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Verfahren zur Gewinnung von Novobiocin Die Erfindung betrifft ein
Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Novobiocin.
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Novobiocin, 7-[4-(Carbamoyloxy)-tetrahydro-3-oxy-5-methoxy-6,6-dimethylpyranyl-2-oxy]-4-oxy-3-[4-oxy-3-(3-methyl-2-butenyl)-benzamido]-8-methylcumarin
ist ein neues Antibiotikum, das folgende Strukturformel hat
Es bildet sich bei der Kultivierung von Mikroorganismen, z. B. des Streptomyces
niveus sowie dessen Mutanten und Varianten. Aus dem dabei erhaltenen Fermentierungsmedium
wird das Novobiocin gemäß Erfindung in der nachfolgend beschriebenen Weise isoliert
und gereinigt.
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Aus dem erhaltenen Fermentierungsmedium wird das Novobiocin zunächst
in ein organisches Lösungsmittel übergeführt. Dieses kann in der Weise geschehen,
daß man das Novobiocin fällt, beispielsweise indem man die Lösung stark sauer macht,
dann das ausgefallene Novobiocin in einem organischen Lösungsmittel aufnimmt, wobei
man entweder die wäßrige Novobiocinniederschlag enthaltende Lösung mit dem organischen
Lösungsmittel behandelt oder den nach dem Filtrieren erhaltenen Novobiocinniederschlag
mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Es hat sich jedoch als vorteilhaft
erwiesen, das Novobiocin mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel direkt
aus dem wäßrigen Medium, in dem das Novobiocin gelöst oder suspendiert enthalten
ist, zu extrahieren. Die wäßrige Lösung wird zunächst angesäuert, um, und wie erforderlich,
zu gewährleisten, daß das Novobiocin im wesentlichen in einer sauren Form, z. B.
als freie Säure oder saures Salz in Abwesenheit des dibasischen Salzes vorliegt.
Es ist nicht unbedingt notwendig, daß die Lösung so stark angesäuert wird, daß das
Novobiocin vollständig ausfällt. Vorteilhafterweise wird der pH-Wert so hoch gehalten,
daß die Ausfällung der Novobiocinsäure auf einem Minimum bleibt. Unter diesen Bedingungen
liegt das Novobiocin in wäßriger Lösung und/oder Suspension in Form der freien Säure
und/oder des sauren Salzes vor und kann wie die freie Säure in einfacher Weise in
die Lösungsmittelphase übergeführt werden. Der so erhaltene Lösungsmittelextrakt
wird dann seinerseits mit einer wäßrigen alkalischen Pufferlösung extrahiert, wobei
der pH-Wert der Pufferlösung vorteilhafterweise auf einem Wert gehalten wird, daß
das Novobiocin hauptsächlich in Form seines dibasischen Salzes vorliegt. Bei Einhaltung
dieser Bedingungen läßt sich das Novobiocin in einfacher Weise in die wäßrige Phase
überführen. Aus der wäßrigen Pufferlösung kann das Novobiocin durch eine weitere
Lösungsmittelextraktion bei einem pH-Wert, bei welchem das Novobiocin im wesentlichen
in Form seines monobasischen Salzes vorliegt, isoliert werden, wobei man es aus
dem Lösungsmittelextrakt zur Kristallisation bringen kann. Man kann es aber auch
direkt aus dem Extrakt der Pufferlösung zur Kristallisation bringen, indem man den.
Extrakt der Pufferlösung so weit ansäuert, daß das Novobiocin in Form der freien
Säure ausfällt. Man kann aber auch so vorgehen, daß man die wäßrige Phase so weit
ansäuert, daß sich etwas freie Säure bildet, ein mit Wasser mischbares organisches
Lösungsmittel zufügt, um. die Verunreinigungen in Lösung zu halten, und dann weitere
Säure zusetzt, um einen pH-Wert aufrechtzuerhalten, bei welchem Novobiocin in Form
der freien Säure aus
der erhaltenen wäßrigen organischen Lösungsmittelextraktion
auskristallisiert.
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Nach einer Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird das gesamte
Kulturmedium bei einem pH-Wert zwischen etwa 7 und etwa 10, vorzugsweise bei etwa
8, filtriert und das- Filtrat auf einem pH-Wert zwischen etwa 2 und etwa 7, vorzugsweise
auf etwa 6, mit Mineralsäure, wie Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure u. dgl.,
eingestellt und die Lösung mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie einem niedrigen
Alkylacetat, vorzugsweise n-Butylacetat, Amylacetat, Äthylacetat u. dgl., extrahiert.
Hierfür eignen sich auch andere Lösungsmittel, z. B. mit Wasser nicht mischbare
niedere Alkohole, wie n-Butanol, n-Amylalkohol, Isopropylalkohol u. dgl., mit Wasser
nicht mischbare niedere Alkanole, wie Methyl-isobutylketon, Methylisopropylketon
u. dgl. Der dabei erhaltene Lösungsmittelextrakt des Novobiocins wird dann mit einer
alkalischen wäßrigen Pufferlösung extrahiert, wie Alkalicarbonat, das auf einen
pH-Wert von etwa 8 bis 11, vorzugsweise auf etwa 10, eingestellt ist. Aus der wäßrigen
Pufferlösung kann das Novobiocin durch Zusatz einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure,
Salzsäure u. dgl., zur Kristallisation gebracht werden. Man kann aber auch das Novobiocin
aus der wäßrigen Pufferlösung mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel
fällen und auf einen pH-Wert zwischen etwa 2 bis etwa 7 ansäuern, um etwas Novobiocin
in Form der freien Säure freizusetzen, die in dem dabei gebildeten wäßrigen Lösungsmittel
unlöslich ist. Man kann hierzu jedes mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel
verwenden. Als Beispiele hierfür seien angegeben: Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol,
tert.-Butanol, Aceton, Glycerin, Äthylenglycol, Propylenglycol, Diäthylenglycol
und Glycolmonoäther, wie Monomethyl- und Monoäthyläther von Äthylenglycol und Propylenglycol.
Man kann aber auch das Novobiocin aus der wäßrigen alkalischen Pufferlösung mit
einem organischen Lösungsmittel extrahieren und nötigenfalls das gesamte Verfahren
wiederholen um ein Antibiotikum eines höheren Reinheitsgrades herzustellen.
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Das Verfahren der Erfindung soll an Hand folgender Beispiele näher
erläutert werden.
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Beispiel 1 In einen 500-ccm-Erlenmeyerkolben werden 100 ccm eines
sterilen Mediums folgender Zusammensetzung gegeben: Glucosemonohydrat . . .
................ 10 g Natriumchlorid ...................... 5 g Pepton, Difco
....................... 5 g Fleischextrakt ....................... 10 g Leitungswasser
q. s. .................. 1 1 Nach der Verdampfung mit einer wäßrigen Sporensuspension
von Streptomyces niveus (das auf einem üblichen Maltose-Trypton-Schrägagar erhalten
worden war) wird der das Medium enthaltende Kolben auf einer hin- und hergehenden
Schüttelapparatur bei 28° C 72 Stunden lang bebrütet. Das erhaltene Produkt ist
die Vorkultur.
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121 eines sterilen Mediums, das folgende Zusammensetzung hat Glucosemonohydrat
................... 25 g Baumwollsamenmehl (extrahiert) ....... 40
g Leitungswasser q. s. .................. 1 1 die sich in einem 251 fassenden
Fermentierbehälter aus rostfreiem Stahl befinden, beimpft man mit 25 ccm der oben
beschriebenen Vorkultur. Die Kultur bebrütet man 2 Tage bei 28° C unter Rühren und
Belüftung (61 pro Minute). Das erhaltene Produkt ist die Saatkultur.
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2501 eines sterilen Fermentierungsmediums folgender Zusammensetzung
Glucosemonohydrat ................... 14 g Stärke...............................
12,5 g Distiller's solubles .................... 20 g Leitungswasser q. s.
.................. 11 die sich in einem 3781 fassenden, mit Harz ausgekleideten
Stahlfermentierungsgefäß befinden, wurden mit 121 der oben beschriebenen Saatkultur
beimpft. Das Fermentierungsmedium wurde auf einer Temperatur von 28° C gehalten,
mit einem Rührer vom Saugrohrtyp mit einer Geschwindigkeit von 280 Touren pro Minute
gerührt und belüftet, wobei der Verbrauch 5,66 m3 pro Stunde betrug. Um die Schaumbildung
zu bekämpfen, wurden zu Beginn 300 ccm Lard-Öl und im weiteren Verlauf der Fermentierung
600 ccm einer 1 °/oigen Lösung von Octadecanol in Lard-Öl zugefügt. Nach 114 Stunden
wurde die Würze geerntet.
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2251 dieser Würze wurden mit 140 ccm einer 50°/oigen Natronlauge auf
einen pH-Wert von 8,1 eingestellt. Dann filtrierte man die Lösung unter Verwendung
von 10 kg einer Infusorienerdefilterhilfe, stellte das pH der geklärten Würze mit
30 ccm konzentrierter Schwefelsäure auf einen Wert von 6 ein und extrahierte mit
701 Amylacetat. Die Amylacetatlösung, die antibiotische Aktivität aufwies, extrahierte
man dann mit 181 einer 10°/oigen wäßrigen Natriumcarbonatlösung bei einem pH-Wert
von 10,2. Dann säuerte man die Carbonatlösung mit 90 ccm konzentrierter Schwefelsäure
an, wobei man einen pH-Wert von 6,0 erhielt, und extrahierte mit 41 Amylacetat.
Der Extrakt, der antibiotische Aktivität aufwies, wurde durch Destillation auf 325
ccm, die 33,8 g festes Produkt enthielten, eingeengt. Zu 50 ccm dieses Konzentrates
gab man 80 ccm Aceton und 140 ccm Skellysolve B (Petrolätherfraktion, die im wesentlichen
aus n-Hexan besteht). Dann wurde die Lösung 16 Stunden gerührt, der Niederschlag
abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 2,0 g (40 °/a Ausbeute) an im
wesentlichen reinem kristallinem Novobiocin mit einer Wirksamkeit von 1000 mcg/mg
(Klebsiella pneumoniae, biologischer Test), Schmp. zwischen 174 und 178° C.
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Beispiel 2 Zu 2251 des im Beispiel 1 beschriebenen fermentierten Mediums
fügte man 140 ccm 50%iger Natronlauge, wobei ein pH-Wert von 8,1 erhalten wurde.
Die Mischung filtrierte man unter Verwendung von 10 kg Filterhilfe und stellte den
pH-Wert der geklärten Würze durch Zusatz von 30 ccm konzentrierter Schwefelsäure
auf 6 ein und extrahierte das in dem Filtrat enthaltene Novobiocin mit 721 Butylacetat.
Die Butylacetatlösung, die antibiotische Wirksamkeit aufwies, extrahierte man dann
mit 181 einer nahezu 0,5 molaren wäßrigen Carbonatpufferlösung bei einem pH-Wert
von 10,2. Die 0,5molare wäßrige Carbonatpufferlösung wurde durch Lösen von 49,0
g wasserfreiem Natriumcarbonat und 4,2 g Natriumbicarbonat in deionisiertem Wasser
hergestellt. Die erhaltene Lösung wies einen pH-Wert von etwa 9 bis etwa 10,5 auf
und wurde durch Zusatz von Natriumhydroxyd oder Schwefelsäure auf den gewünschten
pH-Wert eingestellt. Die die antibiotische Aktivität aufweisende Pufferlösung fügte
man zu 4,51 Aceton und stellte den pH-Wert auf 6,0 bis 6,3 ein, während man die
Mischung bei Raumtemperatur rührte, bis die Kristallisation beendet war. Die nach
der Filtration erhaltenen
v
Kristalle löste man in 250 ccm
Aceton, filtrierte die Lösung, verdünnte mit dem, gleichen Volumen an deionisiertem
Wasser und rührte die Mischung bei Raumtemperatur, bis die Kristallisation im wesentlichen
beendet war, filtrierte wiederum und trocknete die erhaltenen Kristalle im Vakuum.
Das in dieser Weise erhaltene kristalline Novobiocin war im wesentlichen gleich
dem, das nach der im Beispiel l beschriebenen Weise erhalten wurde, mit der Ausnahme,
daß die Ausbeute etwa 48 °/° betrug.
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Beispiel 3 Zu 2251 des im Beispiel 1 beschriebenen fermentierten Mediums
fügte man Filterhilfe zu, filtrierte die Mischung und wusch den erhaltenen Filterkuchen
mit warmem Wasser. Das Volumen der vereinigten Filtrate und Waschwässer war etwa
um ein Fünftel größer als das des Fermentierungsmediums vor der Filtration. Das
Filtrat extrahierte man in einer Podbielniak-Gegenstrom-Extraktionsapparatur mit
751 Äthylacetat. Die Äthylacetatlösung, die antibiotische Wirksamkeit aufwies, wurde
dann mit 181 einer wäßrigen Carbonatpufferlösung, die auf einen pn-Wert von 10,2
eingestellt war, extrahiert und der Pufferextrakt mit 100 ccm einer 600%igen Schwefelsäure
auf einen pn-Wert von 2,0 angesäuert, wobei das Novobiocin auskristallisierte, das
man abfiltrierte und in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise umkristallisierte.
Beispiel 4 2251 des im Beispiel l beschriebenen fermentierten Mediums wurden filtriert
und das darin enthaltene Novobiocin mit Äthylacetat extrahiert. Diesen Butylacetatextrakt
trennte man von der restlichen Mischung ab, dampfte ihn zur Trockene ein und löste
das rohe Novobiocin in 201 einer Boratpufferlösung bei einem. pH-Wert von 10,0.
Zur Herstellung dieser Pufferlösung mischte man 43,9 ccm einer 0,1 n-Na O H-Lösung
und 50,0 ccm einer 0,lmolaren H3B03 Lösung und verdünnte auf 100 ccm. Die Pufferlösung
kann auch aus Borsäure, Kaliumchlorid und Natriumhydroxyd hergestellt werden. Die
das Novobiocin enthaltende Pufferlösung wurde dann in derselben Weise behandelt,
wie es für die Carbonatpufferlösung im Beispiel 2 beschrieben ist. °