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Verfahren zur Herstellung von Derivaten der 6-Aminopenicillansäure
Es ist bekannt, Substanzen mit antibiotischer Wirksamkeit durch Züchtung gewisser
Pilzarten, beispielsweise von Pilzen des Penicilliumstammes, wie Penicillium chrysogenum,
in einem geeigneten Nährmedium zu erzeugen. Eine Gruppe dieser Substanzen mit antibiotischer
Wirksamkeit ist als Penicillingruppe bekannt. Diese Penicilline weisen die allgemeine
Strukturformel R-Pn-COOH (I) auf, in welcher Pn den Rest CsHlo02N2S bedeutet, welchem
nach allgemeiner Auffassung die folgende Struktur zugeschrieben werden muß:
Frühere Arbeiten auf dem Penicillingebiet haben gezeigt, daß der Anteil des in Form
eines metabolitischen bzw. eines penicillinerzeugendenSchimmelpilzes erhaltenen
antibiotischen Stoffes nur einen kleineren Prozentsatz der insgesamt erzeugten Produkte
ausmacht. Später wurde gefunden, daß die Ausbeute an Penicillinen beträchtlich erhöht
werden kann, wenn man die betreffenden Pilze in Gegenwart spezieller chemischer
Verbindungen züchtet, welche in der Literatur als »Precursoren« bezeichnet werden.
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Diese Verbindungen scheinen derart zu wirken, daß sie die Einführung
der Gruppe R der allgemeinen Formel 1 in das Penicillinmolekül erleichtern. Alle
bisher im technischen Maßstab erzeugten Penicilline sind unter Verwendung eines
solchen Precursors erhalten worden.
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Es wurde nun gefunden, daß Substanzen mit antibiotischer Wirksamkeit
dadurch erhalten werden können, daß man eine aus der oben angegebenen Fermentationsbrühe
isolierte spezielle Aminosäure mit einem geeigneten .Acylierungsmittel umsetzt.
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Es wurde nämlich festgestellt, daß diese Fermentationsbrühe eine
Verbindung der nachstehenden Strukturformel enthält:
die von ihr als 6-Aminopenicillansäure bezeichnet
worden ist. Diese Bezeichnung ist
dann auch von anderen Forschern auf diesem Gebiet übernommen worden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Derivaten der
6-Aminopenicillansäure ist dadurch gekennzeichnet, daß man isoliert 6-Aminopenicillansäure
bei Temperaturen nicht über 30"C und bei einem p-Wert von 6 bis 9 in einem Lösungsmittel
mit einem Carbonsäurechlorid oder -bromid, einem Sulfonsäurechlorid, einem Chlorkohlensäureester,
einem Carbonsäureanhydrid oder einem von einer Carbonsäure abgeleiteten gemischten
Anhydrid umsetzt.
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Die so erhältlichen Verbindungen mit antibiotischer Wirksamkeit können
beispielsweise als nährende Zusatzstoffe für Viehfutter, als Therapeutica für Geflügel
und Haustiere sos.-e auch zur Behandlung menschlicher Erkrankungen und insbesondere
für die Bekämpfung solcher Erkrankungen verwendet werden, welche durch grampositive
Bakterien verursacht worden sind.
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Das technisch erfolgreiche Gelingen dieser Arbeitsweise war nicht
zu erwarten, da noch zu einem späteren Zeitpunkt in der Fachliteratur die Meinung
vertreten wurde, daß die 6-Aminopenicillansäure infolge ihrer besonderen Struktur,
besonders wegen der Instabilität ihres A-Lactamringes, eine sehr labile Verbindung
sein muß.
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Die betreffenden Fermentationsmedien, aus welchen die 6-Aminopenicillansäure
isoliert wird, können in üblicher Weise durch Züchtung eines Penicilliumstammes,
insbesondere von Penicillium chrysogenum 51200, in der üblichen Weise erhalten werden,
wobei die Züchtung vorzugsweise unter aerobischen Tauchbedingungen durchgeführt
wird. Für die Herstellung einer solchen Fermentationsbrühe wird jedoch im Rahmen
der Erfindung ein Schutz nicht beansprucht.
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Da einige der erfindungsgemäß herstellbaren Substanzen mit antibiotischer
Wirksamkeit verhältnismäßig unbeständig sind und leicht chemischen Veränderungen
unterliegen, müssen die jeweils angewandten Reaktionsbedingungen so milde gewählt
werden, daß eine Zersetzung der Verbindungen vermieden wird. Im einzelnen hängen
jedoch die Reaktionsbedingungen von der Reaktivität der jeweils verwendeten Acylierungsmittel
ab. In den meisten Fällen muß man einen Kompromiß schließen zwischen der Anwendung
sehr milder Reaktionsbedingungen und einer dadurch bedingten langen Reaktionszeit
und der Anwendung schärferer Reaktionsbedingungen, wodurch die Reaktionszeit verkürzt
wird, aber gleichzeitig in gewissem Ausmaß Zersetzungserscheinungen auftreten.
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Die Reaktionstemperatur darf 30"C nicht überschreiten, und die Umsetzung
läßt sich in vielen Fällen schon bei Zimmertemperatur mit Erfolg durchführen. Um
den pH-Wert des Reaktionsgemisches im Bereich zwischen 6 und 9 zu halten, kann eine
geeignete Puffersubstanz, beispielsweise eine Natriumcarbonatlösung oder ein Natriumphosphatpuffer,
verwendet werden.
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Als Acylierungsmittel eignen sich beispielsweise Adipylchlorid, Propionsäureanhydrid,
Carbobenzoxyglycinäthoxy-ameisensäureanhydrid ,Chlorkohlensäurebenzylester und p-Toluolsulfonsäurechlorid.
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Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert:
Da die 6-Aminopenicillansäure in verhältnismäßig reiner Form eingesetzt wird, braucht
nur ein verhältnismäßig kleiner Überschuß von etwa 200/0 der Acyiierungsmittel angewendet
zu werden, und die so erhaltene Substanzen mit antibiotischer Wirksamkeit weisen
einen verhältnismäßig hohen Reinheitsgrad auf, wie es sich aus der manometrischen
Bestimmung unter Verwendung von Penicillinase ergibt.
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Beispiel 1 Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Phenoxymethylpenicillin
(Penicillin V) und ist typisch für die Reaktion der isolierten 6-Aminopenicillansäure
mit Monocarbonsäurechloriden.
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360 mg einer Lösung von Phenoxyacetylchlorid in 5 ml wasserfreiem
Aceton wurden unter Rühren tropfenweise im Verlauf von 10 Minuten einer Lösung von
450 mg 6-Aminopenicillansäure (etwa 75°/o Reinheit) in 18 ml einer 3%eigen wässerigen
Natriumbicarbonatlösung und 12 ml Aceton hinzugesetzt. Nach vollendetem Zusatz wurde
das Gemisch bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang gerührt und dann mit Ather (30
ml in drei Teilmengen) extrahiert, wobei man nur die wässerige Phase zurückbehielt.
Diese wässerige Lösung wurde mit 5 ml Butanol überschichtet und durch den Zusatz
von n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt.
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Nach dem Trennen der Schichten wurde die wässerige Phase mit zwei
Teilmengen von je 2,5 ml Butanol extrahiert, wobei jedesmal der pH-Wert auf 2 eingestellt
wurde. Die vereinigten Butanollösungen, welche in diesem Stadium die freie Penicillinsäure
enthielten, wurden mit 3 2 ml Wasser gewaschen und dann mit 10 ml Wasser geschüttelt,
welchem man genügend 3 0/obige Natriumbicarbonatlösung hinzugesetzt hatte, um die
wässerige Phase auf einen p-Wert von 7 zu bringen. Die Butanollösung wurde weiterhin
mit zwei Teilmengen Wasser von je 5 ml extrahiert, wobei man jeder Teilmenge genügend
Bicarbonatlösung hinzugesetzt hatte, um die wässerige Phase auf einen pH-Wert von
7 zu halten. Die vereinigten wässerigen Lösungen wurden mit 20 ml Äther gewaschen
und dann bei niedriger Temperatur und niedrigem Druck eingedampft, wobei das rohe
Natriumsalz von Phenoxymethylpenicillin zurückblieb. Nach dem Trocknen in einem
Vakuum-Exsikkator erhielt man 591 mg eines etwas zerfließlichen Pulvers.
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Die Reinheit des Produkts betrug nach dem Penicillinase-Test 73 0/o
und nach dem Bio-Test 68°/o. In seinem chromatographischen Verhalten und in seinem
antibakteriellen Wirkungsbereich zeigte das Produkt keinen wesentlichen Unterschied
gegenüber dem auf biologischem Wege hergestellten Phenoxymethylpenicillin. Es zeigte
auch die relative Beständigkeit gegenüber Säuren, welche für dieses besondere Penicillin
kennzeichnend ist. Nach 2 stündigem Aufbewahren des Produktes bei einem pH-Wert
von 2 war noch kein Verlust an Wirksamkeit festzustellen.
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Beispiel 2 Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von b-Carboxybutylpenicillin
und ist typisch für die Reaktion der isolierten 6-Aminopenicillansäure mit einem
Dicarbonsäurechlorid.
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Die Anteilsmengen der Reagenzien und die Art des Zusatzes wurden
dabei so gewählt, daß eher die Bildung eines Mono-Derivats als eines Bis-Derivats
der Adipinsäure begünstigt wurde.
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Zwei getrennte Lösungen, die eine aus 500 mg 6-Aminopencillansäure
in 6,4 ml 3°/Oiger wässeriger Natriumbicarbonatlösung, die andere aus 420 mg Adipylchlorid
in 6 ml wasserfreiem Aceton bestehend, wurden im Verlauf von 10 Minuten unter Rühren
in jeweils gleichen Anteilmengen einem Gemisch aus 25 ml 30/oiger-Natriumbicarbonatlösung
und 25 ml Äceton hinzugesetzt.
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Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur gerührt und
dann mit Äther (60 ml in drei Teilmengen) extrahiert, worauf die Extrakte verworfen
wurden. Das Produkt wurde durch Aufnehmen der freien Penicillinsäure in Butanol
und nochmaligem Extrahieren mit Wasser bei einem pH-Wert von 7, wie es im Beispiel
1 beschrieben ist, isoliert. Die Ausbeute an trockenem Natriumsalz von-Carboxybutylpenicillin
belief sich auf 445 mg, welches durch den manometrischen Penicillinase-Test als
zu 520/0 rein bestimmt wurde. Bei der Papierchromatographie zeigte das Produkt nur
eine einzelne Zone antibiotischer Wirksamkeit. Nach 2stündigem Aufbewahren des Produkts
bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit auf weniger als 25°/o.
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Beispiel 3 Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Äthylpenicillin
und ist typisch für die Reaktion der isolierten 6-Aminopenicillansäure mit einem
einfachen Carbonsäureanhydrid.
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400 mg 6-Aminopenicillansäure wurden wie im Beispiel 1 acyliert,
abgesehen von der Verwendung von 140 mg Propionsäureanhydrid an Stelle des Phenoxyacetylchlorids.
Nach dem Aufarbeiten wie im Beispiel 1 erhielt man eine Ausbeute von 260 mg an rohem
Natriumsalz von Äthylpenicillin, welches durch den manometrischen Penicillinase-Test
als zu 530/0 rein befunden wurde. Die nach 2stündigem Aufbewahren des Produkts bei
einem pH-Wert von 2 verbleibende Wirksamkeit belief sich auf weniger als 30in. Beispiel
4 Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von N-Carbobenzoxyaminomethylpenicillin
und ist typisch für die Reaktion der isolierten 6-Aminopenicillansäure mit einem
an sich unbeständigen gemischten Anhydrid.
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Eine Lösung von 450 mg N-Carbobenzoxy-glycin und 0,3 ml Triäthylamin
in 10 ml trockenen Acetons wurde gerührt und auf 5 C gekühlt. Eine Lösung von 0,2
ml Chlorkohlensäureäthylester in 2 ml trockenem Aceton wurde unter dauerndem Kühlen
und Rühren tropfenweise hinzugesetzt. Nach 10 Minuten wurde das resultierende Gemisch,
welches N-Carbobenzoxyglycinäthoxy-ameisensäureanhydrid und suspendiertes Trimethylamin-hydrochlorid
enthielt, auf 5 0C gekühlt und langsam unter Rühren einem eiskalten Gemisch aus
430 mg 6-Aminopenicillansäure, 17 ml 30/obiger Natriumbicarbonatlösung und 5 ml
Aceton hinzugesetzt. Man ließ das Gemisch Zimmertemperatur annehmen und hielt es
30 Minuten lang unter dauerndem Rühren auf dieser Temperatur. Das Produkt wurde
dann, wie es im Beispiel 1 beschrieben ist, isoliert, wodurch das rohe Natriumsalz
von Carbobenzoxyaminomethylpenicillin (469 mg mit einer Reinheit von 63°lo) anfiel.
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Die nach 2stündigem Aufbewahren des Produkts bei einem pH-Wert von
2 verbleibende Wirksamkeit belief sich auf 94010.
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Beispiel 5 Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von Benzyloxypenicillin
und ist typisch für die Reaktion der isolierten 6-Aminopenicillansäure mit einem
Ester der Chlórkohlensäure.
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500 mg 6-Aminopenicillansäure wurden, wie es im Beispiel 1 beschrieben
ist, behandelt, jedoch wurden 430 mg Chlorkohlensäurebenzylester statt des Phenoxyacetylchlorids
als Ausgangsverbindung verwendet, und das Gemisch wurde 100 Minuten lang bei Zimmertemperatur
gerührt, bevor dasselbe in der üblichen Weise aufgearbeitet wurde. Die Ausbeute
an dem sehr zerfließlichen rohen Natriumsalz von Benzyloxypenicillin belief sich
auf 445 mg mit einer Reinheit von 900/0. Die nach 2stündigem Aufbewahren des Produkts
bei einem pH-Wert von 2 verbleibende Wirksamkeit belief sich auf 710in.
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Beispiel 6 Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des Natrium-6-p-toluolsulfonamido-penicillanats
und ist typisch für die Reaktion der isolierten 6-Aminopenicillansäure mit einem
Sulfonsäurechlorid.
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400 mg 6-Aminopenicillansäure wurden behandelt, wie es im Beispiel
1 beschrieben ist, jedoch unter Verwendung von 350 mg p-Toluolsulfonylchlorid statt
des Phenoxyacetylchlorids als Ausgangsverbindung. Die Ausbeute an rohem Natrium-6-p-toluolsulfonamido-penicillanat
belief sich auf 402 mg mit einer Reinheit von 570/0. Nach 2stündigem Aufbewahren
des Produkts bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit auf 770/0.
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Beispiel 7 Das Natriumsalz von Methylpenicillin erhielt man durch
Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Acetylchlorid
an Stelle von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an dem rohen Natriumsalz mit einer
Reinheit von 32°/o belief sich auf 27 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Beispiel
8 Das Natriumsalz von l-Propenylpenicillin erhielt man durch Wiederholung des Verfahrens
von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Crotonylchlorid an Stelle von Phenoxyacetylchlorid.
Die Ausbeute an dem rohen Natriumsalz mit einer Reinheit von 290/0 belief sich auf
77 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Nach 2stündigem Aufbewahren des Produkts
bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit auf 240/0.
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Beispiel 9 Das Natriumsalz von Chlormethylpenicillin erhielt man
durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Chloracetylchlorid
an Stelle von Phenoxyacetylchlorid.
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Die Ausbeute an dem rohen Natriumsalz von 77°/o Reinheit belief sich
auf 79 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Nach 2stündigem Aufbewahren des Produkts
bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit auf 800/0.
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Beispiel 10 Das Natriumsalz von Dichlormethylpenicillin erhielt man
durch Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Dichloracetylchlorid
an Stelle von Phenoxyacetylchlorid.
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Die Ausbeute an dem rohen Natriumsalz mit einer Reinheit von 310/0
belief sich auf 80 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Bei 2 stündigem Aufbewahren
des Produkts bei einem pH-Wert von 2 veränderte sich die Wirksamkeit nicht.
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Beispiel 11 Das Natriumsalz von Brommethylpenicillin erhielt man
nach dem Verfahren von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Bromacetylchlorid
an Stelle von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an dem rohen Natriumsalz von 69°lo
Reinheit belief sich auf 107 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure.
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Nach 2stündigem Aufbewahren des Produkts bei einem pH-Wert von 2 sank
die Wirksamkeit auf 950/0.
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Beispiel 12 Das Natriumsalz von Cyclohexylpenicillin erhielt man
nach dem Verfahren von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Hexahydrobenzoylchlorid
an Stelle von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an dem rohen Natriumsalz von 70°/o
Reinheit belief sich auf 76 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure.
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Beispiel 13 Das Natriumsalz von Phenylpenicillin erhielt man durch
das Verfahren von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Benzoylchlorid an Stelle
von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an dem rohen Natriumsalz mit einer Reinheit
von 690/0 belief sich auf 109 mg je 1Ü0 mg 6-Aminopenicillansäure. Nach 2 stündigem
Aufbewahren des Produkts bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit auf weniger
als 150/0.
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Beispiel 14 Das Natriumsalz von Benzylpenicillin erhielt man nach
dem Verfahren nach Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Phenylacetylchlorid an
Stelle von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an dem rohen Natriumsalz mit einer
Reinheit von 70°/o belief sich auf 81 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Nach
2 stündigem Aufbewahren des Produkts bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit
auf weniger als 50/0.
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Beispiel 15 Das Natriumsalz von Benzhydrylpenicillin erhielt man
nach dem Verfahren von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Diphenylacetylchlorid
an Stelle von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an dem rohen Natriumsalz mit einer
Reinheit von 680/0 belief sich auf 111 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Nach
2 stündigem Aufbewahren des Produkts bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit
auf 650/0.
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Beispiel 16 Das Natriumsalz von Styrylpenicillin erhielt man nach
dem Verfahren von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Zimtsäurechlorid an Stelle
von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an rohem Natriumsalz mit einer Reinheit von
240/0 belief sich auf 106 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Nach 2 stündigem
Aufbewahren des Produkts bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit auf weniger
als 40/0. Beispiel 17 Das Natriumsalz von a-Chlorbenzylpenicillin erhielt man nach
dem Verfahren von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von a-Chlorphenylacetylchlorid
an Stelle von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an rohem Natriumsalz belief sich
auf 121 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Nach 2 stündigem Aufbewahren des Produkts
bei einem p-Wert von 2 sank die Wirksamkeit auf 980/0.
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Beispiel 18 Das Natrium salz von Phenylmercaptomethylpenicillin erhielt
man nach dem Verfahren von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von Phenylmercaptoacetylchlorid
an Stelle von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an rohem Natriumsalz mit einer
Reinheit von 72°lo belief sich auf 150 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Nach
2 stündigem Aufbewahren des Produkts bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit
auf 820/0.
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Beispiel 19 Das Natriumsalz von m-Sulfophenylpenicillin erhielt man
nach dem Verfahren von Beispiel 1, je-
doch unter Verwendung von m-Sulfobenzoylchlorid
an Stelle von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an rohem Natriumsalz mit einer
Reinheit von 420/0 belief sich auf 62 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure. Nach
2stündigem Aufbewahren des Produkts bei einem pH-Wert von 2 sank die Wirksamkeit
auf 390/0.
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Beispiel 20 Das Natriumsalz von a-Furylpenicillin wurde erhalten
nach dem Verfahren von Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von a-Furoylchlorid an
Stelle von Phenoxyacetylchlorid. Die Ausbeute an rohem Natriumsalz mit einer Reinheit
von 510/0 belief sich auf 101 mg je 100 mg 6-Aminopenicillansäure.
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Nach 2 stündigem Aufbewahren des Produkts bei einem pH-Wert von 2
sank die Wirksamkeit auf 34°lo.
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Das freie Penicillin kann aus den Natriumsalzen in jedem Falle durch
Ansäuern erhalten werden.
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In den vorstehenden Beispielen wurde nur das Natriumsalz angeführt,
aber selbstverständlich kann man, falls es gewünscht werden sollte, mit ähnlichen
Mitteln auch andere Salze, z. B. die Kalium- und Calciumsalze, erhalten.
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Die das Bakterienwachstum hemmenden Eigenschaften einiger in den
Beispielen angeführten Produkte sind in der nachstehenden Tabelle angegeben:
| Grenzverdünnung fiir die Hemmung |
| bakteriellen Wachstums*) |
| Bei- |
| spiele Eschl Proteus Salm. Staph. Bacillus |
| coli vulgaris typhi aureus subtilis |
| 1 8000 20000 16000 80 # 106 20.108 |
| 2 4000 8000 160000 800000 800000 |
| 3 40 000 20 000 80 000 4 # 106 2 # 106 |
| 4 4000 8000 16000 8 # 106 4,106 |
| 5 8000 16000 20000 20.108 400000 |
| 6 4000 8000 4000 800000 400000 |
| 7 20 000 8 000 40 000 2 # 106 800 000 |
| 8 16000 8000 40000 2 # 106 1600000 |
| 9 20 000 4 000 80 000 4 # 106 800 000 |
| 10 16 000 4 000 80 000 8 # 106 1 600 000 |
| 11 1600 1600 40000 2 # 106 1600000 |
| 12 4 000 4 000 20 000 16 # 106 2 # 106 |
| 13 4000 20000 4000 8 8.106 800000 |
| 14 200 000 200 000 400 000 40 # 106 40 # 106 |
| 15 8000 4000 8000 40 # 106 - |
| 16 4000 4000 4000 1600000 800000 |
| 17 16000 8000 80000 40 # 106 8.106 |
| 18 16000 20000 160000 160 # 106 20000 |
| 19 8000 8000 8000 320 000 32000 |
| 20 4000 20000 8000 1600000 40000 |
*) Ohne Korrektur hinsichtlich Reinheit.