Verfahren zur Herstellung neuer 6-Fluorsteroide Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer 6a- und 6l-Fluor- steroide.
Diese neuen, erfindungsgemäss herstellbaren Steroide besitzen wertvolle therapeutische Eigenschaf ten. Die Verbindungen der folgenden Formel II zei gen anabolische, antiöstrogene und androgene Wirk samkeit. Die Verbindungen der Formeln 1I und<B>111</B> weisen antiosteoporotische, Gonadotropinbildung ver hütende, das Zentralnervensystem und die Fett bestandteile im Blut regulierende Eigenschaften auf.
Die Verbindungen der Formeln 1I und III sind nützlich zur Behandlung von Schwächezuständen sowie osteoporotischen, hypogonadalen und artheroskleroti- schen Erkrankungen.
Die Verbindungen der Formeln 1I und III kön nen in üblichen Dosierungsformen, wie Pillen, Tablet ten, Kapseln, Sirupen oder Elixieren bei oraler An wendung, oder in flüssigen Formen, die sich für natür liche und synthetische Steroidhormone eignen, bei injizierbaren Produkten, verabreicht werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Steroiden der Formeln I und II
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in welchen R1 eine Oxy-, Acyloxy- oder Ketogruppe und Z Wasserstoff, eine Oxy- oder Ketogruppe dar- stellt, ist dadurch gekennzeichnet, dass die Steroide der Formel III
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in der R Wasserstoff oder die Methylgruppe bedeutet, durch Dehydrierung in 1,2-Stellung in die Steroide der Formel I bzw.
durch Dehydrierung in 1,2-Stellung und unter Isomerisierung in die Steroide der Formel 1I übergeführt werden. Das Verfahren wird durch folgendes Reaktionsschema veranschaulicht:
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In diesen Formeln bedeutet R Methyl oder Was serstoff, R1 eine Oxy-, O-Acyl- oder Ketogruppe und Z Wasserstoff oder eine Oxy- oder Ketogruppe. Die Bezeichnung Acyl bezeichnet den Acylrest einer organi schen Carbonsäure, vorzugsweise einer Kohlenwasser- stoffcarbonsäure mit 1 bis einschliesslich 12 Kohlen stoff atomen.
Die Wellenlinie in 6-Stellung zeigt an, dass sowohl a- als auch ss-Konfiguration vorliegen kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann z. B. durchgeführt werden durch fermentative Dehydrie- rung der Verbindungen gemäss Formel I (in welcher R Methyl bedeutet), z.
B. von 6-Fluor-17ss-oxy-4-androsten-3-on und 17 Acylaten, 6-Fluor-17ss-oxy-4-androsten-3,11-dion und 17-Acylaten, 6-Fluor-llss,17ss-dioxy-4-androsten-3-on und 17-Acylaten, 6-Fluor-4-androsten-3,17-dion, 6-Fluor-4-androsten-3,11,17-trion und 6-Fluor-1 lss-oxy-4-androsten-3,17-dion, wobei die Verbindungen gemäss Formel 1I (in welcher R - Methyl) erhalten werden, z. B.
6-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3-on, 6-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3,11-dion, 6-Fluor-1 1ss,17ss-dioxy-1,4-androstadien-3-on, 6-Fluor-1,4-androstadien-3,17-dion, 6-Fluor-1,4-androstadien-3,11,17-trion und 6-Fluor-11 ss-oxy-1,4-androstadien-3,17-dion. Die fermentative Dehydrierung der Verbindungen gemäss Formel I (in welcher R = Methyl) umfasst die Verwendung von Mikroorganismen wie z.
B. Septo- myxa, Corynebacterium, Fusarium und dergleichen unter an sich bekannten Fermentationsbedingungen (siehe z. B. US-Patent Nr. 2 602 769).
Besitzen die Verbindungen der Formel 1 (in wel cher R = Methyl) eine 11-Oxygruppe, wie z. B. 6- Fluor-llss,17/3-dioxy-4-androsten-3-on und 17-Acy- late sowie 6-Fluor-11ss-oxy-4-androsten-3,17-dione, und wird Septomyxa für die Dehydrierung verwendet, so hat es sich als zweckmässig erwiesen, einen Steroid- promotor zu verwenden wie z. B.
Progesteron, 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, 3-Ketobisnorcholensäure, 11ss,21-Dioxy-1,4,17(20)-pregnatrien-3-on und dergleichen.
Hat man die Wahl zwischen einem Ausgangs material mit 17-Oxy- oder 17-Estergruppe, so wird vorzugsweise ein Steroid mit der 17-Oxygruppe ver wendet, da die Dehydrierung unter Verwendung von Mikroorganismen üblicherweise die Verseifung der 17-Estergruppen bewirkt.
Die 17-Acylate, wie die 17- Acetate, 17-Propionate und dergleichen von 6-Fluor- 17,/3-oxy-4-androsten-3-onen und 6-Fluor-llss,1713- dioxy-4-androsten-3-onen, können jedoch auch als Ausgangsmaterial verwendet werden.
, Auf Wunsch können jene Verbindungen der For mel Il (in welcher R Methyl bedeutet), welche eine 17-Oxygruppe enthalten, wie 6-Fluor-17/3-oxy-1,4- androstadien-3,11-dione und 6-Fluor-llss,l7a-dioxy- 1,4-androstadien-3-one,
zu den entsprechenden 17-Acy- laten acyliertwerden. Geeignete Veresterungsmittel sind organische Carbonsäuren und insbesondere Kohlen- wasserstoffcarbonsäuren mit 1-12 Kohlenstoffatomen oder ihre Anhydride und Halogenide. Geeignete Säu ren sind z.
B. gesättigte, geradkettige, aliphatische Säuren wie Ameisen-, Essig-, Propion-, Butter-, Va- lerian-, Önanth-, Laurinsäure, gesättigte, verzweigt- kettige, aliphatische Säuren wie Trimethylessig-, Iso- butter-, Isovalerian-, tertiäre Butylessigsäure, cyclo- aliphatische,
gesättigte Säuren wie ss-Cyclopentylpro- pion-, Cyclohexan-carbon-, Cyclohexylessigsäure, Al- karylsäuren wie Benzoe-, Phenylessig-, ss-Phenylpro- pion-, o-, m- und p-Toluylsäure, gesättigte, zwei basische Säuren (welche in wasserlösliche Salze, z. B.
Natriumsalze, verwandelt werden können) wie Bern stein- und Adipinsäure, einbasische, ungesättigte Säuren wie Acryl-, Croton-, Undecylen-, Propiol-, Undecen-, Zimtsäure; zweibasische, ungesättigte Säu ren (welche in wasserlösliche Salze, z. B. Natrium salze, verwandelt werden können) wie Malein- und Citraconsäure oder ihre Säureanhydride oder Säure halogenide.
Benützt man als Veresterungsmittel die freie Säure, so wird die Reaktion vorzugsweise in Ge genwart eines Veresterungskatalysators wie p-Toluol- sulfonylchlorid, Trifluoressigsäureanhydrid, p-Toluol- sulfonsäure, Trifluoressigsäure, Schwefelsäure und dergleichen durchgeführt. Ist das Veresterungsmittel ein Säurechlorid oder -anhydrid, so wird die Reaktion vorzugsweise in Gegenwart einer tertiären Base wie z.
B. Pyridin, Dimethylanilin und dergleichen durch geführt.
Ist das verwendete Veresterungsmittel fest, so kann ein inertes Lösungsmittel wie Toluol, Xylen oder Dioxan zugesetzt werden, um ein flüssiges Vereste- rungsmedium zu bilden.
Die Verbindungen der Formel I (in welcher R = Methyl), welche eine 17-Oxy- oder 17-Acyloxygruppe enthalten, wie die 6-Fluor-17ss-oxy-4-androsten-3-one und ihre 17-Acylate, die 6-Fluor-17ss-oxy-4-androsten- 3,11-dione und ihre 17-Acylate und die 6-Fluor-11ss, l71>-dioxy-4-androsten-3-one und ihre 17-Acylate,
können jedoch auch der chemischen Dehydrierung mittels Sel_erdioxyd oder seleniger Säure nach bekann ten und ausserdem in den folgenden Beispielen be schriebenen Methoden unterworfen werden, um die Verbindungen gemäss Formel 1I (in welcher R = Methyl) zu bilden, welches eine 17-Oxy- oder 17-Acyl- oxygruppe enthalten, wie z.
B. die 6-Fluor-17/3-oxy- 1,4-androstadien-3-one und ihre 17-Acylate, die 6- Fluor-17i3-oxy-1,4-androstadien-3,11-dione und ihre 17-Acylate und die 6-Fluor-llss,17ss-dioxy-1,4-an- drostadien-3-one und ihre 17-Acylate.
Die fermentative Dehydrierung der Verbindungen gemäss Formel I (in welcher R = Wasserstoff), z. B. 6-Fluor-17ss-oxy-19-nor-4-androsten-3-on und 17-Acylate, 6-Fluor- 17ss-oxy-19-nor-4-androsten-3,11-dion und 17-Acylate, 6-Fluor-1 lss,17ss-dioxy-19-nor-4-androsten-3-on und 17-Acylate, 6-Fluor-19-nor-4-androsten-3,17-dion, 6-Fluor-19-nor-4-androsten-3,11,
17-trion und 6-Fluor-1 iss-oxy-19-nor-4-androsten-3,17-dion, wird wie oben für die fermentative Dehydrierung von Verbindungen der Formel I (in welcher R = Methyl) beschrieben durchgeführt. Die derart gebildeten Ver bindungen der Formel<B>11,</B> in welcher R Wasserstoff ist, sind unstabil und lagern sich zu Verbindungen der Formel III um, z.
B. zu 6-Fluor-östradiol, 6-Fluor-11-ketoöstradiol, 6-Fluor-llss-oxyöstradiol, 6-Fluor-östron, 6-Fluor- 11-ketoöstron und 6-Fluor-11 ss-oxyöstron.
Enthalten die Verbindungen der Formel I, in wel cher R Wasserstoff ist, eine l lss-Oxygruppe und wird Septomyxa zur Dehydrierung verwendet, so hat es sich ebenfalls als zweckmässig erwiesen, einen Steroid- promotor zu verwenden.
Werden als Ausgangsmaterialien die 17-Acylate von 6-Fluor-17ss-oxy-19-nor-4-androsten-3-onen, 6-Fluor-17ss-oxy-19-nor-4-androsten-3,11- dionen und 6-Fluor-11 ss,17ss-dioxy-19-nor-4-androsten- 3-onen verwendet, so wird üblicherweise eine Verseifung der 17-Estergruppe vorgenommen.
Die 17ss-Acylate von 6-Fluoröstradiolen, 6-Fluor- 11-ketoöstradiolen und 6-Fluor-llss-oxyöstradiolen können sodann wie folgt erhalten werden:
die 6-Fluor- östradiole, 6-Fluor-11-ketoöstradiole und 6-Fluor- llss-oxyöstradiole können gemäss den oben für die Acylierung von 6-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3- onen, 6-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3,11-dionen und 6-Fluor-llss,17ss-dioxy-1,4-androstadien-3-onen beschriebenen Verfahren zu den entsprechenden 3,17ss-Diacylaten der 6-Fluor-östradiole,
6-Flizor-11- ketoöstradiole und 6-Fluor-llss-oxyöstradiole acyliert werden. Diese 3,17ss-Diacylate werden sodann in die entsprechenden 17ss-Acylate umgewandelt, indem man diese 3,llss-Diacylate an Stelle der in Beispiel 2 des US-Patentes Nr. 2<B>611733</B> genannten östradiol-3,17ss- diacylate verwendet und nach dem dort beschriebenen Verfahren die Acylgruppe in 3-Stellung selektiv ver seift.
Die bevorzugte Methode zur Herstellung der ge nannten 3,17ss-Diacylate entspricht der in Beispiel 1 des US-Patentes Nr. 2<B>611733</B> beschriebenen, wobei das dort erwähnte Östradiol und Säurehalogenid durch 6-Fluoröstradiol, 6-Fluor-11-ketoöstradiol, 6-Fluor- llss-oxyöstradiol und das geeignete Säurehalogenid ersetzt wird.
Die chemische Dehydrierung der Verbindungen gemäss Formel I (in welcher R Wasserstoff ist), welche eine 17-Oxy- oder 17-Acylatgruppe enthalten wie z. B.
6-Fluor-17ss-oxy-19-nor-4-androsten-3-on und 17-Acylate, 6-Fluor-17ss-oxy-19-nor-4-androsten-3,11-dion und 17-Acylate, 6-Flaor-l lss,17ss-dioxy-19-nor-4-androsten-3-on und 17-Acylate zu Verbindungen der Formel III, welche eine 17-Oxy- oder 17-Acylatgruppe enthalten, wird wie oben für die Umwandlung der Verbindungen der Formel I (in welcher R Methyl ist),
welche eine 17-Oxy- oder 17-Acylatgruppe enthalten, zu den entsprechenden Verbindungen der Formel<B>11,</B> in welcher R Methyl ist, beschrieben durchgeführt. Wie bei der fermentati- ven Dehydrierung sind auch hier die Verbindungen der Formel 11 (in welcher R Wasserstoff ist), welche eine 17-Oxy- oder 17-Acylatgruppe enthalten, unsta bil und lagern sich sofort zu den entsprechenden Ver bindungen der Formel<B>111</B> um wie z.
B. 6-Fluor- östradiol und 17-Acylaten, 6-Fluor-11-ketoöstradiol und 17-Acylaten und 6-Fluor-11/1-oxyöstradiol und 17-Acylaten.
Die genannten Verbindungen der Formeln I,<B>11</B> und<B>111</B> sind alle durch die Anwesenheit einer 6-Fluor- gruppe gekennzeichnet. Die 6-Fluorgruppe kann U.- oder ss-ständig sein. So kann bei Verwendung eines 6[)'-Fluorsteroids als Ausgangsmaterial für die oben beschriebenen Verfahren unter Einhaltung annähernd neuer Reaktionsbedingungen als Endprodukt das ent sprechende 6ss-Epimer erhalten werden.
Wird als Ausgangsmaterial das 6i3-Epimer oder ein überwie gend aus demselben bestehendes Gemisch verwendet, so kann jedes nachfolgende Reaktionsprodukt als 6ss- Epimer oder als entsprechendes Gemisch von 6a- und 6ss-Epimer isoliert werden.
Ein 6a-epimerisiertes Pro dukt kann durch Behandlung des 6ss-Epimers (oder eines Gemisches von 6a- und 613-Epimer) der Verbin dungen gemäss Formel 11 bei Temperaturen von 0 C oder wenig darüber oder darunter in einem organi schen Lösungsmittel wie Chloroform, Methylen- chlorid, Äther und dergleichen und in Gegenwart eines Protonen abgebenden Mittels wie eines Alko hols, einer organischen Säure und dergleichen mit einer Mineralsäure wie z. B. Salzsäure erhalten wer den.
Das Gemisch sollte während der Säurezugabe vorzugsweise bei einer Temperatur von 0 C gehalten werden, doch können auch etwas höhere oder tiefere Temperaturen angewendet werden. Das Reaktions gemisch kann sodann mehrmals mit verdünntem Al kali und Wasser gewaschen und anschliessend getrock net und unter vermindertem Druck eingedampft wer den. Das 6a-Fluorprodukt kann aus dem rohen Re aktionsprodukt gewonnen und durch Umkristallisation gereinigt werden.
Die Epimerisierung der Verbindungen gemäss For mel Il kann auch mit Alkali durchgeführt werden. So können Laugen wie z. B. Lösungen von Natrium- und Kaliumhydroxyd verwendet werden, um das 6ss-Epi- mere in Lösung in einem organischen Lösungsmittel wie Methanol in das 6c:-Epimere überzuführen.
<I>Beispiel 1</I> 6u-Fluor-llss-oxy-1,4-androstadien-3,17-dion (II) Drei 100-ml-Portionen eines Mediums, welches <B>l</B> 'o Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser enthielt, wurden in 250-ml-Erlen- meyerkolben auf pH 4,9 eingestellt. Dieses Medium wurde während 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg,!cm= sterilisiert und mit einer ein- bis zwei tägigen vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 beimpft.
Die Erlenmeyerkolben wer den bei Raumtemperatur (etwa 26-28 C) während 3 Tagen geschüttelt. Anschliessend wird dieses 300-ml- Volumen als Inoculum für 5 Liter desselben Glukose- Maisquellwasser-Mediums verwendet, welches zusätz lich 5 ml eines Schaumverhütungsmittels (ein Gemisch von Landöl und Octadecanol) enthält. Der Fermenten wird in ein Wasserbad gestellt, auf 28 C gebracht und der Inhalt gerührt (300 Umdrehungen pro Mi nute) und belüftet (0,3 Liter Luft pro Minute auf 5 Liter Gärmedium).
Nach 20stündiger Inkubation, nachdem sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g 6a-Fluor-11ss-oxy-4-androsten-3,17-dion (1) sowie 0,5 g 3-Ketobisnor-4-cholen-22-al, gelöst in 16 ml Dimethylformamid zugesetzt und die Inkuba tion bei derselben Temperatur (28 C) und Belüftung während 48 Stunden fortgesetzt (End-pH 8,3). Das Mycelium wird abfiltriert und dreimal mit je 200 ml Aceton extrahiert. Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit 1 Liter Methylenchlorid extrahiert und diese Ex trakte sodann mit den Acetonextrakten vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft.
Der erhaltene Rückstand wird über Florisil (wasser freies Magnesiumsilikat) chromatographiert und die Säule mit Skellysolve-B-Hexanen mit von 6-16 ö steigendem Gehalt an Aceton eluiert. Die derart er haltenen Fraktionen werden zur Trockne verdampft und die Rückstände der Infrarot-Absorptionsanalyse unterworfen. Jene Rückstände, welche die für 6a- Fluor-1113-oxy-1,4-androstadien-3,17-dion charakte ristischen Banden aufweisen, werden vereint und aus Methylenchlorid!Skellysolve-B-Hexanen umkristalli siert.
Man erhält 6n-Fluor-Ilss-oxy-1,4-androstadien- 3,17-dion, (Il) als kristallinen Feststoff.
Anstelle von Septomyxa können Arten anderer Gattungen wie Corynebacterium, Didymella, Calonectria, Alternaria, Collectrotrichum, Cylindrocarpon, Ophiobolus, Fusarium, Listeria, Erysipelothix, Mycobacterium, Tricothecium, Leptosphaeria, Cucurbitaria,
Nocardia und Enzymes von Pilzen der Familie Tuberculariaceae verwendet werden, um eine AI-Bindung in 6a-Fluor- Ili3-oxy-4-androsten-3,17-dion einzuführen.
<I>Beispiel 2</I> 6a-Fluor-1,4-androstadien-3,11,17-trion (I1) Drei 100-ml-Portionen eines Mediums, welches 1 % Glukose, 2 o Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser enthielt, wurden in 250-ml-Erlen- meyerkolben auf pH 4,9 eingestellt. Dieses Medium wurde während 45 Minuten bei einem Druck von <B>1,05</B> kg/cm-7 sterilisiert und mit einer ein- bis zwei tägigen vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 beimpft.
Die Erlenmeyerkolben wer- den bei Raumtemperatur (etwa 26-28 C) während 3 Tagen geschüttelt. Anschliessend wird dieses 300-ml- Volumen als Inoculum für 5 Liter desselben Glukose- Maisquellwasser-Mediums verwendet, welches zusätz lich 5 ml eines Schaumverhütungsmittels (ein Gemisch von Lardöl und Octadecanol) enthält. Der Fermenter wird in ein Wasserbad gestellt, auf 28 C gebracht und der Inhalt gerührt (300 Umdrehungen pro Mi nute) und belüftet (0,3 Liter Luft pro Minute auf 5 Liter Gärmedium).
Nach 20stündiger Inkubation, nachdem sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g 6a-Fluor-4-androsten-3,11,17-trion (I), gelöst in 16 ml Dimethylformamid, zugesetzt und die Inkuba tion bei derselben Temperatur (28 C) und Belüftung während 48 Stunden fortgesetzt (End-pH 8,3). Das Mycelium wird abfiltriert und dreimal mit je 200 ml Aceton extrahiert. Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit 1 Liter Methylenchlorid extrahiert und diese Ex trakte sodann mit den Acetonextrakten vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft.
Der erhaltene Rückstand wird über Florisil (wasser freies Magnesiumsilikat) chromatographiert und die Säule mit Skellysolve-B-Hexanen mit von 6-16 h steigendem Gehalt an Aceton eluiert. Die derart er haltenen Fraktionen werden zur Trockne verdampft und die Rückstände der Infrarot-Absorptionsanalyse unterworfen.
Jene Rückstände, welche die für 6a- Fluor-1,4-androstadien-3,11,17-trion charakteristi schen Banden aufweisen, werden vereint und aus Methylchlorid/Skellysolve-B-Hexanen umkristallisiert, um 6a-Fluor-1,4-androstadien-3,11,17-trion (1I) als kristallines Produkt zu erhalten.
Anstelle von Septomyxa können Arten anderer Gattungen wie in Beispiel 1 erwähnt verwendet wer den, um eine A1-Doppelbindung in 6a-Fluor-4-an- drosten-3,11,17-trion einzuführen.
<I>Beispiel 3</I> 6a-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3,11-dion (II) Drei 100-ml-Portionen eines Mediums, welches 1'% Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser enthielt, wurden in 250-ml-Erlen- meyerkolben auf pH 4,9 eingestellt. Dieses Medium wurde während 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg/cm2 sterilisiert und mit einer ein- bis zwei tägigen vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 beimpft.
Die Erlenmeyerkolben wer den bei Raumtemperatur (etwa 26-28 C) während 3 Tagen geschüttelt. Anschliessend wird dieses 300- ml-Volumen als Inoculum für 5 Liter desselben Glu- kose-Maisquellwasser-Mediums verwendet, welches zusätzlich 5 ml eines Schaumverhütungsmittels (ein Gemisch von Lardöl und Octdecanol) enthält.
Der Fermenter wird in ein Wasserbad gestellt, auf 280C gebracht und der Inhalt gerührt (300 Umdrehungen pro Minute) und belüftet (0,3 Liter Luft pro Minute auf 5 Liter Gärmedium). Nach 20stündiger Inkuba tion, nachdem sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g 6a-Fluor- 17ss-oxy-4-androsten-3,11-dion (1), gelöst in 16 ml Dimethylformamid, zugesetzt und die Inkubation bei derselben Temperatur (28 C) und Belüftung während 48 Stunden fortgesetzt (End-pH 8,3). Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 ml Aceton extrahiert.
Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit 1 Liter Methylenchlorid extrahiert und diese Extrakte sodann mit den Acetonextrakten ver einigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft.
Der erhaltene Rückstand wird über Florisil (wasserfreies Magnesiumsilikat) chromatogra- phiert und die Säule mit Skellysolve-B-Hexanen mit von 6-16% steigendem Gehalt an Aceton eluiert. Die derart erhaltenen Fraktionen werden zur Trockne ver dampft und die Rückstände der Infrarot-Absorptions- analyse unterworfen.
Jene Rückstände, welche die für 6a-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3,11-dion charak teristischen Banden aufweisen, werden vereint und aus Methylenchlorid-Skellysolve-B-Hexanen umkristalli- siert, um 6a-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3,11- dion (1I) als kristallinen Feststoff zu erhalten. Anstelle von;
Septomyxa können andere Mikroorganismen, wie in Beispiel 1 erwähnt, verwendet werden, um eine A1-Doppelbindung in 6a-Fluor-17ss-oxy-4-androsten- 3,11-dion einzuführen.
Anstelle von 6a-Fluor-17ss-oxy-4-androsten-3,11- dion können dessen 17-Ester verwendet werden wie z. B. die 17-Acetate, 17-Propionate, 17-Butyrate, 17- Isobutyrate und dergleichen. In diesen Fällen wird jedoch die Estergruppe üblicherweise während der Fermentierung verseift.
<I>Beispiel 3A</I> 6a-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3,11-dion- 17-propionat (I1) 0,85 g 6a-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3,11- dion werden in 3 ml Pyridin gelöst. Diese Lösung wird sodann mit 1,5 ml Propionsäureanhydrid behandelt und 5 Stunden stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird gekühlt und unter Rühren tropfenweise mit 9 ml Wasser versetzt, wodurch ein Feststoff ausgefällt wird.
Nach 1 Stunde wird das Gemisch filtriert und der Niederschlag bei 70 C im Vakuum getrocknet, um 6a-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3,11-dion- 17-propionat (II), ein kristallines Produkt, zu erhalten.
Auf ähnliche Art erhält man, indem man 6a Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3,11-dion mit den entsprechenden Kohlenwasserstoff-Carbonsäuren oder deren Säureanhydriden und Säurehalogeniden um setzt, andere 17-Acylate von 6a-Fluor-17ss-oxy-1,4- androstadien-3,11-dion wie z.
B. das Formiat, Acetat, Butyrat, Valerat, Hexanoat, Laurat, Trimethylacetat, Isobutyrat, Isovalerat, tert. Butylacetat, Cyclopentylpropionat, Cyclohexan-carboxylat, Cyclohexyl-acetat, Benzoat, Phenylacetat, ss-Phenylpropionat, o-, m-, p-Toluat, Hemisuccinat,
Hemi-adipat, Acrylat, Crotonat, Undecylenat, Propiolat, Undecolat, Cinnamat, Maleat und Citraconat. <I>Beispiel 4</I> 6a-Fluor-17ss-oxy-1,4-androstadien-3-on (Il) Ein Gemisch von 0,918 g (0,003 Mol) 6a-Fluor- 17/3-oxy-4-androsten-3-on (1), gelöst in 18 ml tert. Butylalkohol und 0,18 ml Essigsäure, wurde zusam men mit 0,
21 g gereinigter seleniger Säure während 5 Stunden unter Rühren am Rückfluss erhitzt. Dann wurden 0,12 g gereinigter seleniger Säure zugesetzt und während weiterer 16 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Das Gemisch wurde sodann gekühlt, filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde in 50 ml Methylenchlorid ge löst, mit Wasser, zweimal mit gesättigter Natrium bikarbonatlösung und wieder mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne verdampft.
Der Rückstand wurde in 60 ml Benzol aufgelöst und über 50 g Florisil (synthetisches Magnesiumsilikat) chromatographiert. Die Säule wurde wie folgt eluiert: Fraktion 1 (1000 ml) Skellysolve-B-Hexane plus 4% Aceton Fraktion 2 (1000 ml) Skellysolve-B-Hexane plus 6% Aceton Fraktion 3-43 (je 50 ml) Skellysolve-B-Hexane plus 8 % Aceton Die Rückstände der Fraktionen 13 bis 37 wurden durch Infrarot-Absorption und Schmelzpunkt identi fiziert.
Sie wurden vereint und ergaben 0,361 g des Produktes, das aus Methylenchlorid/Skellysolve-B- Hexanen umkristallisiert wurden und zu 0,308 g 6a- Fluor - 17ss - oxy - 1,4 - androstadien - 3 - an (II) vom Schmelzpunkt 182-184 C führte.
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Analyse:
<tb> Berechnet <SEP> für <SEP> C13H.5FOz: <SEP> C <SEP> 74,97; <SEP> H <SEP> 8,08
<tb> Gefunden: <SEP> C <SEP> 74,79; <SEP> H <SEP> 8,31 Ersetzt man 6a.-Fluor-17ss-oxy-4-androsten-3-on durch 6a-Fluor-17ss-oxy-4-androsten-3-on-17-acylate, so erhält man die entsprechenden 6a-Fluor-17ss-oxy- 1,4-androstadien-3-on-17-acylate, z. B. das 17-Acetat, 17-Propionat, 17-Hemisuccinat, 17-Benzoat und der gleichen.
<I>Beispiel 5</I> 6a-Fluor-llss,17/3-dioxy-1,4-androstadien-3-on (II) Ein Gemisch von 100 mg 6a-Fluor-11ss,17ss-di- oxy-4-androsten-3-on (1), gelöst in 6 ml tertiärem Bu- tylalkohol und 0,55 ml Essigsäure, wird zusammen mit 30 mg Selendioxyd unter Rühren während etwa 24 Stunden auf ungefähr 75 C erhitzt. Dann wird eine weitere 30-mg-Portion Selendioxyd zugesetzt und das Gemisch unter ständigem Rühren während weite rer 24 Stunden erhitzt. Das Gemisch wird sodann ge kühlt, filtriert und eingedampft.
Der Rückstand wird in 50 ml Methylenchlorid gelöst, mit Natriumbikar- bonatlösung und anschliessend mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel daraus verdampft. Der Rückstand wird über eine Säule aus Florisil (wasserfreies Magnesiumsilikat) chromatographiert. Die Säule wird mit Skellysolve-B- Hexanen mit von 5 bis 20% steigenden Mengen Aceton eluiert. Die derart erhaltenen Fraktionen wer den zur Trockne verdampft.
Die Rückstände werden der Infrarot-Absorptionsanalyse unterworfen und jene Rückstände, welche die für 6a-Fluor-11 i3,17ss-dioxy- 1,4-androstadien-3-on charakteristischen Banden auf weisen, vereint und aus Methylenchlorid,'Skellysolve- B-Hexanen umkristallisiert. Man erhält 6("-Fluor-1 1ss, 17ss-dioxy-1,4-androstadien-3-on (11) als kristallinen Feststoff.
Ersetzt man 6a-Fluor-1 1ss,17/3-dioxy-4-androsten- 3-on durch 6a-Fluor-llss,17ss-dioxy-4-androsten-3-on 17-acylate, so erhält man die entsprechenden 6a- Fluor-11 /3,17ss-dioxy-1,4-androstadien-3-on-17-acylate, z. B. das 17-Acetat, 17-Propionat, 17-Hemisuccinat, 17-Benzoat und dergleichen.
<I>Beispiel 6</I> 6a-Fluor-östron (111) Drei 100-ml-Portionen eines Mediums, welches 1 % Glukose, 2% Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser enthielt, wurden in 250-ml-Erlen- meyerkolben auf pH 4,9 eingestellt. Dieses Medium wurde während 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kg,!cm2 sterilisiert und mit einer ein- bis zwei tägigen vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 beimpft. Die Erlenmeyerkolben wer den bei Raumtemperatur (etwa 26-28 C) während 3 Tagen geschüttelt.
Anschliessend wird dieses 300- ml-Volumen als Inoculum für 5 Liter desselben Glu- kose-Maisquellwasser-Mediums verwendet, welches zusätzlich 5 ml eines Schaumverhütungsmittels (ein Gemisch von Specköl und Octadecanol) enthält. Der Fermenter wird in ein Wasserbad gestellt, auf 28 C gebracht und der Inhalt gerührt (300 Umdrehungen pro Minute) und belüftet (0,3 Liter Luft pro Minute auf 5 Liter Gärmedium).
Nach 20stündiger Inkuba tion, nachdem sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g 6a-Fluor-19-nor-4-androsten-3,17-dion (1), gelöst in 16 ml Dimethylformamid, zugesetzt und die Inkubation bei derselben Temperatur (28 C) und Belüftung während 48 Stunden fortgesetzt (End-pH 8,3). Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 ml Aceton extrahiert. Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit 1 Liter Methylenchlorid extrahiert und diese Extrakte sodann mit den Acetonextrakten ver einigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft.
Der erhaltene Rückstand wird über Florisil (wasserfreies Magnesiumsilikat) chromatogra- phiert. Die Säule wird mit Skellysolve-B-Hexanen mit von 5-20 l steigenden Mengen Aceton eluiert. Die derart erhaltenen Fraktionen werden zur Trockne ver dampft.
Die Rückstände werden der Infrarot-Absorp- tionsanalyse unterworfen und jene Rückstände, welche die für 6a-Fluor-östron chrakteristischen Banden auf weisen, vereint und aus Aceton!Hexan umkristallisiert, um 6a-Fluor-östron (III) als kristallinen Feststoff zu ergeben.
<I>Beispiel 7</I> 6a-Fluor- 11-keto-östron (I11) Drei 100-ml-Portionen eines Mediums, welches <B>l</B> ','O Glukose, 2" ; Maisquellwasser (60% Feststoffe) und Leitungswasser enthielt, wurden in 250-ml-Erlen- meyerkolben auf pH 4,9 eingestellt. Dieses Medium wurde während 45 Minuten bei einem Druck von 1,05 kglcm2 sterilisiert und mit einer ein- bis zwei tägigen vegetativen Kultur von Septomyxa affinis A. T. C. C. 6737 beimpft.
Die Erlenmeyerkolben wer den bei Raumtemperatur (etwa 26-28 C) während 3 Tagen geschüttelt. Anschliessend wird dieses 300-ml- Volumen als Inoculum für 5 Liter desselben Glukose- Maisquellwasser-Mediums verwendet, welches zusätz lich 5 ml eines Schaumverhütungsmittels (ein Gemisch von Specköl: und Octadecanol) enthält. Der Fermenter wird in ein Wasserbad gestellt, auf 28 C gebracht und der Inhalt gerührt (300 Umdrehungen pro Minute) und belüftet (0,3 Liter Luft pro Minute auf 5 Liter Gärmedium).
Nach 20stündiger Inkubation, nachdem sich ein gutes Wachstum entwickelt hat, wird 1 g 6c < -Fluor-19-nor-4-androsten-3,11,17-trion, gelöst in 16 ml Dimethylformamid, zugesetzt und die Inkuba tion bei derselben Temperatur (28 C) und Belüftung während 48 Stunden fortgesetzt (End-pH 8,3). Das Mycel wird abfiltriert und dreimal mit je 200 ml Aceton extrahiert. Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit 1 Liter Methylenchlorid extrahiert und diese Extrakte sodann mit den Acetonextrakten vereinigt, über was serfreiem Natriumsulfat getrocknet und verdampft.
Der erhaltene Rückstand wird über Florisil (wasser freies Magnesiumsilikat) chromatographiert. Die Säule wird mit Skellysolve-B-Hexanen mit von 5-20% stei genden Mengen Aceton eluiert. Die derart erhaltenen Fraktionen werden zur Trockne verdampft.
Die Rück stände werden der Infrarot-Absorptionsanalyse unter worfen und jene Rückstände, welche die für 6a-Fluor- 11-keto-östron charakteristischen Banden aufweisen, vereint und aus Aceton-Hexan umkristallisiert, um 6(x-Fluor- I1-keto-östron (11I) als kristallinen Feststoff zu ergeben.
<I>Beispiel 8</I> 6a-Fluor-östradiol (I11) Ein Gemisch von 100 mg 6a-Fluor-17ss-oxy-19- nor-4-androsten-3-on (1), gelöst in 6 ml tertiärem Butylalkohol und 0,55 ml Essigsäure, wird zusam men mit 30 mg Selendioxyd unter Rühren während etwa 24 Stunden auf ungefähr 75 C erhitzt. Dann wird eine weitere 30-mg-Portion Selenoxyd zugesetzt und das Gemisch unter ständigem Rühren während weiterer 24 Stunden erhitzt. Das Gemisch wird sodann gekühlt, filtriert und eingedampft.
Der Rückstand wird in 75 ml Methylenchlorid gelöst, mit Natrium bikarbonatlösung und mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel dar aus verdampft. Der erhaltene Rückstand wird über eine Säule aus Florisil (wasserfreies Magnesiumsilikat) chromatographiert. Die Säule wird mit Skellysolve-B- Hexanen mit von 5-20% ansteigenden Mengen Ace- ton eluiert. Die erhaltenen Fraktionen werden zur Trockne verdampft.
Die Rückstände werden der In frarot-Absorptionsanalyse unterworfen und diejenigen Rückstände, welche die für 6a-Fluor-östradiol cha rakteristischen Banden aufweisen, vereint und aus Methylenehlorid/Skellysolve-B-Hexanen umkristalli siert, um 6a-Fluor-östradiol (III) als kristallinen Fest stoff zu ergeben.
Ersetzt man 6a - Fluor - 17ss - oxy - 19 - nor-4-an- drosten-3-on durch 6a-Fluor-17/3-oxy-19-nor-4-an- drosten-3-on-17-acylate, so erhält man die entspre chenden 6a-Fluor-östradiol-17ss-acylate, z. B. das 17/3-Acetat, 17ss-Propionat, 17ss-Hemisuccinat, 17ss Benzoat und dergleichen.
<I>Beispiel 9</I> 6a-Fluor-llss-oxy-östradiol (III) Ein Gemisch von 100 mg 6a-Fluor-llss,17f3-di- oxy-19-nor-4-androsten-3-on (I), gelöst in 6 ml ter tiärem Butylalkohol und 0,55 ml Essigsäure, wird zu sammen mit 30 mg Selendioxyd unter Rühren wäh rend etwa 24 Stunden auf ungefähr 75 C erhitzt. Dann wird eine weitere 30-mg-Portion Selenoxyd zu gesetzt und das Gemisch unter ständigem Rühren während weiterer 24 Stunden erhitzt. Das Gemisch wird sodann gekühlt, filtriert und eingedampft.
Der Rückstand wird in 75 ml Methylenchlorid gelöst, mit Natriumbikarbonatlösung und mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel daraus verdampft. Der erhaltene Rückstand wird über eine Säule aus Florisil (wasserfreies Magnesiumsilikat) chromatographiert. Die Säule wird mit Skellysolve-B- Hexanen mit von 5-20% ansteigenden Mengen Ace ton eluiert. Die erhaltenen Fraktionen werden zur Trockne verdampft.
Die Rückstände werden der In frarot-Absorptionsanalyse unterworfen und diejenigen Rückstände, welche die für 6a-Fluor-llss-oxy-östra- diol charakteristischen Banden aufweisen, vereint und aus Methylenchlorid/Skellysolve-B-Hexanen umkri stallisiert, um 6a-Fluor-llss-oxy-östradiol (III) als kristallinen Feststoff zu ergeben.
Ersetzt man 6a-Fluor-llss,17ss-dioxy-19-nor-4- androsten-3-ondurch 6a-Fluor-1 lss,17ss-dioxy-19-nor-4- androsten-3-on-17-acylate, so erhält man die entspre chenden 6a-Fluor- 1lss-oxy-östradiol-17ss-acylate, z. B. das 17ss-Acetat, 17ss-Propionat, 17ss-Hemisuccinat, 17ss-Benzoat und dergleichen.
<I>Beispiel<B>1</B></I><B>0</B> _ Die 6ss-Epimeren Ersetzt man das Ausgangsmaterial in Beispiel 1 durch 6ss-Fluor-llss-oxy-4-androsten-3,17-dion und arbeitet unter annähernd neutralen Bedingungen, so erhält man 6ss-Fluor-llss-oxy-1,4-androstadien-3,17- dion.
Ersetzt man das 6a-Fluor-Ausgangssteroid in den Beispielen 2 bis 9 durch die entsprechenden 6ss-Fluor- Ausgangssteroid und arbeitet unter annähernd neu tralen Bedingungen, so erhält man die entsprechenden 6ss-Fluor-Steroid-Endprodukte wie z. B.
6p-Fluor-1,4-androstadien-3,11,17-trion (Beispiel 2), 6/3-Fluor-17fl-oxy-1,4-androstadien-3,1 1-dion (Beispiel 3), 6p-Fluor-17p-oxy-1,4-androstadien-3,11-dion. 17-propionat (und andere 17-Acylate) (Beispiel 3A), 6p-Fluor-17p-oxy-1,4-androstadien-3-on (und dessen 17-Acylate) (Beispiel 4), 6p-Fluor-11 p-17p-dioxy-1,4-androstadien-3-o (und ihre 17-Acylate) (Beispiel 5), 6/3-Fluoröstron (Beispiel 6),
6/i-Fluor-ll-ketoöstron (Beispiel 7), 6p-Fluoröstradiol (und ihre 17p-Acylate) (Beispiel 8) und 6p-Fluor-llp-oxy-östradiol (und ihre 17p Acylate) (Beispiel 9).
<I>Beispiel 11</I> Isomerisierung der 6p-Fluorsteroide zu den entsprechenden 6rz-Fluorsteroiden Diese Umsetzung kann beispielsweise wie folgt ausgeführt werden: Eine Lösung von I g 61)'-Fluor-llp-oxy-1,4-an- drostadien-3,17-dion in 100 ml Chloroform und 0,1 ml Alkohol wird in einem Eis-Wasser-Bad auf etwa -10' C gekühlt und ein Strom von wasserfreiem Chlorwasserstoff langsam während 21 Stunden durch die Lösung geleitet, wobei die Temperatur auf - 5 bis -15 C gehalten wird.
Die Lösung wird sodann mit verdünnter Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrock net und unter vermindertem Druck verdampft. Die Kristallisierung des Rückstandes aus AcetoniSkelly- solve-B-Hexanen ergibt 6(-x -Fluor - 11 p-oxy-1,4-an- drosten-3,17-dion von Beispiel 1.