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Verfahren zur Herstellung von therapeutisch wirksamen Steroidverbindungen
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von therapeutisch
wirksamen Steroidverbindungen der allgemeinen Formel
in der R Wasserstoff oder der Acylrest einer Carbonsäure, X der Rest -CH--, - CHOH
oder -CO und Y Wasserstoff oder der Methylrest ist und in der sich in I(2)-Stellung
eine weitere Doppelbindung befinden kann.
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Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man in an sich bekannter
Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel
in der Ac der Acylrest einer Carbonsäure ist, X den Rest 1:#: CH2> oder CHOH darstellt
und Y die oben angegebene Bedeutung hat, oxydativ hydroxyliert, gegebenenfalls die
11(3-ständige Hydroxylgruppe oxydiert, gegebenenfalls die 21-ständige Acyloxygruppe
hydrolysiert, gegebenenfalls die 1(2)-Stellung mikrobiologisch oder chemisch dehydriert
und gegebenenfalls die 21-ständige Hydroxylgruppewieder acyliert.
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Die oxydative Hydroxylierung kann nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift
2 769 825 mit Osmiumtetroxyd und einem Aminoxydperoxyd oder nach dem Verfahren der
USA.-Patentschrift 2 875 217 mit Osmiumtetroxyd und einem organischen Jodoxyd, z.
B. Phenyljodosoacetat, erreicht werden. Die llß-ständige Hydroxylgruppe wird gewöhnlich
mit Chromsäureanhydrid und Essigsäure, Chromtrioxyd und Schwefelsäure oder mit N-Halogenimiden
oder N-Halogenomiden in eine Ketogruppe umgewandelt. Für die Hydrolyse der 21-Acylate
verwendet man am besten Natrium- oder Kaliumbicarbonat in wäßrigem Alkohol. Dabei
wird unter Sauerstoffausschluß gearbeitet. Die fermentative Dehydrierung der I(2)-Stellung
wird z. B. mit Septomyxa, Corynebacterium, Fusarium u. dgl. erreicht. Bei Verwendung
von Septomyxa zur Dehydrierung wird vorteilhaft ein Steroidpromotor, wie Progesteron,
3-Keto-bisnor-4-cholen-22-al, 3-Keto-bis-nor-cholensäure, IIß,21-Dehydroxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on
usw. angewandt. Wird bei der fermentativen Dehydrierung ein 21-Acylat eingesetzt,
so wird dessen Estergruppe im Verlauf der Gärung gewöhnlich zum freien Alkohol hydrolysiert.
Er kann anschließend wieder verestert werden. Die chemische Dehydrierung kann mit
Selendioxyd vorgenommen werden (vgl. M e y s t r e und Mitarbeiter, Helv. Chim.
Acta, 39, S.734 [1956]). Für die chemische Dehydrierung werden im allgemeinen die
21-Acylate verwendet, die man anschließend zu den freien 21-Alkoholen hydrolysieren
kann.
Das folgende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren.
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Beispiel a) 16a-Fluormethylhydrocortison-21-acetat Zur Herstellung
des Ausgangsst-)ffes, 1133,21-Dihydroxy - 16a - fluormethyl - 4,17(20) - pregnadien-3-on-21-acetat,
für welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung Schutz nicht begehrt wird, wurde
eine Lösung von 1.41 g 16a-Fluormethyl-4-pregnen-3.11,20-trion (F. = 223 bis 226°C)
in tert.-Butanol unter Rühren und unter Stickstoff bei 60°C mit 2.68m1 Diäthyloxalat
und anschließend mit 2,23g
methanolischer Natriummethylatlösung (28,01 Gewichtsprozent)
behandelt. Es entstand fast augenblicklich ein gelber Niederschlag. Unter Rühren
wurde das Gemisch innerhalb von 15 Minuten von 60-C auf 25°C gekühlt. Dann wurde
eine eisgekühlte Lösung von 0,656g wasserfreiem Natriumacetat und 0,67 ml Essigsäure
in 27 ml Methanol zugegeben. Nach dem Abkühlen auf 0°C wurde tropfenweise mit einer
gekühlten Lösung von 1,875 g Brom in 19 ml Methanol oder bis zur bleibenden Bromfärbung
versetzt. Dann wurde das Kältebad entfernt. Anschließend behandelte man mit 5,16
g 28,1%iger, methanolischer Natriummethylatlösung und rührte eine weitere Stunde.
Danach gab man 1,5 g Zink und 3 ml Essigsäure zu, rührte nochmals etwa 40 Minuten
und filtrierte dann durch »Supercel«-Diatomeenerde. Dem Filtrat wurde Wasser und
Methylenchlorid zugegeben. Das Ganze wurde darauf sorgfältig gemischt, um das organische
Material zu extrahieren. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat
getrocknet und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Der so erhaltene Rückstand wurde
in etwa 20 ml Methylenchlorid gelöst und über synthetisches Magnesiumsilikat. das
unter der Handelsbezeichnung »Florisil« bekannt ist, chromatographiert. Die Säule
wurde mit Hexankohlenwasserstoffen (Handelsbezeichnung »Skellysolve B«) und zunehmenden
Anteilen an Aceton eluiert. Die mit 7 bis 10% Aceton in »Skellysolve B« eluierten
Fraktionen ergaben 307 mg 3,11-Diketo -16a - fl uormethyl - 4,17 - (20) -
trans - pregnadien-21-säuremethylester und die mit 10 bis 15% Aceton in »Skellysolve
B« eluierten Fraktionen 235 mg 3, 11 -Diketo-16(c-fluormethyl-4,17(20)-cis-pregnadien-21-säuremethylester.
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Ein Teil des 3.11 - Diketo - 16a - fluormethyl-4.17(20) - trans -
pregnadien - 21 - säuremethylesters wurde aus Aceton-»Skellvsoive B« umkristallisiert;
F. = 157 bis 159-C; i m;11-,01 == 232 mv.; E = 24 450. Das IR-Spektrum bestätigte
die angenommene Struktur.
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Analyse für G@@;H20F0-1: Berechnet ... C 71.14, H 7.47. F 4,90;
gefunden ... C 7L09, H 7J1, F 5.10. Eine.aus Aceton-»Skellysolve B« umkristallisierte
Probe des 3.1I-Diketo-l6a-fluormethyl-4.I7(20)-cispregnadien - 21 - säuretnethylesters
schmolz bei 169 bis 172-C; imH'OH -= 23I m;a.; E = 22050. Das IR-Spektrum bestätigte
die angenommene Struktur. Analyse für C._3H.2"FO.1: Berechnet ... C 71,14, H 7,47,
F 4,90; gefunden ... C 71.01, H 7,58, F 5,29. Die cis- und trans-Isomeren
wurden mit den Isomerengemische enthaltenden Zwischenfraktionen vereinigt, worauf
man 672 mg cis- und trans-3.11-Diketo-16a-fluormethyl-4,17(20)-pregnadien-21-säuremethylester
erhielt.
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Einer Lösung von 670 mg cis- und trans-3,11-Diketo-16a-fluorrnethyl-4,17(20)-pregnadien-21-säuremethylester
in Benzol wurden 20 mg p-Toluolsulfonsäure und 0,8 ml frisch destilliertes Pyrrolidin
zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Rühren und gleichzeitiger Entfernung von Wasser
11(, Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die gekühlte Lösung wurde dann tropfenweise
unter Rühren und unter Stickstoff bei 0'C einer Suspension von 1.0 g Lithiumaluminiumhydrid
in 75 ml Äther gegeben. Nach weiterem 1stündigem Rühren bei Zimmertemperatur wurde
bis zur Beendigung der Umsetzung unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde
dann gekühlt, überschüssiges Hydrid mit 10m1 Äthylacetat und 15m1 Wasser zerstört
und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde etwa 15 Minuten mit
einem Gemisch aus 1,5m1 Essigsäure und 34m1 Methanol gerührt. Anschließend wurde
eine Lösung aus 1,0g Natriumhydroxyd in 10m1 Wasser zugegeben, dann wurde weitere
15 Minuten gerührt, nochmals mit 1,25m1 Essigsäure versetzt und sodann auf das halbe
Volumen eingeengt. Dann gab man 2 ml konzentrierte Schwefelsäure und 35 ml Wasser
zu, rührte etwa 15 Minuten und extrahierte mit Methylenchlorid. Die vereinigten
Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und durch Eindampfen
vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde mit 3 ml Acetanhydrid und 10 ml Pyridin
etwa 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurde das Reaktionsgemisch
in eiskalte Natriumbicarbonatlösung gegossen und mit Äther und Benzol extrahiert.
Die vereinigten Extrakte wurden mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet und ergaben nach dem Abdampfen des Lösungsmittels ein 101,
das, in Methylenchlorid gelöst, über 50 g »Florisil« chromatographiert wurde. Die
Säule wurde mit »Skellysolve B«, das zunehmende Mengen Aceton enthielt, eluiert.
Die mit 10 bis 200/0 Aceton in »Skellysolve B« eluierten Fraktionen ergaben 0.334
g eines Gemisches aus cis- und trans-1133,21-Dihydroxy - 16a - fluormethyl - 4,17(20)
- pregnadien - 3 - on-21-acetat. Ein Teil des cis-Isomeren wurde aus Aceton-»Skellysolve
B« umkristallisiert und ergab 11E3,21 - Dihydroxy - 16a - fluormethyl - 4,17(20)
- cispregnadien-3-on-21-acetat vom Schmelzpunkt 183 bis 186°C; ;.mH'OH = 241 m;i.;
E = 16400. Das IR-Spektrum bestätigte die angenommene Struktur. Analyse für C-2-iH33FOa:
Berechnet ... C71,29, 1 18,17, F4#7-gefunden ... C 70.9L . H8,13,
174.88.
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Zu einer Lösung von 0.334 g eines Gemisches aus cis- und trans- 1113,21-Dihydroxy-4,17(20)-pregnadien-3-on-21-acetat
in 17 ml tert.-Butanol und 0,23 ml Pyridin wurden unter Rühren 1.7m1 N-Methylmorpholin
- oxyd - peroxyd -Reagens (Titer: 1 ml = 41,2 ml 0,1 n-Natriumthiosulfatlösung)
und etwa 5 mg Osmiumtetrocyd gegeben. Nach etwa 10- bis 20stündigem Rühren bei Raumtemperatur
wurde eine Lösung von 0,4 g Natriumhydrosulfit in 30 ml Wasser zugesetzt und noch
30 Minuten
gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Methylenchlorid
extrahiert, die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde in etwa
10 ml Methylenchlorid gelöst und über 30 g »Florisil« chromatographiert, das zuvor
mit »Skellysolve B« behandelt worden war. Beim Eluieren der Säule mit »Skellysolve
B«, das zunehmende Mengen Aceton enthielt, erhielt man aus den Fraktionen mit 20
bis 30% Aceton in »Skellysolve B« kristallines Material, das einen positiven ToIlens-Test
zeigte. Die vereinigten Fraktionen (65 mg) ergaben nach der Umkristallisation aus
Aceton-»SkellyIsolve B« 23 mg 16a-Fluormethylhydrocortison-21-acetat vom Schmelzpunkt
202 bis 205°C; IR-Absorptionsmaxima bei 3550, 3410, 1740, I727, I655, 1624, 1237,
1123, 1060 und 1040 cm-'; i m H.,oH - = 242 mp.; E = 15 750. -Analyse für
C2.1H33FOs: Berechnet ... C 66,06, H 7,57, F 4,36; gefunden ... C
65,72, H 7,61, F 4,77. Die Behandlung der Mutterlaugen mit Äther ergab weiteres
kristallines Material, aus dem nach dem Umkristallisieren aus Aceton-»Skellysolve
B« 8 mg Produkt vom Schmelzpunkt 192 bis 198°C erhalten wurden.
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b) 16a-Fluormethyl-cortison-21-acetat Ein Gemisch aus 0,3g 16a-Fluormethyl-hydrocortison-21-acetat,
100 g Chromsäureanhydrid, 10m1 Eisessig und 0,5 ml Wasser wurde gerührt und bis
zur Beendigung der Umsetzung bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann wurde in
etwa 50 ml Eiswasser gegossen und mit verdünnter Natronlauge neutralisiert. Man
erhielt einen Niederschlag von 16a-Fluormethylcortison-21-acetat, der abfiltriert
und getrocknet wurde. c) 16a-Fluormethyl-hydrocortison Durch ein Gemisch aus 1,0g
16a-Fluormethylhydrocortison - 21 - acetat, 1,0 g Kaliumbicarbonat, 100 ml Methanol
und 15 ml Wasser wurde Stickstoff geleitet. Dabei wurde bis zur Beendigung der Umsetzung
bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Neutralisation mit 5%iger wäßriger Salzsäure
wurde mit Wasser verdünnt und im Kühlschrank stehengelassen. Der ausgefallene Feststoff
wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus Aceton-»Skellysolve B« umkristallisiert.
Man erhielt 16a-Fluormethyl-hydrocortison in Form von hellfarbigen Kristallen. Die
Verwendung der äquivalenten Menge 16,c-Fluormethyl-cortisonacetat ergibt 16a-Fluormethyl-cortison.
d) 1-Deliydro-16a-fluormethyl-hydrocortison " In fünf jeweils 250 ml fassende Erlenmeyerkolben
wurden je 100 ccm eines Nährmediums aus l0io Glucose. 2% Maisquellwasser (60@io
Feststoffe) und Leitungswasser gegeben und auf einen pH-Wert von 4,9 eingestellt.
Dann wurde 45 Minuten bei 1,05 at sterilisiert und mit einer 1- bis 2 Tage alten
vegetativen Kultur von Septomyxa affinis ATCC 6737 beimpft. Die Erlenmeyerkolben
wurden bei Raumtemperatur (26 bis 28#C) etwa 3 Tage geschüttelt. Danach wurden die
gesamten 500 ml als Impfstoff für 101 desselben Glucose-Maisquellwasser-Mediums
verwendet, das noch 5 ml eines Antischaummittels (Gemisch aus Speeköl und Octadecanol)
enthielt. Das Gärgefäß wurde in einem Wasserbad auf 28`C gehalten, sorgfältig
gerührt (300 Umdrehungen pro Minute) und belüftet (0,1I Luft pro Minute und 101
Nährlösung). Nach 20stündiger Inkubation, nach der sich ein gutes Wachstum entwickelt
hatte, wurden 1,0 g 16a- Fluormethyl - hydrocortison und 50 mg 3-Keto-bis-nor-4-cholen-22-al
in Dimethylformamidlösung zugegeben. Die Inkubation wurde bei derselben Temperatur
(28'C) und Belüftung bis zum Ende der Reaktion (End-pH-Wert = 8,3) durchgeführt.
Dann wurde das Mycel abfiltriert und 3 ml mit je 200 ml Aceton extrahiert. Die Nährlösung
wurde dreimal mit je 11 Methylenchlorid extrahiert. Die Aceton- und Methylenchloridextrakte
wurden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der
Rückstand wurde über »Florisil« chromatographiert. Durch Eluieren mit »Skellysolve
B«, das steigende Mengen von 1 bis 500% Aceton enthielt, und nachfolgendes Kristallisieren
erhielt man 1-Dehydro-16a-fluormethyl-hydrocortison als hellfarbenen kristallinen
Feststoff.
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Die mikrobiologische Dehydrierung der 1(2)-Stellung kann auch mit
Corynebacterium, Didymella, Calonectria, Alternaria. Colletotrichum, Cylindrocarpon,
Ophiobolus, Fusarium, Listeria. Erysipelothrix, Mycobacterium, Tricothecium, Leptosphaeria,
Curcurbitaria, Nocardia und Fungil der Familie Tuberculariaceae durchgeführt werden.
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e) 1-Dehydro-16a-fluormethyl-hydrocortison-21-acetat Ein Gemisch aus
290 mg 16a-Fluormethyl-hydrocortison-21-acetat. 290 mg Selendioxyd, 0.5 ml Essigsäure
und 25 ml tert.-Butylalkohol wurde 151j.2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach weiterer
Zugabe von 290 mg Selendioxyd wurde nochmals 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt.
Das Reaktionsgemisch wurde durch Diatomeenerde, die unter der Handelsbezeichnung
»Celite« bekannt ist, filtriert, und die Feststoffe wurden mit Äthylacetat gewaschen.
Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden gemeinsam unter Stickstoff zur Trockne
eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst, zuerst mit wäßriger Kaliumbicarbonatlösung,
dann mit frischer, eiskalter, wäßriger Ammoniumsulfidlösung, eiskaltem verdünntem
Ammoniak, verdünnter Salzsäure und schließlich nochmals mit Kaliumbicarbonatlösung
gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum
eingedampft. Der Rückstand wurde in 15 ml Methylenchlorid gelöst und über 30 g synthetisches
Magnesiumsilikat, das unter der Handelsbezeichnung »Florisil« bekannt ist, chromatographiert.
Nach dem Eluieren mit »Skellysolve B«, das steigende Mengen Aceton enthielt, erhielt
man 177 mg Rohprodukt, das nach dem Umkristallisieren aus Aceton-»Skellysolve B«
131 mg I -Dehydro-16a-fluormethyl-hydrocortison-21-acetat. F. = 194 bis 197'-C.
Die weitere Umkristallisation aus dem yleichen Lösungsmittel eri.m.rl:oH höhte den
Schmelzpunkt auf 197 bis 199#C, = 243 mix; E = 14 800. Das IR-Spektrum
bestätigte
die angenommene Struktur.
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Analyse für C2-,H:31F02 - C3H00: Berechnet ... C 65.85. H 7,52.
F 3.86; gefunden ... C 65.67. H 7,34, F 4,06.
1] 1-Deliydro-l6u-fluormetliyl-liydrocortison-21-acetat
Eine Lösung von 3,0 g 1-Dehydro-16u-fluormethylhydrocortison in 20 ml trockenem
Pyridin wurde mit 20 ml Acetanhydrid versetzt und etwa 24 Stunden stehen gelassen.
Das Gemisch wurde dann in 250 ml Wasser gegossen und etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Der kristalline Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet
und aus Aceton-»Skellysolve B« umkristallisiert. Man erhielt 1 - Dehydro - 16u -
fluormethyl - 21 - acetat; F. _ = 197 bis 199- C.