DE2436772A1 - Verfahren zur extraktion von nblockierten aminosaeuren - Google Patents

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Dr. F. Zumstelnsen. - Pr. E. Assmann Dr. R. Koenigsberger - DIpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumsteln Jun.

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BRÄUHAUSSTRASSE 4

Ceph 185

GLAXO LABORATORIES LIMITED, Greenford,Middlesex,

England

Verfahren zur Extraktion von N-"blockierten

Aminosäuren

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von N-blockierten Aminosäuren aus wäßrigen Lösungen davon, insbesondere aus Fermentationsbrühen bzw. Fermentationsbouillons. Es sei festgestellt, daß der hier verwendete Ausdruck "N-blockierte Aminosäure" bzw. "N-geschützte Aminosäure" auch N-blockierte (bzw. geschützte) Peptide umfaßt.

Es ist häufig erforderlich, Aminosäuren und N-blockierte Aminosäuren aus wäßrigen Lösungen, beispielsweise aus Fermentationsflüssigkeiten und Fermentor-Abfallen oder aus Lösungen von durch die Einwirkung von Enzymen modifizierten Substraten zu isolieren. Solche Isolierungen werden häufig durch beispielweise die vergleichsweise Instabilität von vielen natürlich produzierten N-blockierten Aminosäuren in wäßrigen Medien·

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und die Tatsache, daß die meisten Fermentations- und Enzymreaktionen das gewünschte Produkt lediglich in verdünnter Lösung ergeben, kompliziert, so daß komplexe und teure Isolierungstechniken häufig notwendig sind.

So ist beispielsweise Penicillin G /Ü3S, 5R, 6R)-2,2-Dimethyl-6-phenylacetamidopenam-3-carbonsäure/ in Form der freien Säure instabil, insbesondere in wäßrigen Systemen, und erfordert so spezielle Techniken zu seiner wirksamen Isolierung aus Fermentati ons brühen. Diese Techniken können beispielsweise eine rasche Extraktion, gefolgt von selektiven . und recht kostspieligen Reinigungsschritten zur Isolierung eines annehmbar reinen Penicillin G-Produkts(z.B. eines Salzes) mit größerer Stabilität als die freie Säure, einbeziehen. Alternativ kann das Penicillin G durch Sulfoxidieren und Abtrennen des resultierenden Penillin. G-SuIf oxids isoliert werden. Es ist ähnlich schwierig, Cephalosporin C JJ6R, 7R)-3-Acetoxymethyl-7-(R-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure_<7 aus Fermentationsbrühen abzutrennen wegen seiner amphoteren Struktur und hydrophilen Natur. Die Isolierung von von der Fermentation stammenden 3-Hydroxymethyl-cephalosporinen, wie Desacetylcephalosporin C JJ6R, 7R)-7-(R-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure7 kann in gleicher Weise Probleme verursachen aufgrund der ausgeprägten Neigung solcher Verbindungen, die Lactonbildung durch Reaktion der Hydroxygruppe in der Seitenkette in der 3-Stellung mit der 4-Carboxygruppe einzugehen.

Beispiele für Techniken, die zur Isolierung solcher N-blockierter Aminosäuren verwendet wurden, sind die Verwendung von Ionenaustauscherharzen und Lösungsmittelextraktionen. Die erstgenannte Technik ist jedoch etwas umständlich und teuer bei der Behandlung von verdünnten Lösungen in industriellem Maßstab; die letztgenannte Technik weist den Nachteil auf, daß die zu isolierende Säure häufig eine relativ geringe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln besitzt, so daß die Lösungs-

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mittelanforderungen und. somit die Arbeitskosten sehr hoch werden können.

Es wurde nun jedoch gefunden, daß eine wirksame Abtrennung von N-blockierten Aminosäuren aus ihren wäßrigen Lösungen in besonders einfacher Weise durch ein Verfahren erzielt werden kann, bei dem die Säure einer im wesentlichen gleichzeitigen Veresterung und Lösungsmittelextraktion durch Umsetzung mit einem Diazoalkan in Anwesenheit eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels unterzogen wird; derartige Verfahren werden im folgenden als extraktive Veresterungen bezeichnet.

Veresterungsreaktionen unter Anwendung von Diazoalkanen in teilweise wäßrigen Medien wurden bisher nicht beschrieben. Die Tatsache, daß derartige Reaktionen glatt und wirksam verlaufen, ist überraschend, da anzunehmen wäre, daß andere vorhandene Substanzen, die alkyliert werden könnten, z.B. Wasser, mit der Carboxylgruppe der N-blockierten Aminosäure bei der Reaktion mit dem Diazoalkan in Konkurrenz treten könnten. Eine solche Wechselwirkung scheint jedoch im allgemeinen beim erfindungsgemäßen Extraktions-Veresterungsverfahren minimal zu sein.

So wird gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Extraktion einer N-blockierten Aminosäure aus einer wäßrigen Lösung davon geschaffen, welches darin besteht, diese Lösung mit einem Diazoalkan in Anwesenheit eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels zu behandeln, wobei eine Lösung eines Esters der N-blockierten Aminosäure in dem · organischen Lösungsmittel hergestellt wird.

Diazoalkan-Veresterungsmittel, die bei diesem Verfahren ver-■ wendet werden können, umfassen Verbindungen der allgemeinen Formel

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R¹

R²

worin R ein Wasserstoff atom oder eine organische Gruppe dar-

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.stellt und R eine organische Gruppe bedeutet, oder R und R zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine cyclische organische Gruppe bilden.

Geeignete Diazoalkane umfassen so Verbindungen der Formel I, worin R und/oder R , die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt werden aus carbocyclischen Arylgruppen, wie Phenyl oder Naphthyl; 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ringen, die eines oder mehrere der Atome 0,N und S enthalten (z.B. Thien-2-yl, Fur-2-yl oder Pyridin-2-yl); Aralkylgruppen (z.B. die eine monocyclische Arylgruppe und 1 bis 6 Kohlenstoffatome in dem Alkylteil enthalten, wie Benzyl); heterocyclisch-substituierte Alkylgruppen (z.B. enthaltend 1 bis 6 Kohlenstoffatome in dem Alkylteil, wie Thien-2-ylmethyl oder Fur-2-ylmethyl); Alkylgruppen (z.B. enthaltend 1 bis 6 Kohlenstoffatome, wie Methyl, Äthyl, n-Propyl oder Isopropyl); Cycloalkylgruppen (z.B. enthaltend 5 bis 7 Kohlenstoffatome im Ring, wie Cyclopentyl oder Cyclohexyl); ungesättigte Analoga der vorstellenden Gruppen, beispielsweise carbocyclische oder heterocyclische Aralkenylgruppen_f niedrige (z.B. Cp_g)A.lkenylgruppen (z.B. Vinyl oder Allyl) und Cycloalkenylgruppen (z.B. enthaltend 5 bis 7 Kohlenstoff atome, wie Cyclohexenyl oder Cyclopentadienyl); oder jegliche der vorstehenden Gruppen, substituiert durch ein oder mehrere Halogenatom(e), Cyan-, Nitro-, Alkyl-, Alkylsulfonyl-.. oder Alkoxygruppen, wobei letztere Gruppen beispielsweise 1 bis ' 6 Kohlenstoffatome enthalten können, wie beispielsweise in Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, Äthoxy, Isopropoxy oder

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Methylsulfonyl.

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Alternativ können R und R , zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, eine cyclische Struktur "bilden, z.B. eine C,-_₂₀-cycloaliphatische Gruppe, beispielsweise eine Cycloalkylgruppe (z.B. enthaltend 5 bis 7 Kohlenstoffatome, wie Cyclopentyl oder Cyclohexyl) oder eine Cycloalkenylgruppe (z.B. enthaltend 5 bis 7 Kohlenstoffatome, wie Cyclohexenyl oder Cyclopentadienyl); oder eine heterocyclische Gruppe, die · mindestens einen 5- oder 6-gliedrigen Ring enthält, der ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, enthält (z.B_o eine monocyclische Gruppe, wie Pyranyl oder Piperidinyl).

Besonders nützliche Diazoalkane der Formel I umfassen Verbin-

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düngen, worin R und R so gewählt sind, daß die resultieren-

1 2
de Estergruppe R R CH- eine Aralkylgruppe ist, die 1 oder 2 carbocyclische oder heterocyclische Arylgruppen, gebunden an das C-1 Atom eines niedrigen (z<,B₀ C,, g) Alkylteils enthält, Z₀B. Benzyl, 1-Phenyläthyl, Diphenylmethyl, Napthylphen3?"lmethyl, Di-(thien-2-yl)-methyl, Pheynl-(thien-2-yl)methyl,oder eine substituierte Version jeglicher dieser Gruppen, z.B. Phenyl- (o-tolyl)fflethyl oder (p-MethoxyphenylXphenylmethyl, da solche Estergruppen leicht durch einen nachfolgenden Schritt in der Reaktionsfolge gespalten werden können. Die vorstehende Aufzählung ist jedoch nicht vollständig und soll keine Einschränkung darstellen.

Die zu extrahierende N-blockierte Aminosäure kann durch die Formel Q.COOH dargestellt werden, worin Q eine organische Gruppe mit beispielsweise 1 bis 50 Kohlenstoffatomen und mindestens einer blockierten Aminogruppe ist, oder eine Mono-, Di- oder Polycarbonsäure sein kann. Wird ein Diazoalkan der Formel I verwendet, so entspricht der resultierende Ester der Formel .0.COOCHR¹R², worin R¹ und R² die vorstehend aufgezeigten Be-

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deutungen besitzen.

Beispiele für N-blockierte Aminosäureen, die extraktiv gemäß der vorliegenden Erfindung verestert werden können, umfassen N-blockierte Derivate von einfachen Aminosäuren, wie Glycin, Cystein, Methionin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Phenylalanin, Tryptophan und L-Dopa, insbesondere aus Fermentationsbrühen; N-blockierte Peptide, insbesondere aus Fernientationsbrühen, pflanzlichen und tierischen Extrakten und komplexen wäßrigen Reaktionsmischungen, die von Peptidsynthesen stammen, z.B. Glutathion; und natürliche oder halbsynthetische Penicillin- und Cephalosporinverbindungen und verwandte Abbauprodukte, z.B. Penillasäure oder Penicilloinsäure, insbesondere von Fermentations- und anderen enzymkatälysierten Verfahren.

Die wäßrige Lösung der N-blockierten Aminosäure, die extraktiv verestert werden soll, kann - falls gewünscht - einen geringen Anteil (z.B.. bis zu 50 % Vol/Vol) eines oder mehrerer Colösunesmittel enthalten, z.B. mit Wasser mischbare organische Lösungs« mittel, wie niedrige Alkenole (z.B. Methanol), Ketone (z.B. Aceton), Ester (z.B. Äthylacetat), Ν,Ν-disubstituierte Amide (z.B. Dimethylacetamid) und Äther (z.B. cyclische Äther, wie Dioxan), beispielsweise zur Erhöhung der Löslichkeit der N-blockierten Aminosäure in dem wäßrigen Medium. Alternativ kann in Fällen, wo die N-blockierte Aminosäure eine besonders geringe Löslichkeit in Wasser aufweist, die wäßrige Lösung die Form einer Aufschlämmung annehmen, die eine wäßrige, gesättigte Lösung der N-blockierten Aminosäure in Kontakt und im Gleichgewicht mit Feststoff, ungelöster N-blockierter Aminosäure, enthält. In der vorliegenden Beschreibung vorhandene Hinweise auf wäßrige Lösungen N-blockierter Aminosäuren sollen daher auch solche Aufschlämmungen und wäßrig-organische Lösungen umfassen,

Beispiele für Penicilline und Cephalosporine, die extraktiv

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gemäß der vorliegenden Erfindung verestert werden können, sind Verbindungen mit der Grundformel

R'

0'

(II)

worin Z die Bedeutung von J>S oder >S—>0 hat; X eine zweiwertige Gruppe ist, ausgewählt aus

und

CH,

■GH,

COOH

(a)

COOH

(b)

(worin Y Methyl ist; substituiertes Methyl, z.B. -CHpY¹, worin Y' den Rest eines Nucleophils, einschließlich solcher Gruppen, wie Acetoxy, Hydroxy oder Carbamoyloxy darstellt; oder eine

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ungesättigte Gruppe, wie Vinyl oder substituiertes Vinyl/bedeutet und die unterbrochene Linie zwischen den 2-, 3- und 4-Stellungen von (b) anzeigt, daß die Verbindung eine Ceph-2-em- oder Ceph-3-em-Verbindung sein kann; R eine blockierte Aminogruppe, z.B. eine carboxylische Acylamidogruppe (z.B. mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen) oder eine protonierte Arainogruppe (NEU⁺) ist; und R^a ein Wasserstoffatom oder eine niedrige (z.B. C_1-^) Alkyl-, Alkoxy- oder Alkylthiogruppe; z.B. eine Methoxygruppe ist).

Ist R eine carboxylische Acylamidogruppe, so kann der Acylteil hiervon ausgewählt werden aus der umfangreichen Reihe von Acylgruppen der Penicillin- und Cephalosporin-Literatur. Spe-

Acyl—

ziellevGruppen sind als Beispiele in der folgenden Liste aufgeführt, die lediglich Beispiele angibt und nicht vollständig ist:

(i) R^n^n^" ^{f wor}^ⁿ R^U Aryl (carbocyclisch oder heterocyclisch), Cycloalkyl, substituiertes Aryl, substituiertes Cycloalkyl, Cycloalkadienyl oder eine nicht-aromatische heterocyclische oder mesoionische Gruppe ist und η die Bedeutung von 0 oder einer ganzen Zahl von 1 bis 4 hat. Beispiele für diese Gruppe umfassen Phenylacetyl; Thien-2~ und -3-ylacetyl, 3- und 4-Iosoxazolylacetyl,sowohl substituiert oder unsubstituiert; Pyridylacetyl, Tetrazolylacetyl oder eine Sydnonacetylgruppe. Ist η von 0 unterschiedlich, insbesondere wenn η die Bedeutung von 1 hat, so kann das O^-Kohlenstoffatom der Acylgruppe substituiert sein durch beispielsweise eine Hydroxygruppe, veresterte Hydroxygruppe (z.B. Niedrigalkanoyloxy, wie Acetoxy), blockierte Aminogruppe (z.B. Amino, substituiert durch jede der nachfolgend definierten blockierenden Gruppen) Hydroxyiminogruppe, Acyloxyiminogruppe (z.B. Niedrigalkanoyloxyimino, wie Acetoxyimino oder halgensubstituierte Niedrigalkanoyloxyimino, wie Mono-oder Dichloracetoxyimino) oder verätherte Oxyiminogruppe (z.B. Niedrigalkoxyimino, wie Methoxyimino oder

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t-Butoxyimino, Niedrigcycloalkyloxyimino, wie Cyclopentyloxyimino oder Aryloxyimino, wie Phenoxyimino); Beispiele für CC -substituierte Acylgruppen dieser Art umfassen 2-Hydroxy-2-phenylacetyl, N-blockiertes 2-Amino-2-phenylacetyl und 2-(Fur-2-yl)-2-hydroxyiminoacetyl.

(ii) ^c _n ^H2 +1^C0"' ^{worin n} -^die Bedeutung von 0 oder einer ganzen Zahl von 1 bis 7 hat. Die Alkylgruppe kann gerad- oder verzweigtkettig sein und kann substituiert sein, z.B. durch eine Cyanogruppe, eine Carboxygruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine Hydroxygruppen eine blockierte Aminogruppe oder eine Carboxycarbonylgruppe (-CO₀COOH) oder jegliche derartige Gruppe, in der die funktioneile Gruppe blockiert ist. Beispiele für solche Gruppen umfassen Formyl, Glutaroyl und N-blockiertes (z„B. N-Äthoxycarbonyl) R-5-Amino-5-Garboxypentanoyl.

(iii) , worin R^u die unter (i) definierte Be-R ZC-CO- deutung hat und zusätzlich Benzyl sein

R kann, und R^v und R^w,die gleich oder verschieden sein können, jeweils Wasserstoff, Phenyl, Benzyl, Phenylethyl oder Niedrigalkyl bedeuten und Z ein Sauerstoffoder Schwefelatom ist. Beispiele für diese Gruppe umfassen Phenoxyacetyl oder Pyridylthioacetyl»

Es sei hier erwähnt, daß die Grundformel II in ihre Struktur Verbindungen mit einschließt,die nicht speziell durch die Gruppen (a) und (b) umfaßt werden, z.B. 2-Acetoxyrnethyl-penicilline und 2-Methyl- und 2-Methylen-cephalosporine.

Verbindungen der Formel (lib), worin Y¹ den Rest eines Nucleophils darstellt, können durch Umsetzung der Verbindung der Formel (lib), worin Y' die Bedeutung von Acetoxy hat, mit einem Nucleophil, beispielsweise Pyridin oder anderen tertiären Aminen, wie in der GB-PS 912 541 beschrieben; einem Schwefel-

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V -

V-

- 10 - I

verknüfenden, Stickstoff-verknüpfenden oder anorganischen Nucleophil,_: wie in dem GB-PS 1 01-2 943 beschrieben; einem Schwefel-verknüpf enden Nucleophil, v/ie in der GB-PS 1 059 562 beschrieben; einem Stickstoff-verknüpfenden Nucleophil, wie in den GB-PS 1 030 630, 1 082 943 und 1 082 962 beschrieben; oder einem Schwefel-verknüpfenden Nucelophil, wie in den GB-PS 1 101 423 und 1 206 305 beschrieben, hergestellt werden. Diese Aufzählung gibt lediglich Beispiele an und stellt keine Einschränkung dar.

Verbindungen der Formel(IIb), worin Y¹ eine Hydroxygruppe ist, können nach den in der GB-PS 1 121 308 beschriebenen Verfahren hergestellt xirerden; Verbindungen, worin Y' eine Carbamoyloxygruppe ist, sind in der BE-PS 764 160 beschrieben.

Ist Y in der Formel (lib) eine Methylgruppe, so kann die Verbindung nach der in der GB-PS 957 569 beschriebenen Methode hergestellt werden.

Wie vorstehend aufgezeigt, sollte die nach dem erfindungsgemäf3en Verfahren abzutrennende Aminosäure in N-blockierter Form vorliegen, da dies im allgemeinen die Löslichkeit des resultierenden Esters in dem organischen Lösungsmittel erhöht und so die Wirksamkeit der Extraktion verbessert. Wird dementsprechend gewünscht, eine Säure, die eine oder mehrere freie Aminogruppen enthält, z.B. eine einfache Aminosäure oder eine Penicillinoder Cephalosporinsäure, die eine Aminogruppe in der Seitenkette in 6- oder 7-Stellung enthält, extraktiv zu verestern, so sollten diese Gruppen vor der Veresterung durch Protonieren oder durch Substitution mit einer blockierenden Gruppe blockiert werden.

Wird zur Blockierung einer Aminogruppe die Protonisierung angewendet, so sollte die Protonisierung vorzugsweise unter Anwendung einer starken Säure durchgeführt werden, die der resultierenden, protonisierten Aminosäure eine gewisse Lipoid-Löslich-

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keit verleiht» Geeignete starke Säuren für diesen Zweck umfassen aromatische Sulfonsäuren, beispielsweise Niedrigalkylsubstituierte Benzolsulfonsäuren (z.B. p-Toluolsulfonsäure) und naphthalin sulfonsäuren» .

N-blockierende Gruppen, die zum Schutz von Aminogruppen durch Substitution verwendet werden können, können 1- oder 2-wertige geeignete Gruppen sein, die Acylgruppen, beispielsweise Niedrigalkanoyl, wie Acetyl, substituiertes Niedrigalkanoyl, z.B. Niedrig-halogenalkanoyl, wie Chloracetyl, Aryl-niedrigalkanoyl, wie Phenylacetyl, und Aroyl, wie Benzoyl oder Phthaloyl; Niedrigalkoxycarbonylgruppen, wie Äthoxycarbonyl,

Isobutyloxycarbonyl oder t-Butyloxycarbonyl, und substituierte Niedrigalkoxycarbonylgruppen, z.B. Niedrighalogenalkoxycarbonyl, wie 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl; Arylaiedrigalkoxycarbonylgruppen, wie Benzyloxycarbonyl; Sulxonylgruppen, beispielsweise Niedrigalkylsulfonyl, wie Methansulfonyl und Arylsulfonyl, wie Benzolsulfonyl oder p-Toluolsulfonyl; Ylidengruppen, die durch Reaktion mit Aldehyden und Ketonen, die Schiffs-Basen bilden, gebildet werden, beispielsweise Benzaldehyd, Salicylaldehyd oder Acetessigester; und 2-wertige Gruppen, so daß das Stickstoffatom den Teil eines Dihydropyridinrings/bildet, solche Schutzgruppen werden beispielsweise durch Umsetzung mit Formaldehyd und einem ß-Ketoester, z.B. Acetessigester, wie in der BE-PS 771 694 der gleichen Anmelderin beschrieben, erhalten, umfassen.

Im allgemeinen können solche N-blockierenden Gruppen nach ansich bekannten Methoden eingeführt werden, z.B. durch Umsetzung der Aminosäure mit einem Acylhalogenid, wenn eine Acyl-N-Blockierungsgruppe eingeführt werden soll. Die N-blockierende Gruppe wird erstrebenswert bei einem pH-Wert über dem isoelektrischen Punkt der Aminosäure eingebracht, vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 6-10, und die Reaktionstemperatur liegt vorteilhaft vergleichsweise niedrig, um die Zer-

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setzung der- Säure auf ein Minimum zu reduzieren. Andere Gruppen., z.B. Hydroxyl·- oder TM öl gruppen, die in der Aminosäure vorhanden sind, können gegebenenfalls auch vor der extraktiven Veresterung Blockiert werden.

Das bei der extraktiven Veresterung verwendete, mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel sollte im wesentlichen unter den Reaktionsbedingungen inert sein und sollte dazu geeignet sein, mindestens teilweise die veresterte, N-blockierte Aminosäure zu lösen, so daß die Natur des Lösungsmittels von der speziellen, zu extrahierenden N-blockierten Aminosäure abhängt. Im allgemeinen umfassen organische Lösungsmittel, die verwendet werden können, chlorierte Kohlenwasserstoffe, beispielsweise Methylenchlorid, Chloroform oder Chlorbenzol; aliphatische und aromatische Ester, beispielsweise Äthylacetat, Butylacetat oder Äthylbenzoat; mit Wasser nicht mischbare Ketone, beispielsweise Methyl-äthyl-keton oder Methyl-isobutyl-keton; aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, beispielsweise Benzol; und Alkohole, z.B. mit Wasser nicht mischbare niedrige Alkanole, wie n-Butanol. Mischungen der vorstehenden Lösungsmittel können auch verwendet werden.

Die extraktive Veresterung wird zweckmäßig durch Zusatz einer Lösung des Diazoalkans in dem gewählten organischen Lösungsmittel zu der· wäßrigen Lösung bewirkt, die die N-blockierte Aminosäure enthält, da auf diese Weise im wesentlichen eine gleichzeitige Veresterung der N-blockierten. Aminosäure und Extraktion in das organische Lösungsmittel erzielt werden kann, wodurch der Nutzeffekt des Verfahrens erhöht wird. Alternative Zugabemethoden sind möglich, jedoch können geringere Ausbeuten an isoliertem N-blockiertem Aminosäureester auftreten. So kann beispielsweise die wäßrige Lösung zuerst mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel zur Bewirkung einer mindestens teilweisen Extraktion der N-blockierten Aminosäure behandelt werden, wonach das Diazoalkan zugesetzt werden

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kann, um die gewünschte Veresterung zu beschleunigen.

Die extraktive Veresterung der N-blockierten Aminosäure kann, falls gewünscht, in Anwesenheit einer oder mehrerer weiterer Säuren durchgeführt werden. Die Anwesenheit einer starken Säure mit einem pKa-Wert unter dem der N-blockierten Aminosäure, Z₀Bo einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure, Orthophosphorsäure oder Perchlorsäure, kann sich nicht störend auf die extraktive Veresterung auswirken; so neigt das Diazoalkan in vielen Fällen dazu, vorwiegend mit der schwächeren vorhandenen Säure zu reagieren und sie zu verestern, d.h„ vorzugsweise mit der N-blockierten Aminosäure zu reagieren. Die Menge jeder starken, zu dem Reaktionssystem zugesetzten Säure hängt schließlich teilweise von der Stabilität der Komponenten des Systems unter sauren Bedingungen ab; so sollte der pH-Wert der Reaktionslösung bevorzugt nicht unter etwa 1,5 herabgesetzt werden, da Nebenreaktionen, die die Zerstörung des Diazoalkans einbeziehen, bei solchen niedrigen pH-Werten vorwiegen können, und im allgemeinen ist es daher bevorzugt, Lösungen zu verwenden mit einem pH-Wert, der über etwa 1_?7» beispielsweise im Bereich von 2ρ 0-4,0 liegto

Die extraktive Veresterung kann unter bestimmten Umständen in Anwesenheit von Säuren durchgeführt werden, die schwächer sind als die N-blockierte Aminosäure. So kann beispielsweise Penicillin V und N-blockiertes Cephalosporin C selektiv in Anwesenheit der schwächeren' Säuren Phenoxyessigsäure bzw. Essigsäure extraktiv verestert werden. Ohne sich theoretisch festlegen zu wollen wird angenommen, daß die Löslichkeit der N-blockierten Aminosäure in dem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel ein wesentlicher Faktor ist, der zu solchen extraktiven Veresterungen beiträgt, da sich die Veresterungsgeschwindigkeit und die Selektivität des Verfahrens •verbessern, wenn die Löslichkeit der N-blockierten Aminosäure in dem organischen Lösungsmittel ansteigt.

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Es ist überraschend, daß extraktive Veresterungen unter sauren Bedingungen unter Anwendung von Diazoalkan-Veresterungsmitteln erfolgreich durchgeführt werden können, da bekanntlich die Stabilität von Diazoalkanen in saurem Medium vergleichsweise gering

Die Reihenfolge der Zugabe des Diazoalkans, des organischen Lösungsmittels und jeglicher zugesetzten starken Säure zu der wäßrigen N-blockierten ,Aminosäure hängt im allgemeinen von der Natur des Aminosäuresubstrats ab. So ist die Zugabeweise in Fällen., wo die N-blockierte Aminosäure säurestabil ist, nicht kritisch, soll jedoch ein säureempfindliches Substrat, wie Penicillin G oder N-blockiertes Desacetylcephalosporin C extrahiert werden, so ist es erstrebenswert, die starke Säure nach dem Diazoalkan und dem organischen Lösungsmittel zuzusetzen, da gefunden wurde, daß unter solchen Bedingungen die Veresterung der N-blockierten Aminosäure durch Diazoalkan und folglich die Stabilisierung der Aminsäure in Form ihres Esters sehr rasch verläuft., so daß eine minimale säureinduzierte Zersetzung oder hadere Umwandlung der Aminosäure auftritt. Unter Anwendung dieser Zugabeweise können wäßrige Lösungen von säureempfindlichen N-blocklerten Aminosäuren bis zum Zeitpunkt der extraktiven Veresterung dadurch stabilisiert v/erden, daß man den pH-Wert,bei dem die Zerstörung der N-blockierten Aminosäure auf ein Minimum herabgesetzt oder verhindert wird, beibehält, z.E. einen neutralen oder basischen pH-Wert» Die Verminderung des TjH~V;erts durch Ansäuern der Lösung nach der Zugabe des Diazoalkans und des organischen Lösungsmittels erlaubt dann eine rasche Veresterung der N-blockierten Aminosäure durch das Diazoalkan*

In vielen Fällen ist es bevorzugt, einen Überschuß des Diazoalkans bei der extraktiven Veresterung zu verwenden. Die präzise Menge hängt von der Natur des Diazoalkans und der N-blockierten Aminosäure ab. Im kritischen Falle liegt die Menge des erforderlichen Diasoalkans bsi etwa 1,0 bis 1,5 Mol/Äquivalent

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Säure„Ist es so beispielsweise erwünscht, eine dibasische Säure zu extrahieren ₉ z.B. eine Cephalosporindisäure, so ist es zweckmäßig, 2 bis 3 Mol des Diazoalkans, z.B. etwa 2,1 Mol/Mol der basischen Säure zu verwenden«

Das erfindungsgemäße extraktive Veresterungsverfahren kann bei beispielsweise einer Temperatur im Bereich von -10 bis +100⁰C, Z₀B. 0-50⁰C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt werden und überwacht werden durch beispielsweise Messung der Stickstoffentwicklung in dem Reaktionssystem, was eine praktische quantitative Anzeige des Ausmaßes der Zersetzung des Diazoalkans ergibt, oder durch spektroskopische Techniken, z.B. Verfolgen der Bildung von Esterbindungen durch I.R.-Spektroskopie oder der Zersetzung von Diazogruppen, die sich durch einen Verlust der I.R,- und U.V.- oder sichtbaren Absorption ausdrückt.

Nach Vollendung der extraktiven Veresterung kann der N-blockierte Aminosäureester unter Anwendung von beispielsweise üblichen Techniken isoliert werden. So kann das organische Lösungsmittel von der wäßrigen Lösung abgetrennt v/erden, gereinigt werden, z.B. durch Waschen, und das Lösungsmittel zur Bildung des gewünschten Esters verdampft werden. Alternativ kann die organische Lösung einer weiteren Reaktion ohne Abtrennung des N-blockierten Aminosäureesters zwischendurch unterzogen werden. So kann beispielsweise ein extrahierter Penicillinester direkt in sein Sulfoxid durch Anwendung in einer Ringerweiterungsreaktion verwendet werden.

Wie vorstehend aufgezeigt, ist das erfindungsgemäße extraktive Veresterungsverfahren von besonderem Wert bei der Isolierung von natürlich erzeugten Aminosäuren und N-blockierten Aminosäuren, insbesondere Penicillinen und Cephalosporine aus Fermentationsflüssigkeiten. Verbindungen die extraktiv unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens verestert werden können, umfassen ' so natürlich vorkommende Penicilline, wie Penicillin G, Pe-

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niclllin ¥ und deren hydroxylierte und 6 oc-methoxylierte Analoga und natürlich vorkommende Cephalosporine, wie Cephalosporin C, Desacetylcephalosporin C, Besacetoxycephalosporin C, 3-Carbamoyloxymethyl-cephalosporine und 7e*.-methoxylierte Analoga dieser Verbindungen, worin jegliche freien Aminogruppen zuerst blockiert wurden. Das Verfahren kann auch vorteilhaft bei der Isolierung von N~blockierten Aminosäuren, erhalten aus enzymatiashen Reaktionen angewendet werden, beispielsweise von (6R,7R)-3-Acetoxymethyl~7-(4-carboxybutanamido)ceph-3-em-4-carbonsäure, die durch enzymatische Oxidation von Cephalosporin C hergestellt werden kann und bisher etwas schwierig zu isolieren war durch beispielsweise Lösungsmittelextraktion, aufgrund ihrer geringen Löslichkeit in mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln.

Besonders wichtige Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen die extraktive Veresterung von Cephalosporin C und 3-Hydroxymethylcephalosporinen, insbesondere Desacetylcephalosporin C. 3-Hydroxymethyl-cephalosporine sind schweirig nach üblichen Techniken su isolieren aufgrund ihrer ausgeprägten Neigung zur Lactonbildung, insbesondere unter sauren Bedingungen. Im Falle von Desacetyl-cephalosporin C ist das resultierende ' Lacton eine stabile Verbindung mit einer geringen antibiotischen Aktivität und ohne Wert als Ausgangsmaterial für die Herstellung von halbsynthetischen Cephalosproin-antibiotika. Carboxylatsalze von 3-Hydroxymethyl-cephalosporinen sind jedoch im wesentlichen beständig gegen eine derartige Lactonbildung, so daß eine wirksame Isolierung gemäß der vorliegenden Erfindung durch Durchführung der vorhergehenden Behandlungen erzielt werden kann, z.B. N-Blockierung der wäßrigen 3-Hydroxymethylcephalosporinlösung bei basischem pH-Wert, anschließende Zugabe eines Diazoalkans und des mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, gefolgt von einer starken Säure, wie vorstehend beschrieben, um die extraktive Veresterung zu beschleunigen.

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Im Falle der extraktiven Veresterung von Desacetyl-cephalosporin C kann beispielsweise die notwendige N-Blockierung unter basischen Bedingungen beispielsweise durch Umsetzung mit einem geeigneten Acylierungsmittel, Z₀B₀ Benzoylchlorid, oder eines Halogenameisensäurealkylesters,(wie Chlorameisensäureäthylester) in Anwesenheit eines Basenüberschusses,(z.B. eines Alkalimetallhydroxids, wie Natriumhydroxid, oder eines Puffers, wie Kaliumphosphat) durchgeführt werden,, Anschließend kann eine Lösung des Diazoalkans (z.'B„ Diphenyldiazomethan) in einem geeigneten. Lösungsmittel zugefügt werden, falls gewünscht nach Extraktion bei im wesentlichen neutralem pH-Wert (z.Be im Bereich von pH 5-8)j um Nebenprodukte der N-Blockierungsreaktion zu ent~ fernen,und die Lösung angesäuert werden, beispielsweise auf einen pH-Wert im Bereich von 2-4 (z_oB_e im Bereich von etwa pH 5₀5) mit einer starken Söure (z.B. einer Mineralsäure, wie Schwfelsäure oder Orthophosphorsäure), um die extraktive Veresterung zu beschleunigen»

Die wäßrige De-sacetylcephalosporin C-Ausgangslösung bei Extraktionen, wie den vorstehend beschriebenen, ist vorzugsweise im wesentlichen frei von Cepholosporin C₀

Die Fähigkeit,Desacetyl-cephalosporin C in wirksamer und wirtschaftlicher Weise zu extrahieren, ist von beträchtlichem Wert, da typische Cephalosporin C-Fermentationsbrühen, die durch Fermentation von Cephalosporium acremonium erhalten werden, einen beträchtlichen Anteil von Desacetyl-cephalsoproin C enthalten, von dem der Hauptanteil normalerweise bei der Isolierung von Cephalosporin C nach üblichen Techniken verlorengeht. Diese Verschwendung eines potentiell wertvollen Ausgangsmaterials zur Herstellung von halbsynthetischen Cephalosporinen ist selbstverständlich unerwünscht, und es ist ersichtlich, daß beträchtliche wirtschaftliche Vorteile erwachsen, wenn der Desacetyl-cephalsoproin C-Gehalt einer Fermentationsbrühe zusätzlich zu dem Cephalosporin C-Gehalt isoliert wird_o

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Das erfindungsgemäße extraktive Veresterungsverfahren wird in einer- Anzahl von Wegen bei der Behandlung von Cephalosporin-Fermentationsbrühen angewendet, die von dem gewünschten Produkt abhängen. So kann es beispielsweise zweckmäßig sein, zuerst die Brühe, falls gewünscht, nach vorhergehender Behandlung, wie Filtration, mit einer Esterase zu behandeln, die dazu dient, den Cephalosporin C-Gehalt der Brühe zu desacetylieren, vorzugsweise einer Esterase_f die durch Kultivieren eines Hefemikroorganismus oder einer Mutante davon des Stamms Rhodotorula* z.B₀ eines Mikroorganimus der Species Rhodotorula rubra, erseugt wird, und darauf das Reaktionsprodukt einer N-Blockierungsreairfcion (z.B. durch Behandlung mit Benzoylchlorid oder Clilorameisensäureäthylester unter basischen Bedingungen) und einer extraktiven Veresterung unter Bildung eines im wesentlichen reinen N-blockierten Desacetyl-cephalosproin C-Esterderivats zu miterziehen» Alternativ können der Cephalosporin C- und Desacetyl-cephalosporiii C-Gehalt einer Brühe zuerst einer N-Blockierungsreaktion und extraktiven Veresterung unter Bildung einer Mischung von N-blockierten Cephalosporin C- und Desacetyl-cephalosporin C-Esteraerivaten unterzogen werden, die anschließend mit einem Acetylierungsmittel (z.B. Acetylchlorid) zur Acetylierung des N-blockierten Desacetyl-Cephalosporin C-Estergehalts der Mischung behandelt werden, wobei man ein Produkt erhält, das ein im wesentlichen reines N-blockiertes Cephalosporin C-Esterderivat enthält.

Die als Veresterungsmittel beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Diazoalkane können zweckmäßig,wie in der BE-PS 802 112 der gleichen&sael&erin beschrieben, durch Oxydation des entsprechenden Hydrazons unter Verwendung einer organischen Persäure, Perjodsäure, einer hypohalogenigen Säure (unterhalogenigen Säure) oder Hypohalogenidsalzes oder -esteis^ Chromsäure, Chlor, Brom oder einer Quelle für positives 'Halogen, wie einem N-Halogenamid oder -imid hergestellt werden» Peressigsäure ist für diesen Zweck ein besonders bevorzugtes Oxydationsmittel.

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Die Oxydation wird vorzugsweise in Anwesenheit einer Base und vorteilhaft auch eines Oxydationskatalysators, z.B. Jod, durchgeführt»

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken. Alle Temperaturen sind in ⁰C angegeben.

Beispiel 1

(6R _?7R)-7~(R-5"Benzoylamino-5-carboxyOentanamido)-5-hydroxymethylceph~3-em-4-carbonsäure-bis-diphenvlmethyl-ester

Zu einer Lösung von 6,0 g(10 mMol, 70% Reinheit) Kalium-(6R,7R)-(R-5-aminoe' 5-carboxypentahamido) -3~hydroxymethylceph-3-em-4-carboxylat Jn 150ml Wasser würfe eine Mischung von 3,5 ml (30 mMol) Benzoylchlorid und 5 ml Aceton gefügt. Die Mischung wurde 1,5 Std. bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH-Wert bei 8,5 durch Zugabe von 50% Kaliumphosphat gehalten wurde. Der pH-Wert wurde mit Orthophosphorsäure auf 5,0 eingestellt, und die Lösung wurde mit 100 ml Chloroform extrahiert, um Benzoesäure und Benzoylchlorid zu entfernen. 90 ml Äthylacetat, die 5 g (26 mMol) Diphenyldiazomethan enthielten, 50 ml Dichlormethan und 10 ml Äthanol wurden zu. der wäßrigen Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde 45· Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 gehalten wurdet'

Nach dem Abtrennen wurde die Lösungsmittelschicht mit 100 ml 5% Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und die gummiartige Masse wurde in 25 ml Isopropanol bei 30° gelöst. 10 ml Petroläther (Kp. 30-40°) wurden zugefügt, und die Lösung wurde auf -5^Ό gekühlt. Das Produkt wurde mit 15 ml Petroläther gewaschen' und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei man 10,5 g der Titelverbindung erhielt»

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Die Dünns chi ciitchromato graphie an Siliciumdioxidgel GF254-Plattsn unter Verwendung von Chloroform:Acetonι Essigsäure (80:20:1) als Lösungsmittel zsigte an, daß das Produkt hauptsächlich die Titelverbindung mit Spuren von Verunreinigungen war.

Beispiel 2.

■ Diphenvlmethyl- (3S, 5R, 6R) -2,2-dimethyl-6-phenp3cyacetamido-P enam- 5.-.C ar b oxy 1 a t-1 - oxi d

Zn einer Lösung von 7,8 g (20 mMol) Kalium-(3S,5R,6R)-2,2-di>_~~ methyl-6-phenoxyacetamidopenam-3-carboxylat in 100 ml Wasser wurde eine Lösung von 4 g (20 mMol) Diphenyldiazomethan in 75 ml Dichlormethan gefügt. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 10° gerührt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von Orthophosphorsäure auf 3,5 eingestellt wurde. Die Lösung wurde getrennt und die Lösungsmittelschicht mit 100 ml Wasser, 100 ml 5^iger Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. 18,5 ml (37% Gew/Vol) Peressigsäure wurden zu dem Lösungsmittel während 15 Minuten bei 10° gefügt, und es wurde 30 weitere Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde mit 100 ml Wasser, 100 ml 5^iger Natriumbicarbonslösung und 100 ml Wasser gewaschen. Das . Lösungsmittel wurde, im Vakuum entfernt, und die Titelverbindung (9,1g) wurde aus heißem Isopropanol kristallisiert.

Die JCR - und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 3

(6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(R-^-benzoylamino-S-carboxypentanarnido)-ceph-3-em-4-carbonsäure-bis-diphenylmethylestere

Zu einer Lösung von 4,8 g (10 mMol) (6R,7R)-3-Acetonmethyl-7-(R-5-benzo3^1amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure in 100 ml V/asser wurde eine Lösung von 4 g (20 mMol) Diphenyldiazomethan in 75 ml Dichlormethan, 25 ml Äthylacetat und 10 ml Äthanol zugefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtempe-

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ratur gerührt, wobei der pH- Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Nach Trennung wurde das Lösungsmittel mit 100 ml 5^iger Natriumbicarbonatlösung und mit 100 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40-60°) behandelt, wobei man 6,0 g der Titelverbindung erhielt.

Die ;" IR" - und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 4

(6R₉7R)~7-(R-5-Carboxv-5-isobutyloxvcarbonvlaminopentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure-bis-diphenylmethylester

50 ml (375 mMol) Chlorameisensäureisobutylester wurden während einer Stunde zu einer Lösung von 34,4 g (60 mMol) Kalium-(6R, 7R)-7-(R-5-amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonxylat in 350 ml" Wasser bei pH-Wert 7,8-8,0 und 5° gefügt. Die Mischung wurde weitere 30 Minuten gerührt, wobei die Temperatur von 5° und der pH-Wert von 7,8 bis 8,0 beibehalten wurden. Die Lösung wurde mit 250 ml Chloroform bei pH 5,0 extrahiert. Eine Lösung von 25 g (126 mMolj Diphenyldiazomethan in 250 ml Dichlormethan, 100 ml Äthylacetat und 30 ml Äthanol wurden zu der wäßrigen Lösung gefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 15°C gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 2 χ 100 ml 5%igein Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40-60°) unter Bildung von 45,5g der Titelverbindung behandelt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

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Beispiel 5

(SR, TR)-?-(R-5-Benzolsulfonylamino-5-carboxypentanamido)- ^-hydroxyinethvlceph--3-eni--4--carbonsäure--Ms~diphenvlmethylester

Zu einer Lösung von 4,1 g (10 mMol) Kalium-(6R,7R)-7-(R-5~amino-5-carboxypentanamido )-3-hydroxymethylceph--3-em-4-carboxylat in 100 ml Wasser, das 9 g Natriurabicarbonat enthielt, wurde eine Lösung von 2 ml (15,7 mMol) Benzolsulfonylchlorid in 15 ml Aceton während 30 Minuten gefügt. Die Reaktionstemperatur (10°) und der pH-Wert (7,8-8,0) der Lösung wurden weitere 90 Minuten beibehalten. Die Lösung wurde mit 2 χ 100 ml Chloroform bei pH-Wert 5,0 extrahiert. Eine Lösung von 6,0g (30 mMol) Diphenyldiazomethan in 80 ml Dichlormethan, 150 ml Äthylacetat und 20 ml Äthanol wurdsizu der wäßrigen Lösung gefügt, und die Mischung wurde 30 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt würde. Nach der Abtrennung wurde das Lösungsmittel mit 2 χ 100 ml 5%iger Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40-60°) unter Bildung von 5,8 g der Titelverbindung behandelt.

Das Dünnschichtehromatogramm und die IR-Daten zeigten an, daß die Struktur die der Titelverbindung war.

Beispiel 6 Diphenylmethyl- (6R_t 7R)»5-hycLroxymethyl-7" (thien~2-ylacetamido )■

ceph-3-em-4-carboxylat

^hydroxymethyl-Zu einer Lösung von 4,0 g (10 mMol) Kalium-(6R,7R)-Jf^thien-2-

ylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat ¹In 100 ml Wasser wurde eine Lösung von 2,0 g (10 mMol) Diphenyldiazomethan in 75 ml Dichlormethan und 10 ml Äthanol gefügt₀ Die Mischung wurde 25 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 100 ml Wasser, 2 χ 100 ml 5%iger Natriumbicarbonatlösung

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und 100 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40-60°) unter Bildung von 5,15 g der Titelverbindung behandelt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 7

(6R,7R)-5-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-emcarbonsäure-bis-diphenylmethyl-ester

Zu einer Aufschlämmung von 0,24 g (0,575 mMol) (6R,7R)-3-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure wurden 0?3 g (1»5 mMol) Dipheny!diazomethan in 15 ml Dichlormethan gefügt® Die Mischung wurde 15 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophsophorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Die Mischung wurde anschließend weitere 75 Minuten bei Raumtemperatur gerührt» Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 2 χ 25 ml 5%iger Natriumbicarbonatlösung und 25 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die. gummiartige Masse mit Petroläther (40-60°) unter Bildung von O₅38 g der Titelverbindung behandelt.

Die IR- und NMR-Daten brstätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 8

(6R,7R)-7-(R-5-Isobutyloxycarbonylamino-5-carboxypentanamido)-3~hvdroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure-bis-phenyl-(o-tolyl)-methyl-ester

Zu einer Lösung von 11,2 g (20 mMol,' 67,1% Reinheit) Kalium-(6Rs,7R)-7-(R.-5-amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-." - 3-em-4-carboxylat in 100 ml Wasser wurden 16 ml (120 mMol)

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Chlorameisensäureisobutylester während 1 Std. bei 10° und pH-Wert 7,8-8,0 gefügt. Die Mischung wurde weitere 30 Minuten gerührt, wobei derpH-Wert bei 7,8-8,0 gehalten wurde. Der pH-Wert wurde mit Orthophosphorsäure auf 5,0 eingestellt, und es wurde mit 2 χ 100 ml Chloroform extrahiert. Eine Lösung von 4,2 g (40 mMol)(o-Tolyl)-phenyldiazomethan in einer Mischung von 120 ml Dichlormethan, 60 ml Äthylacetat und 20 ml Äthanol wurde zu der wäßrigen Lösung gefügt. Die Mischung wurde 45 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf •2,0 eingestellt wurde. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 100 ml V/asser, 2 χ 100 ml 5%iger Natriumbicarbonatlösung und 100 ml V/asser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40-60°) unter Bildung von 16,9 g der Titelverbindung behandelt.

Beispiel 9

(6R, 7R)-7-/R-5-Carboxy-5- ( 3,5-diäthoxycarbonvl-2 , 6-dimethyl- 1,4-dihydropyridin-i-yl)-pentanamido7-3-hvdroxymethylceph-3- em-4-carbonsäure~bis-diphenylmethyl-ester

Zu einer Lösung von 12 g (20.mMol, 70^ Reinheit) Kalium-(6R,7R)-7-(R-5-amino-5~carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carboxylat wurden 18,7 ml (249 mMol) 37%ige Formaldehydlösung und 25,2 ml (199 mMol) Acetessigsäureäthylester getrennt während 1 Std_o bei 5° gefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von 25#lger Kaliumphosphatlösung auf 7,0 gehalten. Nach weiteren 30 Minuten Rühren wurde die Lösung mit 200 ml Dichlormethan extrahiert. 150 ml Dichlormethan, die 10 g (52 mMol) Diphenyldiazomethan enthielten, wurden zu der wäßrigen Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde 45 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Nach der Abtrennung wurde die Lösungsmittelschicht mit 200 ml Wasser, 200 ml 5/^iger Natriumbic arbonat lösung und 200 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Magnesiumsulfat wurde die Lösung im Vakuum auf ein Volumen von 75 ml konzentriert, wobei man

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eine Lösung der Titelverbindung erhielt.

Beispiel 10

(SR,75)-7-(R-S-Benzyloxvcarbonylamino-^-carboxypentanamido)- 3-carbamoyloxymethvl-7-methoxyceph-3-em-4-carbonsäuΓe-bis- diphenylmethyl-ester

3,5 ml Chlorameisensäurebenzylester wurden während 1 Std. zu einer gerührten Lösung von 4 g (etwa 5% Reinheit) des Monoammoniumsalzes von (6R,7S)-7-(R-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-carbamoyloxymethyl-7-niethoxyceph-3-em-4-carbonsäure in 80 ml Wasser, die 6 g Natriumbicarbonat enthielten, bei 10° gefügt. Der pH-Wert wurde die ganze Zeit durch Zugabe von 1 n-Natriumhydroxid auf 7,8-8 gehalten. Die Mischung wurde bei 10° und pH 7,8-8 während weiterer 90 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde mit Orthophosphorsäure auf 5 eingestellt, und die Lösung wurde mit 2 χ 100 ml Chloroform gewaschen. Zu der wäßrigen Phase wurden 50 ml Äthylacetat,und 10 ml Äthanol sowie eine Lösung von Diphenyldiazomethan in Methylenchlorid (50 ml, etwa 0,2 m) gefügt. Die Mischung wurde bei 15° 45 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2 eingestellt wurde. Nach der Trennung wurde die organische Phase mit 2 χ 75 ml 5?oiger wäßri-ger Natriumbicarbonatlösung und mit 100 ml Wasser gewaschen, getrocknet,(in Na₂SO^) und zu 2,9 g einer gummiartigen Masse verdampft. Durch Reinigung durch Säulenchromatographie (Siliciumdioxidgel; Äthylacetat und Chloroform), gefolgt von präparativer Dünnschichtchromatographie (Siliciumdioxidgel; Chloroform und Methanol) erhielt man 260 mg der Titelverbindung in Form eines weißen Schaums. Die IR-, NMR-, UV- und Mikroanalysendaten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

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Beispiel 11

(6R_f7S)-7-/R-5-Carboxy-5-(2,2_t2-trichloräthoxvcarbonvlamino)-pentanamido7-3~cart)amovloxvniethvl--7-methoxvceph--3-em~4--car]3on·- säure-bis-dipheny!methyl-ester

3 ml 2,2,2-Trichloräthylchlorameisensäureester wurden während 1 Std. zu einer gerührten Lösung von 4 g (etwa 5% Reinheit) des Monoammoniumsalzes von (6R,7S)-7-(R-5-Amino-5-carboxypentanamido )-3- (carbamoyloxymethyl-7-methoxyceph-3-ein-4~carbonsäure in 80 ml Wasser, die 6 g Natriumbicarbonat enthielten, bei 10° gefügt. Der pH-Wert wurde die ganze Zeit durch Zugabe von 1 n-Natriumhydroxyd bei 7,8-8 gehalten. Die Mischung wurde bei 10° und pH 7,8-8 während weiterer 90 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde mit Orthophosphorsäure auf 5 eingestellt, und die Lösung wurde mit 2 χ 100 ml Chloroform gewaschen. Zu der wäßrigen Phase wurden 50 ml Äthylacetat, 10 ml Äthanol und eine Lösung von Diphenyldiazomethan in Methylenchlorid (50 ml, etwa 0,2 m) gefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 15° gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2 eingestellt wurde, Nach der Trennung wurde die organische Schicht mit 2 χ 80 ml 5/oiger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und mit 100 solV/asser gewaschen, getrocknet (Na^SO^) und verdampft, wobei man 2,8 g einer gummiartigen Masse erhielt. Durch Reinigung durch SäulenchroKiatrographie (Siliciumdioxidgel; Chloroform und Äthylacetat), gefolgt von präparativer Dünnschichtchromatographie (Siliciumdioxidgel; Chloroform und Methanol) erhielt man 410 mg der Titelverbindung in Form eines weißen Schaums. Die IR-, NMR-, UV- und Mikroanalysendaten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 12

(6R_r7S)-7-(R-5-3enzoylamino-5-carboxypentanamido)-3-carbamoyloxvmethyl-7-methoxyceph-3-em-4-carbonsäure-bis-diphenylmethyle.ster.

Eine Lösung von 5 g (etwa 0,85 mMol, etwa 8% Reinheit) des

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Monoammoiniumsalzes von (6R,7S)-7-(R-5~Amino-5-carboxypentanamido)-3-carbaruoyloxymethyl-7-methoxyceph-3-em-4-carbonsäure in 100 ml Wasser wurde mit 50%iger Kaliumphosphatlösung auf den pH-Wert 8,3 eingestellt. Eine Lösung von 3m 1 (26 mMol) Benzoylchlorid in 5 ml Aceton wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 1,5 Std. bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 50%igem Kaliumphosphat auf 8,3 gehalten wurde. Der . pH-Wert wurde mit Phosphorsäure auf 5 eingestellt, und die Lösung wurde mit 100 ml Chloroform gewaschen. Zu der wäßrigen Phase wurden 90 ml Äthylacetat, 10 ml Äthanol und eine Lösung von Diphenyldiazomethan in Methylenchlorid (50 ml, etwa 0,2 m) gefügt. Die Mischung wurde 45 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2 eingestellt wurde. Nach dem Abtrennen wurde die organische Schicht mit 100 ml 5%iger wäßriger NatriumbicarbonatlÖsung und 100 ml Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO^) und zu 2,6 g einer gummiartigen Masse verdampft. Durch Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie (Siliziumdioxidgel; Chloroform und Äthylacetat) erhielt man 554 mg der Tite!verbindung als weißen Schaum. Die IR-, NMR-, UV- und Mikroanalysendaten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 13

(6R,7R)-7-/R-5-Carboxv-5-( 2, Z,Z- trichloräthoxycarbonylamino pentanamido7'-3-hydroxvmethylceph-3-em-4-carbonsäure-bis-di- phenylmethyl-ester.

5 ml (37 mMol) 2,2,2-Trichloräthylchlorämiei^ensäureester wurden zu einer Lösung von 20 mMol Kalium-(6R,7R)-7-(R-5-amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carboxylat in 100 ml Wasser gefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde 30 Minuten · unter Verwendung von 10%iger (Gew/Vol) Natriumhydroxidlösung auf 7,5-8,0 gehalten. Die Lösung wurde anschließend mit 50 ml Dißhlormethan bei pH 5,0 extrahiert. Eine Lösung von 8,5 g - (44 mMol) Diphenyldiazomethan in 150 ml Di chlorine than wurde zu

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wäßrigen Phase gefügt, und der pH-Wert wurde unter Verwendung von 10biger (Vol/Vol) Schwefelsäure während 15 Minuten auf 3,5 eingestellt. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 3 x 150 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei man 20,5 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 14,.

(6R,7R)-7-/R-5-Carboxy-5-(2,2,2-trichloräthoxvcarbonvlamino)- _rpentanamido7~3-hydroxymethvlceph-^-em"4-oarbonsäure~bis- naphthylphenylmethyl-ester

Das Verfahren von Beispiel 13 wurde wiederholt, wobei jedoch eine Lösung von etwa 44 mMol Naphthylphenyldiazomethan in 150 ml Dichlormethan anstelle der Lösung von Diphenyldiazomethan in Dichlormethan verwendet wurde, wobei man 23»3 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der TitelverbindungV ' ' .,..„....-, ,„ .. .

Beispiel 15

(6R,7R)-7-/R-S-CaTbOXV-5-C 2₁2,2-trichloräthoxvcarbonvlamino)-pentanamido7-3-hvdroxvmethylceph-3-em-4~carbonsäure-bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ester

Das Verfahren von Beispiel 13 wurde wiederholt, wobei jedoch eine Lösung von etwa 44' mMol (p-Methoxyphenyl)-phenyldiazomethan in 150 ml Dichlormethan anstelle der Lösung von Diphenyldiazomethan in Dichlormethan verwendet wurde, wobei man 6,4 g der Titelverbindung erhielt.

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Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der TitelverMndung.

Beispiel 16

(6R_t7R)-7-^R-5-Carboxy-5-(2,2,2-trichloräthoxvcarbonvlamino)~ pentanamido7~3-hydroxvmethylceph-3-em--A—carbonsäure-bis-1-phenyläthyl-ester

Das Verfahren von Beispiel 13 wurde wiederholt, wobei jedoch . eine Lösung von etwa 44 mMol 1-Phenyldiazoäthan in 150 ml Dichlormethan anstelle der Lösung von Diphenyldiazomethan in Dichlormethan verwendet wurde, wobei man 18,6 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 17

(6R_?7R)-7-.(R-5-Carboyy-5-äthoxvcarbonylaminopentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure-bis-diphenylmethylester

Das Verfahren von Beispiel 13 wurde wiederholt, wobei jedoch 5 ml (52 mMol) Chlorameisensäureäthylester anstelle des Chlorameisensäure-2,2,2-trichloräthylesters verwendet wurden, wobei man 15,7 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 18

Diphenvlmethyl-(6R,7R)-3-acetoxymethyl-7-(thien-2-ylacetamido)-■ceph-3-em-4-carboxylat

Zu einer Lösung von 4,2 g (10 mMol) Natrium-(6R,7R)-3-acetoxy-

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methyl-7-(thien-2~ylacetamido)-ceph-3-em-4-carboxylat in 50 ml Wasser wurden 30 ml Dichlormethan gefügt, die 2,1 g (HmMoI) Diphenyldiazomethan enthielten. Der pH-Wert der Lösung wurde während 15 Minuten unter Verwendung von 1Obiger (Vol/Vol) Schwefelsäure auf 3,0 eingestellt. Die Mischung wurde getrennt und die Lösungsmittelphase mit 4 χ 50 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei man 6,96 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 19

Dipheny!methyl-(5R?6r)-2,ff-dimethyl^-phenoxyacetamidopenam-3-carboxylat

Zu einer Lösung von 10 g (25,7 mMol) Kalium-(5R,6R)-2,2-dimethyl-e-phenoxyacetamidopenam-S-carboxylat und 2 g (13,1 mMol) Phenoxyessigsäure in 100 ml Wasser wurde eine Lösung von 5,2 g (27 mMol) Diphenyldiazomethan in 100 ml Dichlormethan gefügt. Der pH-Wert wurde auf 4,0 eingestellt, und die Lösung wurde 10 Minuten gerührt. Nach dem Trennen wurde das Lösungsmittel mit 100 ml Wasser, 100 ml 5%iger (Gew/Vol) Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei man 11,4 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung, die lediglich 30% der Ausgangs-Phenoxyessigsäure als Verunreinigung enthielt.

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2^36772

Beispiel 20

N- ( 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl) -glutaminsäure-bis-diphenylmethyl-ester

5,5 ml (40 mMol) 2,2,2-Trichloräthylchlorameisensäureester wurden zu einer Lösung von 3»38g (20 mMol) DL-Glutaminsäure in 100 ml Wasser gefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde 30 Minuten unter Verwendung von 10%iger (Gew/Vol) Natriumhydroxydlösung auf 7,5-8,0 gehalten. Die Lösung wurde anschließend mit 2 χ 100 ml Dichlormethan bei pH-Wert 5,0 extrahiert. Eine Lösung von 85 g ('44 mMol) Diphenyldiazomethan in 140 ml Dichlormethan wurde zu der wäßrigen Phase gefügt und der pH-Wert unter Verwendung von 10Soiger (Vol/Vol) Schwefelsäure während 15 Minuten auf 2,0 eingestellt. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 3 x 150 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im 'Vakuum entfernt, wobei man 14,3 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 21 N-Benzvloxycarbonyiglvcin-bis-dipnenvlmethyl-ester

Eine Lösung von 2,1 g (11 mMol) Diphenyldiazomethan in 32 ml Dichlormethan wurde zu einer Lösung von 2,1 g (10. mMol) N-Benzyloxycarbonylglycin in 50 ml Wasser gefügt. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 1Obiger (Vol/Vol) Schwefelsäure während 15 Minuten auf 3,5 eingestellt. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 3 x 50 ml Wasser gewaschen und anschließend im Vakuum entfernt. Das Produkt wurde anschließend durch Zusatz vontiberscMissigem. Äther ausgefällt. Der Nieder- · schlag wurde filtriert und mit 15 ml Äther gewaschen, wobei man 3,4 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindungο

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Beispiel 22

N-(2,2 _r 2-Trichloräthoxycarbonyl)-glutathion-bis-diphenylmethylester

Das Verfahren von Beispiel 13 wurde wiederholt, wobei jedoch 6,14 g (20 mMol) Glutathion anstelle von Kalium-(6R,7R)-7-(R-5-amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3™em-4-carboxylat behandelt wurden, wobei man 11,3 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 23 DL~Methionin-diphenylmethylester-p-toluol-sulfonsäuresalz

3,0 g (20 mMol) DL-Methionin und 3,8 g (20 iiiMol) p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat wurden in 50 ml Wasser bei Raumtemperatur gelöst. 50 ml Dichlormethan, die 4,85 g (25 mMol) Diphenyldiazomethan enthielten, wurden zugesetzt, und die Mischung wurde 1 Std. beim pH-Wert 2 gerührt. Nach der Trennung wurde die Losungsmittelschicht mit 50 ml 5%iger Natriumbicarbonatlösung . , und 50 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und das Produkt aus Acetonitril kristallisiert_o Durch Filtrieren und Waschen mit 15 ml Acetonitril erhielt man 5,4 g der Titelverbindung.

Der Schmelzpunkt und die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

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Beispiel 24

Dipheny!methyl- ( 6R, 7R) -T-amino-3-acet oxymethylceph/-3-em-4-carboxylat-hydrochlorid

4,2 ml'(31 mMol) 2,2,2~Trichloräthyl-chlorameisensäureester wurden zu 100 ml einer wässrigen Lösung gefügt, die die Kaliumsalze von (6R,7R)-7-(R-5-Aminö-5-carboxypentanamido)-3-acetoxymethylceph-3-em-4-carbonsäure (1OmMoI) und (6R.,7R)-7-(R-5-Amino~5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph~3-em-4-carbonsäure (10 mMol) enthielt.

Der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung einer 10 9i-igen (Gew.-Vol.) Uatriumhydroxidlösung eine Stunde bei 7,5-8,0 genalten. Die Lösung wurde-anschließend mit 50 ml Dichlonnethan bei pH-Wert 5,0 extrahiert. Eine Lösung γοη 8,5 g (44 mMol) Diphenyldiazomethan in 150 ml Dichlormethan wurde zu der wässrigen Phase gefügt und der pH-¥ert unter Verwendung von 10 $ (Vol./Vol.) Schwefelsäure während 30 Minuten auf 3,5 eingestellt, nach Abtrennung wurde das Lösungsmittel mit 3 χ 150 ml Wasser gewaschen und mit 10g wasserfreiem Magnesiumsulfat gerührt. ITa ch dem Ab filtrieren des Feststoffes wurde die Lösung durch Destillation im Vakuum auf 50 ml konzentriert. 4,3 ml (60 mMol) Acetylchlorid und 4,8 ml (60 mMol) Pyridin wurden zu der Lösung gefügt, wobei gekühlt wurde, um die Temperatur auf 5-10° zu halten. Nach 30-minütigem Rühren wurde die Lösung filtriert und zu einer Aufschlämmung von 9,0g (43 mMol) Phosphorpentachlorid und 3,5 ml (43 mMol) Pyridin in 40 ml Dichlormethan gefügt. Während der Zugabe wurde die Temperatur auf -5° gehalten. Die Mischung wurde 50 Minuten gerührt, wobei die Temperatur zwischen 0 und 5° gehalten wurde. Each dem Kühlen auf -10° wurden 40 ml Methanol zugesetzt und es wurde weitere 15 Minuten gerührt. 40 ml Wasser und 250 ml Diisopropyläther wurden anschließend zugefügt und das Produkt eine Stunde kristallisieren gelassen.

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Das Produkt \-/urde filtriert mit 100 ml einer Mischung von Methanol und Diisopropylätlier (30:70) gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 7,8 g der lite!verbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der üütelverbindung.

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Claims (11)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Extraktion einer N-blockierten Aminosäure
aus einer wäßrigen Lösung davon, dadurch gekennzeichnet,
daß man die.Lösung mit einem Diazoalkan in Anwesenheit
eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels behandelt, wobei eine Lösung eines Esters der N-blockierten Aminosäure in dem organischen Lösungsmittel erzeugt wird»

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Diazoalkan derart gewählt wird, daß die in die N-blockierte Aminosäure eingebrachte Estergruppe eine Aralkylgruppe ist, die eine Niedrigalkylgruppe umfaßt, die einen
oder zwei carbocyclische oder heterocyclische Arylsubstituenten in der 1-Stellung aufweist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aralkylgruppe eine Diphenylmethylgruppe ist.

4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich die N-blockiarte Aminosäure aus einer Fermentationsbrühe ableitet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die N-blockierte Aminosäure eine natürlich vorkommende Penicillin- oder Cephalosporinverbindung ist, in der freie Amino-, gruppen blockiert wurden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die N-blockierte Aminosäure ein N-blockiertes Derivat von
Desacetyl-cephalosporin C ist.

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7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die N-blockierte Aminosäure eine Mischung von N-t>lockierten Derivaten von Cephalosporin C und Desacetyl C ist.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die N-blockierte Aminosäure ein N-blockiertes Derivat von Glutathion ist.

9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Diazoalkan in Lösung in dem organischen Lösungsmittel zu der wäßrigen Lösung der N-blockierten Aminosäure gefügt wird.

10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die extraktive Veresterung durch Vermindern des pH-V/erts einer neutralen oder basischen Lösung der N-blockierten Aminosäure unter Verwendung einer starken Säure mit einem pKa-Wert, der unter dem der N-blockierten Aminosäure liegt, nach Zugabe des Diazoalkans und des mit V/asser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels durchgeführt wird.

11. Ester von N-blockierten Aminosäuren, hergestellt durch eines der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10„

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