DE1213569B - Herstellung und Gewinnung des neuen Antibioticums 11837 R. P. - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C12d

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1213 569

Aktenzeichen: R 38813IV a/30 h

Anmeldetag: 18. September 1964

Auslegetag: 31. März 1966 .

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gewinnung eines neuen Antibioticums, das im folgenden mit der Nr. 11837 R. P. bezeichnet wird. Dieses neue Produkt ist insbesondere auf Grund seiner erhöhten antibakteriellen Wirksamkeit gegen die grampositiven Keime und seiner sehr langen Wirkungsdauer wertvoll. Es kann aus künstlichen Züchtungsmedien eines im nachfolgenden vollständiger identifizierten Mikroorganismus erhalten werden, der dem Genus Streptomyces angehört und mit »Streptomyces viii- ίο dans DS 9466« (NRRL 3087) bezeichnet wird.

Das Antibioticum 11837 R. P. ist in Wasser sehr löslich, in Methanol, Pyridin, Essigsäure und Dimethylformamid löslich und in Äthanol, Aceton, Chloroform und η-Hexan wenig oder nicht löslich.

In wäßriger Lösung ist das Antibioticum 11837 R. P. von pH 5 bis 10 sehr stabil (es behält zumindest 90% seiner Aktivität nach 2 Wochen bei 37° C bei), bei pH 4 mäßig stabil (es verliert 30 °/o Aktivität in 2 Wochen bei 37° C) und bei pH 2 verhältnismäßig ao instabil (es verliert 70 °/o seiner Aktivität in 6 Tagen bei 37° C).

Das Antibioticum 11837 R. P. ergibt negative Prüfungen bei den folgenden Reaktionen: Biuretreaktion, Reaktion mit Ferrichlorid, Reaktion mit Ninhydrin. Es ergibt positive Prüfungen in den folgenden Reaktionen: Reaktion mit Ninhydrin nach saurer Hydrolyse, Diazotierungsreaktion, Xanthoproteinreaktion, Reaktion mit ammoniakalischem Silbernitrit (vor Hydrolyse zweifelhaft und nach saurer Hydrolyse sehr stark), Reaktion mit Phloroglucin, Reaktion mit Carbazol, Kaliumpermanganatreaktion, Reaktion nach Benedict nach saurer Hydrolyse. Durch konzentrierte Schwefelsäure färbt es sich orange und durch konzentrierte Salzsäure blaßrosa.

Das Antibioticum 11837 R. P. ist eine starke Säure, deren durch potentiometrische Titration mit Natronlauge gemessenes Neutraläquivalent 600 beträgt (pKa = 4,1). Sein Molekulargewicht scheint über 5000 zu liegen, da es durch eine Membran aus regenerierter Cellulose (Art Cellophan) nicht dialysiert.

Das Antibioticum 11837 R. P. enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Phosphor. Seine Elementarzusammensetzung (nach der Analyse seines Natriumsalzes) ist etwa die folgende: C = 46,9«/ο, H = 7,9%, O = 39,2%, N = 3,9%, P = 2,25%..

Es besitzt die nachfolgend angegebenen physikalischen Eigenschaften: Aussehen: weißes amorphes Pulver. Schmelzpunkt: kein scharfer Schmelzpunkt, zersetzt sich ab 160° C. Infrarotspektrum (die BeHerstellung und Gewinnung des neuen Antibioticums 11837 R. P.

Anmelder:
Rhöne-Poulenc S. A., Paris

Vertreter:

Dr. F. Zumstein,

Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Assmann und Dipl.-Chem. Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte, München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:

Denise Mancy, Charenton, Seine; Leon Ninet,

Jean Preud'Homme, Paris (Frankreich)

Beanspruchte Priorität:

Frankreich vom 19. September 1963 (948 030)

Stimmung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen):

Dieses Spektrum ist in der F i g. 1 wiedergegeben, in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzählen in cm"¹ (oberer Maßstab) und als Ordinate die Transmissionen in Prozent aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabelle I sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption für dieses Produkt wiedergegeben.

Tabelle I

3360 sst	1164 m	609 540/376
2930 st	1125 Sch
1720 st	1100 m
1630 sst	1068 sst
1564 m	1040 sst
1550 st	968 m
1430 Sch	950 m
1400 Sch	890 sch
1380 st	860 sch
1330 m	800 sch
1222 st
sst = sehr stark	sch = schwach
st = stark	Sch = Schulter
m = mittel

Das Natriumsalz des Antibioticums 11837 R. P. hat die folgende Elementarzusammensetzung: C = 45,O°/o, H = 7,4%, O = 37,6¹Vo₅ N = 3,72%, P = 2,16«/o,Na = 4,15°/o.

Es zeichnet sich durch die folgenden physikalischen Eigenschaften aus: ■

Aussehen: praktisch weißes amorphes Pulver. Drehvermögen: [<%] f = 6 ± 1° (c = 0,6% in Wasser). Ultraviolettspektrum (die Messung wurde mit einer Lösung mit 30 mg je Liter in Wasser durchgeführt): Absorptionsende: Ei*_n =3.0 bei 220 m μ, 3,5 bei 257 m μ. Infrarotspektrum (die Bestimmung wurde an mit Kaliumbromid verpreßtem Produkt vorgenommen): Dieses Spektrum ist in der F i g. 2 wiedergegeben, in der als Abszisse einerseits die Wellenlängen in Mikron (unterer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm"¹ (oberer Maßstab) und als Ordinate die Transmissionen in Prozent aufgetragen sind.

In der nachfolgenden Tabellen sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption für dieses Produkt angegeben.

Tabelle II

3400 sst	1160 m
2910 st	1100 m
1730 sst	1062 sst
1547 m	1042 Sch
1525 st	1030 Sch
etwa 1430 Sch	972 m
1378 st	947 m
1330 m	890 sch
1238 m	860 sch
sst = sehr stark	sch = schwach
st = stark	Sch = Schulter
m = mittel

Die bakteriostatische Wirkung von 11837 R. P. gegenüber einer gewissen Zahl von Keimen wurde durch eine der üblicherweise zu diesem Zweck angewendeten Verdünnungsmethoden bestimmt. Für jeden Keim wurde die kleinste Konzentration an Substanz, die unter bestimmten Bedingungen jegliche sichtbare Entwicklung in einer geeigneten Nährbouillon verhindert, bestimmt. Die Ergebnisse der verschiedenen Bestimmungen sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt, in der die minimalen bakteriostatischen Konzentrationen in Mikrogramm Substanz je Kubikzentimeter Versuchsmedium ausgedrückt sind.

Diese verschiedenen Bestimmungen zeigen, daß "die Wirksamkeit von 11837R.P. hauptsächlich bei den Keimen auftritt, die die Färbung nach Gram aufnelrmen: Seine Wirksamkeit gegen Streptococcus haemolyticus ist besonders hoch. Es ist verhältnismäßig wenig wirksam gegenüber gramnegativen Keimen, obgleich seine Wirksamkeiten gegenüber Neisseria catarrhalis, Neisseria gonorrhaeae und Bruceila abortus bovis beträchtlich sind. Es zeigt keine gekreuzte Resistenz mit den folgenden Antibiotica: Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Spiramycin, Carbomycin, Erythromycin, Pristinamycin und Novobiocin. Die Ergebnisse verschiedener Bestimmungen der bakteriostatischen Konzentrationen von 11837 R. P. gegenüber verschiedenen Stämmen von Staphylococcus, die gegen eines oder mehrere der obengenannten Antibiotica eine Resistenz zeigen, sind in der Tabelle IV zusammengestellt, in der zu Vergleichszwecken die relativen bakteriostatischen Konzentrationen für drei Stämme von Staphylococcus, die gegen alle diese Antibiotica empfindlich sind und in Tabelle III angegeben sind, aufgenommen wurden.

Tabelle III

Geprüfte Bakterienstämme Minimale bakteriostatische
Konzentration in μg/cπl³

Staphylococcus aureus, Stamm 209 P-ATCC 6538 P

Staphylococcus aureus, Stamm 133 (Institut Pasteur)

Staphylococcus aureus, Stamm Smith

Sarcina lutea — ATCC 9341 , ·

Streptococcus f aecalis — ATCC 9790

Streptococcus viridans — (Institut Pasteur)

Streptococcus pyogenes haemolyticus (Stamm Dig 7, Institut Pasteur)

Neisseria gonorrhaeae (A 50 — Institut Pasteur)

Diplococcus pneumoniae (Stamm TiI, Institut Pasteur)

Bacillus subtilis — ATCC 6633

Bacillus cereus — ATCC 6630

Mycobacterium species — ATCC 607

Mycobacterium para-smegmatis (A 75 — Lausanne)

Escherichia coli — ATCC9637

Shigella dysenteriae — Shiga L (Institut Pasteur)

Salmonella paratyphi A (Lacasse, Institut Pasteur)

Salmonella schottmuelleri (parathyphi B) Fougenc (Institut Pasteur) .

Proteus vulgaris — A 244 -..-...

Klebsiella pneumoniae — ATCC10031

Pseudomonas aeruginosa (Stamm Bass — Institut Pasteur)

Brucella bronchiseptica (CN-387 — Wellcome Institut)

Bruceila abortus bovis B 19

Pasteurella multocida (A 125, Institut Pasteur)

Treponema von Reiter

0,15
0,15
0,35
150

50
0,6
0,005
1,25
0,03
3
0,03

35

65

35

40

55

30
165

60

40
9

2,5
1,5

20

Tabelle IV

Geprüfte Bakterienstämme (Staphylococcus aureus) Minimale bakteriostatische Konzentration in μg/cm³

Stamm 209 P-ATCC 6538 P (s)

Stamm 209 P gegen Spiramycin resistent gemacht

Stamm 209 P gegen Carbomycin resistent gemacht

Stamm 209 P gegen Pristinamycin resistent gemacht

Stamm 209 P gegen Novobiocin resistent gemacht

Stamm 133 (Institut Pasteur) (s)

Stamm Smith (s)

Stamm B₃ (resistent gegen Penicillin und Streptomycin)

Stamm Hb (resistent gegen Penicillin und Tetracyclin)

Stamm Beaujon 3 (resistent gegen Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin und Chloramphenicol)

Stamm MB I (resistent gegen Penicillin und Erythromycin) ;.

Stamm Lavault (resistent gegen Penicillin, Erythromycin und Spiramycin)

0,15

0,2

0,15

0,25

0,1

0,15

0,35

0,2

0,3

0,3
0,1
0,1

Die antibakterielle Wirksamkeit von 11837 R. P. wurde in vivo bei Laboratoriumstieren bestätigt, die experimentell mit Keimen, wie beispielsweise Streptokokken, Pneumokokken, Staphylokokken und Neisseria (N. meningitidis), infiziert worden waren. Das Antibioticum ist besonders bei der Maus auf parenteralem Wege wirksam, wobei die Wirksamkeit bei intravenöser Verabreichung zweimal größer als bei subcutaner Verabreichung ist.

Das Antibioticum besitzt eine sehr lange Wirkungsdauer, was ihm eine sehr gute präventive Wirksamkeit verleiht. Diese präventive Wirkung wurde bei Staphylokokken- und Streptokokkeninfektionen bei der Maus gezeigt. So wurde beispielsweise festgestellt, daß 11837 R. P. bei einer Dosis von 250 mg/kg i. v. alle Mäuse gegen eine intraperitoneale Infektion durch Streptokokken 56 Tage nach einmaliger Verabreichung des Produkts schützte. Bei der gleichen Dosis (250 mg/kg), jedoch bei subcutaner Verabreichung, schützt das Benzathin-Penicil-Hn G Mäuse nur während 24 Stunden.

Die Toxizität von 11837 R. P. wurde hauptsächlich bei der Maus bestimmt. Die Dosis letalis 50% oder DL₆₀ wurde bei subcutaner und intravenöser Verabreichung bestimmt:

DL₅₀ = 1,7 g/kg s. c.
DL₅₀ = 1,5 g/kg i.v.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Produkt sehr wenig toxisch ist.

Der das Antibioticum 11837 R. P. erzeugende Organismus gehört zum Genus Streptomyces und wird mit dem Namen »Streptomyces viridans DS 9466« bezeichnet. Er wurde im Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, USA., unter der Nr. »NRRL 3087« hinterlegt.

Dieser Organismus wurde aus einer in der Nähe von Madras in Indien entnommenen Erdprobe isoliert.

Die Isolierungsmethode ist die folgende: Die entnommene Erdprobe wird in destilliertem, sterilem Wasser suspendiert und die Suspension dann auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Ein kleines Volumen jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Petrischalen aufgebracht, die ein Agar-Nährmedium enthalten.

Nach Inkubation von einigen Tagen bei 26° C werden die Kolonien der Mikroorganismen, die man isolieren will, auf Schrägagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten.

Gemäß der Klassifikation von »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage (1957), für den Genus Streptomyces sowie gemäß der Klassifikation und der Beschreibungen, die von S. A. Waksman in »The Actinomycetes«, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1961), angegeben sind, stellt man fest, daß die morphologischen Charakteristiken des das Antibioticum 11837 R. P. erzeugenden Organismus den für Streptomyces viridans beschriebenen entsprechen. Dies ist der Grund, warum der 11837 R. P. erzeugende Organismus als zu dieser Species gehörig angesehen und Streptomyces viridans DS 4966 genannt wurde.

In der folgenden Tabelle V sind die Charakteristiken des Stammes Streptomyces viridans DS 9466 parallel zur Beschreibung der Species Streptomyces viridans, wie sie in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 7. Auflage [1957] (The Williams and Wilkins Company, Baltimore), gegeben ist, angegeben. Dieser Vergleich zeigt gut, daß der 11837 R. P. erzeugende Organismus Eigenschaften aufweist, die mit den für Streptomyces viridans beschriebenen übereinstimmen. Einige vorhandene geringe Unterschiede lassen sich nur als verschiedene Stämme ein und der gleichen Species deuten.

Streptomyces viridans DS 9466 besitzt die Eigenschaft, auf gewissen Kulturmedien, insbesondere dem Medium nach Bennett, ein lösliches grünes Pigment zu produzieren, das zu Beginn seiner Produktion und dann, wenn es in ausreichender Menge gebildet ist, eine intensive smaragdgrüne Färbung aufweist. Diese Bildung von smaradgrünem Pigment ist ziemlich willkürlich und hängt insbesondere von der Intensität der Mikroorganismenbeimpfung auf den Medien, auf denen der Mikroorganismus erzeugt wird, ab. Diese Bildung wird durch die Anwesenheit von Erde begünstigt. Das Smaragdgrün, das das Substrat aufweist, bleibt nicht intakt und schlägt im Laufe des Alterns je nach den Kulturmedien und je nach der erzeugten Menge in Grünschwärzlich oder Grünbräunlich oder Braungräulich um.

Tabelle V

Streptomyces viridans
(Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage,
S. 758 bis 759)

Streptomyces viridans DS 9466

Vegetatives
Wachstum

Luftausgesetztes
Mycel

Gelatine
Agar

Synthetischer
Agar

Grüne bis braungrüne
Kolonien

Dunkelgrau, oliv oder graugrün gefärbt, samtartig, bedeckt die gesamte Kolonie.
Lange Sporophoren, die
Spiralen bilden. Zylindrische Sporen

Rasche Verflüssigung

Braungrünes Wachstum.
Bildung von löslichem
braunem Pigment '

Grüne Kolonien. Bildung von
löslichem grünem Pigment

Saccharose
Stärke
Cellulose
Nitrite

Antagonistische
Eigenschaften

Koagulation und rasche
Peptonisation

Rasche Inversion
Rasche Hydrolyse
Schlechtes Wachstum
Aktive Bildung aus Nitraten
Keine

Gelbgräuliches bis lebhaft gelbes oder gelbbräunliches vegetatives Mycel. Auf gewissen Medien färbt es sich in einer grünen Farbe, die bis zu Braungrün oder Grünschwärzlich in den Zonen umschlägt, in denen das lösliche grüne Pigment erzeugt wird

Hellgrau bis dunkelgrau, pulverig, gut entwickelt. Lange monopode Sporophoren, die durch zu abschließenden Büscheln eingezogene Sporenketten beendet sind; können Verzweigungen längs ihres Hauptstiels aufweisen. Gewundene Sporenketten oder solche, die kurze Spiralen bilden. Zylindrische Sporen

Mäßige Verflüssigung

Gelbes oder bräunliches bis braungrünes Wachstum, je nach den Medien. Kein oder bräunliches lösliches Pigment; außerdem je nach dem Fall fakultative und mehr oder weniger regelmäßige Bildung von löslichem grünem Pigment

Gelbliches bis bräunliches vegetatives Mycel, das sich während der Bildung von löslichem grünem Pigment grün färbt. Kein oder gelbliches oder bräunliches Pigment, meistens wenig intensiv. In gewissen Fällen Bildung von löslichem grünem Pigment in kleiner Menge (Glycerin-Asparagin-Agar, Agar mit Stärke nach Waksman) oder in reichlicherer Menge (Agar nach Czapek mit Glycerin); in letzterem Fall wurde ein günstiger Einfluß der Anwesenheit von Erde festgestellt

Lange Peptonisation, der keine Koagulation bei 25° C vorhergeht, mit schwacher Koagulation bei 37° C

Schlecht verwertet

Ziemlich rasche Hydrolyse

Positives Wachstum

Rasche und starke Bildung aus Nitraten

Erzeuger von 11837 R. P.

Streptomyces viridans DS 9466 weist einen luftausgesetzten sporulierten Teil von ziemlich dunkelgrauer Farbe auf, der auf einer gewissen Zahl von üblichen Kulturmedien, insbesondere dem Medium nach Bennett, gut entwickelt ist. Er bildet zylindrische Sporen mit Abmessungen von 0,7 bis 0,9 μ Breite und 1,3 bis 1,5 μ Länge. Seine Sporophoren sind monopod eingesetzt; sie bilden recht häufig einen verzweigten Teil mit kompliziertem Bau. Gewisse Sporenfäden tragen eine einzige Sporenkette, doch endet der luftausgesetzte Faden häufig in einem Büschel von mehreren Sporenfäden, am häufigsten zwei bis vier Sporenfäden, die an der gleichen Stelle an seinem Ende eingefügt sind; einer oder mehrere der am Ende des Hauptfadens angefügten Fäden können sich gegebenenfalls ihrerseits an ihrem endständigen Teil teilen, um so ebenfalls neue Gruppen von zwei bis vier Sporenketten zu bilden. Längs des Hauptfadens und der Sekundärfäden beobachtet man häufig Verzweigungen, die entweder von einem einzigen Sporenfaden, der durch eine einzige Sporenkette endet, oder durch einen einzigen Faden, der durch mehrere an der gleichen endständigen Stelle eingesetzte Sporenketten endet, oder bisweilen durch zwei oder drei Sporenfäden, die an der gleichen Stelle eingefügt sind und gegebenenfalls endständige Verzweigungen tragen, gebildet werden. Die Sporenketten sind gewunden mit einfach umgebogenen Enden, oder sie rollen sich ein, wobei sie ein oder zwei Spiraldrehungen beschreiben, die im allgemeinen offene Spiralen bilden.

Die Züchtungseigenschaften und biochemischen Eigenschaften von Streptomyces viridans DS 9466 wurden auf üblicherweise zur Prüfung des Aussehens von Stämmen von Streptomyces verwendeten Agar-Nährmedien und Nährbouillons geprüft. Die erhaltenen Beobachtungen sind in der folgenden Tabelle VI zusammengestellt. Ohne besondere genaue Angaben betreffen sie Kulturen von 2 bis 4 Wochen bei 26° C, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben. Der größte Teil der verwendeten Kulturmedien wurde nach den in »The Actinomycetes«, S. A. Waksman, S. 193 bis 197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA., 1950, angegebenen Rezepturen hergestellt; in diesem Falle sind sie mit dem Buchstaben W, dem die Nummer, die ihnen mit »The Actinomycetes« gegeben ist, folgt, bezeichnet.

Tabelle VI

10

Kulturmedium
(D

Entwicklungs
grad

(2)

Vegetatives Mycel

oder
Unterseite der Kultur

(3)

Luftausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von luftausgesetztem Mycel und Sporulation)

(4)

Lösliches Pigment (5)

Beobachtungen

und biochemische Eigenschaften

(6)

Agar nach Bennett
(Anm. A)

Maltose-Trypton-Agar (Anm. B)

Agar nach Emerson (W-23)

Glucose-Pepton-Agar (W-7)

Nähr-Agar (W-S)

Glucose-Asparagin-Agar (W-2)

Glycerin-Asparagin-Agar (W-3)

Agar mit Calciummalatnach Krainsky(Anm. C)

Agar mit Tyrosin
(Anm. D)

Agar mit Stärke
(W-Il)

Agar mit Stärke
nach Pridham
(Anm. E)

Synthetischer Agar
nach Czapek mit
Glycerin (Anm. F)

Kultur auf Kartoffeln (W-27)

Reine Gelatine,
12»/oige (Anm. G)

Nitrathaltige Nährbouillon (Anm. H)

Glucose-Nitrat-Bouillon nach
Dimmick
(Anm.I)

Synthetische Bouillon nach Czapek
mit Cellulose
(Anm. J)

gut

gut

mittel

mittel

gering

mittel

mäßig

gut

gut

mäßig

gut

gut

ziemlich
gut

mittel

gut

mäßig

ziemlich
gut

Unterseite gelbbräunlich, färbt sich braungrün an Stellen, wo lösliches grünes Pigment erzeugt wird

Unterseite braungelbgräulich

Hellbraungelb, gut entwickelt

Hellgelb. Ziemlich gut entwickelt

Hellgelbgräulich. Mäßige Entwicklung

Lebhaft gelb bis gelbbraun

Gelbbräunlich mit unregelmäßiger Spur von grünlich

Unterseite hellgelbgräulich

Unterseite braungelb

Unterseite graugrünlich bis dunkelbraungrün

Unterseite hellgelbgräulich

Unterseite hellgelbbraun bis braungelb. Färbt sich ferner dunkelbraungrün im Bereich, wo lösliches grünes Pigment erzeugt wird

Vegetatives Mycel braungelbgrünlich bis sehr dunkelgrün, wird durch Altern braunschwärzlich

Kultur an der Oberfläche auf den Bereich der Beimpfungsstelle beschränkt. Unterseite gelb

Weißlicher Ring an der Oberfläche

Schwacher Ring und an der Oberfläche sehr mäßig entwickelter Schleier. Weißgräulich bis hellgelblich

Hellgräulich bis dunkelgrau, gut entwickelt

Weißlich bis grau

Weißlich, in Form von Spuren

Weißlich. Sehr

Keiner

Nach 2 Wochen keiner. In den alten Kulturen Entwicklung mäßig, weißlich bis gräulich

Weißgräulich bis hellgrau, Entwicklung sehr mäßig

Weißlich bis hellgrau

Weißlich. Mäßig entwickelt

Weißlich bis grau. Mäßig entwickelt

Hellgrau, ziemlich gut entwickelt

Weißlich bis grau

Weißlich bis hellgrau, mäßige Entwicklung

Weißlich bis gräulich. Mäßige Entwicklung

Sehr verminderte Entwicklung. Weißlich

Keiner oder weißlich, in Form von Spuren

Grau. Gut entwickelt auf dem ganzen Teil des aus der Bouillon ausgetauchten Papiers

Grün, wird durch Altern graugrünlich bis sehr dunkelbraungrün, geht bis zu schwärzlich, je nach der erzeugten Menge

Graubrännlich, wenig intensiv

Keines

Gelblich, wenig intensiv

Keines

Keines in 2 Wochen. In 1 Monat gräulich bis graugrünlich, in geringer Menge

Graubräunlich, wenig intensiv, ferner unregelmäßig geringe Menge grünlich bis graugrün

Keines oder spät, gräulich, wenig intensiv

Braungelb

Graugrünlich bis grüngräulich

Keines

Hellgelbbraun bis hellbraungelb. Wenn Medium mit Erde versetzt ist, ferner Produktion von grünem löslichem Pigment, das beim Altern braungräulich bis sehr dunkelbraungrün, fast schwärzlich wird

Mehr oder weniger spät erzeugt. Reichlich. Sehr dunkelgrün, wird schwarzgrünlich, diffundiert in jede Kartoffel

Späte Bildung. In 2 Wochen keines. In 1 Monat hellgelblich

Keine

Sehr blaßgelb

Keines

Die Produktion von löslichem grünem Pigment wird durch Anwesenheit von Erde begünstigt

Löslichmachung von Calciummalat

Gute Löslichmachung von Tyrosin

Mittlere Hydrolyse von Stärke

Die Anwesenheit von Erde beeinflußt die Produktion von löslichem grünem Pigment auf diesem Medium erheblich

Verflüssigung von Gelatine positiv, aber verhältnismäßig langsam, in 1 Monat unvollständig

Untersuchung von Nitriten stark positiv

Untersuchung von Nitriten stark positiv

Untersuchung von Nitriten stark positiv

609 540/376

	Ent	Vegetatives Mycel	Luftausgesetzter Teil (umfaßt Gesamtheit von	Lösliches Pigment	Beobachtungen
Kulturmedium	wicklungs	oder	luftausgesetztem Mycel		und
	grad	Unterseite der Kultur	und Sporulation)	(5)	biochemische Eigenschaften
(1)	(2)	(3)	'_■■ (4)		(6)
Magermilch
(Anm. K)
a) bei 26° C	gut	Ring gut entwickelt.	Keiner bis geringe		In 2 Wochen unver
		Sehr blaßgelblich	Spuren, weißlich		ändertes Aussehen von
					Milch. Dann langsame
					Peptonisation, fast
					vollständig nach
					1 Monat Züchtung.
					Keine Koagulation.
					pH geht hi I Monat
					von 6,3 auf 7,2 bis 7,4
b) bei 37° C	ziemlich	Ring mittelmäßig ent	Keiner bis geringe		In 2 Wochen unver
	gut	wickelt. Hellgelb bis	Spuren, weißlich		ändertes Aussehen von
		hellbraungelb			Milch. Nach 3 bis
					4 Wochen Züchtung
					schwache Koagulation
					mit Peptonisations-
					beginn.
					pH geht in 1 Monat
					von 6,3 auf 5,0 bis 6,1
Medium nach.					Produktion von H2S
Tresner und					negativ
Danga (Anm. L)

Anmerkungen:

Literaturstellen oder Zusammensetzungen der Kulturmedien

Anm. A: K. L. Jones, Journal of Bacteriology, 57, S. (1949).

Anm. B: A. M. Williams und E.McCoy, Applied Microbiology, I, S. 307 (1953).

Anm. C: Grundy und Mitarbeiter, Antibiotics and Chem.,, 2, S. 401 (1952).

Anm. D: Pepton 0,5%, Fleischextrakt 0,3%,' Tyrosin 0,5%, Agar 2%.

Anm. E: Anorganische Salze — Stärke — Agar, T. G. P r i d harn und Mitarbeiter, Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 947 bis 953. ' ^;

Anm. F: Entspricht der Rezeptur W-I, wobei 30 g Saccharose durch 15g Glycerin ersetzt sind.

Anm. G: »Vollgelatine« — hergestellt nach den Angaben in »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva, N. Y., H₅₀ — 18.

Anm. H: Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria — Society of American Bacteriologists, Geneva, N. Y., 1I₆₀ — 18.

Anm. I: Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria — Society of American Bacteriologists, Geneva, N. Y., H₅₀ — 19.

Anm. J: Entspricht der Rezeptur W-18, wobei Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen, ersetzt ist.

Anm. K: Handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers angemacht.

Anm.L: H.D.Tresner und F.Danga, Journal of Bacteriology, 76„ S.. 239 bis 244 (1958).

Nach dem Prinzip der Methode von Pridham und Gottlieb (J. of Bact.,. 56, S. 107 bis 114, 1948) verwertet Streptomyces viridans DS 9466 als Kohlenstoffquellen die folgenden Elemente gut: Xylose, Arabinose, Rhamnose, Glucose, Galactose, Lävulose, Mannose, Lactose, Maltose, Trehalose, Cellobiose, Dextrin, Stärke, Inulin, Erythrit, Adonit, Dulcit, Sorbit; die Verwertung von Saccharose ist gering und langsam,; fast null in 10 Tagen und ermöglicht nur eine schlechte Entwicklung in 1 Monat.

Das Herstellungsverfahren des Antibioticums 11837 R. P. besteht im wesentlichen darin, Streptomyces viridans DS 9466 auf geeigneten Medien und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und anschließend das im Verlauf der Züchtung gebildete Antibioticum abzutrennen.

Die Züchtung von Streptomyces viridans DS 9466 kann nach jeder . beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Immersionszüchtungsmethode erfolgen, doch ist letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Technik der Fermentationen verwendet werden.

Insbesondere kann man den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Streptomyces viridans DS 9466 — Stammansatz

Kultur auf Agar

\
Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermentationsgefäß
Produktionskultur im Fermentationsgefäß

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle dieses Elemente in- Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Dextrine, Stärke, Melasse, oder andere

Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthaltende Substanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, wie Mannit u. dgl., oder gewisse organische Säuren, wie Milchsäure, Citronensäure, Weinsäure u. dgl., verwenden. Gewisse tierische und pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff enthaltenden Quellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise Nitrate, anorganische und organische Ammoniumsalze, Harnstoff und Aminosäuren sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in proteidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysaten, Sojamehlen, Arachismehlen, Fischmehlen] Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers' solubles und Maisquellwasser.

Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumcarbonate.

Andere Nbewirken das zur Entwicklung von Streptomyces, viridans DS 9466 und zur Erzeugung des Antibioticums erforderliche Ionengleichgewicht, wie beispielsweise die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in spezieller Art als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen von Streptomyces viridans DS 9466. Zu diesen gehören die Zink-, Kobalt-, Eisen-, Kupfer- und Mangansalze.

Zu Beginn der Züchtung soll der pH-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5, liegen. Die zur Züchtung optimale Temperatur beträgt 25 bis 28° C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 35° C eine befriedigende Produktion erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann zwischen weiten Grenzwerten schwanken. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 21 Luft je Liter Bouillon und Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an Antibioticum wird nach 4- bis 7tätiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.

Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, daß die zur Produktion des Antibioticums 11837 R. P. angewendeten allgemeinen Bedingungen der Züchtung von Streptomyces viridans DS 9466 in ziemlich weitem Maße variieren und jedem besonderen Erfordernis angepaßt werden können.

Das Antibioticum 11837 R. P. kann aus den Fermentationsmaischen nach verschiedenen Methoden isoliert werden.

Die Fermentationsmaische kann bei einem pH-Wert über oder gleich 7 filtriert werden, doch verbleibt unter diesen Bedingungen ein beträchtlicher Teil der Aktivität in dem Filterkuchen, der dann ebenfalls behandelt werden muß, um das wirksame Produkt zu extrahieren. Es ist daher zu bevorzugen, das Filtrieren bei einem pH-Wert unterhalb 5 und vorzugsweise in der Nähe von pH 3 vorzunehmen. Unter diesen Bedingungen verbleibt die gesamte Aktivität in dem Filterkuchen, aus dem sie bei einem pH-Wert zwischen 3 und 7 mit Wasser, das einen Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht, wie beispielsweise Methanol, Äthanol oder Propanol enthält, oder mit einem Gemisch von niedrigen aliphatischen Alkoholen mit höchstens 6 Kohlenstoffatomen extrahiert werden kann, wobei das geeignetste Gemisch n-Butanol und Methanol in Mengenanteilen von 2:1 oder 3:1, bezogen auf das Volumen, enthält. Man kann die Fermentationsbrühe auch durch

ίο eine Säule leiten, die ein Ionenaustauscherharz mit stark anionischem Charakter enthält, und dann die Säule mit einem wäßrig-alkoholischen Lösungsmittel, wie beispielsweise wäßrigem Methanol, das einen Elektrolyten enthält, eluieren.

Das Rohprodukt kann aus den oben angegebenen alkoholischen oder wäßrig-alkoholischen Lösungen durch Einengen der Lösung auf ein kleines Volumen isoliert werden. Dieses Einengen läßt sich bequem bei einer Temperatur unterhalb 40° C unter

ao vermindertem Druck vornehmen. Durch Abkühlen und/oder durch Zugabe eines schlechten Lösungsmittels für 11837 R. P., wie beispielsweise eines Ketons, eines Äthers, eines Esters, eines chlorierten Lösungsmittels, von Benzol oder Hexan, fällt das rohe Antibioticum aus. Wenn sich das Antibioticum in dem Filtrat der Kulturbrühen befindet, unterwirft man diese Lösung einer Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie beispielsweise einem aliphatischen Alkohol mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen. Man verfährt dann wie oben angegeben: Einengen auf ein kleines Volumen und Ausfällung.

Das Antibioticum 11837 R. P. kann dann durch Binden an ein Ionenaustauscherharz mit stark anionischem Charakter und anschließende Elution mit einer wäßrig-alkoholischen Lösung, die einen Elektrolyten, wie beispielsweise Salzsäure oder Natrium-, Ammonium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumchlorid in einer Menge von 5 bis 50 g/l Elutionsmittel, enthält, gereinigt werden. Das Eluat wird dann auf ein geringes Volumen bei einer Temperatur unterhalb 40° C unter vermindertem Druck eingeengt, und das Konzentrat wird einer Gegenstromdialyse gegen einen Strom destillierten Wassers mittels einer Membran aus regenerierter Cellulose unterworfen. Die Mineralsalze und verschiedene Verunreinigungen werden von dem Wasser mitgeführt, und das Antibioticum 11837 R.P. verbleibt in seiner Gesamtheit in der dialysierten Lösung. Diese letztere wird azeotrop durch Zugabe von Butanol unter vermindertem Druck auf ein sehr kleines Volumen eingeengt. Das gereinigte Antibioticum wird aus dem wäßrigen Konzentrat mit einem Gemisch von Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton und Isopropanol, gegebenenfalls unter Zusatz von Äther oder Isopropyläther in solchen Mengenanteilen, daß keine Entmischung während des Mischens mit der wäßrigen Phase auftritt, ausgefällt. Bevorzugte Gemische sind Aceton—Isopropanol (4:1 Volumina)

und Aceton—Isopropanol—Äther (1:1:1 Volumina). Man kann das Antibioticum einer zweiten Reinigung unterziehen, die darin besteht, eine wäßrige Lösung von 11837 R. P. mit einem Ionenaustauscherharz mit stark kationischem Charakter zu rühren, bis ein konstanter pH-Wert zwischen 2 und 3 erreicht ist. Der Abfluß wird anschließend mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie beispielsweise einem aliphatischen Alkohol mit 4 oder

5 Kohlenstoffatomen oder einem Ester, wie beispielsweise Essigsäureäthylester, oder einem Gemisch solcher Lösungsmittel, gewaschen. Man arbeitet vorzugsweise mit einem Gemisch gleicher Volumina n-Butanol und Essigsäureäthylester. Die wäßrige Phase wird auf ein Hundertstel eingeengt, mit Butanol versetzt und unter vermindertem Druck unter weiterer Zugabe von Butanol eingeengt. Das gereinigte Antibioticum 11837 R. P. wird durch Zugabe eines schlechten Lösungsmittels für das Antibioticum, wie beispielsweise Hexan, Zentrifugieren, Waschen und Trocknen, erhalten.

Es ist ersichtlich, daß die verschiedenen angegebenen Methoden nacheinander in verschiedener Reihenfolge oder mehrere Male wiederholt angewendet werden können, je nach den Herstellungs-. erfordernissen, um das Antibioticum 11837 R. P. in für die vorgesehenen Anwendungszwecke geeigneter Form zu erhalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Im folgenden wird die Aktivität stets durch biologische Bestimmung nach der Diffusionsmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis als empfindlichem Keim und bezogen auf eine reine Probe von 11837 R. P. als Eichmaß bestimmt. Diese Aktivität ist in Einheiten (E) je Milligramm für die festen Produkte und in Einheiten je Kubikzentimeter für Lösungen ausgedrückt (die Einheit ist als kleinste Menge des Produkts definiert, die, gelöst in 1 ecm eines geeigneten Kulturmediums, das Wachstum von Staphylococcus aureus 209 P unter bestimmten Bedingungen inhibiert).

Beispiel 1

In ein 170-1-Fermentationsgefäß bringt man die folgenden Bestandteile ein:

Maisquellwasser 4,800 kg

Hydratisierte Glucose 2,400 kg

Natriumchlorid 0,600 kg

Magnesiumsulfat 0,120 kg

Wasser ad 1001

Nach Einstellung des pH-Wertes des Gemisches auf 7,15 mit 575 ecm konzentrierter Natronlauge (d = 1,33) setzt man noch 0,600 kg Calciumcarbonat zu.

Das Kulturmedium wird dann durch 40minutiges Durchleiten vom Dampf von 122° C sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 1201 und der pH-Wert 7,15. Das Medium wird dann mit 200 ecm einer gerührten bzw. geschütteten Erlenmeyer-Kultur des Stammes Streptomyces viridans DS 9466 beimpft. Die Züchtung wird 28 Stunden bei 26° C unter Bewegen und unter Belüftung mit steriler Luft entwickelt. Sie ist dann zur Beimpfung der Produktionskultur geeignet.

Die Produktionskultur wird in einem 350-1-Fermentationsgefäß durchgeführt, das mit folgenden Substanzen beschickt ist:

Sojamehl 8 kg

. Distillers solubles . .. . 1 kg

Stärke 3kg

Sojaöl 31

Calciumcarbonat 2 kg

Natriumchlorid 2 kg

HydratisiertesKobaltchlorid(6H₂0) 4 g

Wasser ad 1801

Das Medium, dessen pH-Wert 7,05 beträgt, wird durch 40minutiges Durchleiten von Dampf von 122° C sterilisiert. Nach Abkühlen beträgt das Volumen der Bouillon 2001 und der pH-Wert 7,15.

Man beimpft mit 201 der obigen Impfkultur aus dem 170-1-Fermentationsgefäß. Die Züchtung wird während 138 Stunden bei 26 bis 27° C unter Bewegen und unter Belüften mit steriler Luft durchgeführt. Der pH-Wert des Mediums beträgt dann 7,90 und

ίο das Volumen der Maische 1801. Die in der Fermentationsmaische vorhandene Antibioticummenge beträgt 4515 E/ccm.

Beispiel 2

Die Impfkultur wird in einem 170-1-Fermentationsgefäß unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen vorgenommen.

Die Produktionskultur wird in einem 350-1-Fermentationsgefäß durchgeführt, das mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Maisquellwasser 6 kg

Stärke 2 kg

Sojaöl 31

_ag Hydratisiertes Kobaltchlorid (6 H₂O) 4 g Wasser ad 1751

Nach Einstellen des pH-Wertes des Gemisches mit 380 ecm konzentrierter Natronlauge (d = 1,33) auf 5,90 setzt man noch 1 kg Calciumcarbonat zu. Das Gemisch wird durch 40minutiges Durchleiten von Dampf von 122° C sterilisiert. Nach Abkühlen vervollständigt man das Kulturmedium durch sterile Zugabe der folgenden Lösung:

Ammoniumsulfat 0,4 kg

Wasser ad 51·

Das Volumen der Bouillon beträgt dann 2001 und ihr pH-Wert 6,80. Man beimpft mit 201 der Impfkultur aus dem 170-1-Fermentationsgefäß. Die Kultur wird 144 Stunden unter Bewegen und unter Belüften mit steriler Luft bei 26 bis 27° C entwickelt. Der End-pH-Wert der Kultur beträgt 8,40 und das Volumen der Fermentationsmaische 1851. Die in der Fermentationsmaische vorhandene Antibioticummenge beträgt 3550 E/ccm.

Beispiel 3

2001 Fermentationsbrühe mit einem Gehalt von 2855 E/ccm und einem pH-Wert, von 8,4 werden durch Zugabe von 5 η-Salzsäure auf pH 3 in einem mit einer Bewegungsrichtung ausgestatteten Bottich eingestellt. Man setzt dann 12 kg Filterhilfe zu. Das Gemisch wird auf einer Filterpresse filtriert und der Filterkuchen mit 60 Γ Leitungswasser gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit, die praktisch inaktiv sind, werden verworfen. Der Filterkuchen wird unter ■ Bewegen in .1501 eines Gemisches von Butanol (2 Volumina) und Methanol (1 Volumen) suspen-

diert.Der auftretende pH-Wert des Gemisches wird dann durch Zugabe einer 10 n-Natriumhydroxydlösung auf 6 eingestellt. Das Bewegen wird 30 Minuten fortgesetzt, und die Bouillon wird dann auf einer Filterpresse filtriert.

Das Filtrat wird gesammelt und der Filterkuchen mit 301 des oben beschriebenen Gemisches von Butanol und. Methanol gewaschen. Das gesamte Filtrat und die Waschflüssigkeit (1851) weisen einen

17.

Gehalt von 2075 E/ccm auf. Der Filterkuchen wird verworfen. Das alkoholische Filtrat wird unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei 35° C auf ein Volumen von 21 eingeengt.

Das im Verlaufe des Einengens ausgefallene Antibioticum wird durch Filtrieren isoliert, mit Aceton gewaschen und im Trockenschrank im Vakuum (5 mm Hg) getrocknet. Man erhält so 254 g graugrünes Produkt mit einem Gehalt von 1025 E/mg.

Beispiel 4

3751 Kulturbrühe mit einem pH-Wert von 7,9 werden zur Entfernung der gröbsten Teilchen gesiebt. Der pH-Wert wird mit 5 η-Salzsäure in einem Bottich unter Bewegen auf 7 eingestellt. Dann werden 22,51 Ionenaustauscherharz Dowex 1X 2 in der Chloridform zugegeben. Das Bewegen wird

2 Stunden fortgesetzt. Nach dieser Zeitspanne wird das Gemisch durch ein Vibrationssieb gesiebt. Das Harz wird auf dem Sieb zurückgehalten, und die abgetropfte Flüssigkeit wird verworfen. Das Harz wird anschließend in eine Säule eingebracht und nacheinander mit 501 einer wäßrigen 5%igen Natriumchloridlösung und dann mit 101 Wasser gewaschen. Das gewaschene Harz wird dann durch Durchleiten von 201 Methanol vom Wasser befreit. Die Elution wird mit einer Lösung von Methanol mit 20% Wasser und 2,8 % Ammoniumchlorid vorgenommen. Die Eluate werden alle 10 1 fraktioniert. Die drei ersten Elutionsfraktionen enthalten 98% der eluierten Aktivität. Sie werden vereinigt und unter vermindertem Druck (20 mm Hg) auf ein Volumen von

3 1 eingeengt. Die eingeengte Lösung mit einem Gehalt von 92 950 E/ccm und einer Dichte von 1,057 wird während 48 Stunden gegen destilliertes Wasser mittels einer Membran aus Cellophan dialysiert. Nach dieser Zeitspanne beträgt das Volumen der Lösung 4,71 und die Dichte 1,025. Die Lösung wird unter vermindertem Druck (5 mm Hg) auf 300 ecm eingeengt und dann lyophilisiert. Man erhält so 48 g Rohprodukt mit einem Gehalt von 6530 E/mg.

Beispiel 5

10 Volumina) versetzt, was die Ausfällung des Antibioticums bewirkt. Nach Filtrieren, Waschen mit Aceton und Trocknen über Nacht bei 35° C unter 2 mm Hg erhält man 8,25 g ernes hellbraunen Pulvers mit einem Gehalt von 24 600 E/mg.

Beispiel 6

7,9 g des gemäß Beispiel 5 erhaltenen Produkts

ίο werden in 790 ecm der schweren Phase, die aus einem η - Butanol - Essigsäureäthylester - Wasser - Gemisch (10:10:20 Volumina) abgetrennt wurde, gelöst und bis zu einem konstanten pH-Wert (2,1) mit Ionenaustauscherharz Amberlite IR 120 in der Säureform, das in kleinen Anteilen, insgesamt 50 ecm, zugegeben wird, gerührt. Das Harz wird abfiltriert und die erhaltene Lösung zweimal mit 790 ecm der leichten, von dem obigen Gemisch abgetrennten Phase gewaschen. Die Waschflüssigkeiten

ao werden ihrerseits mit einem gleichen Volumen der schweren Phase reextrahiert.

Die schweren Phasen werden vereinigt und unter vermindertem Druck (20 mm Hg) auf 15 ecm eingeengt. Das erhaltene wäßrige Konzentrat wird mit 20 Volumina eines Methanol - Äther - Gemisches (4 : 6 Volumina) versetzt. Das Antibioticum fällt aus und wird gesammelt. Man erhält 3,05 g einer ersten Fraktion mit einem Gehalt von 18300 E/mg.

Das Filtrat wird unter vermindertem Druck (20 mg Hg) bis auf ein Volumen von 100 ecm eingeengt. Man setzt dann 320 ecm Methanol und 35 ecm n-Butanol zu. Dann engt man unter vermindertem Druck (20 mg Hg) bei einer Temperatur unterhalb 40° C auf 15 ecm ein. Nach Zugabe von 15Volumina η-Hexan, Zentrifugieren, Waschen mit η-Hexan und Trocknen über Nacht bei 35° C unter 2 mm Hg erhält man 1,78 g gereinigtes Antibioticum mit einem Gehalt von 36000 E/mg.
Außerdem werden die vereinigten leichten Phasen unter vermindertem Druck (20 mg Hg) auf etwa 70 ecm eingeengt. Durch Zugabe von 15 Volumina η-Hexan isoliert man 1,5 g braunes Pulver mit einem Gehalt von 17 200 E/mg.

45

250 g des gemäß Beispiel 3 hergestellten rohen Antibioticums werden in 41 Wasser bei pH 8 gelöst.

Die wäßrige Lösung wird filtriert und dann durch eine 2,71 Ionenaustauscherharz Dowex 1X2 in der Chloridform enthaltende Säule geleitet. Der Abfluß wird verworfen. Das Harz wird mit 2,51 Wasser und dann mit 2,51 eines Methanol-Wasser-Gemisches (80:20 Volumina) gewaschen. Das Antibioticum wird schließlich mit 10 1 eines Methanol-Wasser-Gemisches (80:20 Volumina) mit einem Gehalt von 7,5 g Kaliumchlorid je Liter eluiert.

Das Eluat wird unter vermindertem Druck (20 mm Hg) bei einer Temperatur unterhalb 40° C auf 400 ecm eingeengt. Das Konzentrat wird 24 Stunden gegen einen Strom von destilliertem Wasser durch eine Membran aus regenerierter Cellulose dialysiert, um die Mineralsalze und verschiedene organische Verunreinigungen zu entfernen.

Die dialysierte Lösung, die die gesamte Aktivität des Eluats enthält (650 ecm), wird unter vermindertem Druck (20 mm Hg) auf 125 ecm eingeengt.

Das so erhaltene Konzentrat wird mit 20 Volumina eines Äther-Aceton-Isopropanol-Gemisches (10:10:

Beispiel 7

542 mg des gemäß Beispiel 6 hergestellten Antibioticums mit einem Gehalt von 36000 E/mg werden in 20 ecm Wasser gelöst. Der pH-Wert, der nach diesem Auflösen 2,3 beträgt, wird durch Zugabe von 8,9 ecm 0,1 η-Natronlauge auf 6,85 eingestellt, und die neutrale Lösung wird lyophilisiert. Man erhält so 565 mg Natriumsalz des Antibioticums, dessen wäßrige Lösung ein Absorptionsmaximum im Ultravioletten bei 256,5 πΐμ (E if_m = 106) aufweist. Seine Elementarzusammensetzung ist die folgende: C = 47,4%, H = 7,07%, O = 35,3% (durch Differenz), N = 5,01%, P = 1,84%, Na = 3,4%.

Beispiel 8

50 g des gemäß Beispiel 5 hergestellten Antibioticums werden in 500 ecm destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird über Nacht gegen 401 destilliertes Wasser durch eine Membran aus regenerierter Cellulose dialysiert.

Nach der Dialyse wird die Lösung des Antibioticums mit einem Volumen n-Propanol versetzt,

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Claims (1)

19 20

und das Gemisch wird in den oberen Teil einer Säule Gemisch durch eine Säule, die 100 ecm zuvor bei

eingebracht, die von unten nach oben mit folgenden pH 4 gewaschenes Aluminiumoxyd enthält, geleitet.

Bestandteilen beschickt ist: 75 g granulierte Aktiv- Die Entwicklung und Elution werden mit einem

kohle »Acticarbone BS 40-80«, die zuvor mit ver- n-Propanol-Wasser-Gemisch (50:50 Volumina)

dünnter Salzsäure gewaschen wurde, 125 ecm Am- 5 durchgeführt.

berlite IR 120 (H-Zyklus), 500 g granulierte Aktiv- Die aktiven Fraktionen werden vereinigt (430 ecm)

kohle der gleichen Qualität wie oben. und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur

Nach Durchleiten der Lösung des Antibioticums unterhalb 40⁰C auf 100 cmm eingeengt. Das Konfährt man fort, mit einem n-Propanol-Wasser-Ge- zentrat wird über Nacht gegen 101 destilliertes Wasmisch (50:50 Volumina) zu eluieren. Die aktiven ίο ser dialysiert. Das Dialysat wird mit 1 Volumen Fraktionen (71) werden zusammengefaßt, mit In- n-Propanol versetzt, und das aktive Material wird Natronlauge auf pH 7 neutralisiert und unter vermin- mit 10 Volumina Aceton ausgefällt. Man gewinnt so dertem Druck bei einer Temperatur unterhalb 40° C 12 g gereinigtes Antibioticum in Form des Natriumauf 140 ecm eingeengt. salzes mit einem Gehalt von 44000 E/mg, das die

Das Konzentrat wird 24 Stunden gegen viermal 15 folgenden Merkmale aufweist: C = 45,0%, H =

10 1 destilliertes Wasser dialysiert und dann mit 7,4%, O = 37,6% (durch Differenz), N =3,72%,

1 Volumen n-Propanol versetzt. P = 2,16%, Na = 4,15%.

Das Antibioticum wird dann durch Zugabe von [a]f =+6 ± 1° (c = 0,6% in Wasser); Ultra-

10 Volumina Aceton ausgefällt. Nach Isolieren und violettspektrum: Absorptionsende: 220 πΐμ, U\f_m 30;

Trocknen gewinnt man 23,5 g Antibioticum in 20 257 πΐμ, EJf_n 3,5.

Form seines Natriumsalzes mit einem Gehalt von ^

42400 E/mg. Patentanspruch:

Bei iei g Verwendung des Streptomyces viridans

^p . DS 9466 (NRRL 3087) zur Herstellung des Anti-

22-g des gemäß Beispiele hergestellten Anti- 25 bioticums 11837 R. P. durch aerobe Züchtung in

bioticums werden in 110 ecm Wasser gelöst. Die Lö- einem üblichen Nähnnedium und Gewinnung des

sung wird mit 110 ecm n-Propanol versetzt und das Antibioticums durch Extraktion.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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