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Verfahren zur Herstellung eines konzentrierten Schweinecholeraantigens
aus dem Blut immunisierter Schweine Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
eines konzentrierten Schweinecholeraantigens aus dem Blut immunisierter Schweine,
mit dem in Schweinen eine passive Immunität gegen den Schweinecholeravirus erzeugt
werden kann.
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Das bisher verwendete Anti-Schweinecholeraserum wird in üblicher Weise
dadurch hergestellt, daß gegen Schweinecholera immunen Schweinen mindestens 5 ccm
von virulentem Schweinecholeravirus pro 450 g Schweinegewicht eingeimpft werden.
Die Immunität gegen Schweinecholera kann das Tier als natürliche Immunität besitzen,
oder sie kann durch gleichzeitige Einspritzung von virulentem oder modifiziertem
Virus und Anti-Schweinecholeraserum in das Tier erzeugt werden. Schweine, die gegen
Schweinecholera immun sind und denen virulenter oder modifizierter Schweinecholeravirus
injiziert wurde, entwickeln eine Hyperimmunität, d. h. sie erzeugen einen Überschuß
von Schweinecholeraantikörpern. Nach einer Inkubationszeit von ungefähr 10 bis 14
Tagen kann das hyperimmunisierte Blut von dem Tier abgezogen werden. In einer Zeit
von nicht mehr als 40 Tagen nach der Hyperimmunisierung können mehrere Blutentnahmen
vorgenommen werden, wobei jede Blutentnahme jeweils sieben Tage nach der vorangehenden
stattfindet. Gewöhnlich wird dem Tier dreimal Blut aus dem Schwanz entnommen und
danach das Tier durch Blutentnahme am Hals endgültig getötet. Das hyperimmunisierte
Blut kann dann gesammelt werden, und nach der Defibrinierung wird das Serum vom
Blutkuchen abgetrennt und pasteurisiert. Das erhaltene Schweinecholeraantiserum
kann mit Phenol konserviert werden und durch gleichzeitige Injektion mit virulentem
Schweinecholeravirus an nicht immunen Schweinen auf seine Potenz geprüft werden.
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Zur Immunisierung gesunder Schweine gegen Schweinecholera ist es bekannt,
dem Tier virulente Viren und gleichzeitig hyperimmunes Schweineserum zu injizieren.
Durch die Schutzkörpersubstanz des hyperimmunen Serums wird das Tier befähigt, die
Virusinfektion zu überleben und durch die antigene Wirkung des Virus selbst Antikörper
zu entwickeln, um die Immunisierung hervorzurufen. Als wesentlicher Nachteil dieser
Behandlungsweise ist es anzusehen, daß die Wirkung der Schutzkörpersubstanz des
bekannten Serums häufig nicht ausreicht, um die Infektion derTiere erfolgreich zu
bekämpfen. Um diesen Mangel zu umgehen, hat man, wie im folgenden noch näher erläutert
wird, sich bisher des sehr umständlichen und kostspieligen Weges der Verwendung
modifizierter Viren mit verminderter Ansteckungsfähigkeit bedient.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein konzentriertes Schweinecholeraantigen
aus dem Blut immunisierter Schweine dadurch hergestellt, daß ein gegen Schweinecholera
immunes Schwein mit nicht mehr als 10 ccm von mit Schweinecholera infiziertem Blut
pro kg Körpergewicht hyperimmunisiert wird und daß aus dem Serum des immunisierten
Blutes durch chemische Fraktionierung die Serumglobuline mit den Schweinecholeraantikörpern
von den übrigen Bestandteilen abgetrennt werden. Das auf diese Weise gewonnene Anti-Schweinecholerapräparat
erlaubt es, die Immunität bei Schweinen durch die Injektion bedeutend kleinerer
Mengen dieses Präparates zu erzeugen, als es bisher möglich war. Das Verfahren kann
in großtechnischem Maße, und zwar mit verhältnismäßig geringen Kosten gegenüber
den bekannten Ausführungsformen durchgeführt werden. Die Wirksamkeit des erfindungsgemäß
hergestellten Anti-Schweinecholerapräparates ist dreibis viermal so groß wie die
des Anti-Schweinecholeraserums.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Schweinecholeraantikörper
durch die chemische Fraktionierung des hyperimmunisierten Blutes genügend angereichert,
um damit Immunität von nicht immunen Schweinen zu erhalten. Diese Fraktionierung
kann derart durchgeführt werden, daß aus dem überimmunisierten
Blut
der Serumanteil extrahiert wird und dann dieses Serum mit einem proteinfällenden
Reagens behandelt wird, um eine Fraktion, die in der Hauptsache aus Serumglobulinen
und Schweinecholeraantikörpern besteht, daraus selektiv zu entfernen. Obwohl das
in diesem Verfahren zur Erzeugung der Cberimmunisierung eines immunen Schweines
verwendete Schweinecholeraviruspräparat modifiziert oder gemildert werden kann,
wurden besonders günstige Ergebnisse mit virulentem Schweinecholeravirus erhalten.
Mit dem Ausdruck ,mit Schweinecholera infiziertes Blut" ist ein virulenter Schweinecholeravirus
oder überimmunisierender Virus gemeint, der nach dem Verfahren erhalten wurde, wie
es in ">Rules and Regulations Relating to Viruses, Serum etc- vorbeschrieben ist,
herausgegeben vom US-Department of Agriculture am 1. März 1949, und zwar in Abschnitt
118.
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Die Hyperimmunisierung eines gegen Schweinecholera immunen Schweines
wird dadurch erreicht, daß es mit Schweinecholeravirus in einer Menge infiziert
wird, die nicht mehr als 4,5 ccm des mit Schweinecholera infizierten Blutes pro
450 g des Schweinegewichts beträgt. d. h. mit 0,002 bis 4,5 ccm des mit Schweinecholera
infizierten Blutes pro 450 g des Schweinegewichts. Es wurde gefunden, daß bessere
Ergebnisse erhalten werden, wenn die gegen Schweinecholera immunen Schweine mit
dem Schweinecholeravirus in einer Menge von 0,02 bis 3,0 ccm des mit Schweinecholera
infizierten Blutes pro 450 g Schweinegewicht infiziert werden, und besonders gute
Präparate werden erhalten, wenn die Hyperimmunisierung durch die Infizierung eines
gegen die Schweinecholera immunen Schweines mit dem Schweinecholeravirus in einer
Menge von 0,1 bis 1,0 ccm des mit Schweinecholera infizierten Blutes pro 450 g Schweinegewicht
erfolgt. Die Infizierung des gegen Schweinecholera immunen Schweines mit Schweinecholeravirus
kann durch parenterale Verabreichung, z. B. intravenöse oder subkutane Injektion,
erhalten werden.
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Die Inkubationszeit zur Erreichung der Hyperimmunisierung kann mindestens
11 Tage nach der Hyperimmunisierung durch Infizierung mit dem Schweinecholeravirus
betragen. Auch die Anzahl und Folgen der Blutentnahmen aus dem hyperimmunisierten
Schwein kann nach der üblichen Praxis erfolgen. Zum Beispiel kann die Blutentnahme
durch eine bis vier Blutentnahmen in verschiedenen Zeitabständen aus dem Schwanz,
der Vene oder dem Hals erfolgen. Das gewonnene Blut kann dann chemisch fraktioniert
werden, um ein Konzentrat der Schweinecholeraantikörper zu extrahieren, wobei Fibrinogen,
Albumin und andere Verunreinigungen zurückbleiben. Diese Extrahierung des Schweinecholera-Antikörperkonzentrates
kann erhalten werden durch Defibrinieren des Blutes, Abtrennung des Blutkuchens
vom defibrinierten Blut, um das Serum zu erhalten, dann wird das Serum mit einem
Protein fällenden Mittel fraktioniert, um eine Fraktion zu erhalten, die im wesentlichen
aus den Serumglobulinen und Schweinecholeraantikörpern besteht. Das Blut wird durch
Rühren mit einem Draht defibriniert, um die Umwandlung des Fibrinogens in Fibrin
zu erhalten, worauf dann das koagulierte Fibrin von dem Blut abgetrennt wird. Die
Abtrennung des Hämoglobins und der Zellrückstände aus dem defibrinierten Blut wird
erreicht durch Zugab-. eins Rouleauxingmittels, wie Bohnenextrakt (aus jack b2ans),
um die Agglutinierung der roten Blutzellen zu erhalten, auch durch Mischen des defibrinierten
Blutes mit gesättigter Natriumchloridlösung in einer Menge von 3 ccm pro 100 ccm
Blut und Zentrifugieren oder Filtrieren des Blutes, um den erhaltenen Niederschlag
zu entfernen.
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Dieses Serum kann dann chemisch mit einem proteinfällenden Mittel
fraktioniert werden, um das Konzentrat des Schweinecholeraantikörp2rs zu erhalten.
Die chemische Fraktionierung des hyperimmunisierten Serums kann erhalten werden
durch ein Verfahren, wie es von Cammarata und Deutsch in Arch. Biochem., 25, S.
354 (1950), beschrieben ist. Auch kann die chemische Fraktionierung durch Schockerhitz2n
nach dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2 785 105 erhalten werden. Hier besteht
ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrates der Schweinecholeraantikörp2r darin,
daß eine Globulinfraktion des Serums, die y-Globuline, ß-Globuline und Schweinecholeraantikörp2r
enthält, durch Einstellen des hyperimmunisierten Serums auf ein pA von 4,8 bis 6,0
und Erhitzen dieses Serums auf 40 bis 65'C selektiv koaguliert wird. Dabei wird
ein Koagulat dieser Globuline erhalten, wAches dann von der Lösung der Schweinecholeraantikörp2r
abgetrennt wird. Andere geeignete Verfahren zur chemischen Fraktionierung des hyperimmunisierten
Serums verwenden die Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Schwermetallionen usw.
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In dem bevorzugten Verfahren zur Herstellung des Anti-Schweinecholerapräparates
wird hyperimmunisiertes Serum auf ein pH von 6,7 bis 7,1 und eine Alkoholkonzentration
von 18 bis 30 Volumprozent eingestellt und der erhaltene Niederschlag von der überstehenden
Flüssigkeit abgetrennt. Die Ionenstärke dieser alkoholischen Lösung kann ungefähr
0,1 bis 0,2 sein, und die Einstellung dieser Ionenstärke kann durch Regulierung
der Natriumchloridmenge, die dem defibrinierten Blut beim Abtrennen der Zellsubstanzen
zugegeben wird, geschehen. Die Temperatur während dieser Fraktionierung soll ungefähr
50C bis zu einer Temperatur oberhalb des Gefrierpunktes der Alkohollösung sein.
Der bei diesem Fraktionierungsverfahren verwendetete Alkohol kann Methanol oder
Äthanol sein, obwohl Äthanol vozuziehen ist, und kann zu dem hyperimmunisierten
Serum in im wesentlich wasserfreier Form zugegeben werden, z. B. denaturierter 95
°;7,)iger Äthylalkohol, oder in mehr verdünntem Zustand, um die Denaturierung des
Proteins zu verhindern, z. B. 53 °/,)iger wäßriger Alkohol. Besonders gute Ergebnisse
werden erreicht, wenn die alkoholische Fraktionierung dadurch erreicht wird, daß
das hyperimmunisierte Serum auf ein pn von ungefähr 6,9, eine Äthanolkonzentration
von ungefähr 25 Volumprozent, eine Ionenstärke von ungefähr 0,15 und eine Temperatur
von 0 bis - 5'C eingestellt wird Der dabei erhaltene Niederschlag enthält in der
Hauptsache Serumglobuline und Schweinecholeraantikörp2r. Der Niederschlag wird von
der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und in Wasser suspendiert und die erhaltene
Lösung auf ein p" von 7,2 eingestellt, um andere verunreinigende Proteine, in der
Hauptsache P-Globuline, zu fällen. Dieser Niederschlag von f-Globulin kann durch
Zentrifugieren abgetrennt werden. Die lösliche Fraktion, die in der Hauptsache y-Globuline
und Schweinecholeraantikörper enthält, kann mit einem Konservierungsmittel, z. B.
Phenol, in einer Menge von 0,50,J`,) gemischt und verpackt werden für die Verwendung
zur Erzeugung passiver Immunität in nicht immunen Schweinen.
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Vor der chemischen Fraktionierung kann das defibrinierte Serum durch
Erhitzen auf 58 bis 59'C in einer geeigneten Pasteurisiervorrichtung pasteurisiert
werden. Nach beendeter Pasteurisierung soll das Serum so schnell wie möglich abgekühlt
und mit dem Konservierungsmittel, wie Phenol, in einer Menge von 0,5 °/,) gemischt
und dann bis zur chemischen Fraktionierung gelagert werden. Auch das erfindungsgemäß
erhaltene Präparat gegen Schweinecholera kann ähnlich pasteurisiert und konserviert
werden.
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Die Wirksamkeit oder der Titer dieses Anti-Schweinecholerapräparates
kann bestimmt werden, indem nicht
immune Schweine mit diesem Produkt
und gleichzeitig mit virulentem Schweinecholeravirus infiziert werden und dann der
Grad des Schutzes, den die Schweine gegen Schweinecholera erhalten, im Vergleich
mit Kontrollschweinen, die nicht mit virulentem Schweinecholeravirus in Abwesenheit
des Konzentrates der Schweinecholeraantikörper infiziert wurden, beobachtet werden.
Dieses Anti-Schweinecholerapräparat kann zur Erzeugung von Immunität gegen Schweinecholera
verwendet werden, indem nicht immune Schweine gleichzeitig mit virulentem oder modifiziertem
Schweinecholeravirus und diesem Präparat geimpft «erden. Die Erfindung wird in den
folgenden Beispielen erläutert Beispiel 1 Gegen Schweinecholera immune Schweine
wurden willkürlich ausgewählt aus drei verschiedenen Züchtungen. Sie hatten ein
Durchschnittsgewicht von 79,27 kg, 126,84 kg und 117,78 kg. Aus einer Züchtung stammten
immer fünf Schweine, die also eine gegen Schweinecholera immune Schweinegruppe von
fünfzehn Schweinen bildeten. Diese Schweine wurden mit 1 ccm des virulenten Schweinecholeravirus
pro 450 g Schweinekörpergewicht geimpft, um ihre Hyperimmunisierung zu erreichen.
Am 12. Tage nach der Impfung mit dem Virus wurde den Schweinen am Schwanz Blut entnommen,
und am 19. Tage nach der Impfung wurde das Blut aus dem Hals entnommen. Das bei
jeder Blutentnahme erhaltene Blut wurde sofort defibriniert und mit 0,5 °/o Phenol
konserviert. Das defibrinierte Blut aus jeder Blutentnahme wurde aufgefangen und
mit Bohnenextrakt und 3 ccm gesättigter Natriumchloridlösung pro 100 ccm Blut vereinigt.
Die erhaltene Mischung wurde zentrifugiert, um den Blutkuchen vom Serum zu trennen.
Das Serum wurde durch 30 :Minuten langes Erhitzen auf 58 bis 59'C pasteurisiert,
dann schnell abgekühlt, mit 0,501, Phenol gemischt und für die nachfolgende
chemische Fraktionierung gelagert. Das Präparat erhielt die Bezeichnung I. Beispiel
2 Das erhaltene überimmunisierte Serum wird auf ein pli von 6,9 eingestellt und
eine 53°/oige wäßrige Lösung von Äthylalkohol (vergällt mit 50/, Methylalkohol)
durch eine Kapillare hinzugegeben, bis eine endgültige Alkoholkonzentration von
25 Volumprozent erreicht ist. Der Alkohol wird vor der Zugabe zu dem Serum auf eine
Temperatur von - 20°C abgekühlt und die erhaltene alkoholische Lösung auf einer
Temperatur von ungefähr - 5'C gehalten. Der entstehende Niederschlag wird von der
überstehenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren bei einer Temperatur von - 5'C abgetrennt
und bei Kühlschranktemperatur gehalten bis zur weiteren Behandlung. Beispiel 3 Ein
Teil des nach Beispiel 2 erhaltenen Niederschlages wird in Wasser suspendiert, und
zwar in einer solchen Meng, daB eine endgültige Proteinkonzentration von ungefähr
3 °/p erhalten wird. Die entstandene Suspension wird auf ein pff von 7,2 eingestellt
und 24 Stunden bei einer Temperatur von ungefähr O' C gerührt. Der dabei
entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugieren von der überstellenden Flüssigkeit
abgetrennt. Zu dieser überstehenden Flüssigkeit wird 0,5 °/o Phenol hinzugegeben
und das erhaltene Anti-Schweinecholerapräparat gelagert, bis zur Impfung nicht immuner
Schweine. Das Präparat erhielt die Bezeichnung III.
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Beispiel 4 Ein Teil des nach Beispie12 erhaltenen Niederschlages wird
in Wasser suspendiert, und zwar in einer solchen Menge, daß eine endgültige Proteinkonzentration
von ungefähr 60/" erhalten wird. Diese Lösung wird auf ein pH von 7,2 eingestellt
und 24 Stunden bei einer Temperatur von ungefähr O' C gerührt. Der dabei
entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugieren von der überstehenden Flüssigkeit
abgetrennt. Zu dieser überstehenden Flüssigkeit wird Phenol hinzugegeben, und zwar
0,5 °/o und das erhaltene Anti-Schweinecholerapräparat wird gelagert bis zur Impfung
nicht immuner Schweine. Das Präparat erhielt die Bezeichnung IV.
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Ein Teil von jedem der nach Beispiel 3 und 4 erhaltenen Anti-Schweinecholerapräparate
wird durch 30 Minuten langes Erhitzen bei einer Temperatur von 58 bis 59'C pasteurisiert,
dann schnell abgekühlt und zur Konservierung werden 0,5 °/o Phenol hinzugegeben.
Das pasteurisierte Präparat von Beispiel 3 wird mit III A bezeichnet, während das
pasteurisierte Produkt von Beispiel 4 mit IV A bezeichnet wird.
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Die Wirksamkeit der nach dem Verfahren der vorangehenden Beispiele
erhaltenen Anti-Schweinecholerapräparate wird mit einem handelsüblichen Anti-Schweinecholeraserum
verglichen, wobei das handelsübliche Anti-Schweinecholerapräparat die Bezeichnung
VI erhielt.
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Hundertdreiundzwanzig nicht immune Schweine (Ferkel) werden in acht
Gruppen geteilt, wobei jede Gruppe aus fünfzehn oder sechzehn Schweinen besteht.
Jedes Schwein wurde mit 2 ccm virulentem Schweinecholeravirus geimpft und jede Gruppe
von Schweinen, mit Ausnahme einer Gruppe, die als Kontrollgruppe gilt, wurde mit
einem Anti-Schweinecholerapräparat injiziert. Innerhalb jeder Schweinegruppe (Ferkel)
wurde das besondere Anti-Schweinecholerapräparat in zwei verschiedenen Dosierungen
injiziert.
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Die mittlere Temperatur der Schweine am Tage der Behandlung war 39'C,
und die Standardabweichung der Temperatur war 0,32'C.
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Die Schweine wurden nach der Impfung 14 Tage lang beobachtet und die
Reaktion jedes Schweines innerhalb der Gruppe nach dem folgenden Bewertungssystem
aufgezeichnet.
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Bewertung Erklärung 0 Während der Beobachtungszeit von 14 Tagen nicht
einmal eine erhöhte Temperatur.
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1 Eine Temperatur von 40'C (104,0'F) oder höher an mindestens einem
Tag während der 14tägigen Periode; keine anderen Symptome.
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2 Sichtlich langsam an mindestens einem Tag während der Beobachtungszeit,
aber nicht krank; gesund am Ende der 14 Tage.
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3 Sichtlich krank an mindestens einem Tag während der Beobachtungszeit;
gesund am Ende der 14 Tage.
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4 Langsam oder krank am Ende der 14 Tage; später gesund.
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5 Langsam oder krank am Ende der 14 Tage, später sterbend oder tot.
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6 Sterbend am Ende der 14 Tage (tot). 7 Tot am 12., 13. oder 14. Tag.
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8 Tot am 9., 10. oder 11. Tag. 9 Tot am 6., 7. oder B. Tag.
Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgezeigt
| Anti- |
| Schweine- Dosis Bewertung '-ttel- |
| Cholera- (ccm) wert |
| präparat |
| 1 6,0 0 0 7 0 0 3 1 0 1,88 |
| 1 1 1 7 8 1 0 0 |
| 1 12,0 1 1 3 1 1 1 1 1 1,25 |
| 1 1 0 0 0 7 1 0 |
| III 5,0 0 1 0 1 9 7 0 1 2,38 |
| III 10,0 1 0 0 0 1 0 0 1 0,38 |
| IIIA 5,0 1 0 0 7 8 3 1 7 3,38 |
| IIIA 10,0 1 1 0 1 1 1 1 1 0,88 |
| IV 2,5 8 1 1 1 7 7 1 8 4,25 |
| IV 5,0 1 1 0 0 0 9 1 0 1,50 |
| IVA 2,5 1 7 7 4 8 7 5 7 5,75 |
| IVA 5,0 1 0 3 1 1 3 0 1 1,25 |
| VI 5,0 7 8 7 7 4 0 1 8 5,25 |
| VI 10,0 1 0 1 1 1 1 7 3 1,88 |
| Kontrolle -*) K K K K K K K 00 |
| (nur Virus) |
| - K K K K 00 |
| *) K bedeutet, daß das Schwein nach kurzer Zeit eingegangen
ist. |
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene
Anti-Schweinecholerapräparate eine Wirksamkeit haben, die mindestens so hoch wie
die des Anti-Schweinecholeraserumsist.
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Das im Beispiel 2 angegebene chemische Fraktionierungsverfahren wurde
für die Behandlung von hyperimmunisiertem Serum verwendet, das durch Impfung von
gegen Schweinecholera immunen Schweinen mit 0,002 ccm v
und 0,02 ccm von virulentem
Choleravirus pro 450 g Schweinegewicht erhalten wurde. Die erhaltenen Anti-Schweinecholerapräparate
wurden, wie oben angegeben, bei nicht immunen Schweinen geprüft. Die Ergebnisse
zeigten, daß die Schweinecholeraantikörperwirksamkeit dieser Präparate annähernd
zweimal so groß ist wie die von handelsüblichem Schweinecholeraserum.