DE2436772C2

DE2436772C2 - Verfahren zur Extraktion von N-blockierten Cephalosporin- oder Penicillinverbindungen aus deren wäßrigen Lösungen

Info

Publication number: DE2436772C2
Application number: DE2436772A
Authority: DE
Inventors: Colin Grange-Over-Sands Lancashire Robinson; Derek Windermere Westmorland Walker
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1973-08-01
Filing date: 1974-07-31
Publication date: 1986-03-06
Also published as: FR2239473B1; BE818367A; CA1031769A; NL7410293A; JPS5076003A; AU7188074A; ES428799A1; GB1479141A; ATA628374A; SU578863A3; IE39650L; AT335606B; IE39650B1; FR2239473A1; CH614924A5; SE7409886L; ZA744905B; JPS5829299B2; DK408674A; HU173065B

Description

CN₂

worin R¹ und R² gleich oder verschieden sind und eine gewünschtenfalls durch ein oder mehrere Halogenatome, Cyan-, Nitro-, Alkyl-, Alkylsulfonyl- oder Alkoxygruppen substituierte carbocyclische Arylgruppe bedeuten und R¹ auch ein Wasserstoffatom sein kann, umsetzt und die erhaltene Lösung des entsprechenden Esters der N-blockierten Cephalosporin- oder Penicillinverbindung in dem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel von der wäßrigen Phase abtrennt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ und R² Phenylgruppen sind.

3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich die wäßrige Ausgangslösung aus einer Fermentationsbrühe ableitet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die natürlich vorkommende Cephalosporinverbindung, deren freie Aminogruppe blokkiert ist, ein N-blockiertes Derivat von Desacetylcephalosporin C ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die natürlich vorkommende Cephalosporinverbindung, deren freie Aminogruppe blokkiert ist, eine Mischung von N-blockierten Derivaten von Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C ist.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Diazoalkan in Lösung in dem organischen Lösungsmittel zu der wäßrigen Ausgangslösung zugefügt wird.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die extraktive Veresterung durch Verminderung des pH-Wertes einer neutralen oder basischen Lösung der wäßrigen Ausgangslösung unter Verwendung einer starken Säure mit einem pKa-Wert, der unter dem der natürlich vorkommenden Cephalosporinverbindung oder der natürlich vorkommenden Penicillinverbindung, deren freie Aminogruppe in üblicher Weise blockiert ist, liegt, nach Zugabe des Diazoalkans und des mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von N-blockierten Cephalosporin- oder Penicillinverbindungen aus deren wäßrigen Lösungen, insbesondere aus Fermentationsbrüher. bzw. Fermentationsbouillons. Es ist häufig erforderlich. Aminosäuren und N-blokkierte Aminosäuren aus wäßrigen Lösungen, beispielsweise aus Fermentationsflüssigkeiten und Fermenter-Abfällen oder aus Lösungen von durch die Einwirkung von Enzymen modifizierten Substraten zu isolieren. Solche Isolierungen werden häufig durch beispielsweise die vergleichsweise Instabilität von vielen natürlich produzierten N-b!ockierten Aminosäuren in wäßrigen Medien und die Tatsache, daß die meisten Fermentationsund Enzymreaktionen das gewünschte Produkt lediglich in verdünnter Lösung ergeben, kompliziert, so daß komplexe und teure Isolierungstechniken häufig notwendig sind.

So ist beispielsweise Penicillin G [(3S, 5R, 6R)-2,2-Dimethyl-e-phenylacetamidopenam-S-carbonsäure] in Form der freien Säure instabil, insbesondere in wäßrigen Systemen, und erfordert so spezielle Techniken zu seiner wirksamen Isolierung aus Fermentationsbrühen. Diese Techniken können beispielsweise eine rasche Exifaktion, gefolgt von selektiven und recht kostspieligen Reinigungsschritten zur Isolierung eines annehmbar reinen Penicillin G-Produkts (z. B. eines Salzes) mit größerer Stabilität als die freie Säure, einbeziehen. Alternativ kann das Penicillin G durch Sulfoxidieren und Abtrennen des resultierenden Penicillin G-Sulfoxids isoliert werden. Es ist ähnlich schwierig, Cephalosporin C [(R6, 7R)-3-AcetoxymethyI-7-(R-5-amino-5carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure] aus Fermentationsbrühen abzutrennen wegen seiner amphoteren Struktur und hydrophilen Natur. Die Isolierung von von der Fermentation stammenden 3-Hydroxymethyl-cephalosporinen, wie Desacetylcephalosporin C [(6R, 7R)-7-(R-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethyl-
ceph-3-em-4-carbonsäure] kann in gleicher Weise Probleme verursachen aufgrund der ausgeprägten Neigung solcher Verbindungen, die Lactonbildung durch Reaktion der Hydroxygruppe in der Seitenkette in der 3-Stellung mit der 4-Carboxygruppe einzugehen.

Beispiele für Techniken, die zur Isolierung solcher N-blockierter Aminosäuren verwendet wurden, sind die Verwendung von Ionenaustauscherharzen und Lösungsmittelextraktionen. Die erstgenannte Technik ist jedoch etwas umständlich und teuer bei der Behandlung von verdünnten Lösungen in industriellem Maßstab; die letztgenannte Technik weist den Nachteil auf, daß die zu isolierende Säure häufig eine relativ geringe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln besitzt, so daß die Lösungsmittelanforderungen und somit die Arbeitskosten sehr hoch werden können.

Es wurde nun jedoch gefunden, daß eine wirksame Abtrennung von N-blockierten Cephalosporin- oder Penicillinverbindungen aus ihren wäßrigen Lösungen in besonders einfacher Weise durch ein Verfahren erzielt werden kann, bei dem die Säure einer im wesentlichen gleichzeitigen Veresterung und Lösungsmittelextraktion durch Umsetzung mit einem Diazoalkan in Anwesenheit eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels unterzogen wird; derartige Verfahren werden im folgenden als extraktive Veresterung bezeichnet.

Veresterungsreaktionen unter Anwendung von Diazoalkanen in teilweise wäßrigen Medien wurden bisher nicht beschrieben. Die Tatsache, daß derartige Reaktionen glatt und wirksam verlaufen, ist überraschend, da anzunehmen wäre, daß andere vorhandene Substanzen, die alkyliert werden können, z. B. Wasser, mit der Car-

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boxylgruppe der N-blockierten Aminosäure bei der Reaktion mit dem Diazoalkan in Konkurrenz treten könnten. Eine solche Wechselwirkung scheint jedoch im allgemeinen beim erfindungsgemäßen Extraktions-Vercstcrungsverfahren minimal zu sein.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Extraktion von natürlich vorkommenden Cephalosporinvcrbindungen oder von natürlich vorkommenden Penicülinverbindungen, deren freie Aminogruppe in üblicher Weise blockiert ist, aus ihren wäßrigen Lösungen, und ist dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung in Anwesenheit eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels mit einem Diazoalkan der allgemeinen Formel

R¹

CN₂

worin R¹ und R² gleich oder verschieden sind und eine gcwünschtenfalls durch ein oder mehrere Halogenatome, Cyan-, Nitro-, Alkyl-, Alkylsulfonyl- oder Alkoxygruppen substituierte carbocyclische Arylgruppen bedeuten und R¹ auch ein Wasserstoffatom sein kann, umsetzt und die erhaltene Lösung des entsprechenden Esters der N-blockierten Cephalosporin- oder Penicillinverbindung in dem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel von der wäßrigen Phase abtrennt.

Geeignete Diazoalkane umfassen so Verbindungen der Formel I, worin R¹ und/oder R², die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt werden aus carbocyclischen Arylgruppen, wie Phenyl oder Naphthyl, substituiert durch ein oder mehrere Halogenatom(e), Cyan-, Nitro-, Alkyl-, Alkylsulfonyl- oder Alkoxygruppen, wobei letztere Gruppen beispielsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten können, wie beispielsweise in Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, Äthoxy, Isopropoxy oder Methylsulfonyl.

Besonders nützliche Diazoalkane der Formel I umfassen Verbindungen, worin R¹ und R² so gewählt sind, daß die resultierende Estergruppe R¹R²CH-, Benzyl, Diphenylmehtyl, Naphthylphenylmethyl oder eine substituierte Version jeglicher dieser Gruppen, z. B. Phenyl-(o-tolyl)-methyl oder (p-Methoxyphenyl)-phenylmethyl ist, da solche Estergruppen leicht durch einen nachfolgenden Schritt in der Reaktionsfolge gespalten werden können.

Die wäßrige Lösung von natürlich vorkommenden Cephalosporin- oder Penicillinverbindungen, deren freie Aminogruppe in üblicher Weise blockiert ist, die extraktiv verestert werden soll, kann — falls gewünscht — einen geringen Anteil (z. B. bis zu 30% Vol/Vol) eines oder mehrerer Colösungsmittel enthalten, z. B. mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, wie niedrige Alkanole (z. B. Methanol), Ketone (z. B. Aceton), Ester (z. B. Äthylacetat), Ν,Ν-disubstituierte Amide (z. B. Dimethylacetamid) und Äther (z. B. cyclische Äther, wie Dioxan), beispielsweise zur Erhöhung der Löslichkeit der N-blockierten Cephalosporin- oder Penicillinverbindung in dem wäßrigen Medium. Alternativ kann in Fällen, wo die N-blockierte Cephalosporin- oder Penicillinverbindung eine besonders geringe Löslichkeit in Wasser aufweist, die wäßrige Lösung die Form einer Aufschlämmung annehmen, die eine wäßrige, gesättigte Lösung der N-blockierten Cephalosporin- oder Penicillinverbindung in Kontakt und im Gleichgewicht mit Feststoff, ungelöster N-blockierter Aminosäure, enthält In der Beschreibung vorhandene Hinweise auf wäßrige Lösungen N-blockieter Cephalosporin- oder Penicillinverbindungen so'ien daher auch solche Aufschlämmungen und wäßrig-organische Lösungen umfassen.

Wie vorstehend aufgezeigt, muß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren abzutrennende natürlich vorkommende Cephalosporin- oder Penicillinverbindung in N-blockierter Form vorliegen, da dies im allgemeinen

ίο die Löslichkeit des resultierenden Esters in dem organischen Lösungsmittel erhöht und so die Wirksamkeit der Extraktion verbessert. Wird dementsprechend gewünscht, eine natürlich vorkommende Cephalosporin- oder Penicillinverbindung, die eine oder mehrere freie Aminogruppen enthält, extraktiv zu verestern, so sollten diese Gruppen vor der Veresterung durch Protonieren oder durch Substitution mit einer blockierenden Gruppe blockiert werden.

Wird zur Blockierung einer Aminogruppe die Protonisierung angewendet, so sollte die Protonisierung vorzugsweise unter Anwendung einer starken Säure durchgeführt werden, die der resultierenden, protonisierten natürlich vorKommende Cephalosporin- oder Penicillinverbindung eine gewisse Lipoid-Löslichkeit verleiht.

Geeignete starke Säuren für diesen Zweck umfassen aromatische Sulfonsäuren, beispielsweise Nitdrigalkylsubstituierte Benzolsulfonsäuren (z. B. p-Toluolsulfonsäure) und Naphthalinsulfonsäuren.

N-blockierende Gruppen, die zum Schutz von Aminogruppen durch Substitution verwendet werden können, können 1- oder 2-wertige geeignete Gruppen sein, die Acylgruppen, beispielsweise Niedrigalkanoyl, wie Acetyl, substituiertes Niedrigalkanoyl, z. B. Niedrig-halogenalkanoyl, wie Chloracetyl, Aryl-niedrigalkanoyl, wie Phenylacetyl, und Aroyl, wie Benzoyl oder Phthaloyl; Niedrigalkoxycarbonylgruppen, wie Äthoxycarbonyl, Isobutyloxycarbonyl oder t-Butyloxycarbonyl, und substituierte Niedrigalkoxycarbonylgruppen, z. B. Niedrighalogenalkoxycarbonyl, wie 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl; Arylniedrigalkoxycarbonylgruppen, wie Benzyloxycarbonyl; Sulfonylgruppen, beispielsweise Niedrigalkylsulfonyi, wie Methansulfonyl und Arylsulfonyl, wie Benzolsulfonyl oder p-Toluolsulfonyl; Ylidengruppen, die durch Reaktion mit Aldehyden und Ketonen, die Schiffs-Basen bilden, gebildet werden, beispielsweise Benzaldehyd, Salicylaldehyd oder Acetessigester; und 2-wertige Gruppen, so daß das Stickstoffatom den Teil eines Dihydropyridinrings bildet, solche Schutzgruppen werden beispielsweise durch Umsetzung mit Fomaldehyd und einem /?-Ketoester, z. B. Acetessigester, wie in der BE-PS 7 71 694 der gleichen Anmelderin beschrieben, erhalten, umfassen.

Im allgemeinen können solche N-blockierenden Gruppen nach an sich bekannten Methoden eingeführt werden, z. B. durch Umsetzung der Penicillin- oder Cephalosporinverbindung mit einem Acylhalogenid, wenn eine Acyl-N-Blockierungsgruppe eingeführt werden soll. Die N-blockierende Gruppe wird erstrebenswert bei einem pH-Wert über dem isoelektrischen Punkt der Penicillin- oder Cephalosporinverbindung eingebracht, vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 6—10, und die Reaktionstemperatur liegt vorteilhaft vergleichsweise niedrig, umd die Zersetzung der Säure auf ein Minimum zu reduzieren. Andere Gruppen, z. B. Hydroxyl- oder Thiolgruppen, die in der Penicillin- oder Cephalosporinverbindung vorhanden sind, können gegebenenfalls auch vor der extraktiven Veresterung blockiert werden.

Das bei der extraktiven Veresterung verwendete, mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel sollte im wesentlichen unter den Reaktionsbedingungen inert sein und sollte dazu geeignet sein, mindestens tei'weise die veresterte, N-blockierte Penicillin- oder Cephalosporinverbindung zu lösen, so daß die Natur des Lösungsmittels von der speziellen, zu extrahierenden N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindung abhängt. Im allgemeinen umfassen organische Lösungsmittel, die verwendet werden können, chlorierte Kohlenwasserstoffe, beispielsweise Methylenchlorid, Chloroform oder Chlorbenzolj aliphatische und aromatische Ester, beispielsweise Äthylacetat, Butylacetat oder Äthylbenzoat; mit Wasser nicht mischbare Ketone, beispielsweise Methyl-äthyl-keton oder Methyl-isobutyl-keton; aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, beispielsweise Benzol; und Alkohole, z. B. mit Wasser nicht mischbare niedrige Alkanole, wie n-Butanol. Mischungen der vorstehenden Lösungsmittel können au^h verwendet werden.

Die extraktive Veresterung wird zweckmäßig durch Zusatz einer Lösung des Diazoalkans in dem gewählten organischen Lösungsmittel zu der wäßrigen Lösung bewirkt, die die N-blockierte Penicillin- oder Cephalosporinverbindung enthält, da auf diese Weise im wesentlichen eine gleichzeitige Veresterung der N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindung und Extraktion in das organische Lösungsmittel erzielt werden kann, wodurch der Nutzeffekt des Verfahrens erhöht wird. Alternative Zugabemethoden sind möglich, jedoch können geringere Ausbeuten an isoliertem N-blockiertem Ester auftreten. So kann beispielsweise die wäßrige Lösung zuerst mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel zur Bewirkung einer mindestens teilweisen Extraktion der N-blockierten Penicillinoder Cephalosporinverbindung behandelt werden, wonach das Diazoalkan zugesetzt werden kann, um die gewünschte Veresterung zu beschleunigen.

Die extraktive Veresterung kann, falls gewünscht, in Anwesenheit einer oder mehrerer weiterer Säuren durchgeführt werden. Die Anwesenheit einer starken Säure mit einem pKa-Wert unter dem der N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindung, z. B. einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure, Orthophosphorsäure oder Perchlorsäure, kann sich nicht störend auf die extraktive Veresterung auswirken; so neigt das Diazoalkan in vielen Fällen dazu, vorwiegend mit der schwächeren \orhandenen Säure zu reagieren und sie zu verestern, d. h. vorzugsweise mit der N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindung zu reagieren. Die Menge jeder starken, zu dem Reaktionssystem zugesetzten Säure hängt schließlich teilweise von der Stabilität der Komponenten des Systems unter sauren Bedingungen ab; so sollte der pH-Wert der Reaktionslösung bevorzugt nicht unter etwa 1,5 herabgesetzt werden, da Nebenreaktionen, die die Zerstörung des Diazoalkans einbeziehen, bei solchen niedrigen pH-Werten vorwiegen können, und im allgemeinen ist es daher bevorzugt. Lösungen zu verwenden mit einem pH-Wert, der über etwa 1,7, beispielsweise im Bereich von 2,0—4,0 liegt.

Die extraktive Veresterung kann unter bestimmten Umständen in Anwesenheit von Säuren durchgeführt werden, die schwächer sind als die N-blockierte Penicillin- oder Cephalosporinverbindung. So kann beispielsweise Penicillin V und N-blockiertes Cephalosporin C selektiv in Anwesenheit der schwächeren Säuren Phenoxyessigsäure bzw. Essigsäure extraktiv verestert werden. Ohne sich theoretisch festlegen zu wollen wird angenommen, daß die Löslichkeit der N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindung in dem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel ein wesentlicher Faktor ist, der zu sokchen extraktiven Veresterungen beiträgt, da sich die Veresterungsgeschwindigkeit und die Selektivität des Verfahrens verbessern, wenn die Löslichkeit der N-blockierten in dem organischen Lösungsmittel ansteigt

ίο Es ist überraschend, daß extraktive Veresterungen unter sauren Bedingungen unter Anwendung vcn Diazoalkan-Veresterungsmitteln erfolgreich durchgeführt werden können, da bekanntlich die Stabilität von Diazoalkanen in saurem Medium vergleichsweise gering ist. Die Reihenfolge der Zugabe des Diazoalkans, des organischen Lösungsmittels und jeglicher zugesetzten starken Säure zu der wäßrigen Lösung hängt im allgemeinen von der Natur des Substrats ab. So ist die Zugabeweise in Fällen, wo die N-blockierte Penicillin- oder Cephalosporinverbindung säurestabil ist, nicht kritisch, soll jedoch ein säureempfindliches Substrat, wie Penicillin G oder N-blockiertes Desacetylcephalosporin C extrahiert werden, so ist es erstrebenswert, die starke Säure nach dem Diazoalkan und dem organischen Lösungsmittel zuzusetzen, da gefunden wurde, daß unter solchen Bedingungen die Veresterung der N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindung durch Diazoalkan und folglich die Stabilisierung der Penicillin- oder Cephalosporinverbindung in Form ihres Esters sehr rasch verläuft, so daß eine minimale säureinduzierle Zersetzung oder andere Umwandlung auftritt Unter Anwendung dieser Zugabeweise können wäßrige Lösungen von säureempfindlichen N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindungen bis zum Zeitpunkt der extraktiven Veresterung dadurch stabilisiert werden, daß man den pH-Wert, bei dem die Zerstörung der N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindung auf ein Minimum herabgesetzt oder verhindert wird, beibehält, z. B. einen neutralen oder basischen pH-Wert. Die Verminderung des pH-Werts durch Ansäuern der Lösung nach der Zugabe des Diazoalkans und des organischen Lösungsmittels erlaubt dann eine rasche Veresterung der N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindung durch das Diazoalkan.
In vielen Fällen ist es bevorzugt, einen Überschuß des Diazoalkans bei der extraktiven Veresterung zu verwenden. Die präzise Menge hängt von der Natur des Diazoalkans und der N-blockierten Penicillin- oder Cephalosporinverbindung ab. Im kritischen Falle liegt die so Menge des erforderlichen Diazoalkans bei etwa 1,0 bis 1,5 Mol/Äquivalent Säure. Ist es so beispielsweise erwünscht, eine dibasische Säure zu extrahieren, z. B. eine Cephalosporindisäure, so ist es zweckmäßig, 2 bis 3 Mol des Diazoalkans, z. B. etwa 2,1 Mol/Mol der basischen Säure zu verwenden.

Das erfindungsgemäße extraktive Veresterungsverfahren kann bei beispielsweise einer Temperatur im Bereich von -10 bis + 100⁰C, z. B. 0-50⁰C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt werden und überwacht werden durch beispielsweise Messung der Stickstoffentwicklung in dem Reaktionssystem, was eine praktische quantitative Anzeige des Ausmaßes der Zersetzung des Diazoalkans ergibt, oder durch spcktroskop'.rche Techniken, z. B. Verfolgen der Bildung von Esterbindungen durch 1. R.-Spektroskopie oder der Zersetzung von Diazogruppen, die sich durch einen Verlust der I.R.- und U.V.- oder sichtbaren Absorption ausdrückt.

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Nach Vollendung der extraktiven Veresterung kann der N-blockierte Penicillin- oder Cephalosporinester unter Anwendung von beispielsweise üblichen Techniken isoliert werden. So kann das organische Lösungsmittel von der wäßrigen Lösung abgetrennt werden, gereinigt werden, z. B. durch Waschen, und das Lösungsmittel zur Bildung des gewünschten Esters verdampft werden. Alternativ kann die organische Lösung einer weiteren Reaktion ohne Abtrennung des N-blokkierten Penicillin- oder Cephalosporinesters zwischendurch unterzogen werden. So kann beispielsweise ein extrahierter Penicillinester direkt in sein Sulfoxid durch Anwendung in einer Ringerweiterungsreaktion verwendet werden.

Wie vorstehend aufgezeigt, ist das erfindungsgemäße extraktive Veresterungsverfahren von besonderem Wert bei der Isolierung von natürlich erzeugten N-blokkierten Penicillinen und Cephalosporinen aus Fermentationsflüssigkeiten. Verbindungen, die extraktiv unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens verestert werden können, umfassen so Penicillin G, Penicillin V und deren hydroxylierte und 6«-methoxylierte Analoga und natürlich vorkommende Cephalosporine, wie Cephalosporin C, Desacetylcephalosporin C, Desacetoxycephalosporin C, 3-CarDamoyloxymethyI-cephalosporine und 7<z-methoxylierte Analoga dieser Verbindungen, worin jegliche freien Aminogruppen zuerst blockiert wurden. Das Verfahren kann auch vorteilhaft bei der Isolierung von (6R, 7R)-3-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)ceph-3-em-4-carbonsäure die durch enzymatische Oxidation von Cephalosporin C hergestellt werden kann und bisher etwas schwierig zu isolieren war, angewendet werden.

Besonders wichtige Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen die extraktive Veresterung von Cephalosporin C und 3-Hydroxymethylcephalosporinen, insbesondere Desacetylcephylosporin C. 3-Hydroxymethyl-cephalosporine sind schwierig nach üblichen Techniken zu isolieren aufgrund ihrer ausgeprägten Neigung zur Lactonbildung, insbesondere unter sauren Bedingungen. Im Falle von Desacetyl-cephalosporin C ist das resultierende Lacton eine stabile Verbindung mit einer geringen antibiotischen Aktivität und ohne Wert als Ausgangsmaterial für die Herstellung von halbsynthetischen Cephalosporin-antibiotika. Carboxylatsalze von 3-Hydroxymethyl-cephaIosporinen sind jedoch im wesentlichen beständig gegen eine derartige Lactonbildung, so daß eine wirksame Isolierung gemäß der Erfindung durch Durchführung der vorhergehenden Behandlungen erzielt werden kann, z. B. N-BIockierung der wäßrigen 3-Hydroxymethyi-cephaiosporiniösung bei basischem pH-Wert, anschließende Zugabe eines Diazoalkans und des mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, gefolgt von einer starken Säure, wie vorstehend beschrieben, um die extraktive Veresterung zu beschleunigen.

Im Falle der extraktiven Veresterung von Desacetylcephalosporin C kann beispielsweise die notwendige N-Blockierung unter basischen Bedingungen, beispielsweise durch Umsetzung mit einem geeigneten Acylierungsmittel, z. B. Benzoylchlorid, oder eines Halogenameisensäurealkylesters, (wie Chlorameisensäureäthylester) in Anwesenheit eines Basenüberschusses, (z. B. eines Alkalimetallhydroxids, wie Natriumhydroxid, oder eines Puffers, wie Kaliumphosphat) durchgeführt werden. Anschließend kann eine Lösung des Diazoalkans (z. B. Diphenyldiazomethan) in einem geeigneten Lösungsmittel zugefügt werden, falls gewünscht nach Extraktion bei im wesentlichen neutralem pH-Wert (z. B. im Bereich von pH 5—8), um Nebenprodukte der N-Blockierungsreaktion zu entfernen, und die Lösung angesäuert werden, beispielsweise auf einen pH-Wert im Bereich von 2—4 (z. B. im Bereich von etwa pH 3,5) mit einer starken Säure (z. B. einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure oder Orthophosphorsäure), um die extraktive Veresterung zu beschleunigen.

Die wäßrige Desacetylcephalosporin C-Ausgangslösung bei Extraktionen, wie den vorstehend beschriebenen, ist vorzugsweise im wesentlichen frei von Cephalosporin C.

Die Fähigkeit, Desacetyl-cephalosporin C in wirksamer und wirtschaftlicher Weise zu extrahieren, ist von beträchtlichem Wert, da typische Cephalosporin C-Fermentationsbrühen, die durch Fermentation von Cephalosporium acremonium erhalten werden, einen beträchtlichen Anteil von Desacetyl-cephalosporin C enthalten, von dem der Hauptanteil normalerweise bei der Isolierung von Cephalosporin C nach üblichen Techniken verlorengeht. Diese Verschwendung eines potentiell wertvollen Ausgangsmaterials zur Herstellung von halbsynthetischen Cephalosporinen ist selbstverständlich unerwünscht, und es ist ersichtlich, daß beträchtliehe wirtschaftliche Vorteile erwachsen, wenn der Desacetyl-cephalosporin C-Gehalt einer Fermentationsbrühe zusätzlich zu dem Cephalosporin C-Gehalt isoliert wird.

Das erfindungsgemäße extraktive Veresterungsverfahren wird in einer Anzahl von Mengen bei der Behandlung von Cephalosporin-Fermentationsbrühen angewendet, die von dem gewünschten Produkt abhängen. So kann es beispielsweise zweckmäßig sein, zuerst die Brühe, falls gewünscht, nach vorhergehender Behandlung wie Filtration, mit einer Esterase zu behandeln, die dazu dient, den Cephalosporin C-Gehalt der Brühe zu desacetylieren, vorzugsweise einer Esterase, die durch Kultivieren eines Hefemikroorganismus oder einer Mutante davon des Stamms Rhodotorula z. B. eines Mikro-Organismus der Species Rhodotorula rubra, erzeugt wird, und darauf das Reaktionsprodukt einer N-Blockierungsreaktion (z. B. durch Behandlung mit Benzoylchlorid oder Chlorameisensäureäthylester unter basischen Bedingungen) und einer extraktiven Veresterung unter Bildung eines im wesentlichen reinen N-blockierten Desacetyl-cephalosporin C-Esterderivats zu unterziehen. Alternativ können der Cephalosporin C- und Desacetylcephalosporin C-Gehalt einer Brühe zuerst einer N-Blockierungsreaktion und extraktiven Veresterung unter Bildung einer Mischung von N-blockierten Cephalosporin C- und Desacetyi-cephaiosporin C-Esterderivaten unterzogen werden, die anschließend mit einem Acetylierungsmittel (z. B. Acetylchlorid) zur Acetylierung des N-blockierten Desacetyl-Cephalosporin C-Estergehalts der Mischung behandelt werden, wobei man ein Produkt erhält, das ein im wesentlichen reines N-blockiertes Cephalosporin C-Esterderivat enthält

Die als Veresterungsmittel beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Diazoalkane können zweckmäßig, wie in der BE-PS 8 02 112 der gleichen Anmelderin beschrieben, durch Oxydation des entsprechenden Hydrazons unter Verwendung einer organischen Persäure, Perjodsäure, einer hydrohalogenigen Säure (unterhalogenigen Säuren) oder Hypohalogenidsalzes oder -esters, Chromsäure, Chlor, Brom oder einer Quelle für positives Halogen, wie einem N-Halogenamid oder -imid hergestellt werden. Peressigsäure ist für diesen Zweck ein besonders bevorzugtes Oxydationsmittel.

Die Oxydation wird vorzugsweise in Anwesenheit einer Base und vorteilhaft auch eines Oxydationskatalysators, z. B. Jod, durchgeführt.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Alle Temperaturen sind in ° C angegeben.

Beispiel 3 Beispiel 1

(6R, 7R)-7-(R-5-Benzoylamino-5-carboxy-

pentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-

4-carbonsäure-bis-diphenylmethyl-ester

Zu einer Lösung von 6,0 g (lOmMol, 70% Reinheit) Kalium-(6R, 7R)-(R-5-amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carboxylat in 150 ml Wasser wurde eine Mischung von 3,5 ml (30 mMol) Benzoylchlorid und 5 ml Aceton gefügt. Die Mischung wurde 1,5 Std. bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH-Wert bei 8,5 durch Zugabe von 50% Kaliumphosphat gehalten wurde. Der pH-Wert wurde mit Orthophosphorsäure auf 5,0 eingestellt, und die Lösung wurde mit 100 ml Chloroform extrahiert, um Benzoesäure und Benzoylchlorid zu entfernen. 90 ml Äthylacetat, die 5 g (26 mMol) Diphenyldiazomethan enthielten, 50 ml Dichlormethan und 10 ml Äthanol wurden zu der wäßrigen Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde 45 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 gehalten wurde.

Nach dem Abtrennen wurde die Lösungsmittelschicht mit 100 ml 5% Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und die gummiartige Masse wurde in 25 ml lsopropanol bei 30° gelöst 10 ml Petroläther (Kp. 30—40°) wurden zugefügt, und die Lösung wurde auf — 5° gekühlt. Das Produkt wurde mit 15 ml Petroläther gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei man 10,5 g der Titelverbindung erhielt.

Die Dünnschichtchromatographie an Siliciumdioxidgel GF254-PIatten unter Verwendung von Chloroform : Aceton : Essigsäure (80 :20 :1) als Lösungsmittel zeigte an, daß das Produkt hauptsächlich die Titelverbindung mit Spuren von Verunreinigungen war.

Beispiel 2

Diphenylmethyl-(3S, 5R, 6R)-2,2-dimethyl-6-phenoxyacetamidopenam-3-carboxylat-1 -oxid

Zu einer Lösung von 7,8 g (20 mMol) Kalium-(3S, 5R, öRJ^^-dimethyl-ö-phenoxyacetamidopenam-S-carboxylat in 100 ml Wasser wurde eine Lösung von 4 g (20 mMol) Diphenyidiazomethan in 75 mi Dichiomiethan gefügt. Die Mischung wurde 15 Minuten bei 10° gerührt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von Orthophosphorsäure auf 3,5 eingestellt wurde. Die Lösung wurde getrennt und die Lösungsmittelschicht mit 100 ml Wasser, 100 ml 5%iger Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. 18,5 ml (37% Gew/Vol) Peressigsäure wurden zu dem Lösungsmittel während 15 Minuten bei 10° gefügt, und es wurde 30 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde mit 100 ml Wasser, 100 ml 5%iger Natriumbicarbonlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und die Titelverbindung (9,1 g) wurde aus heißem lsopropanol kristallisiert

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

(6R, 7R)-3-Acetoxymethyl-7-(R-5-benzoylamino-

5-carboxypentanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure-bis-diphenylmethylester

Zu einer Lösung von 4,8 g (10 mMol) (6R, 7R)-3-Acetoxymethyl-7-(R-5-benzoylamino-5-carboxypentanami- do)-ceph-3-em-4-carbonsäure in 100 ml Wasser wurde

ίο eine Lösung von 4 g (20 mMol) Diphenyldiazomethan in 75 ml Dichlormethan, 25 ml Äthylacetat und 10 ml Äthanol zugefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Nach Trennung wurde das Lösungsmittel mit 100 ml 5%iger Natriumearbonatlösung und mit 100 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40—60°) behandelt, wobei man 6,0 g der Titelverbindung erhielt.

Die Ir- und NMR-Daten bestätigen die Struktur als die der Titelverbindung.

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Beispiel 4

(6R,7R)-7-(R-5-Carboxy-5-isobutyloxycarbonyl-

aminopentanamidoJ-S-hdydroxymethylceph-S-em-

4-carbonsäure-bis-diphenylmethylester

50 ml (375 mMol) Chlorameisensäureisobutylester wurden während einer Stunde zu einer Lösung von 34,4 g (60 mMol) Kalium-(6R, 7R)-7-(R-5-amino-5-carboxypentanamidoJ-S-hydroxymethylceph-S-em^-carboxylat in 350 ml Wasser bei pH-Wert 7,8-8.0 und 5" gefügt Die Mischung wurde weitere 30 Minuten gerührt, wobei die Temperatur von 5° und der pH-Wert von 7,8 bis 8,0 beibehalten wurden. Die Lösung wurde mit 250 ml Chloroform bei pH 5,0 extrahiert Eine Lösung von 25 g (126 mMol) Diphenyldiazomethan in

250 ml Dichlormethan, 100 ml Äthylacetat und 30 ml Äthanol wurden zu der wäßrigen Lösung gefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 15°C gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 2 χ 100 ml 5%iger Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40—60°) unter Bildung von 45,5 g der Titelverbindung behandelt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigen die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 5

(6R, 7R)-7-(R-5-Benzolsulfonylamino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-
4-carbonsäure-bis-diphenylmethylester

Zu einer Lösung von 4,1 g (10 mMol) Kalium-(6R, 7R)-7-(R-5-amino-5-carboxypentanamido)-3-hydrox-

ymethylceph-3-em-4-carboxylat in 100 ml Wasser, das 9 g Natriumbicarbonat enthielt, wurde eine Lösung von 2 ml (15,7 mMol) Benzolsulfonychlorid in 15 ml Aceton während 30 Minuten gefügt Die Reaktionstemperatur (10°) und der pH-Wert (7,8—8,0) der Lösung wurden weitere 90 Minuten beibehalten. Die Lösung wurde mit 2 χ 100 ml Chloroform bei pH-Wert 5,0 extrahiert. Eine Lösung von 6,0 g (3OmMoI) Diphenyldiazomethan in

24 26 772

80 ml Dichlormethan, 150 ml Äthylacetat und 20 ml Äthanol wurden zu der wäßrigen Lösung gefügt, und die Mischung wurde 30 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Nach der Abtrennung wurde das Lösungsmittel mit 2x100 ml 5°/oiger Natriumcarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40—60°) unter Bildung von 5,8 g der Titel verbindung behandelt.

Das Dünnschichtchromatogramm und die IR-Daten zeigten an, daß die Struktur die der Titelverbindung war.

Beispiel 6

(6R, 7R)-3-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-carbonsäure-bis-diphenylmethyl-ester

Zu einer Aufschlämmung von 0,24 g (0,575 mMol) (6R, 7R)-3-Acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure wurden 0,3 g (1,5 mMol) Diphenyldiazomethan in 15 ml Dichlormethan gefügt. Die Mischung wurde 15 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Die Mischung wurde anschließend weitere 75 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 2 χ 25 ml 5°/oiger Natriumcarbonatlösung und 25 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40—60°) unter Bildung von 0,38 g der Titelverbindung behandelt

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 7

(6R, 7 R)-7-(R-5-Isobutyloxycarbonylamino-5-carboxypentanamidoJ-S-hydroxymethylceph-S-em^-carbon-säure-bis-phenyl-(o-tolyl)-methyl-ester

Zu einer Lösung von 11,2 g (20 mMol, 67,1 % Reinheit) Kalium-(6R, 7R)-7-(R-5-amino-5-carboxypentanamido)-3-hydroxymetyhlceph-3-em-4-carboxylat in 100 ml Wasser wurden 16 ml (120 mMol) Chlorameisensäureisobutylester während 1 Std. bei 10 und pH-Wert 7,8—8,0 gefügt. Die Mischung wurde weitere 30 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert bei 7,8—8,0 gehalten wurde. Der pH-Wert wurde mit Orthophosphorsäure auf 5,0 eingestellt, und es wurde mit 2 χ iOO mi Chloroform extrahiert. Eine Lösung von 4,2 g (40 mMol) (o-Tolyl)-phenyldiazomethan in einer Mischung von 120 ml Dichlormethan, 60 ml Äthylacetat und 20 ml Äthanol wurde zu der wäßrigen Lösung gefügt Die Mischung wurde 45 Minuten gerührt wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 100 ml Wasser, 2 χ 100 ml 5%iger Natriumcarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und die gummiartige Masse mit Petroläther (40—60°) unter Bildung von 16,9 g der Titelverbindung behandelt.

12
Beispiel 8

2,6-dimethyl-l,4-dihydropyridin-l-yl)-pentanamido]-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure-
bis-diphenylmethyl-ester

Zu einer Lösung von 12 g (2OmMoI, 70% Reinheit) Kalium-(6R, 7R)-7-(R-5-amino-5-carboxypentanamido)-

S-hydroxymethylceph-S-em^-carboxylat wurden

18,7 ml (249 mMol) 37%ige Formaldehydlösung und 25,2 ml (199 mMol) Acetessigsäureäthylester getrennt während 1 Std. bei 5° gefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von 25%iger Kaliumphosphatlösung auf 7,0 gehalten. Nach weiteren 30 Minuten Rühren wurde die Lösung mit 200 ml Dichlormethan extrahiert. 150 ml Dichlormethan, die 10 g (52 mMol) Diphenyldiazomethan enthielten, wurden zu der wäßrigen Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde 45 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mii Orthophosphorsäure auf 2,0 eingestellt wurde. Nach der Abtrennung wurde die Lösungsmittelschicht mit 200 ml Wasser, 200 ml 5°/oiger Natriumcarbonatlösung und 200 ml Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Magnesiumsulfat wurde die Lösung im Vakuum auf ein Vulumen von 75 ml konzentriert, wobei man eine Lösung der Titelverbindung erhielt.

B e i s ρ i e 1 9

(6R,7S)-7-(R-5-Benzyloxycarbonylamino-S-carboxypentanamidoJ-S-carbamoyloxymethyl-

7-methoxyceph-3-em-4-carbonsäure-bisdiphenylmethyl-ester

3,5 ml Chlorameisensäurebenzylester wurden während 1 Std. zu einer gerührten Lösung von 4 g (etwa 5% Reinheit) des Monoamoniumsalzes von (6R, 7S)-7-(R-S-Amino-S-carboxypentanamidoJ-S-carbamoyloxyme-
thyl-7-methoxyceph-3-em-4-carbonsäure in 80 ml Wasser, die 6 g Natriumcarbonat enthielten, bei 10° gefügt. Der pH-Wert wurde die ganze Zeit durch Zugabe von 1 η-Natriumhydroxid auf 7,8—8 gehalten. Die Mischung wurde bei 10° und pH 7,8—8 während weiterer 90 Minuten gerührt Der pH-Wert wurde mit Orthophosphorsäure auf 5 eingestellt, und die Lösung wurde mit 2 χ 100 ml Chloroform gewaschen. Zu der wäßrigen Phase wurden 50 ml Äthylacetat und 10 ml Äthanol soso wie eine Lösung von Diphenyldiazomethan in Methylenchlorid (50 ml, etwa 0,2 m) gefügt Die Mischung wurde bei i5⁼ 45 Minuten gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2 eingestellt wurde. Nach der Trennung wurde die organische Phase mit 2 χ 75 ml 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und mit 100 ml Wasser gewaschen, getrocknet (in Na₂SO₄) und zu 2,9 g einer gummiartigen Masse verdampft Durch Reinigung durch Säulenchromatographie (Siliciumdioxidgel; Äthylacetat und Chloroform), gefolgt von präparativer Dünnschichtchromatographie (Siliciumdioxidgel; Chloroform und Methanoi) erhielt man 260 mg der Titelverbindung in Form eines weißen Schaums. Die IR-, NMR-, UV- und Mikroanalysendaten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 10

(6R,7S)-7-[R-5-Carboxy-5-(2,2,2-trichlor-

äthoxycarbonylamino)-pentanamido]-3-carbamoyl-

oxymethyl-Z-methoxyceph-S-em-'l-carbonsäure-

bis-diphenylmethyl-ester

3 ml 2,2,2-Trichloräthylchlorameisensäureester wurden während 1 Std. zu einer gerührten Lösung von 4 g (etwa 5% Reinheit) des Monoammoniumsalzes von (6R, 7S)-7-(R-5-Amino-5-carboxypentanamido)-3-(carbai.ioyloxymethyl^-methoxyceph-S-em^-carbonsäure in 80 ml Wasser, die 6 Natriumbicarbonat enthielten, bei 10° gefügt. Der pH-Wert wurde die ganze Zeit durch Zugabe von 1 η-Natriumhydroxid bei 7,8—8 gehalten. Die Mischung wurde bei 10° und pH 7,8—8 während weiterer 90 Minuten gerührt Der pH-Wert wurde mit Orthophosphorsäure auf 5 eingestellt, und die Lösung wurde mit 2 χ 100 ml Chloroform gewaschen. Zu der wäßrigen Phase wurden 50 ml Äthylacetat, 10 ml Äthanol und eine Lösung von Diphenyldiazomethan in Methylenchlorid (50 ml, etwa 0,2 m) gefügt. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 15° gerührt, wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2 eingestellt wurde. Nach der Trennung wurde die organische Schicht mit 2 χ 80 ml 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und mit 100 ml Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SCt) und verdampft, wobei man 2,8 g einer gummiartigen Masse erhielt Durch Reinigung durch Säulenchromatographie (Siliciumdioxidgel; Chloroform und Äthylacetat), gefolgt von präparativer Dünnschichtchromatographie (Siliciumdioxidgel; Chloroform und Methanol) erhielt man 410 mg der Titelverbidung in Form eines weißen Schaums. Die IR-, NMR-, UV- und Mikroanalysendaten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 11

(6R, 7S)-7-(R-5-Benzoylamino-5-carboxypentan-

amido)-3-carbamoyloxymethyI-7-methoxyceph-

3-em-4-carbonsäure-bis-diphenylmethylester

Eine Lösung von 5 g (etwa 0,85 mMol, etwa 8% Reinheit) des Monoammoniumsalzes von (6R, 7S)-7-(R-S-Amino-S-carboxypentanamidoJ-S-carbamoyloxymethyl-7-methoxyceph-3-em-4-carbonsäure in 100 ml Wasser wurde mit 50%iger Kaliumphosphatlösung auf den pH-Wert 8,3 eingestellt. Eine Lösung von 3 ml (26 mMol) Benzoylchlorid in 5 ml Aceton wurde zugesetzt, und die Mischung wurde 1,5 Std. bei Raumtemperatur gerührt wobei der pH-Wert durch Zugabe von 50%igem Kaliumphoshat auf 8,3 gehalten wurde. Der pH-Wert wurde mit Phosphorsäure auf 5 eingestellt und die Lösung wurde mit 100 ml Chloroform gewaschen. Zu der wäßrigen Phase wurden 90 ml Äthylacetat 10 ml Äthanol und eine Lösung von Diphenyldiazomethan in Methylenchlorid (50 ml, etwa 0,2 m) gefügt. Die Mischung wurde 45 Minuten gerührt wobei der pH-Wert mit Orthophosphorsäure auf 2 eingestellt wurde. Nach dem Abtrennen wurde die organische Schicht mit 100 ml 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO-O und zu 2,6 g einer gummiartigen Masse verdampft Durch Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie (Siliziumdioxidgel; Chloroform und Äthylacetat) erhielt man 554 mg der Titelverbindung als weißen Schaum. Die IR-, NMR-, UV- und Mikroanalysendaten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 12

(6R,7R)-7-[R-5-Carboxy-5-(2,2,2-trichloräthoxy-

carbonylaminopentanamidoj-S-hydroxymethylceph-S-em^-carbonsäure-bis-diphenylmethyl-ester

ίο 5 ml (37 mMol) 2,2,2-Trichloräthylchlorameisensäureester wurden zu einer Lösung von 20 mMol KaIium-(6R, 7S)-7-(R-5-amino-5-carboxypentanamido)-S-hydroxymethylceph-S-em^-carboxylat in 100 ml Wasser gefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde 30 Minuten unter Verwendung von 10%iger (Gew/Vol) Natriumhydroxidlösung auf 7.5—8,0 gehalten. Die Lösung wurde anschließend mit 50 ml Dichlormethan bei pH 5,0 extrahiert Eine Lösung von 8,5 g (44 mMol) Diphenyldiazomethan in 150 ml Dichlormethan wurde zur wäßrigen Phase gefügt, und der pH-Wert wurde unter Verwendung von 10%iger (Vol/Vol) Schwefelsäure während 15 Minuten auf 3,5 eingestellt. Nach der Trennung wurde das Lösungsmittel mit 3 χ 150 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsittel wurde im Vakuum entfernt, wobei man 20,5 g der Titelverbindung erhielt

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 13

(6R,7R)-7-[R-5-Carboxy-5-(2,2^-trichloräthoxycarbonylamino)-pentanamido]-3-hydroxymethylceph-S-em^-carbonsäure-bis-naphthylphenylmethyl-ester

Das Verfahren von Beispiel 12 wurde wiederholt, wobei jedoch eine Lösung von etwa 44 mMol Naphthylphenyldiazomethan in 150 ml Dichlormethan anstelle der Lösung von Diphenyldiazomethan in Dichlormethan verwendet wurde, wobei man 233 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 14

(6R,7R)-7-[R-5-Carboxy-5-(2,2,2-trichlorälhoxycarbonylamino)-pentanamido]-3-hydroxy-

methylceph-S-em^-carbonsäure-bis-(p-methoxyphenyl)-phenylmethyl-ester

Das Verfahren von Beispiel 12 wurde wiederholt wobei jedoch eine Lösung von etwa 44 mMol (p-Methoxyphenyl)-phenyldiazomethan in 150 ml Dichlormethan anstelle der Lösung von Diphenyldiazomethan in Dichlormethan verwendet wurde, wobei man 6.4 g der Titelverbindung erhielt.

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung.

Beispiel 15

(6R,7R)-7-(R-5-Carboxy-5-äthoxycarbonyIamino-

pentanamido)-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbon-

säure-bis-diphenylmethylester

Das Verfahren von Beispiel 12 wurde wiederholt wobei jedoch 5 ml (52 mMol) Chlorameisensäureäthylester anstelle des Chlorameisensäure-2,2,2-trichloräthylestcr

24 26 772

15

verwendet wurden, wobei man 15,7 g der Titelverbin- waschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 7,8 g

dung erhielt der Titelverbindung erhielt

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als

diederTitelverbidung. die der Titelverbindung.

Beispiel 16

Diphenylmethyl-(5R,6R)-2^-dimethyl-6-phenoxyacetamidopenam-3-carboxylat

Zu einer Lösung von 10 g (25,7 mMol) Kalium-(5R, 6R)-2.2-dimethyl-6-phenoxyacetamidopenam-3-carboxylat und 2 g (13,1 mMol) Phenoxyessigsäure in 100 ml Wasser wurde eine Lösung von 5,2 g (27 mMol) Diphenyldiazomethan in 100 ml Dichlormethan gefügt. Der pH-Wert wurde auf 4,0 eingestellt, und die Lösung wurde 10 Minuten geführt Nach dem Trennen wurde das I .ösungsmittel mit 100 ml Wasser, 100 ml 5%iger (Gew/ VoI) Natriumbicarbonatlösung und 100 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, wobei man 11,4 g der Titelverbindung erhielt

Die IR- und NMR-Daten bestätigten die Struktur als die der Titelverbindung, die lediglich 30% der Ausgangs-Phenoxyessigsäure als Verunreinigung enthielt.

Beispiel 17

Diphenylmethyl-(6R, 7R)-7-amino-3-acetoxymethylceph-S-em^-carboxylat-hydrochlorid

4,2 ml (31 mMol) 2,2,2-TrichIoräthyl-chlorameisensäurecster wurden zu 100 ml einer wäßrigen Lösung gefügt, die die Kaliumsalze von (6R, 7R)-7-(R-5-Amino-S-carboxypentanamidoJ-S-acetoxymethylceph-S-em-4-carbonsäure (1OmMoI) und (6R, 7R)-7-(R-5-Amino- j

S-carboxypentanamidoJ-i-hydroxymethylceph-S-em- |

4-carbonsäure(10 mMol) enthielt. j

Der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung 40 ]■

einer 10%igen (Gew.-Vol.) Natriumhydroxidlösung eine j

Stunde bei 7,5—8,0 gehalten. Die Lösung wurde an- j

schließend mit 50 ml Dichlormethan bei pH-Wert 5,0 j

extrahiert. Eine Lösung von 8,5 g (44 mMol) Diphenyl- j

diazomethan in 150 ml Dichlormethan wurde zu der 45 '

wäßrigen Phase gefügt und der pH-Wert unter Verwen- ⁽

dung von 10%iger (V0I./V0I.) Schwefelsäure während

30 Minuten auf 3,5 eingestellt. Nach Abtrennen wurde ;

das Lösungsmittel mit 3 χ 150 ml Wasser gewaschen und mit 10 g wasserfreiem Magnesiumsulfat gerührt

Nach dem Abfiltrieren des Feststoffes wurde die Lö- i

sung durch Destillation im Vakuum auf 50 ml konzen- i

triert 4,3 ml (60 mMol) Acetylchlorid und 4,8 ml i

(60 mMol) Pyridin wurden zu der Lösi'ng gefügt, wobei gekühlt wurde, um die Temperatur auf 5—10° zu halten. Nach 30-minütigem Rühren wurde die Lösung filtriert und zu einer Aufschlämmung von 9,0 g (43 mMol) Phosphorpentachlorid und 3,5 ml (43 mMol) Pyridin in 40 ml Dichlormethan gefügt Während der Zugabe wurde die Temperatur auf —5° gehalten. Die Mischung wurde 50 Minuten gerührt, wobei die Temperatur zwischen 0 und 5° gehalten wurde. Nach dem Kühlen auf — 10° wurden 40 ml Methanol zugesetzt und es wurde weitere 15 Minuten gerührt. 40 ml Wasser und 250 ml Diisopropyläther wurden anschließend zugefügt und das Produkt eine Stunde kristallisieren gelassen.

Das Produkt wurde filtriert mit 100 ml einer Mischung von Methanol und Diisopropyläther (30 : 70) ge-

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Extraktion von natürlich vorkommenden Cephalosporinverbindungen oder von natürlich vorkommenden Penicillinverbindungen, deren freie Aminogruppe in üblicher Weise blokkiert ist, aus ihren wäßrigen Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Lösung in Anwesenheit eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels mit einem Diazoalkan der allgemeinen Formel