¹J₂ Stunde bei 0 bis 5° sowie ^l/₂ Stunde bei 22° (Wasserbad) und entfernt dann das Aceton im Vakuum. Die wäßrige Phase wird mit Essigester gewaschen, bei pH 3,3 mit Benzol gewaschen und schließlich bei pH 2,0 mit Essigester extrahiert. Der Extrakt gibt beim Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen 4,24 g (78%) N-Benzoyl-cephalosporin C, das aus Essigester in Nadeln kristallisiert, F. 113 bis 117°.

Zur Veresterung werden 3,5 g (6,7 mMol) N-Benzoyl-cephalosporin C in 150 ml Dioxan gelöst und während 45 Minuten mit einer Lösung von 13,5 mMol Phenyldiazomethan in 90 ml Äther reagieren gelassen. Man dampft ein, nimmt in Chloroform—Äther (1:3) auf und wäscht nacheinander mit 10%iger wäßriger Phosphorsäure, 10%iger wäßriger Dikaliumhydrogenphosphatlösung und gesättigter Kochsalzlösung. Trocknen der organischen Phase, Eindampfen und Verreiben des Rückstandes mit Äther gibt 4,35 g N-Benzoyl-cephalosporin-C-dibenzylester, der aus Aceton kristallisiert, F. 178 bis 18Γ.

Beispiel 9 5<>

746mg (ImMoI) N-Phthaloyl-cephalosporin-C-di-(p-methoxy-benzylester) werden in 40 ml Methylenchlorid bei 22° 8 Tage mit 538 mg (6,8 mMol) Pyridin und 338 mg (2,2 mMol) Phosphoroxychlorid reagieren gelassen. Man läßt mit 6 ml Alkohol 8 Stunden bei 22° stehen und versetzt zur Hydrolyse mit 120 ml Dioxan-Wasser (2:1). Analog Beispiel 5 durchgeführte Hydrolyse und Aufarbeitung mit Benzol—Essigester (5:2) gibt 184 mg (48%) 7-Aminocephalosporansäurep-methoxy-benzylester. Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Il: Rf =0,50; im System I: Rf = 0,72. Der Ester wird durch 5minütige Einwirkung von wasserfreier Trifluoressigsäure zur 7-Aminocephalosporansäure gespalten.

Der als Ausgangsstoff verwendete N-Phthaloylcephalosporin-C-di-(p-methoxy-benzylester) kann wie folgt hergestellt werden: 2,73 g (5 mMol) N-Phthaloylcephalosporin C und 1,66 g (12 mMol) Anisylalkohol werden in 30 ml Dioxan gelöst. Nach dem Abkühlen auf 10° wird in einer Portion eine Lösung von 2,88 g (14 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in 20 ml Dioxan zugesetzt. Man läßt das Gemisch 30 Minuten bei 10° und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, das Filtrat lyophilisiert, der Rückstand, in Benzol—Essigester (5:2) aufgenommen, viermal mit 10%iger wäßriger sekundärer Kaliumphosphat- und zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen. Der über Natriumsulfat getrocknete und eingedampfte Extrakt enthält 3,44 g (92,4%) N-Phthaloyl-cephalosporin-C-di^p-methoxybenzylester). Das Produkt wird in Benzol—Petroläther (6:4) aufgenommen und an Silicagel (Merck) gereinigt. Die Substanz läßt sich mit Benzol-Chloroform (2:8) eluieren.

Gemäß Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in n-Butylacetat als Fließmittel ist das Produkt einheitlich; Rf = 0,55 (farbloser Fleck auf violettem Untergrund nach Besprühen mit Jod-Stärke-Reagens, vgl. R. T h ο m a s, Nature, 191, 1161 [1961]).

Die Substanz kristallisiert in Drusen aus Methylenchlorid-Petroläther, F. 124 bis 127°. UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit: X_max 258 ηΐμ (ε = 8700).

Beispiel 10

2,63 g (3 mMol) kristalliner N-Phthaloyl-cephalosporin-C-dibenz hydrylester werden in 110 ml Methylenchlorid 10 Tage mit 1,58 g (20 mMol) Pyridin und 1,00 g (6,5 mMol) Phosphoroxychlorid bei 20° reagieren gelassen. Man versetzt mit 20 ml Methanol und läßt weitere 8¹Z₂ Stunden stehen. Dann wird 260 ml Dioxan und 130 ml 5%ige wäßrige Phosphorsäure zugegeben, kurz aufgeschüttelt und im Vakuum bis zur Homogenität eingeengt. Man läßt 15 Stunden bei 22° stehen, verdünnt mit 50 ml Wasser und dampft das Dioxan im Vakuum ab. Die wäßrige Phase (140 g) wird mit 70 ml Alkohol versetzt und dreimal mit Benzol—Essigester (5:2) augeschüttelt. Die organischen Phasen werden viermal mit 2 n-Salzsäure-Alkohol (2:1) gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Phasen werden auf pH 6 neutralisiert, im Vakuum vom Alkohol befreit und bei pH 8,0 mit Essigester extrahiert, der über Natriumsulfat getrocknet und dann eingedampft wird. Man erhält so 871 mg (= 66%) 7 - Aminocephalosporansäure - benzhydrylester. Das IR-Absorptionsspektrum (Methylenchlorid) zeigt im Carbonylgebiet nur Banden bei 5,63, 5,76 und 5,78 μ (Schulter). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System I ist Rf = 0,58 und im System Benzol—Aceton (7:3): Rf = 0,51.

438 mg (1 mMol) 7 - Amino - cephalosporansäurebenzhydrylester werden in 5 ml Anisol gelöst, mit 20 ml wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt und nach 5 Minuten rasch eingedampft (0,1 mm Hg). Der in Essigester aufgenommene Rückstand wird mit l%iger wäßriger Trifluoressigsäure extrahiert. Aus der mit Pyridin auf pH 3,5 gestellten, dann im Vakuum stark eingeengten, wäßrigen Phase scheiden «sich 248 mg (91%) 7-Amino-cephalosporansäure ab. Sie ist nach Dünnschichtchromatogramm (an Silicagel im System η - Butanol — Pyridin — Eisessig — Wasser (30:20:6:24); Rf = 0,45; Braunfärbung mit Ninhydrin-Collidin) einheitlich und identisch mit authentischem Material. Der mikrobiologische Plattentest

(Staphylococcus aureus) gibt nach Phenylacetylierung gleiche Hemmzonen.

j Zur weiteren Charakterisierung wird der 7-Aminocephalosporin-C-dibenzhydrylester kann wie folgt herin den 7 - (ß - Chloräthylureido) - cephalosporansäurebenzhydrylester übergeführt. Dieses Produkt ist nach Dünnschichtchromatogramm (an Silicagel im System Benzol—Aceton (8:2): Rf = 0,32) einheitlich und identisch mit dem Produkt, das aus authentischer 7-Amino-cephalosporansäure durch Umsatz mit Chlor- ^thylisocyanat und nachfolgender Veresterung mit biphenyldiazomethan hergestellt worden ist. Auch dieser Ester läßt sich, wie oben beschrieben, mit Tri-Huoressigsäure leicht zur freien Carbonsäure hydrolysieren.

Der als Ausgangsstoff verwendete N-Phthaloyl- ;ephalosporin-C-dibenzhydrylester kann wie folgt hergestellt werden: a) 1,09 g (2 mMol) N-Phthaloylxphalosporin C (Reinheit etwa 78%) werden in 16,5 ml bioxan gelöst und mit 776 mg (4 mMol) Diphenyldiazomethan in 12 ml Dioxan versetzt. Die tief purpur-/iolette Reaktionslösung wird 5 Std. bei 22° im Dunceln stehengelassen. Man dampft die nur noch schwach Osagefärbte Lösung im Vakuum ein, nimmt den Rückwand in 200 ml Chloroform auf, wäscht zweimal mit :iskalter 5%iger Phosphorsäure, Wasser, dreimal mit iiskaltem n-Natriumbicarbonat und schließlich mit 10%iger Natriumchloridlösung. Der mit Natriumsulfat getrocknete Chloroformauszug wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand, 1,66 g, dreimal mit ^O ml Äther verrieben. Der Digerierungsrückstand, 1,23 g, wird aus Aceton-di-n-propyläther umkristallisiert, wobei 1,12 g N-Phthalyl-cephalosporinp-dibenzhydrylester, F. 158,5 bis 160°, erhalten werden.

IR-Absorptionsspektrum in Nujol: Banden unter tnderem bei 3,05, 5,62, 5,71, 5,80, 6,00, 6,07 μ (Schuler), 6,44, 6,85 μ (breit), 7,26, 7,66, 7,90, 8,21 μ.
I UV - Absorptionsspektrum in Äthanol: A₁ max »59 πΐμ (ε = 9100), I₁ max 264 ηΐμ (ε = 9100).

Rf-Werte im Dünnschichtchromatogramm auf Siicagel: System Benzol—Aceton (8:2): 0,49, System "yclohexan—Äthylacetat (1: l):0,28.

Reaktion nach R e i η d e 1 und Hoppe grau-'iolett. Reaktion mit Jod-Stärke-Essigsäure (nach t. T h ο m a s, 1. α): schwach positiv.

b) 10 g (18,3 mMol) N-Phthaloyl-cephalosporin C werden in 150 ml Dioxan-Methanol (9:1) gelöst und >ei 20° unter Rühren während ^l/₂ Std. mit einer klar iltrierten Lösung von 8,5 g (43,8 mMol) Diphenyliiazomethan in 50 ml Petroläther versetzt. Man gibt :Ö ml Methanol zu und rührt eine weitere Stunde. )ann dampft man im Vakuum ein, kristallisiert aus issigester und wäscht die Kristalle mit Äther. Die ausbeute an kristallinem N-Phthalyl-cephalosporin- -dibenzhydrylester beträgt 84%, farblose Nadeln, * 160 bis 161°.

2,63 g

Beispiel 11
(3 mMol) kristallisierter N-Phthaloyl-

ephalosporin-C-dibenzhydrylester werden in 100 ml iethylenchlofid gelöst, mit 2,4 ml (3OmMoI) Pyriin und unter Kühlen mit 12,5 ml 10%igem Phosphorentachlorid (6 mMol) in Methylenchlorid versetzt, tfan läßt 20 Minuten bei 20° stehen, gibt unter Küh- :n 20 ml Methanol zu und läßt weitere 6 Stunden fehen. Dann gießt man das Gemisch auf gut gerührte i50ml Dioxan -5% ige wäßrige Phosphorsäure (2:1), entfernt das Methylenchlorid im Vakuum bis zur Homogenität der Lösung und läßt 15 Stunden bei 22° hydrolysieren. Die wie im Beispiel 10, aber mit

2 n-Salzsäure-Alkohol (1:1) statt (2:1), durchgeführte Aufarbeitung gibt 1,114 g Rohprodukt, aus dem durch Verreiben mit Äther 710 mg (54%) reiner 7-Aminocephalosporansäure-benzhydrylester erhalten wird. Er kristallisiert aus Äther in zu Drusen vereinigten Nadeln; F. 122 bis 124°. Er kann, wie im Beispiel 10 gezeigt, zu 7-Amino-cephalosporansäure verseift werden.

Beispiel 12

26,3 g (0,03 Mol) kristallisierter N-Phthaloylcephalosporin-C-dibenzhydrylester werden in 1 1 absolutem Methylenchlorid gelöst, mit 29,0 ml (0,36 Mol) Pyridin und unter Kühlen mit 187 ml 10%igem Phosphorpentachlorid (0,09 Mol) in Methylenchlorid versetzt. Man beläßt ¹I₂ Stunde im Wasserbad von 20°, gibt unter Kühlen 200 ml Methanol zu und läßt weitere 6 Stunden stehen. Dann gießt man die Reaktionslösung auf ein gut gerührtes Gemisch von 1,3 1 Dioxan und 0,5 1 7%iger wäßriger Phosphorsäure, entfernt das Methylenchlorid im Vakuum bis zur Homogenität und läßt 17 Stunden bei 22° hydrolysieren.

Die wie im Beispiel 11 durchgeführte Aufarbeitung gibt 17,7 g rohen 7-Amino-cephalosporansäure-benzhydrylester, der sofort verseift wird. Man nimmt in 17 ml Anisol auf, versetzt unter Kühlen mit 85 ml Trifluoressigsäure und dampft anschließend bei 0,1 Torr ein. Die Kontaktzeit mit der Säure beträgt etwa 15 Minuten. Eine Lösung des Eindampfrückstandes in 100 ml Essigester sowie etwa 30 ml 50%ige wäßrige Trikaliumphosphatlösung werden gleichzeitig in 100 ml gerührte 30%ige wäßrige Dikaliumhydrogenphosphatlösung gegossen (End-pH = 6,5). Man trennt die beiden Phasen und extrahiert die untere mit zwei weiteren Portionen Essigester. Die Essigesterauszüge werden zweimal mit je 50 ml 3%iger wäßriger Dikaliumhydrogenphosphatlösung gewaschen, die ver-

40. einigten wäßrigen Phasen mit konzentrierter Salzsäure auf pH 3,5 gestellt und die auf etwa 100 ml eingeengte Lösung bei 0° zur Kristallisation gebracht. Man erhält so 6,14 g (75%) reine 7-Amino-cephalosporansäure. UV-Absorptionsspektrum (in 0,1 n-Natriumbicarbonatlösung): k_max 263 ΐημ (ε = 8300). [_a]_D = +118° (c = 1 in 0,5 n-Natriumbicarbonat).

B ei spi e 1 13

In gleicher Weise, wie im Beispiel 12 beschrieben, kann N - Phthaloyl - cephalosporin - C - di - tetrahydropyran - 2 - yl - ester in 7 - Amino - cephalosporansäure - tetrahydropyran -2 - yl - ester übergeführt und dann zur 7-Aminocephalosporansäure verseift werden.

Im Dünnschichtchromatogramm im System II ist Rf = 0,41 für den Tetrahydropyran-2-ylester.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 2,73 g N-Phthaloyl-cephalosporin C werden mit 10 ml 2,3-Dihydro-4-pyran Übergossen, mit Eis-Kochsalz-Mischung auf —10° abgekühlt und unter Rühren mit 50 mg p-Toluolsulfonsäure sowie nach 20 Minuten mit weiteren 50 mg p-Taluolsulfonsäure versetzt. Man rührt unter 'Feuchtigkeitsausschluß

3 Stunden im Kältebad, verdünnt dann mit 20 ml Dioxan und gießt in dünnem Strahl· in einen eiskalten, kräftig gerührten und etwa 10%igen Phosphatpuffer vom pH 9,5. Die im Vakuum vom organischen Lösungsmittel befreite, wäßrige Phase wird mit Benzol— Essigester (5:2) extrahiert. Der durch Zusatz von 5 ml

Pyridin basisch gemachte Extrakt gibt beim Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen im Vakuum ein neutrales Rohprodukt, das durch Digerieren mit 1% Pyridin enthaltenden Gemischen von Petroläther und Äther (zuerst 98:2, dann 3:1) von in den Gemischen löslichen Begleitstoffen befreit wird. Man erhält so 2,36 g N - Phthaloyl - cephalosporin - C - di - tetrahydropyranylester. Die Verbindung weist bei Dünnschichtchromatographie an Silicagel im System Benzol—Aceton (7:3) einen Rf-Wert von 0,40 auf. Das IR-Absorptionsspektrum in Methylenchlorid zeigt unter anderem Banden bei 5,64, 5,75, 5,82, 5,91, 7,27, 7,41, 8,35, 8,49, 8,86, 8,98, 9,08, 9,41, 9,48, 9,70, 10,65 und 11,60 μ.

Beispiel 14

Verwendet man bei dem Verfahren von Beispiel 12 als Ausgangsstoff N^^-Dinitrophenyl-cephalosporin-C-di-p-nitrophenylester, so erhält man den 7-Aminocephalosporinsäure-p-nitrophenylester. Rf-Wert im Papierchromatogramm, System I = 0,26; gelbbraune Färbung mit Ninhydrin-Collidin oder bioautographischer Nachweis mit Staph. aureus nach Besprühen mit

1 m-Pyridin in Aceton—Wasser (1:1) und l%igem Phenylacetylchlorid in Aceton. Im UV-Spektrum Maximum bei 263 πΐμ (ε = 7900).

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 15 g N-2,4-Dinitrophenyl-eephalosporin C werden in 600 ml absolutem Pyridin gelöst, mit 8 g p-Nitrophenol und 20 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 14 Stunden bei 22° stehengelassen. Dann filtriert man vom auskristallisierten Dicyclohexylharnstoff (F. 220°) ab und dampft im Vakuum ein. Die Lösung des Rückstandes in 1 1 Essigester wird mit

2 η-Salzsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum eingedampft, in Aceton aufgenommen und von weiterem, ausgefallenem Dicyclohexylharnstoff durch Filtration befreit. Das eingedampfte Filtrat (22,8 g) wird an 1 kg Silicagel chromatographiert. Die mit je 700 ml Benzol-Chloroform (1:1) eluierten Fraktionen enthalten 8,49 g gelben, amorphen N-2,4-Dinitrophenyl - cephalosporin - C - di - ρ - nitrophenylester. Rf-Wert im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel, System: Chloroform—Methanol (95:5) = 0,70. Das IR-Spektrum in Nujol weist unter anderem Banden auf bei 5,63, 5,70, 5,85, 6,00, 6,16, 6,27, 6,56 und 7,44 μ.

Beispiel 15

50

Wie im Beispiel 12 beschrieben, wird N-Phenylacetylcephalosporin - C - monomethylester - desacetyllacton behandelt. Man erhält das 7-Amino-cephalosporansäure-desacetyllacton in einer Ausbeute von 63%.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: Man löst 1 g N-Phenylacetyl-cephalosporin C in 20 ml Dioxan, versetzt unter Rühren mit überschüssiger ätherischer Diazomethanlösung und läßt 30 Minuten bei 22° stehen. Dann wird mit 0,5 ml Eisessig versetzt und im Vakuum eingedampft. Eine Chloroformlösung des Eindampfrückstandes wird mit 1 n-Salzsäure, 1 n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser neutral gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält so 972 mg N-Phenylacetylcephalosporin-C-dimethylester.

506 mg N-Phenylacetyl-cephalosporin-C-dimethylester werden in 50 ml Methanol—Dioxan (3:1) gelöst, mit 1 ml konzentrierter Salzsäure versetzt und 2^l/₂ Tage bei 2° stehengelassen. Dann verdünnt man mit 60 ml Wasser und engt im Vakuum auf etwa 40 ml ein. Der Chloroformextrakt der dauren wäßrigen Phase wirdmit 1 n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser ge- i i waschen, über Natriumsulfat getrocknet und einge-ij dampft. Man erhält so 468 mg Eindampfrückstand,: j der an 50 g Silicagel chromatographiert wird. Die mit: Chloroform—Methanol 98 : 2 eluierten Fraktionen enthalten N - Phenylacetyl - cephalosporin - C - monomethylester-desacetyllacton. j

Das IR-Spektrum in Nujol zeigt eine Lactonbande j bei 5,62 μ. Weitere Banden sind unter anderem bei | 3,03, 3,37, 3,45, 5,57, 5,70, 5,93, 6,11, 6,36, 6,50, 6,85,! 7,24, 7,57, 7,76, 7,95, 8,28, 8,47, 8,74, 8,93, 9,10, 9,23,1 9,79, 10,11, 13,63 μ (die Banden 3,37, 3,45, 6,85, 7,241 und 13,63 μ gehören zum Nujol). Die Verbindung ist! nach Papierchromatogramm einheitlich (System: j n-Butanol—Methanol—Wasser 2:1:2, Rf = 0,88). \

B e i s ρ i e 1 16 j

9,6 g 2,4,6 - Trinitrophenyl - cephalosporin - C - dibenzhydrylester (Reinheit 44%) werden in 260 ml absolutem Methylenchlorid gelöst. Nach Abkühlen der Lösung auf —18° versetzt man mit 5 ml wasserfreiem Pyridin und gibt dann eine Lösung von 7,8 g i Phosphorpentachlorid in 100 ml absolutem Methylen- j chlorid unter Rühren innerhalb 10 Minuten tropfen-! weise zu. Man rührt noch 45 Minuten bei —12 bis —10° und gibt dann innerhalb 5 Minuten 64 ml auf —10° abgekühltes Methanol hinzu. Die Lösung wird weiter 40 Minuten bei —10° und dann 1 Stunde.bei + 10° gerührt und dann unter Rühren mit 110 ml j 2 η-Salzsäure versetzt. Man trennt die Phasen und extrahiert die wäßrige Phase mit 100 ml Methylenchlorid j nach. Die vereinigten Methylenchloridphasen werden j schonend im Vakuum eingedampft. Nach Trocknen i im Hochvakuum erhält man einen harzigen, braunen Rückstand von rohem 7-Aminocephalosporan- j säure-benzhydrylester.

Man löst den 7-ACA-benzhydry.lester in 5 ml Anisol, • versetzt unter Kühlen mit 14 ml Trifluoressigsäure, läßt 30 Minuten bei 20 bis 30° reagieren und gibt; dann ein auf —10° gekühltes Gemisch von 25 ml Tri-| äthylamin und 180 ml Methanol hinzu. Man stelltj das pH mit Triäthylamin (6 ml) auf 3,5, kühlt auf —18°' ab und läßt das Reaktionsgemisch kristallisieren. Der j kristalline Niederschlag wird durch Nutschen abge- j trennt, mit Methanol, Methylenchlorid und Diäthyläther gewaschen und im Hochvakuum getrocknet. Man erhält die 7-Amino-cephalosporansäure in einer Reinheit von 83,3%. ;

Der als Ausgangsmaterial verwendete 2,4,6-Trinitrophenyl - cephalosporin - C - dibenzhydrylester kann wie folgt hergestellt werden: 3701 Cephalosporin-C-haltiger Kulturbrühe werden mit einer Lösung von 2,72 kg Oxalsäure in 10 1 Wasser und 0,9 1 einer Mischung von gleichen Volumteilen Wasser und konzentrierter Schwefelsäure versetzt, so daß ein pH von 3 resultiert. Nach Zugabe von 8 kg (Diatomeenerde) als Filterhilfsmittel filtriert man durch ! eine Filterpresse. Das klare Filtrat (3201) enthält 1,57 g Cephalosporin C pro Liter. Der feuchte Filterrückstand (62 kg) wird verworfen.

Man fügt das Filtrat zu einer Lösung von 920 g 2,4,6-trinitrobenzolsulfonsaurem Natrium vom pH 7,5. die man erhält, wenn man 796 g wasserfreies Natriumsulfit in 3,35 1 deionisiertem Wasser löst, 1 kg Eis zu-

fugt und innerhalb 15 Minuten eine Lösung von 1,425 kg Pikrylchlorid in 4,35 i Aceton unter Rühren hinzugibt. Das pH des Lösungsgemisches wird mit konzentrierter Natronlauge unter Rühren auf 9,0 gestellt und dann während 4 Stunden bei einer Temperatur von 26° auf 8,5 bis 8,7 gehalten. Die klare rote Reaktionslösung, die das 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C enthält, wird bei einem pH von 1,5 bis 2,0, das man mit 5 η-Schwefelsäure einstellt, mittels eines Gegenstromextraktors mit Methylisobutylketon extrahiert. Man erhält 190 1 Methylisobutylketon-Extrakt. Dieser wird mittels eines Gegenstromextraktors mit einem 0,2 m-Phosphatpuffer vom pH 8 extrahiert. Man erhält 95 1 wäßrigen Extrakt vom pH 6. Aus diesem wird das 2,4,6-Trinitrophenylcephalosporin C nochmals mit Methylisobutylketon bei pH 2 extrahiert. Die erhaltenen 50 1 organischer Lösung werden bei pH 6 dreimal mit je 4 1 Wasser extrahiert. Den so erhaltenen wäßrigen Extrakt (121) kühlt man auf 0 bis 4° ab, stellt das pH mit 6 η-Salzsäure auf 2,0 ein, saugt den Niederschlag ab und wäscht ihn mit eiskaltem Wasser. Nach dem Trocknen verbleiben 751 g rohes 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C. Aus dem Filtrat werden noch weitere 269 g des Produktes gewonnen. Das Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System η - Butanol — Eisessig — Wasser (75:7,5:21) zeigt für 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C in bezug auf Pikrinsäure als Bezugssubstanz einen Rf_P-Wert von 0,51. 200 g rohes 2,4,6-Trinitrophenyl-cephalosporin C werden in 2 1 Methylisobutylketon suspendiert und mit einer Lösung von 200 g Diphenyldiazomethan (hergestellt durch Oxydation von Benzophenonhydrazon mit Mangandioxyd) in 600 ml Methylisobutylketon versetzt. Nach 1,5 Stunden läßt man die rotviolette Lösung in 10 1 Petroläther einlaufen. Dabei fällt der rohe 2,4,6-Trinitrophenylcephalosporin - C - dibenzhydrylester als hellgelbes Pulver aus. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit Petroläther gewaschen und im Vakuum bei 40° getrocknet. Das Produkt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Toluol—Aceton (8:2) einen Rf-Wert von 0,53. Ausbeute: 280 g des Diesters mit einer Reinheit von 44%.

Beispiel 17

45

8,IgN- Phthalyl - cephalosporin - C - di - trichloräthylester werden in 300 ml absolutem Methylenchlorid gelöst, mit 10 ml absolutem Pyridin versetzt und auf —16° abgekühlt. Dann gibt man unter Rühren innerhalb 10 Minuten eine Lösung von 6,4 g Phosphorpentachlorid in 110 ml Methylenchlorid hinzu, wobei die Temperatur auf —13° ansteigt. Man rührt noch 40 Minuten bei —12°, gibt dann zu der Lösung innerhalb 3 Minuten 65 ml auf etwa —20° abgekühltes Methanol, wobei die Temperatur des Reaktionsgemisches auf —10° steigt. Dann rührt man '/2 Stunde bei — 10°, erwärmt auf +20° und rührt eine weitere Stunde. Unter Rühren gibt man 220 ml 1 n-Salzsäure hinzu und rührt weiter ³/₄ Stunde bei 20°. Aufarbeitung wie im Beispiel 18 ergibt 4,3 g 7-Aminocephalosporin-'säure-trichloräthylester in einer Reinheit von 79% (gemäß UV-Spektrum). Das Produkt wird in 70 ml 90%iger, wäßriger Essigsäure gelöst und bei 20^c unter kräftigem Rühren portionenweise innerhalb 30 Minuten mit 25 g Zinkstaub versetzt. Nach weiteren 2 Stunden Rühren wird das Gemisch zentrifugiert und die entstandene klare Lösung eingedampft. Mehrmaliges Digerieren mit Methanol gibt schwach beigegelarbte. reine 7-Amino-ccphalosporansaure.

Das Ausgangsmatcrial kann wie folgt hergestellt werden: Zu einer Lösung von 5.5 g N-Phthalylcephalosporin C in 70 ml Acetonitril wird bei 20° eine Lösung von 4.1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 30 ml Acetonitril gegeben und I¹Z₂ Stunden bei 20^:' unter Feuchtigkeitsausschluß gerührt. Nach Zugabe von 60 ml ,i./l/i'-Trichloräthanol wird noch 48 Stunden bei 20° gerührt und dann das Gemisch im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester aufgenommen und die Lösung nacheinander mit l0%iger wässeriger Phosphorsäure und 0,5 n-Dikaliumhydrogenphosphat-Lösung geschüttelt. Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat und Eindampfen ergibt ein Rohprodukt, das an der 30fachen Menge Silicagel chromatographiert wird. Elution erfolgt mit Benzol-Essigester-Gemischen mit steigendem Essigestergehalt. Man erhält so reinen N-Phthalyl-cephalosporin-C-di-trichloräthylester.

Beispiel 18

4,73 g Cephalosporin-C-Natriumsalz (80%ig) werden in 50 ml 10%igem Dikaliumhydrogenphosphat-Puffer und 30 ml Aceton gelöst und bei 22° und pH 9,0 (mit 50%iger Trikaliumphosphatlösung eingestellt und dann konstant gehalten) mit einer Lösung von 2,5 g o-Nitrophenylsulfenylchlorid in 20 ml Aceton versetzt. Man rührt 1 Stunde bei pH 9. Die Lösung wird bei pH 6 im Vakuum vom Aceton befreit und dann in der Kälte bei pH 2 mit Essigester extrahiert. Der mit gesättigter, kalter Kochsalzlösung gewaschene und über Natriumsulfat getrocknete Auszug gibt beim Eindampfen 3,78 g N-(o-Nitrophenylsulfenyl)-cephalosporin C, das in 60 ml Dioxan—Methanol (8:2) mit überschüssigem Diphenyldiazomethan während einer Stunde bei 22° verestert wird. Man dampft zur Trockne ein und wäscht eine Essigesterlösung des Rückstandes mit 10%iger Dikaliumhydrogenphosphat-Lösung. Trocknen, Eindampfen und Digerieren mit Petroläther gibt 6,34 g (Reinheit etwa 86%, Ausbeute 76%) N-(o-Nitrophenylsulfenyl)-cephalosporin-C - dibenzhydrylester. Dünnschichtchromatographie im System Benzol—Aceton (6:4): Rf = 0,75; in Benzol—Aceton (7:3): Rf = 0,66.

5,25 g (86% ig, 5 mMol) N-(o-Nitrophenylsulfenyl)-cephalosporin-C-dibenzhydrylester und 5 ml Pyridin in 130 ml Methylenchlorid werden unter Stickstoffatmosphäre bei —30° mit einer Lösung von 3,1 g (15 mMol) Phosphorpentachlorid in 50 ml Methylenchlorid innerhalb 5 Minuten versetzt und anschließend 45 Minuten bei —10° gerührt. Man gibt 32 ml Methanol zu und rührt 30 Minuten bei —10° und

1 Stunde bei +20°. Nach Zugabe von 110 ml 1 n-Salzsäure wird noch 1 Stunde bei +20° gerührt. Dann wird das Gemisch auf pH 8 gebracht und mit Methylenchlorid extrahiert. Trocknen des Auszugs über Natriumsulfat und Eindampfen gibt 6,0 g rohen 7-Aminocephalosporansäureester. Er wird bei —15° in 2,5 ml Anisol und 7,5 ml Trifluoressigsäure gelöst und 20 Minuten bei 20° stehengelassen. Die Lösung wird mit 90 ml kaltem Methanol verdünnt und mit etwa 12 ml Triäthylamin auf pH 3,5 gestellt. Filtration nach

2 Stunden Stehen bei 0° und Waschen des Rückstandes mit Methanol, Methylenchlorid und Äther gibt 985 mg (72%) reine 7-Aminocephalosporansäure. Die Ausbeute an 7-ACA in bezua auf Cephalosporin C beträgt 55%.

17
Beispiel 19

Eine Lösung von 100 g Cephalosporin-C-Natriumsalz (84"/0Ig) in 2 1 10%igem Dikaliumhydrogenphosphat-Puffer und 1 1 Äthanol wird bei 0^c und pH 9,5 (Zugabe von Trikaliumphosphat) innerhalb 30 Minuten mit einer Lösung von 75 g 2,4-Dinitrofluorbenzol in 1 1 Äthanol versetzt. Man rührt 3 Stunden bei 25° und pH 9,0 bis 9,5. Das Gemisch wird zur Entfernung des Alkohols eingeengt und bei pH 6 mit Essigester gewaschen. Extraktion bei pH 2,0 mit Essigester und Digerieren des Eindampfrückstandes mit Äther gibt 115,2 g (etwa 85%iges) N-(2,4-Dinitrophenyl)-cephalosporinC als gelbes Pulver; [a]f = +121,7° ± 0,5° (c = 2 in Methanol). Ausbeute 95%. Eine Lösung von 2,5 g dieses Materials in 100 ml Acetonitril wird in einem Druckgefäß in Gegenwart von 2 ml Bortrifluorid-Ätherat mit 100 ml Isobutylen während 20 Stunden bei 22° zur Reaktion gebracht. Man gibt 50 ml Pyridin zu, dampft ein und wäscht eine Chloroformlösung des Rückstandes mit 10%iger Dikaliumhydrogenphosphatlösung. Trocknen der Lösung und Filtration durch eine Säule aus 100 g Silicagel liefert im Filtrat 1,67 g (Reinheit 93%, Ausbeute 61%) gelben N - (2,4 - Dinitrophenyl) - cephalosporin - C - di-(tert.butylester); Dünnschichtchromatogramm an Kieselgel: Rf = 0,79 in Benzol—Aceton (6:4), Rf = 0,87 in n-Butanol—Eisessig (10:1) gesättigt mit Wasser.

745 mg N - (2,4 - Dinitrophenyl) - cephalosporin-C - di - (tert.butylester) werden entsprechend Beispiel 18 in 25 ml Methylenchlorid und 1 ml Pyridin mit einer Lösung von 620 mg Phosphorpentachlorid in 10 ml Methylenchlorid zur Reaktion gebracht, mit 6,2 ml Methanol umgesetzt und mit 20 ml 1 η-Salzsäure hydrolysiert. Aufarbeitung des 7-Aminocephalosporansäureesters und Kristallisation aus Methanol—Äther gibt 256 mg 7-Aminocephalosporansäure-tert.-butylester; F. 107 bis 111°. Das Material wird mit 10 ml Trifluoressigsäure Übergossen und 30 Minuten bei 20° stehengelassen. Man dampft ein, löst in 30 ml kaltem Methanol und stellt mit Triäthylamin auf pH 3,5. Filtration nach 17 Stunden Stehen bei +4° gibt 187 mg (Ausbeute 69%) 7-Aminocephalosporansäure. Die Ausbeute an 7-ACA in bezug auf Cephalosporin C beträgt 42%.

Beispiel 20

Eine Lösung von 9,40 g 85%igem Cephalosporin-C-Natriumsalz in 300 ml 5%igem Dikaliumhydrogenphosphat und 200 ml Aceton wird mit 8,6 g tert.-Butyloxycarbonylazid versetzt und 18 Stunden bei 22° und pH 9,0 bis 9,5 (Zugabe von Trikaliumphosphat) gerührt. Das Gemisch wird zur Entfernung des Acetons eingeengt, mit Essigester gewaschen und schließ-Hch in der Kälte bei pH 2,5 extrahiert. Man erhält 9,10 g N - (tert. - Butyloxycarbonyl) - cephalosporin C als farblosen Schaum. Das Material wird in 100 ml Dioxan—Methanol (8:2) gelöst und mit überschüssigem Diphenyldiazomethan versetzt. Nach 1 Stunde Stehen bei 20° dampft man ein, löst den Rückstand in Essigester und wäscht die Lösung mit 10%igem Dikaliumhydrogenphosphat. Trocknen, Eindampfen und Digerieren mit Hexan gibt 13,2 g N-(tert.-Butyloxycarbonyl) - cephalosporin - C - dibenzhydrylester (Reinheit 83%, Ausbeute 76%). Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,79 in Benzol—Aceton (6:4); Rf = 0,58 in Benzol—Aceton (7:3).

Die gleiche Reaktionsfolge wie im Beispiel 18 wird mit 5,1 g N-ftert.-ButyloxycarbonylH'cphalosporin-C-dibenzhydrylester (83" _(Jig) durchgeführt, und man erhält 1,07 g (Ausbeute 79%) 7-Aminocephalosporansäure.

Die Ausbeute an 7-ACA in bezug auf Cephalosporin C beträgt 60%.

Beispiel 21

Eine Lösung von 470 g 88%igem Cephalosporin-C-Natriumsalz in 5 1 10%igem Dikaliumhydrogenphosphat und 2 1 Aceton wird bei pH 9,1 und 22° innerhalb 15 Minuten mit einer Lösung von 300 g N-Äthanolcarbonyl-phthalimid in Aceton versetzt und anschließend 1 Stunde bei 22° und pH 9,1 (Zugabe von Trikaliumphosphat) gerührt. Einengen, Waschen mit Essigester und Extraktion mit Essigester bei pH 2 gibt nach Digerieren mit Äther 507 g (84%iges; Ausbeute 90%) Ν,Ν-Phthaloylcephalosporin C.

15 g davon werden in 400 ml Methylenchlorid und 7,5 ml Triäthylamin gelöst, bei —20° mit einer Lösung von 6,8 ml Trichloracetylchlorid in 200 ml Methylenchlorid unter Rühren versetzt und anschließend V₂ Stunde bei -20° gerührt. Dann werden 19,5 g festes Hydroxymethylphthalimid und 13 ml Pyridin zugegeben und l^l/₂ Stunden bei 0° weitergerührt. Man dampft das Gemisch im Vakuum ein, nimmt den Rückstand in 1 m-Kaliumdihydrophosphat auf und extrahiert mit Essigester. Diese Auszüge werden mit Im- Dikaliumhydrogenphosphat und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Das Rohprodukt wird mit 500 ml Äther digeriert, und man erhält als in Äther unlöslichen Anteil 20,6 g etwa 90%igen Ν,Ν-Phthaloyl-cephalosporin-C-di-phthalimidomethylester. Ausbeute: 87%.

Dünnschichtchromatographie an Silicagel: im System n-Butanol—Eisessig (10:1) gesättigt mit Wasser: Rf = 0,76; im System sek.-Butanol—Eisessig—Wasser (67:10:23): Rf =0,71.

.Eine Lösung von 480 mg 90%igem N-Phthaloylcephalosporin - C - di - phthalimidomethylester und 0,5 ml Pyridin in 30 ml Methylenchlorid wird unter Stickstoff bei —20° mit einer Lösung von 312 mg Phosphorpentachlorid in 3,1 ml Methylenchlorid versetzt und anschließend 45 Minuten bei — 12° gerührt. Das Gemisch wird hierauf mit 3,2 ml Methanol versetzt und 30 Minuten bei —10° und 1 Stunde bei + 20° sowie nach Zugabe von 11ml 1 n-Salzsäure 30 Minuten bei + 20° gerührt. Man stellt mit 1 ml 50%igem Trikaliumphosphat und etwa 12 ml 2 n-Natronlauge auf pH 8,0 und extrahiert mit Methylenchlorid. Der getrocknete Auszug gibt beim Eindampfen 402 mg rohen 7-Aminocephalosporansäure-phthalimidomethylester. Dünnschichtchromatographie an Silicagel: im System n-Butanol—Essigester (10:1) gesättigt mit Wasser: Rf = 0,51; im System sek.-Butanol — Essigsäure — Wasser (67: 10: 23): Rf = 0,58. Das Material wird mit 3 ml einer gesättigten Bromwasserstofflösung im Eisessig Übergossen und nach 8 Minuten Stehen bei 20° im Vakuum bei 0,1 Torr eingedampft. Der Rückstand wird anschließend in 10 ml Methanol aufgenommen, das pH mit Triäthylamin auf einen Wert von 3,5 gebracht und das Gemisch 17 Stunden bei +5° stehengelassen. Filtration ergibt 62 mg (46%) 7-Aminocephalosporansäure.

Die Ausbeute an 7-ACA in bezug auf Cephalosporin C beträgt 36%.

B e i s ρ i e 1 22

Eine Suspension von 4,85 g 85%igem Cephalosporin-C-Natriumsalz in 80 ml Methanol wird mit |17ml l,5normaler methanolischer Salzsäure versetzt jund die klare Lösung bei 0,1 Torr eingedampft. Der aus Cephalosporin-C-hydrochlorid bestehende Rückstand (6,3 g) wird in 100 ml Dimethylformamid gelöst μηά mit 10 g Diphenyldiazomethan 20 Minuten bei 20° verestert. Eindampfen, Digerieren mit Hexan und ,Waschen einer Essigesterlösung mit 0,5 m-Dikaliumhydrogenphosphat gibt 7,54 g Rohprodukt, das an g Silicagel chromatographiert wird. Die mit ChIo- >form—Aceton (9:1) eluierten Fraktionen enthalten 15 g (94%) Cephalosporin -C- dibenzhydrylester. lünnschichtchromatogramm an Silicagel: Rf = 0,63 System n-Butanol—Eisessig (9:1) gesättigt mit /asser; Rf = 0,77 im System n-Butanol—Pyridin— isessig—Wasser (38:24:8:30); Rf = 0,25 im System oluol—Aceton (6:4).

795 mg davon werden in 50 ml eines klarfiltrierten remisches von 1/20 m-Phosphatpuffer pH 7,5 und iceton (1:2) gelöst, mit 1,5 ml Salicylaldehyd versetzt nd 30 Minuten bei 20° gerührt. Man verdampft das aceton im Vakuum und extrahiert die wäßrige Phase lit Essigester. Der mit 0,5 m-Dikaliumhydrogenhosphat gewaschene und über Sikkon getrocknete .uszug gibt beim Eindampfen bei 0,1 Torr 705 mg - (o - Hydroxybenzyliden) - cephalosporin - C - dijnzhydrylester. Dünnschichtchromatogramm an licagel: Rf = 0,31 im System Toluol—Aceton (9:1).

0,7 g des Produktes werden analog dem Beispiel 21

zum 7-Aminocephalosporansäure-benzhydrylester und dieser zu 7-Aminocephalosporansäure gespalten.

Ausbeute 49%. Die Ausbeute an 7-ACA, bezogen auf Cephalosporin C, beträgt 46%.

Beispiel 23

Eine Lösung von 380 mg gemäß Beispiel 22 hergestelltem Cephalosporin - C - dibenzhydrylester und 55 mg 2,6-Lutidin in 30 ml Methylenchlorid wird mit 0,7 ml einer Methylenchloridlösung, enthaltend 70 mg ß-Brompropionitril, versetzt und A¹J₂ Stunden bei 25° gerührt. Das den gebildeten N-Cyanäthyl-cephalosporin - C - dibenzhydrylester (Rf = 0,64 im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Toluol—Aceton [8:2]) enthaltende Gemisch wird hierauf mit 0,5 ml Pyridin und unter Feuchtigkeitsausschluß bei — 20° mit einer Lösung von 320 mg Phosphorpentachlorid in 3,2 Methylenchlorid versetzt. Man rührt 45 Minuten bei —15° und führt dann die weiteren Verfahrensschritte mit Methanol und Salzsäure durch, wie im Beispiel 21 beschrieben. Aus dem durch Extraktion gewonnenen 7-Aminocephalosporansäurebenzhydrylester (565 mg, lösungsmittelhaltig) erhält man nach der Einwirkung von Trifluoressigsäure und Isolierung 72 mg (53%) reine 7-Aminocephalosporansäure. Bezüglich Cephalosporin C beträgt die Ausbeute 50%.

Claims

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Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephalosporansäure und Desacetyl-V-aminocephalosporansäurelacton, dadurch gekennzeichnet, daß man Cephalosporine bzw. Desacetylcephalosporin-C-lacton, worin die Aminogruppe in an sich bekannter Weise blockiert ist und die Carboxylgruppen in an sich bekannter Weise durch leicht abspaltbare Estergruppen geschützt sind, bei Zimmertemperatur oder unter Kühlen in Gegenwart eines tertiären Amins in an sich bekannter Weise mit Phosphorpentachlorid oder Phosphoroxychlorid reagieren läßt, das Gemisch in an sich bekannter Weise mit einem Alkohol behandelt und nach erfolgter Umsetzung in an sich bekannter Weise mit wäßriger Säure hydrolysiert und gegebenenfalls erhaltene Ester in an sich bekannter Weise spaltet.

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