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Verfahren zur Herstellung des 6a,16a-Dimethyl-l-dehydro-corticosterons
und seiner 21-Ester In den ausgelegten Unterlagen der belgischen Patentanmeldung
614196 ist unter anderem die Herstellung des 6a,16a-Dimethyl-l-dehydro-corticosterons
und seines 21-Acetats beschrieben. Man geht dabei aus von dem 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-21-ol-3,20-dion
bzw. seinem 21-Acetat, in welches unter Einwirkung der Enzyme von Curvularia lunata
zunächst die llß-ständige Hydroxylgruppe und dann unter Einwirkung der Enzyme von
Corynebacterium simplex die A1-Doppelbindung eingeführt wird, woran sich gewünschtenfalls
noch eine Acylierung des 21-ständigen Hydroxyls nach an sich bekannten Methoden
anschließt. Das so erhältliche 6a,16a-Dimethyl-l-dehydro-corticosteron besitzt starke
antiinflammatorische Aktivität bei gleichzeitig stark verminderter Glucocorticoider
Nebenwirkung. Leider sind jedoch die auf dem genannten Wege erhältlichen Ausbeuten
technisch unbefriedigend.
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Es wurde nun gefunden, daß sich die Ausbeuten an dem gewünschten Wirkstoff
ganz wesentlich verbessern lassen, wenn man die obenerwähnte llß-Hydroxylierung
mittels Curvularia lunata statt bei der genannten 6a-Verbindung bei der entsprechenden
6ß'-Verbindung vornimmt und die 6ß-Methylgruppe der hierbei anfallenden Hydroxylierungsprodukte
nachträglich in an sich bekannter Weise in saurem Medium in die 6a-Methylgruppe
umlagert. Diese Umlagerung kann im übrigen vor oder nach der im Anschluß an die
Hydroxylierung erforderlichen Einführung der A'-Doppelbindung vorgenommen werden.
Die 21-ständige Hydroxylgruppe kann gegebenenfalls auf einer beliebigen Stufe des
Verfahrens durch Verseifung aus einer entsprechenden 21-Acyloxygruppe freigesetzt
oder erneut verestert werden.
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Die nachfolgende Tabelle erläutert die erfindungsgemäß vorteilhafte
llß-Hydroxylierung der 6ß-substituierten Steroide mittels Curvularia lunata am Beispiel
des 6ß,16a-Dimethyldesoxycorticosterons im Vergleich zum 6a,16a-Dimethyl-desoxycorticosteron:
| Fermentationszeit 6ß,16ra-Dimethyl- Nicht umgesetztes 6rt,16rc-Dimethyl-
Nicht umgesetztes |
| Stunden corticosteron Ausgangsmaterial corticosteron Ausgangsmaterial |
| 24 590/0 1501o 120% 720% |
| 30 68% 3% 18% 650% |
| 36 720% - 20% 62% |
| 60 - - 20% 5901 0 |
Das als Ausgangsstoff des vorliegenden Verfahrens benötigte 6ß,16a-Dimethyl-4-pregnen-llß,21-diol-3,20-dion
(bzw. sein 21-Ester) ist durch Umsetzung des bereits beschriebenen 6ß,16a-Dimethyl-pregnan-3ß,5a,21-triol-20-on-21-acetats
(vgl. I. I r i a t e und M. L. F r a n c o , »Journ. Org. Chem.«, 26 [1961], S.
2047), nach O p p e n a u e r leicht zugänglich. Zugleich mit der Oxydation des
3ß-ständigen Hydroxyls zur 3-Ketogruppe wird das 5a-ständige Hydroxyl mit dem benachbarten
Wasserstoffatom als Wasser abgespalten und die A4-Doppelbindung gebildet.
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Das erfindungsgemäße Verfahren verläuft nach folgendem Schema, in
das die gegebenenfalls durchzuführende Verseifung oder Veresterung in 21-Stellung
nicht mit aufgenommen worden ist.
Beispiel 1 a) Darstellung des Ausgangsstoffes, 6ß,16ct-Dimethyl-4-pregnen-21-ol-3,20-dion-21-acetat
(II) Die Lösung von 9,6 g 6ß,16a-Dimethyl-pregnan-3ß,5a,21-triol-20-on-21-acetat
(I) (dargestellt nach I. 1 r i a t e und M. L. F r a n c o, »J. Org. Chem.«, 26
[1961] S. 2047) in 355 ml Toluol (absolut) und in 125m1 Cyclohexanon wird nach Abdestillieren
mit 20g Aluminiumisopropylat in 80m1 Toluol versetzt und 3 Stunden unter Rühren
und langsamem Abdestillieren zum Sieden erhitzt (Badtemperatur 130'C). Das Reaktionsgemisch
verdünnt man mit Benzol, kühlt in Eis auf etwa 5°C und schüttelt mit eiskalter 2
n-Schwefelsäure, dann mit kalter 5%iger Natriumcarbonatlösung und mit Wasser (bis
zur Neutralität) aus. Nach Abdestillieren der Lösungsmittel im Vakuum wird eine
Vakuum-Wasserdampfdestillation angeschlossen. Nach Abtrennung des Wassers bleiben
15 g eines braunen Öles zurück, das an Silicagel chromatographiert wird. Die Chloroform-
und Chloroform-Essigester-(1 : 1)-Eluate enthalten die gewünschte 3-Keto--1-1-Verbindung
(II), die als Öl anfällt und als solches zur nächsten Reaktionsstufe eingesetzt
wird. e242 = 13900.
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b) 6ß,16a-Dimethyl-4-pregnen-llß,21-diol-3,20-dion (III) Ein Fermenter
aus rostfreiem Stahl mit 501 Fassungsvermögen wird mit 301 einer Nährlösung aus
4,40% Glucose 1,00% Malzextrakt 0,100/0 KH2P04 0,05% KCI 0,050/0 mgSO, 0,002% FeS04
0,50% Maisquellwasser beschickt, durch halbstündiges Erhitzen auf 120°C sterilisiert
und nach dem Abkühlen mit einer Suspension (Sporensuspension) von Curvularia lunata
beimpft, die durch Abschwemmen einer 7tägigen Maiskolbenkultur (15 g Mais) mit etwa
100 ml physiol. Kochsalzlösung erhalten wurde.
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Nach 2tägiger Vermehrung bei 25°C unter Rühren (220 U/min) und Belüftung
(1,65 m3/Std.) werden 1,8 1 der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen
und in einem gleich großen Fermenter mit 28,21 einer Nährlösung aus 4,4(1/o Glucose
1,00% Malzextrakt 0,3 % NaN03 0,1% KH2P0:4 übergeführt. Nach 24stündiger Anzucht
unter Rühren und Belüftung wie oben werden 7,5 g 6ß,16a-Dimethyl-4-pregnen-21-ol-3,20-dion
in 200 ml Äthanol zugesetzt, und es wird unter gleichen Bedingungen 28 Stunden fermentiert.
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Der Verlauf der Fermentation wird durch Entnahme von Proben überprüft,
die mit Methylisobutylketon extrahiert werden. Die Extrakte werden papierchromatographisch
im System Toluol-Dioxan-Propylenglykol analysiert.
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Nach beendeter Fermentation (28 Stunden) wird die Kulturbrühe über
eine große Nutsche abgesaugt. Der Mycelrückstand wird mehrmals mit Wasser gewaschen
und das Filtrat mit dreimal 101 Methylisobutylketon extrahiert. Der Extrakt wird
anschließend in einem Umlaufverdampfer im Vakuum konzentriert und im Rundkolben
vorsichtig im Vakuum zur Trockne eingedampft.
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Die Substanz wurde mehrmals aus Methylenchlorid-Isopropyläther umkristallisiert.
Fp. 191/194 bis 197°C; f212 = 14600. NMR: peak bei z = 4,28 unaufgespalten (= 6ß-Methyl).
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Beispiel 2 6ß,16a-Dimethyl-4-pregnen-l lß,21-diol-3,20-dion-21-acetat
(IV) Durch übliche Acetylierung von III in Pyridin mit Acetanhydrid bei Raumtemperatur
wurde das Acetat erhalten. Fp. 205/207,5 bis 209,5°C; ein
= 14300.
NMR: peak bei z = 4,28 unaufgespalten (= 6ß-Methyl).
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Beispiel 3 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-1 lß,21-diol-3,20-dion-21-acetat
(V) In die Lösung von 632 mg 6ß,16a-Dimethyl-4-pregnen-llß,21-diol-3,20-dion-21-acetat
(IV) in trockenem Methylenchlorid leitet man nach Zusatz von 6 Tropfen Methanol
100 Minuten unter Eiskühlung einen trockenen Chlorwasserstoffstrom ein. Dann wird
mit eiskalter 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser neutral gewaschen. Nach--Einengen
in Vakuum wird der Rückstand aus Methylenchlorid-Isopropyläther umkristallisiert.
Ausbeute 417 mg. Fp. 185/186 bis 188°C; e2.11 = 15200. NMR: peak bei z =
4,28 aufgespalten (= 6a-Methyl).
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Beispiel 4 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-l lß,21-diol-3,20-dion (VI) 105
mg 6a,16a-Di iethyl-4-pregnen-llß,21-diol-3,20-dion-21-acetat (V) werden in 6m1
absolutem luftfreiem Methanol gelöst, mit 1,7m1 Natriummethylat (0,5 mMol) rsetzt
und 10 Minuten bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Nach Zugabe von 1 ml
Wasser wird weitere 3 Minuten nachgerührt und mit Essigester neutralisiert. Die
Lösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Methylenchlorid ausgekocht.
Der Methylenchloridextrakt wird eingeengt und mit Isopropyläther versetzt, wobei
Kristallisation eintritt. Nach Umkristallisieren aus gleichem Lösungsmittel Fp.
163/165 bis 167°C; e241 = 14500.
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Beispiel s 6a,16a-Dimethyl-1,4-pregnadien-11(3,21-diol-3,20-dion (VII)
Eine Lösung von 250 mg 6a,16a-Dimethyl-4-pregnen-l lß,21-diol-3,20-dion in 25m1
Dimethylformamid wird zu 1000 ml einer Bakteriensuspension von Corynebacterium
simplex zugesetzt und 20 Stunden bei 30°C geschüttelt. (Diese Bakteriensuspension
wurde bereitet, indem 8 g eines Bakterientrockenpulvers, das durch Sprühtrocknung
einer normal gewachsenen Submerskultur von Corynebacterium simplex [Medium 0,75%
Pepton, 1,2% Maisquellwasser] erhalten worden war, in 1000 ml Trispuffer [Triäthylaminoäthanol]
aufgeschlämmt wurden.) Die Reaktion wird durch dünnschichtchromatographische Analyse
verfolgt. Man extrahiert die Lösung mit Methylisobutylketon. Der Extrakt wird im
Vakuum eingeengt und der Extraktrückstand aus Aceton-Isopropyläther mehrmals umkristallisiert.
Fp. 135/137 bis 139°C; e@ = 14300. Beispiel 6 6a,16a-Dimethyl-1,4-pregnadien-1 lß,21-diol-3,20-dion-21-acetat
(VIII) Durch Umsetzung mit Acetanhydrid von VII in Pyridin bei Raumtemperatur wird
das Acetat dargestellt. Umkristallisation aus Methylenchlorid-Isopropyläther. Fp.
156/159 bis 162°C; f2-12 = 14100.