DE10242763A1

DE10242763A1 - Verwendung von Saccharomyces cerevisiae erg4-Mutanten zur Expression von Glukosetransportern aus Säugetieren

Info

Publication number: DE10242763A1
Application number: DE10242763A
Authority: DE
Inventors: Günter Dr. Müller; Silke Dlugai; Dörthe VOSS; Eckhard Dr. Boles
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2002-09-14
Filing date: 2002-09-14
Publication date: 2004-03-18
Also published as: IL197621A; KR20050056206A; ZA200501871B; BR0314115A; RU2345136C2; IL197621A0; KR101233998B1; RU2005110955A; NO20051795L; HK1084401A1; WO2004026907A2; JP2006517088A; AU2003264257B2; MXPA05002816A; CA2498636A1; CN1694960A; JP4520854B2; CA2498636C; WO2004026907A3; IL167321A

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Hefestämme, in denen ein humaner GLUT4-Transporter oder ein humaner GLUT1-Transporter funktional zur Expression gebracht werden kann sowie auf bestimmte GLUT4-Transportproteine, die in Hefestämmen besonders einfach funktional exprimiert werden können.

Description

Die Erfindung betrifft Hefestämme, in denen der humane Glut 4 und Glut 1 Transporter funktionell zur Expression gebracht werden kann.

Die meisten heterotrophen Zellen transportieren Glukose über spezielle Transporterproteine ins Zellinnere. Bei den verschiedenen Organismen haben sich unterschiedliche Mechanismen herausgebildet, die den Glukosetransport vermitteln, wie insbesondere Protonen-Symportsysteme, Na⁺-Glukosetransporter, bindungsproteinabhängige Systeme, Phosphotransferasesysteme sowie Systeme für die erleichterte Diffusion. Bei den Eukaryoten vermittelt eine Familie von Glukosetransportern, die bei Säugetieren von den GLUT-Genen (GLUT = Glucosetransporter) und bei Saccharomyces cerevisiae von den HXT-Genen (HXT = Hexosetransporter) codiert werden, die Glukoseaufnahme über erleichterte Diffusion. Diese Transporter zählen zu einer größeren Familie von Zuckertransportern. Sie sind durch das Vorliegen von 12 transmembranen Helices und durch mehrere konservierte Aminosäurereste gekennzeichnet.

Der Glukosetransport spielt bei Krankheiten, die mit einer defekten Glukosehomöostase assoziiert sind, wie zum Beispiel Diabetes mellitus oder Fanconi-Bickel-Syndrom, eine große Rolle. Der Glukosetransport bei Säugetieren war deshalb Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind dreizehn Glukosetransporter-ähnliche Proteine (GLUT1 bis GLUT12, HMIT – H-myo-Inositol-Transporter)) identifiziert worden. Zu den Schlüsselrollen dieser Transporter zählen die Aufnahme von Glukose in verschiedene Gewebe, ihre Speicherung in der Leber, ihre insulinabhängige Aufnahme in die Muskelzellen und Adipozyten sowie die Glukose-Messung durch die β-Zellen des Pankreas.

GLUT1 vermittelt den Glukosetransport in die Erythrozyten und durch die Blut-Hirn-Schranke, wird jedoch auch in vielen anderen Geweben exprimiert, während GLUT4 auf insulinabhängige Gewebe, in erster Linie auf Muskel- und Fettgewebe beschränkt ist. Bei diesen insulinabhängigen Geweben stellt die Kontrolle des Targetings von GLUT4-Transportern in intrazelluläre Kompartimente oder Plasmamembrankompartimente einen wichtigen Mechanismus für die Regulierung der Glukoseaufnahme dar. In Gegenwart von Insulin wird intrazelluläres GLUT4 auf die Plasmamembran zurückverteilt, um die Glukoseaufnahme zu erleichtern. GLUT1 wird in diesen insulinabhängigen Geweben ebenfalls exprimiert, und seine Verteilung in der Zelle wird ebenfalls von Insulin beeinflusst, jedoch weniger stark. Darüber hinaus wird die relative Wirksamkeit, mit der GLUT1 oder GLUT4 den Zuckertransport katalysieren, nicht nur von dem Ausmaß des Targetings jedes Transporters an die Zelloberfläche bestimmt, sondern auch von ihren kinetischen Eigenschaften.

Die Tatsache, dass unterschiedliche Glukosetransporter-Isoformen koexprimiert werden sowie der rasche Glukosemetabolismus hat Untersuchungen bezüglich der Rolle und der genauen Eigenschaften jeder Glukosetransporter-Isoform in diesen insulinabhängigen Geweben kompliziert gestaltet. Um diese Probleme zu lösen, wurden heterologe Expressionssysteme wie Xenopus-Oozyten, Gewebekulturzellen, Insektenzellen und Hefezellen verwendet. Es stellte sich jedoch heraus, dass eine Reihe von Schwierigkeiten bei diesen Systemen auftraten: zu schwache Aktivität der heterolog exprimierten Transporter, eigene Glukosetransporter bei diesen Systemen, die intrazelluläre Retention eines beträchtlichen Teils der Transporter, oder sogar die Produktion inaktiver Transporter.

Natürlich vorkommendes GLUT4 Protein von Säugetieren insbesondere dasjenige des Menschen kann in Stämmen von Saccharomyces cerevisiae unter bestimmten Bedingungen in funktioneller Weise zur Expression gebracht werden.

Hefezellen sind einzellige eukaryotische Organismen. Sie eignen sich deshalb für manche Proteine besser zur Expression als bakterielle Systeme, insbesondere im Hinblick auf die Durchführung von Screeningassays zur Identifizierung von pharmazeutisch aktiven Substanzen.

Vorliegende Erfindung betrifft ein gereinigtes und isoliertes Polynukleotid umfassend eine DNA Sequenz, welche für das GLUT4V85M Protein codiert.

Dieses Protein enthält an Position 85 der Aminosäurekette des humanen GLUT4 Proteins einen Aminosäureaustausch von Valin nach Methionin. Dieses veränderte GLUT4V85M Protein eröffnet weitere Alternativen zur Expression eines funktionellen GLUT4 Proteins. Ein GLUT4 Protein soll in Zusammenhang mit Saccharomyces cerevisiae als funktionell angesehen werden, wenn in einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae, dessen sämtliche Glukosetransporter inaktiv sind (= hxt(– )) nach Expression dieses GLUT4 Proteins eine Glukoseaufnahme zu beobachten ist. Die Glukoseaufnahme kann entweder durch Transportmessungen mittels radioaktiv markierter Glukose oder durch Wachstum auf Medium mit Glukose als einziger Kohlenstoftquelle festgestellt werden.

Das gereinigte und isolierte Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert, kann in einer bevorzugten Ausführungsform eine Sequenz der folgenden Gruppen umfassen oder aus ihr bestehen:

a) eine Nukleotidsequenz, gemäß Seq ID Nr. 1,
b) eine Nukleotidsequenz, welche unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz der Seq ID Nr. 1 hybridisiert und die für ein Protein GLUT4V85M kodiert.

Das gereinigte und isolierte Polynukleotid kodiert bevorzugt ein GLU4V85M Protein, welches eine Aminosäuresequenz der Seq ID Nr. 2 aufweist.

Das gereinigte und isolierte Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M wie vorstehend beschrieben kodiert, kann in operativer Weise mit einem Promotor verbunden sein. Als Promotor kommen insbesondere prokaryotische oder eukariotische Promotoren wie beispielsweise der Lac-, trp-, ADH- oder HXT7-Promotor in Frage. Der für das Protein GLUT4V85M kodierende Teil des Polynukleotids ist genau dann in operativer Weise mit einem Promotor verbunden, wenn mittels dieses Promotors unter Zuhilfenahme eines Vektors in einem bakteriellen oder eukaryotischen Organismus eine mRNA gebildet wird, welche in das Protein GLUT4V85M translatiert werden kann. Ein solcher Vektor ist beispielsweise der Vektor p4H7GLUT4V85M (Seq ID Nr. 3). Das Protein GLUT4V85M kann mittels diesen Vektors in Hefezellen exprimiert werden. Vorstehend beschriebenes Polynukleotid umfassend eine DNA Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert, eignet sich in einer bevorzugten Ausführungsform zur Replikation dieses Polynukleotids in einer Hefezelle oder zur Ausprägung des für das Protein GLUT4V85M kodierenden Teils des Polynukleotides in das Protein GLUT 4 V85M in einer Hefezelle. Als Hefezelle eignet sich insbesondere Saccharomyces cerevisiae. Zur Replikation und Expression in einer Hefezelle liegt das Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert, als Hefevektor vor. Der für das Protein GLUT4V85M kodierende Bereich des Polynukleotids kann in operativer Weise mit einem für Hefezellen spezifischen Promotor wie beispielsweise dem ADH-Promotor (Alkohol-Dehydrogenase-Promotor) oder HXT7-Promotor (Hexosetransporter-Promotor) verbunden sein. Bei den Hefevektoren handelt es sich um eine Gruppe von Vektoren, die zur Klonierung von DNA in Hefen entwickelt wurde.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Hefezelle aus Saccharomyces cerevisiae, in welcher sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind (= hxt(–)) und in welcher kein funktionelles Erg4 Protein enthalten ist. Bei einer solchen Hefezelle handelt es sich bevorzugt um eine wie bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, 38124 Braunschweig) als Saccharomyces cerevisiae DSM 15187 hinterlegte Hefezelle.

Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Hefezelle, in der sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind und in der kein funktionelles Fgy1 Protein und kein funktionelles Erg4 Protein enthalten ist. Das Fehlen eines Erg4 Proteins oder eines Fgy1 Proteins kann insbesondere auf eine Unterbrechung der betreffenden kodierenden Genomabschnitte oder auf teilweise oder vollständige Entfernung der kodierenden Genomabschnitte zurückzuführen sein.

Als Hefezelle, welche keine funktionellen Glukosetransporter, kein funktionelles Fgy1 Protein und kein funktionelles Erg4 Protein enthält, wird bevorzugt eine wie bei der DSMZ als Saccharomyces cerevisiae DSM 15184 hinterlegte Hefezelle verwendet. Eine wie vorstehend beschriebene Hefezelle wird bevorzugt zur Ausprägung (= Expression) eines GLUT1 Proteins oder eines GLUT4 Proteins eines Säugetieres, wie insbesondere von Ratte, Maus, Kaninchen, Schwein, Rind oder Menschenaffen verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Hefezelle zur Ausprägung eines menschlichen GLUT4 oder GLUT1 Proteins verwendet.

Eine Hefezelle aus Saccharomyces cerevisiae deren sämtliche Glukosetransporter sowie das Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind, kann ein Polynukleotid dieser Erfindung enthalten, welches eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert. Diese Hefezelle kann das Protein GLUT4V85M auch zur Expression bringen und damit dieses Protein enthalten.

Ein solcher Hefestamm enthaltend ein Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst, ist bevorzugt der bei der DSMZ hinterlegte Hefestamm Saccharomyces cerevisiae DSM 15185.

Eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie das Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind, welche ein Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert, enthält, kann beispielsweise hergestellt werden, indem

a) eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie das Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind, bereitgestellt wird,
b) ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst und in einer Hefezelle repliziert werden kann, bereitgestellt wird,
c) die Hefezelle aus a) mit dem Polynukleotid aus b) transformiert wird,
d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird,
e) gegebenenfalls das Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.

Ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst, ist bevorzugt ein in einer Hefezelle replizierbarer Vektor, in welchem die DNA-Sequenz kloniert wurde. Ein solcher Vektor ist beispielsweise p4H7GLUT4V85M (Seq ID Nr. 3).

Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie deren Proteine für Fgy1 und Erg4 nicht mehr funktionell sind und die ein Polynukleotid enthält, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst. Diese Hefezelle kann das Protein GLUT4V85M auch zur Expression bringen und damit dieses Protein enthalten. Ein solcher Hefestamm ist bevorzugt der bei der DSMZ hinterlegte Hefestamm Saccharomyces cerevisiae DSM 15186.

Eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie die Proteine Fgy1 sowie Erg4 nicht mehr funktionell sind und die ein Polynukleotid umfassend eine DNA- Sequenz, welche für das Protein GLUT4V85M kodiert, enthält, kann beispielsweise hergestellt werden, indem

a) eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie die Proteine Fgy1 sowie Erg4 nicht mehr funktionell sind, bereitgestellt wird,
b) ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst und in einer Hefezelle repliziert werden kann, bereitgestellt wird,
c) die Hefezelle aus a) mit dem Polynukleotid aus b) transformiert wird,
d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird,
e) gegebenenfalls das Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.

Das vorstehend genannte isolierte und gereinigte Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst, ist bevorzugt ein in einer Hefezelle replizierbarer Vektor, in welchem die DNA-Sequenz kloniert wurde. Ein solcher Vektor ist beispielsweise p4H7GLUT4V85M (Seq ID Nr. 3).

Die Erfindung betrifft auch eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind, welche ein Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, die für das Protein GLUT4V85M kodiert, enthält.

Diese Hefezelle kann das Protein GLUT4V85M auch zur Expression bringen und damit dieses Protein enthalten. Ein solcher Hefestamm ist bevorzugt der bei der DSMZ hinterlegte Hefestamm Saccharomyces cerevisiae 15188.

Eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind und die ein Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, die für das Protein GLUT4 V85M kodiert, enthält, kann beispielsweise hergestellt werden, indem

a) eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind, bereitgestellt wird,
b) ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst und in einer Hefezelle repliziert werden kann, bereitgestellt wird,
c) die Hefezelle aus a) mit dem Polynukleotid aus b) transformiert wird,
d) eine transformierte Hefezelle selektiert,
e) gegebenenfalls das Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.

Bei dem vorstehend genannten isolierten und gereinigten Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst, handelt es sich bevorzugt um einen in einer Hefezelle replizierbaren Vektor, in welchem die DNA-Sequenz kloniert wurde. Ein solcher Vektor ist beispielsweise p4H7GLUT4V85M (Seq ID Nr. 3).

Die Erfindung betrifft auch ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß Seq ID Nr. 2. Dieses Protein ist ein humanes GLUT4 Protein, in welchem an Position 85 der Aminosäurekette ein Valin durch ein Methionin ausgetauscht ist.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität eines GLUT4 Proteins stimuliert, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Hefezelle bereitgestellt wird, deren sämtliche Glukosetransporter sowie das Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind, und die ein Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Protein GLUT4V85M kodiert, enthält,
b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird,
d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird,
e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Vergrößerung der aufgenommenen Glukosemenge in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des GLUT4V85M Proteins stimuliert. Von Verbindungen, welche die Aktivität GLUT4V85M Proteins stimuliert, ist anzunehmen, dass sie auch die Aktivität von GLUT4 stimulieren.

Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, welches eine Verbindung, die durch vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde, enthält sowie weiterhin Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung, die durch vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes Typ I und/oder II.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, welche durch vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung, welche durch vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung, welche durch ein vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.

Vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche das Protein, das durch das Erg4 Gen kodiert ist, inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Hefezelle bereitgestellt wird, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind und die ein Polynukleotid enthält, welches eine DNA-Sequenz umfasst, die für das Protein GLUT4V85M kodiert und in einer Hefezelle repliziert werden kann,
b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird,
d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird,
e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Erhöhung der aufgenommenen Menge an Glukose in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des Proteins Erg4 inhibiert.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche das korrespondierende Protein des FGY1 Gens inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Hefezelle bereitgestellt wird, deren sämtliche Glukosetransporter und deren Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind und welche ein GLUT4 Protein enthält, bereitgestellt wird,
b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird,
c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird,
d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird,
e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Erhöhung der aufgenommenen Menge an Glukose in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des Proteins Fgy1 inhibiert.

Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, welche durch das vorstehend beschriebene Verfahren identifiziert wurde, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.

Die Erfindung wird im folgenden bezüglich technischer Einzelheiten näher erörtert.

Hybridisierung bedeutet die Zusammenlagerung zweier Nukleinsäure-Einzelstränge, die komplementäre Basensequenzen besitzen, zu Doppelsträngen. Hybridisierung kann zwischen zwei DNA-Strängen, einem DNA- und einem RNA-Strang sowie zwischen zwei RNA-Strängen erfolgen. Grundsätzlich lassen sich Hybridmoleküle herstellen, indem man die beteiligten Nukleinsäuren, die zunächst doppelsträngig vorliegen können, soweit erhitzt, dass sie in einzelsträngige Moleküle ohne Sekundärstruktur zerfallen. Dies geschieht beispielsweise durch Kochen im Wasserbad für 10 Minuten. Anschließend lässt man sie langsam abkühlen. Während der Abkühlphase erfolgt die Paarung komplementärer Ketten zu doppelsträngigen Hybridmolekülen. Hybridisierungen werden unter Laborbedingungen gewöhnlich unter Zuhilfenahme von Hybridisierungsfiltern durchgeführt, auf welchen einzelsträngige oder denaturierbare Polynukleotidmoleküle durch Blotten oder Elektrophorese aufgebracht werden. Die Hybridisierung kann mit entsprechenden komplementären Polynukleotidmolekülen sichtbar gemacht werden, indem man diese zu hybridisierenden Polynukleotidmoleküle mit einer radioaktiven fluoreszierenden Markierung versieht. Stringenz beschreibt den Grad der Übereinstimmung oder Passgenauigkeit bestimmter Bedingungen. Bei hoher Stringenz sind die Anforderungen an die Übereinstimmung höher als bei niederer Stringenz. Bei der Hybridisierung von Nukleinsäuren werden je nach Anwendung und Zielsetzung bestimmte, unterschiedlich stringente Bedingungen eingestellt. Bei hoher Stringenz sind die Reaktionsbedingungen bei der Hybridisierung so eingestellt, dass nur sehr gut zueinander passende, komplementäre Moleküle miteinander hybridisieren können. Niedere Stringenz ermöglicht auch eine partielle Hybridisierung von Molekülen mit mehr oder weniger großen Abschnitten ungepaarter bzw. fehlgepaarter Basen.

Die Hybridisierungsbedingungen sollten als stringent insbesondere dann verstanden werden, wenn die Hybridisierung in einer wässrigen 2 × SSC enthaltenden Lösung bei 68°C für mindestens 2 Stunden erfolgt und anschließend zuerst für 5 Minuten in 2 × SSC/0,1 % SDS bei Raumtemperatur, dann 1 Stunde in 1 × SSC/0,1 % SDS bei 68 °C und für 1 weitere Stunde in 0,2 % SSC/0,1 % SDS bei 68°C gewaschen wird.

Eine 2 × SSC-, 1 × SSC bzw. 0,2 × SSC-Lösung wird durch entsprechende Verdünnung einer 20 × SSC-Lösung hergestellt. Eine 20 × SSC-Lösung enthält 3 mol/l NaCl und 0,3 mol/l Na-Citrat. Der pH-Wert beträgt 7,0. Dem Fachmann sind die Methoden für Hybridisierungen von Polynukleotiden unter stringenten Bedingungen vertraut. Erfindet entsprechende Anleitungen in Fachbüchern wie insbesondere den Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience; Herausgeber: Frederich M. Ausubel, Roger Brant, Robert E. Kingston, David J. Moore, J. G. Seidmann, Kevin Struhl; ISBN: 0-471-50338-X).

Bei den Hefevektoren können verschiedene Untergruppen unterschieden werden. Ylp-Vektoren (Yeast integrating plasmids) entsprechen im wesentlichen dem für Klonierungen in Bakterien eingesetzten Vektoren, enthalten aber ein selektierbares Hefe-Gen (z. B. URA3, LEU2).

Nur wenn es nach Einführung dieses Vektors zur Integration der Fremd-DNA in einem Hefe-Chromosom kommt, werden diese Sequenzen zusammen mit dem Chromosom repliziert und bei der Entstehung eines Klon an alle Tochterzellen stabil weitergegeben.

Von diesem Verfahren ausgehend sind Plasmide abgeleitet, die sich aufgrund von eukaryotischen ORIs (origin of replication) autonom replizieren können. Solche Hefevektoren werden YRp-Vektoren (Yeast replicating plasmids) oder ARS-Vektoren (autonomously replicating sequence) genannt. Weiterhin gibt es YEp-Vektoren (Yeast episonal plasmids), die sich von 2μm-Hefeplasmid ableiten und ein selektierbares Markergen enthalten. Die Klasse der YAC-Vektoren (Yeast artifical chromosome) verhält sich wie eigenständige Chromosomen.

Ein Hefevektor enthaltend ein Gen zur Expression wird, damit es zur Expression gebracht werden kann, durch Transformation in die Hefe eingeführt. Dazu eignen sich beispielsweise Methoden wie die Elektroporation oder die Inkubation kompetenter Zellen durch Vektor-DNA. Geeignete Expressionspromotoren der Hefe sind dem Fachmann bekannt. Solche sind beispielsweise der SOD1-Promotor (Superoxiddismutase), ADH-Promotor (Alkoholdehydrogenase), der Promotor für das Gen der sauren Phosphatase, HXT2-Promotor (Glukosetransporter 2), HXT7-Promotor (Glukosetransporter 7), GAL2-Promotor (Galaktosetransporter) und andere. Das Konstrukt bestehend aus einem Expressionspromotor einer Hefe und einem Gen zur Expression (z. B. GLUT4V85M) ist für den Zweck der Expression Bestandteil eines Hefevektors. Dieser Hefevektor kann zur Durchführung der Expression als selbstreplizierendes Partikel unabhängig vom Genom der Hefe vorliegen oder stabil in das Genom der Hefe integriert sein. Als Hefevektor eignet sich grundsätzlich jede Polynukleotidsequenz, welche in einer Hefe vermehrt werden kann. Als Hefevektoren können insbesondere Hefeplasmide oder künstliche Hefechromosomen (Yeast Artifical Chromosomes) verwendet werden. Hefevektoren enthalten in der Regel einen „origin of replication" (2μ, ars) für die Einleitung der Replikation sowie einen Selektionsmarker, der üblichenrweise aus einem Auxotrophiemarker oder einem Antibiotikumresistenzgen besteht. Einem Fachmann als Hefevektoren bekannt sind beispielsweise pBM272, pCS19, pEMBCYe23, pFL26, pG6, pNN414, pTV3, p426MET25, p4H7 oder andere.

Die Selektion einer Zelle im Sinne dieser Erfindung soll deren gezielte Anreicherung aufgrund eines Selektionsmarkers wie beispielsweise der Resistenz gegen ein Antibiotikum oder dem Wachstumsvermögen auf einem bestimmtem Minimalmedium, sowie weiterhin deren Isolierung und anschließende Anzucht auf einer Agarplatte oder in Submerskultur verstanden werden.

Für den Fachmann gehören Anzucht, Transformation und Selektion einer transformierten Hefezelle sowie Expression eines Proteins in einer Hefezelle zu üblicherweise verwendeten Methoden. Erfindet Anleitungen hierzu in Standardlehrbüchern wie beispielsweise in „Walker Graeme M.: Yeast Physiology and Biotechnology, Wiley and Sons, ISBN: 0-471-9446-8" oder in „Protein Synthesis and Targeting in Yeast, Ed. Alistair J. P. Brown, Mick F. Fruite and John E. G. Mc Cartly; Springer Berlin; ISBN: 3-540-56521-3 oder in "Methods in Yeast Genetics, 1997: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual; Adams Alison (Edt.); Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN: 0-87969-508-0".

Bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind 17 Hexosetransporter und zusätzlich drei Maltosetransporter bekannt, die, sofern sie stark genug exprimiert werden, in der Lage sind, Hexosen in die Hefe zu transportieren. Bekannt ist ein Stamm, dem durch Deletion sämtliche Transporter, die zur Hexoseaufnahme geeignet sind, entfernt wurden. Dieser Stamm enthält lediglich noch die beiden Gene MPH2 und MPH3, die zu Maltosetransportproteinen homolog sind. Die beiden Gene MPH2 und MPH3 werden bei Anwesenheit von Glukose im Medium reprimiert. Herstellung und Charakterisierung dieses Hefestammes ist in Wieczorke et all, FEBS Lett. 464, 123-128 (1999) beschrieben. Dieser Stamm ist nicht in der Lage, sich auf einem Substrat mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle zu vermehren. Aus diesem Stamm können Mutanten selektiert werden, die ausgehend von einem entsprechenden Vektor GLUT1 funktionell exprimieren (Stamm hxt fgy1-1).

Transformiert man in den Hefestamm hxt fgy1-1 einen Plasmidvektor, welcher ein GLUT4-Gen unter Kontrolle eines Hefepromotors trägt, wird dennoch nur sehr wenig Glukose transportiert. Die funktionelle Expression von GLUT4 erfordert weitere Anpassungen dieses Hefestammes, um einen signifikanten Glukosetransport mittels GLUT4 zu ermöglichen. Solche Hefestämme, die Glukose mittels eines einzigen Glukosetransporters GLUT4 in Zellen aufnehmen, lassen sich auf Substraten mit Glukose als einziger Kohlenstoftquelle isolieren. Dazu wird ein Hefestamm hxt fgy1-1, der ein GLUT4-Gen unter funktioneller Kontrolle eines Hefepromotors trägt, transformiert. Diese so transformierten Hefezellen werden auf einem Nährmedium ausgebracht, welches Glukose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, und werden darauf inkubiert. Nach einigen Tagen der Inkubation bei beispielsweise 30 °C beobachtet man Wachstum von einzelnen Kolonien. Eine dieser Kolonien wird isoliert. Entfernt man aus dieser Kolonie das Hefeplasmid, unterbleibt die Vermehrung auf dem Nährmedium mit Glukose als einzige Kohlenstoffquelle. Wird diesem Stamm, der nun kein Vektorplasmid mehr enthält, wiederum ein Hefevektor, der ein GLUT4-Gen unter funktioneller Kontrolle eines Hefepromotors trägt, durch Transformation zugeführt, dann ist dieser Stamm wiederum in der Lage, sich auf einem Medium mit Glukose als einziger Kohlenstoftquelle zu vermehren.

Vorstehend genannte Hefestämme sind Gegenstand der internationalen Anmeldung PCT/EP02/01373 mit Tag der Anmeldung vom 9. Februar 2002, welche die Priorität der DE 10106718.6 vom 14. Februar 2002, in Anspruch nimmt.

Hefestämme deren sämtliche eigene Transporter für Hexosen (Glukosetransporter) nicht mehr funktionell sind, werden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) bereits in Zusammenhang mit der internationalen Anmeldung PCT/EP02/01373 zu einem früheren Zeitpunkt unter der Nummer DSM 14035, DSM 14036 oder DSM 14037 hinterlegt.

Die Polynukleotid- und Aminosäuresequenzen für GLUT4 sind zugänglich beispielsweise über folgende Einträge in Genbank: M20747 (cDNA; Mensch), EMBL: D28561 (cDNA; Ratte), EMBL: M23382 (cDNA; Maus), Swissprot: P14672 (Protein; Mensch), Swissprot: P19357 (Protein; Ratte) und Swissprot: P14142 (Protein; Maus).

Polynukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen für GLUT1 sind offenbart unter den folgenden Code-Nummern der angegebenen Datenbanken: EMBL: M20653 (cDNA; Mensch), EMBL: M13979 (cDNA; Ratte), EMBL: M23384 (cDNA; Maus), Swissprot: P11166 (Protein; Mensch), Swissprot: P11167 (Protein; Ratte) und Swissprot: P17809 (Protein; Maus).

Arzneimittel sind Darreichungsformen pharmakologisch aktiver Substanzen zur Therapie von Krankheiten oder körperlicher Fehlfunktionen bei Mensch und Tier. Für die orale Therapie kennt man beispielsweise Pulver, Granulate, Tabletten Pillen, Pastillen, Dragees, Kapseln, flüssige Extrakte, Tinkturen, Sirup. Für eine äußerliche Anwendung verwendet man beispielsweise Aerosole, Sprays, Gele, Salben oder Puder. Eine parenterale Anwendung ist möglich mit Injektions- oder Infusionslösungen mit Ampullen, Flaschen oder Spritzampullen. Dem Fachmann der pharmazeutischen Technologie (Galenik) sind diese und andere Arzneimittel bekannt.

Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels ermöglichen die Zubereitung der wirksamen Substanz mit dem Ziel, eine auf die jeweilige Anwendung optimal abgestimmte Ausbringung, Verteilung und Entfaltung des Wirkstoffes zu ermöglichen. Solche Hilfsstoffe sind beispielsweise Füll-, Binde-, Spreng-, oder Gleitmittel wie Lactose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Cellulose, Stärke, Dicalciumphosphat, Polyglykole, Alginate, Polyvinylpyrrolidon, Carboxymethylcellulose, Talkum oder Siliciumdioxid.

Diabetes oder Zuckerkrankheit äußert sich durch Ausscheidung von Glukose mit dem Harn bei krankhafter Erhöhung des Blutglukosespiegels (Hyperglycämie) aufgrund einer chronischen Stoffwechselstörung, die auf Mangel an Insulin oder herabgesetzter Insulinwirkung beruht. Die fehlende oder reduzierte Insulinwirkung führt zu mangelhafter Resorption und Verwertung der ins Blut aufgenommenen Glukose durch die Körperzellen. Im Fettgewebe kommt es unter der Einwirkung Insulin-antagonistischer Hormone zu gesteigerten Lipolyse mit Erhöhung der freien Fettsäuren im Blut.

Bei der Fettleibigkeit (Adipositas, Obesitas) handelt es sich um abnorme Gewichtszunahme aufgrund einer gestörten Energiebilanz durch übermäßige Kalorienaufnahme, die ein Gesundheitsrisiko beinhaltet.

Die Bestimmung der Menge einer Hexose, die von einem wie eben vorstehend beschriebenen bereitgestellten Hefestamm aufgenommen wird, kann mittels Aufnahmestudien mit radioaktiv markierter Glukose erfolgen. Dazu wird eine bestimmte Menge der Hefezellen beispielsweise eine Menge von 60 mg Nassgewicht pro ml in beispielsweise 100 μl eines Puffers suspendiert und mit einer definierten Menge von ¹⁴C- oder ³H- markierter Glukose als einzige Kohlenstoffquelle versetzt. Man inkubiert die Zellen und entnimmt zu bestimmten Zeiten definierte Mengen der Zellen. Die Bestimmung der aufgenommenen Menge an Glukose erfolgt mit Hilfe von LSC (Liquid Scintillation Counting = Flüssig-Szintillationszählung). Die Bestimmung der Menge einer Hexose, die von einem wie eben vorstehend beschriebenen bereitgestellten Hefestamm aufgenommen wird, kann aber auch mittels Wachstumstest auf Medien mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle erfolgen. Dazu bestimmt man die Wachstumsrate des Stammes nach Zugabe der Verbindung beispielsweise durch regelmäßige Messungen der optischen Dichte der Kultur bei 600 nm und vergleicht diesen Wert mit der Wachstumsrate eines Kontrollstammes (z. B. Wildtyphefestamm).

Die Bereitstellung einer Verbindung erfolgt insbesondere durch chemische Synthese oder Isolierung chemischer Stoffe aus biologischen Organismen. Die chemische Synthese kann auch automatisiert erfolgen. Die durch Synthese oder Isolierung gewonnenen Verbindungen können in einem geeigneten Lösungsmittel in Lösung gebracht werden. Geeignete Lösungsmittel sind insbesondere wässrige Lösungen, welche einen bestimmten Anteil eines organischen Lösungsmittels wie zum Beispiel DMSO (Dimethylsulfoxid) enthalten.

Das In-Kontakt-Bringen eines Stammes der Hefe mit einer Verbindung zur Identifizierung einer Verbindung im Sinne einer vorstehend genannten Erfindung, erfolgt insbesondere in dafür vorgesehenen Vorrichtungen eines Laborroboters. Solche Vorrichtungen können aus speziell präparierten Kammern mit Vertiefungen, aus Mikrotiterplatten, Eppendorfgefäßen oder Laborgläsern bestehen. Laborroboter sind in aller Regel auf hohe Durchsatzraten konzipiert. Ein Verfahren wie das vorstehend genannte ausgeführt mit Hilfe eines Laborroboters wird deshalb auch HTS (High Throughput Screening) genannt.

Die Seq ID Nr. 1 offenbart eine Polynucleotidsequenz umfassend den codierenden bereich des Proteins GLUT4V85M. Die Seq ID Nr. 2 offenbart die Aminosäuresequenz des Proteins GLUT4V85M. Die Seq ID Nr. 3 offenbart die Polynucleotidsequenz des Vektors p4H7GLUT4V85M.

Verwendung der Hefestämme
Alle in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Hefestämme stammten vom Stamm CEN-PK2-1C (MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1MAL2-8^c SUC2) ab. Die Herstellung eines Hefestammes mit Deletionen in den Hexose-Transportergenen (HXT) wurde von Wieczorke et al., FEBS Lett. 464, 123 – 128 (1999) beschrieben: EBY-18ga (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8^c SUC2), EBY.VW4000 (MATa Δhxt1-17 Δga12 Δagt1 Δmph2 Δmph3 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8^c SUC2). Die Medien beruhten auf 1 Hefeextrakt und 2 % Pepton (YP), während die Minimalmedien aus 0,67 % Difco-Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren (YNB) bestanden und Zusätze für Auxotrophiebedürfnisse sowie unterschiedliche Kohlenstoffquellen enthielten. Die Hefezellen wurden unter aerobischen Bedingungen bei 30°C auf einem Rundschüttler oder auf Agarplatten gezüchtet. Das Zeltwachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) oder Bestimmung des Durchmessers der Hefekolonien verfolgt.
Bestimmung der Glukoseaufnahme
Der Glukosetransport wurde als Aufnahme von D-(U-¹⁴C]-Glukose (Amersham) gemessen und die Kinetikparameter wurden aus Eadie-Hofstee-Graphiken bestimmt. Die Zellen wurden abzentrifugiert, mit Phosphatpuffer gewaschen und wieder in Phosphatpuffer in einer Konzentration von 60 mg (Nassgewicht) pro ml suspendiert. Die Glukoseaufnahme wurde bei Glukosezentrationen zwischen 0,2 und 100 mM bestimmt, und die spezifische Aktivität des Substrats bewegte sich zwischen 0,1 und 55,5 kBq μmol^– ¹. Die Zellen und die Glukoselösungen wurden 5 Minuten bei 30°C vorinkubiert. Die Glukoseaufnahme wurde durch Versetzen der Zellen mit radioaktiver Glukose gestartet. Nachdem 5 Sekunden lang inkubiert worden war, versetzte man mit 10 ml eiskaltem Stoppuffer (0,1 M KiPO₄, pH 6,5, 500 mM Glukose) und die Zellen wurden rasch auf Glasfaserfiltern (⌀ = 24 mm, Whatman) abgefiltert. Die Filter wurden dreimal rasch mit eiskaltem Puffer gewaschen und die eingebaute Radioaktivität wurde mit einem Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen. Die Hemmung durch Cytochalasin B (Endkonzentraion 20μM, gelöst in Ethanol) wurde in einem 15-Sekunden-Aufnahmetest mit 50 mM bzw. 100 mM radioaktiver Glukose gemessen, nachdem die Zelle 15 Minuten lang in Gegenwart des Hemmstoffs oder nur des Lösungsmittels inkubiert worden war.
Es wurde ein neues heterologes Expressionsystem für Glukosetransporter aus Säugetierzellen entwickelt. Dieses System basiert auf einem S. cerevisiae-Stamm, dem alle endogenen Glukosetransporter durch Zerstörung der kodierenden Gene entfernt wurden. Dieser Stamm ist nicht mehr in der Lage, Glukose über die Plasmamembran aufzunehmen und mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Um die heterologen Glukosetransporter des Menschen oder aus anderen Säugetieren, GLUT1 und GLUT4, in einer aktiven Form in die Plasmamembran der Hefe zu integrieren, mussten zusätzliche Mutationen in den Hefestamm eingefügt werden. GLUT1 ist nur in einem fgy1-1 Mutantenstamm aktiv, GLUT4 nur in fgy1-1 fgy4-X Doppelmutanten.
Das FGY1-Gen konnte kloniert werden. Es handelt sich dabei um den S. cerevisiae ORF YMR212c. Aufgrund der Ergebnisse ergibt sich für die Funktion, dass entweder Fgy1 oder ein von Fgy1 erzeugtes Produkt die Aktivität menschlicher Glukosetransporter inhibiert oder an der Verschmelzung der GLUT-transportierenden Vesikel mit der Plasmamembran beteiligt ist.
Im Gegensatz zu GLUT1 und ähnlich zu Säugetierzellen ist ein großer Teil der GLUT4-Proteine in der Hefe in intrazellulären Strukturen lokalisiert. Es konnten insgesamt neun rezessive Mutanten isoliert werden (fgy4-1 bis fgy4-9), in denen GLUT4 nun weiter zur Plasmamembran geleitet wird und bei gleichzeitiger fgy1-1 Mutation dort aktiv wird.
Zur Komplementationsanalyse wurde die von Bruns et al. (Genes Dev. 1994; 8: 1087–105) beschriebene Insertions-Genbank eingesetzt. Der hxt fgy1-1 Stamm wurde zunächst mit einem GLUT4-Plasmid und dann mit der mobilisierten Insertions-Genbank transformiert. Anschließend wurde nach Transformanten gesucht, die auf Glukosemedium wachsen konnten. Bei einer der untersuchten Mutanten stellte es sich heraus, dass das ERG4-Gen zerstört worden war. ERG4 kodiert für ein Enzym (Oxidoreduktase) der Ergosterolbiosynthese. Dieses Enzym, die Sterol-C-24(28)-Reduktase katalysiert den letzten Schritt der Ergosterolbiosynthese und wandelt Ergosta-5,7,22,24,(28)-Tetraenol in das Endprodukt Ergosterol um. Das Erg4-Protein enthält vermutlich acht Transmembrandomänen und ist im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Eine erg4-Mutante ist lebensfähig, da der Einbau der Ergosterolvorstufen in die Membranen der Hefe den Verlust von Ergosterol kompensiert.
Der hemmende Einfluss von Erg4 auf die Funktionalität von GLUT4 wurde durch eine gezielte erg4-Deletion im hxt fgy1-1 Stamm bestätigt. Der resultierende Stamm (hxt fgy1-1 Δerg4) wurde mit SDY022 bezeichnet.
Proteininteraktionstests mit Hilfe des „Split-Ubiquitin"-Systems ergaben, dass das menschliche GLUT4 direkt mit Erg4 der Hefe interagiert. Es kann deshalb davon ausgegangen werden, dass das Erg4-Protein der Hefe im Endoplasmatischen Retikulum entweder direkt die weitere Translokation von GLUT4 verhindert oder dass es GLUT4 in irgendeiner Art und Weise modifiziert, die für die Translokation und/oder Funktion wichtig ist.
Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Deletion von ERG4 im hxt-Nullstamm alleine, also trotz funktionellem FGY1, zwar GLUT1 aktiv macht aber nicht GLUT4. Die Ergebnisse der Wachstumstests sind in Tab. 1 zusammengefasst.
Um auszuschließen, dass Ergosterol selbst einen negativen Einfluss auf GLUT4 ausübt, wurden Wachstumstests auf Agarplatten mit Ergosterol unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Alle mit GLUT4 transformierten Hefestämme konnten unter diesen Bedingungen nicht wachsen (Tab. 2). Auch die GLUT1-Transformanten im hxt fgy1-1 Stamm zeigten im Gegensatz zu aerobem Wachstum unter anaeroben Bedingungen kein Wachstum auf Glukose. Nur nach der Deletion von ERG4 konnten GLUT1-Transformanten wachsen.
Der Austausch von Val85 in Met durch in vitro Mutagenese machte GLUT4 unabhängig von der fgy1-1 Mutation und führte dazu, dass GLUT4V85M bereits in einem hxt erg4 Stamm funktionell war. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass Fgy1 direkt oder indirekt auf diese Position, die sich innerhalb der zweiten Transmembranhelix der GLUT-Transporter befindet, wirkt.
In Tabelle 3 findet sich die Beschreibung der in Zusammenhang mit dieser Patentanmeldung bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) – Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschwei – hinterlegten Hefestämme.
Tabelle 1: Wachstum von GLUT1- und GLUT4-Transformanten auf Glukosemedium
Tabelle 2: Wachstum von GLUT1- und GLUT4-Transformanten auf Glukosemedium mit und ohne Ergosterol unter anaeroben Bedingungen
Tabelle 3: Merkmale der hinterlegten Hefestämme (Saccharomyces cerevisiae)
Basismedium: 0,67% Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren (Difco); pH 6,2. Supplementierung der Auxotrophien: Leucin (0,44 mM), Tryptophan (0,19 mM), Histidin (0,25 mM9, Uracil (0,44 mM). Maltose kann zwischen 1–2% eingesetzt werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Gereinigtes und isoliertes Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass dieses Polynukleotid eine Sequenz aus einer der folgenden Gruppen umfasst: a) eine Nukleotidsequenz gemäß Seq ID Nr. 1 b) eine Nukleotidsequenz, welche unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz der Seq ID Nr. 1 hybridisiert und die für ein Protein GLUT4V85M kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein GLUT4V85M eine Aminosäuresequenz gemäß Seq ID Nr. 2 aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1 bis 3, in welchem der kodierende Bereich für das Protein GLUT4V85M in operativer Weise mit einem Promotor verbunden ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1 bis 4, welches in einer Hefezelle zur Replikation gebracht werden kann.
Polynukleotid nach Anspruch 5, mittels dessen in einer Hefezelle ein Protein zur Ausprägung gebracht werden kann.
Hefezelle aus Saccharomyces cerevisiae, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind und kein funktionelles Erg4 Protein enthalten ist.
Hefezelle aus Saccharomyces cerevisiae, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind, kein funktionelles Fgy1 Protein enthalten ist und kein funktionelles Erg4 Protein enthalten ist.
Hefezelle nach Anspruch 7 oder 8 gekennzeichnet dadurch, dass das ERG4-Gen ganz oder teilweise deletiert ist.
Hefezelle nach Anspruch 7 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae DSM 15187.
Hefezelle nach Anspruch 8 oder 9 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae DSM 15184.
Verwendung einer Hefezelle gemäß Anspruch 15 bis 18 zur Ausprägung eines GLUT1 Proteins oder GLUT4 Proteins eines Säugetieres.
Verwendung nach Anspruch 12 zur Ausprägung eines menschlichen GLUT4 Proteins oder eines menschlichen GLUT1 Proteins.
Hefezelle gemäß Anspruch 7 enthaltend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 bis 6.
Hefezelle gemäß Anspruch 14 enthaltend ein Protein GLUT4V85M.
Hefezelle nach Anspruch 14 und/oder 15 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae DSM 15185.
Herstellung einer Hefezelle gemäß Anspruch 14 bis 16 gekennzeichnet dadurch, dass a) eine Hefezelle gemäß Anspruch 7 bereitgestellt wird, b) ein Polynukleotid gemäß Anspruch 5 oder 6 bereitgestellt wird, c) die Hefezelle gemäß a) mit dem Polynukleotid gemäß b) transformiert wird, d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird, e) gegebenenfalls ein Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.
Hefezelle gemäß Anspruch 8 oder 9 enthaltend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 bis 6.
Hefezelle nach Anspruch 18 enthaltend ein Protein GLUT4V85M.
Hefezelle nach Anspruch 18 und/oder 19 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae DSM 15186.
Herstellung einer Hefezelle gemäß Anspruch 18 bis 20 dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle gemäß Anspruch 8 oder 9 bereitgestellt wird, b) ein Polynukleotid gemäß Anspruch 5 oder 6 bereitgestellt wird, c) die Hefezelle gemäß a) mit dem Polynukleotid gemäß b) transformiert wird, d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird, e) gegebenenfalls ein Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.
Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind enthaltend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 bis 6.
Hefezelle gemäß 22 enthaltend ein Protein GLUT4V85M.
Hefezelle nach Anspruch 22 und/oder 23 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae DSM 15188.
Herstellung einer Hefezelle gemäß Anspruch 22 bis 24 dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle hergestellt wird, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind, b) ein Polynukleotid gemäß Anspruch 5 oder 6 bereitgestellt wird, c) die Hefezelle gemäß a) mit dem Polynukleotid gemäß b) transformiert wird, d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird, e) gegebenenfalls ein Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.
Protein mit der funktionellen Aktivität eines Glukosetransporters gekennzeichnet dadurch, dass es durch eine Polynukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert ist.
Protein nach Anspruch 13 bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID Nr. 2.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität eines GLUT4 Proteins stimuliert, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 14 bis 17 bereitgestellt wird, b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird, d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird, e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wird, wobei eine Verbindung, die eine Vergrößerung der aufgenommenen Glukosemenge in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des GLUT4 Proteins stimuliert.
Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 28 identifiziert werden, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
Verwendung einer Verbindung, welche mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 28 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes Typ I und/oder II.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche das korrespondierende Protein des Fgy1 Gens inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 7 oder 10, welche ein GLUT4 Protein enthält, bereitgestellt wird, b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird, d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird, e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Erhöhung der aufgenommenen Menge an Glukose in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität eines Proteins Fgy1 inhibiert.
Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 31 identifiziert wurde, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
Verwendung einer Verbindung, welche mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 31 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche das Protein, welches durch das ERG4 Gen kodiert ist, inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 22 bis 25 bereitgestellt wird, b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird, d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird, e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Erhöhung der aufgenommenen Menge an Glukose in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des Proteins Erg4 inhibiert.
Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 34 identifiziert wurde, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
Verwendung einer Verbindung, welche mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 34 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.