DE1208302B - Verfahren zur Herstellung von D(-)- und L(ú½)-alpha-Aminobenzylpenicillin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

CO7d

Deutsche KL: 12 ρ-4/01

Nummer: 1 208 302

Aktenzeichen: N23 648IVd/12p

Anmeldetag: 24. August 1963

Auslegetag: 5. Januar 1966

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von D( —)- und L( -<- )-«-Aminobenzylpenicillin.

Aus der britischen Patentschrift 873 049 ist «-Aminobenzylpenicillin und dessen Verwendbarkeit als Antibiotikum mit breitem Wirkungsspektrum bekannt. Nach dem in dieser Patentschrift beschriebenen Verfahren wird «-Aminobenzylpenicillin durch Acylierung von 6-Aminopenicillansäure mit einem reaktionsfähigen Derivat der a-Carbobenzoxyaminophenylessigsäure und anschließende hydrierende Abspaltung der Carbobenzoxygruppe aus a-Carbobenzoxyaminobenzylpenicillin unter Verwendung eines Edelmetalls als Katalysator hergestellt. Nach der britischen Patentschrift 902 703 wird zur Herstellung einer optisch aktiven Form des a-Aminobenzylpenicillins so vorgegangen, daß aus optisch aktiver Aniinophenylessigsäure durch Umsetzung mit Carbobenzyloxychlorid zunächst Carbobenzyloxyaminophenylessigsäure hergestellt und diese dann in Gegenwart von Chlorkohlensäureäthylester mit 6-Aminopenicillansäure gekuppelt wird. Die so erhaltene Verbindung wird durch Hydrierung in Gegenwart von Palladium als Katalysator gespalten, wobei das gewünschte a-Aminobenzylpenicillin anfällt.

Es wurde nun gefunden, daß D( —)- und L(—)-ii-Aminobenzylpenicillin auch erhalten werden, wenn

Verfahren zur Herstellung von D( —)- und L(+ J-t-Ammobenzylpenicillin

Anmelder:

Novo Terapeutisk Laboratorium A/S, Kopenhagen

Vertreter:

Dr. D. Louis, Patentanwalt,

Nürnberg, Keßlerplatz 1

Als Erfinder benannt:

Eigil Bjerl Nielsen, Holte;

William Andersen, Lyngby (Dänemark)

Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 28. August 1962 (33 049), vom 26. Juli 1963

man eine Verbindung der allgemeinen Formel I

R^]

CH₂

NH-CH-CO A¹

NH-CH-CO

A² NH-CH-CH

/■ CHo ^X ■ CH₃

C-

N-

CH

COOR²

mit Chymotrypsin in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 6 bis 8 und bei einer Temperatur unterhalb 50 C enzymatisch spaltet.

In der Formel I bedeutet R¹ den Säurerest einer Carbonsäure oder Sulfonsäure. R'² eine salzbildende Gruppe, X ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, wobei der Aminosäurerest A¹ die L-Konfiguration und der Aminosäurerest A² die D- bzw. L-Konfiguration hat. Je nach der Konfiguration der Gruppe A² wird das d( —)- oder das l( + )-a-Aminobenzylpenicillin erhalten.

Die Proteinase Chymotrypsin hydrolisiert Verbindungen der allgemeinen Formel I. obwohl der Aminosäurerest A² in natürlichen Proteinen und Peptiden nicht vorkommt. Die Hydrolyse erfolgt auch unabhängig von der Konfiguration des Aminosäurerestes A². Die erfindungsgemäße Spaltung findet selektiv an der Peptidbindung zwischen den

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Aminosäureresten A¹ und A² statt, wodurch α-Aminobenzylpenicillin in hoher Ausbeute erhalten wird. Diese Tatbestände waren nicht vorhersehbar.

Die enzymatische Spaltung wird in einem wäßrigen Medium ausgeführt mit oder ohne Puffersubstanzen. Obgleich Chymotrypsin seine größte Aktivität bei einem pH-Wert zwischen 8 und 9 besitzt, wird erfindungsgemäß ein pH-Wert zwischen 6 und 8 eingestellt, weil in diesem Bereich sowohl die Ausgangsverbindung als auch das Endprodukt die größte Stabilität besitzen. Da die Penicilline bei Temperaturen von mehr als 50⁰C zerfallen, muß die enzymatische Spaltung unterhalb 50⁰C durchgeführt werden, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 30 und 40° C.

Die in der erfindungsgemäßen Weise zu spaltende Ausgangsverbindung kann durch Synthese aus einem N-blockierten Dipeptid der allgemeinen Formel

_Ri___Ai__A2_coOH

und 6-Aminopenicillansäure erhalten werden unter Anwendung hinlänglich bekannter Methoden der Peptidsynthese, z. B. unter Verwendung von Carbodiimiden oder mittels gemischter Anhydride oder dem Azid des Dipeptids. Gegenüber dem bekannten Verfahren des britischen Patents 902 703 hat die erfindungsgemäße Arbeitsweise folgende Vorteile: Bezogen auf 6-Aminopenicillansäure wird eine sehr viel höhere Ausbeute an reinem a-Aminobenzylpenicillin erhalten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist wirtschaftlicher. Durch die Verwendung des Palladiumkatalysators bei der Hydrierung in der letzten Stufe stellt sich das bekannte Verfahren sehr teuer, selbst unter Berücksichtigung der Tatsache, daß sich der größte Teil des Katalysators durch eine Regenerierung wiedergewinnen läßt, die ja ebenfalls aufwendig ist. Der Einsatz von Chymotrypsin als Spaltungsmittel in der letzten Stufe ist demgegenüber sehr viel günstiger.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen der Erläuterung der Erfindung. Für die Verfahren zur Herstellung der Ausgangsstoffe wird ein Schutz nicht begehrt.

Beispiel 1

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5 mg kristallines «t-Chymotrypsin (500 Kunitz-Gerinnungseinheiten pro Gramm), die in 0,5 ml Wasser aufgelöst sind, werden einer Lösung von 220 mg (345 μΜοΙ) des Natriumsalzes der 6-[N-Benzoyl-L-tyrosyl-D(—)-a-amino-a-phenylacetamido]-penicillansäure in 30 ml Wasser bei einem pH-Wert von 6,5 zugesetzt. Die Mischung wurde während 2 Stunden bei 35°C gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 1 η-Natronlauge auf 6,5 gehalten wurde.

Die Papierelektrophorese der erhaltenen Lösung zeigte, daß sie lediglich eine antibiotisch wirksame Substanz enthielt und daß die Wanderung dieser Substanz wesentlich verschieden von der des Ausgangsmaterials war. Eine Analyse der Lösung ergab, daß in ihr eine 120 mg reinem d(—)-a-Aminobenzylpenicillin (95% der Theorie) entsprechende Menge an Penicillin enthalten war.

Die Lösung wurde mit Salzsäure auf pH 2 angesäuert, und das ausgefällte N-Benzoyl-L-tyrosin wurde mit Diäthyläther extrahiert. Der pH-Wert der wäßrigen Phase wurde durch Zugabe von Natriumhydroxyd auf 4,65 erhöht. Hiernach wurde die Lösung einer Gefriertrocknung unterzogen.

Die Rekristallisation des bei der Gefriertrocknung erhaltenen Produkts aus Wasser ergab 90 mg reines D (—) - α - Aminobenzylpenicillin - Monohydrat mit einer Drehung {a]² _D° = +280° (c = 1 in Wasser).

Mikroanalyse:
Ermittelter Wert

C 52,4, H 5,9, N 11,8, S 8,8%;
theoretischer Wert

C 52,3, H 5,8, N 11,4, S 8,7%.

Die Ausgangsverbindung für die oben beschriebene enzymatische Spaltung kann in der folgenden Weise synthetisiert werden: N-Benzoyl-L-tyrosyl-D( )-a-phenylglycinhydrazid (3,0 g) wurde in einer Mischung aus Salzsäure und Essigsäure aufgelöst und bis auf — 10⁰C gekühlt, worauf Natriumnitrit in kalter wäßriger Lösung (1,0 g) zugesetzt wurde. Das ausgefällte Azid wurde abfiltriert und in Tetrahydrofuran aufgelöst. Die Lösung des Azids wurde umgesetzt mit einer Lösung des Triäthylammoniumsalzes der 6-Aminopenicillansäure (1,2 g) in 90% wäßrigem Tetrahydrofuran während 24 Stunden bei 4°C. Hiernach wurde 6-(N-Benzoyl-L-tyrosyl-D(—)-a-amino-a-phenylacetamido)-penicillansäure als Natriumsalz isoliert. Die Ausbeute des Salzes, das einen Reinheitsgrad von 95% besaß, war 2,05 g (55% der Theorie, berechnet auf 6-Aminopenicillansäure). Beispiel 2

2 mg kristallines a-Chymotrypsin, das in 0,5 ml Wasser gelöst war, wurde einer Lösung von 220 mg (345 μΜοΙ) des Natriumsalzes der 6-(N-Benzoyl-L-tyrosyl-L(+)-a-amino-o-phenylacetamido)-peniciI-lansäure in 30 ml Wasser mit einem pH-Wert von 6,5 zugesetzt. Die Mischung wurde IV2 Stunden bei 35°C gerührt, wobei der pH-Wert durch Zusatz von 1 η-Natronlauge auf 6,5 gehalten wurde.

Das gebildete L(+)-a-Aminobenzylpenicillin wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise in reinem Zustand isoliert, wobei 86 mg der Verbindung erhalten wurden: [a]f = +210° (c = 1 in Wasser). Mikroanalyse:

Ermittelter Wert
C 54,8, H 5,6, N 11,9, S 9,1%;

theoretischer Wert

C 55,0, H 5,5, N 12,0, S 9,2%.

Beispiel 3

5 mg kristallines a-Chymotrypsin, das in 0,5 ml Wasser aufgelöst ist, wurde einer Lösung von 205 mg (336μΜο1) des Natriumsalzes der 6-(N-AcetyI-L-tyrosyl-D(—)-a-amino-a-phenylacetamido)-penicillansäure in 35 ml einer Bicarbonat-Pufferlösung bei einem pH-Wert von 7,5 zugesetzt. Die Mischung wurde sich während 3 Stunden bei 30⁰C überlassen, wobei der pH-Wert durch Zugabe von 1 n-Natronlauge auf 7,5 gehalten wurde.

Das gebildete d(—)-a-Aminobenzyrpenieillin wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise in reinem Zustand isoliert, wobei 66 mg der Verbindung erhalten wurden.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von d(—)- und L(+)-a-Aminobenzylpenicillin,dadurch ge-

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kennzeichnet, daß man eine Penicillinverbindung der allgemeinen Formel X

R¹-!

CH₂

NH-CH-CO
A¹

NH — CH — CO

A² NH — CH — CH

c:

C-

N-

-CH₃ ^CH₃

CH

COOR²

in der R¹ der Säurerest einer Carbonsäure oder Sulfonsäure, R² eine salzbildende Gruppe und X ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe ist und der Aminosäurerest A¹ die L-Konfiguration und der Aminosäurerest A² die D- bzw. !.-Konfiguration hat, mit Chymotrypsin in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 6 bis 8 und bei einer Temperatur unterhalb 5OC in das d( —)- bzw. l( — )-a-AminobenzyIpenicillin enzymatisch spaltet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Spaltung bei einer Temperatur zwischen 30 und 40° C ausführt.

In Betracht gezogene Druckschriften:

Bekanntgemachte Unterlagen der belgischen Patente Nr. 608 669, 903 785;

britische Patentschriften Nr. 902 703, 903 785.

Bei der Bekanntmachung der Anmeldung ist ein Prioritätsbeleg ausgelegt worden.

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