KR20050056206A - 포유동물로부터 글루코즈 수송체의 발현을 위한사카로마이세스 세레비지애 ｅｒｇ4 돌연변이체의 용도 - Google Patents

포유동물로부터 글루코즈 수송체의 발현을 위한사카로마이세스 세레비지애 ｅｒｇ4 돌연변이체의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람 GLUT4 수송체 또는 사람 GLUT1 수송체가 작용적으로 발현될 수 있는 효모 균주, 및 특히 효모 균주내에서 특히 용이하게 작용적으로 발현될 수 있는 GLUT4 수송 단백질에 관한 것이다.

Description

포유동물로부터 글루코즈 수송체의 발현을 위한 사카로마이세스 세레비지애 ＥＲＧ4 돌연변이체의 용도{Use of Saccharomyces cerevisiae ERG4 mutants for the expression of glucose transporters from mammals}
본원에서 기술하는 모든 효모 균주는 균주 CEN-PK2-1C(MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1MAL2-8C SUC2)로부터 유래되었다. 헥소스 수송체 유전자(HXT)에 결실을 갖는 효모 균주의 제조는 문헌[참조: Wieczorke et al., FEBS Lett. 464, 123-128 (1999): EBY-18ga(MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8C SUC2]에 기재되었다. EBY. VW4000(MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δmph2 Δmph3 Δstl1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1MAL2-8C SUC2]. 배지는 1% 효모 추출물 및 2% 펩톤(YP)에 기초한 반면에, 최소 배지는 아미노산을 함유하지 않는 0.67% 디프코(Difco) 효모 질소 염기(YNB)로 구성되었으며 영양요구성에 필요한 첨가제와 상이한 탄소원을 함유하였다. 효모 세포를 회전 진탕기 또는 아가 플레이트상에서 30℃에서 호기성 조건하에 성장시켰다. 세포 성장을 600nm(OD600)에서 광학밀도를 측정하거나 효모 콜로니의 직경을 측정함으로써 모니터링하였다.
글루코즈 흡수의 측정
글루코즈 수송을 D-[U-14C]-글로코즈(제조원: Amersham)의 흡수로서 측정하고 반응속도론적 매개변수를 이디-호프스티(Eadie-Hofstee) 플롯으로부터 결정하였다. 세포를 원심분리하여 제거하고 포스페이트-완충액으로 세척하고 ml당 60mg(습식 중량)의 농도로 포스페이트 완충액 속에 재현탁시켰다. 글루코즈 흡수를 0.2 내지 100mM 사이의 글루코즈 농도에 대해 측정하였고, 기질의 특이적 활성은 0.1 내지 55.5kBqμmol-1이었다. 세포 및 글루코즈 용액을 30℃에서 5분 동안 예비항온처리하였다. 글루코즈 흡수는 방사성 글루코즈를 세포에 첨가함으로써 개시되었다. 5초 동안 항온처리한 후, 빙냉 종결 완충액(0.1M KiPO4, pH 6.5, 500mM 글루코즈) 10ml을 첨가하고 세포를 유리 섬유 필터(Ø=24mm, 제조원: Whatman)상에서 여과하여 신속히 제거하였다. 상기 필터를 빙냉 완충액으로 신속히 3회 세척하고, 혼입된 방사성을 액체 신틸레이션 계수기를 사용하여 측정하였다. 세포를 15분 동안 억제제의 존재하에 또는 용매 단독의 존재하에 항온처리한 후, 시토칼라신 B(cytochalasin B)(최종 농도 20μM, 에탄올 속에 용해됨)를 50mM 또는 100mM 방사성 글루코즈를 이용한 15초 흡수 검정에 의해 측정하였다.
포유동물로부터의 글루코즈 수송체에 대한 신규 이종 발현 시스템은 개발된 바 있다. 상기 시스템은 암호화 유전자를 파괴시킴으로써 모든 내인성 글루코즈 수송체가 제거된 에스. 세레비지애 균주에 기초한다. 상기 균주는 더이상 원형질막을 통해 글루코즈를 흡수할 수 없고 단독의 탄소원으로서의 글루코즈하에 성장할 수 없다. 사람 또는 기타 포유동물의 이종 글루코즈 수송체인 GLUT1 및 GLUT4의 활성 형태를 효모 원형질막내로 통합시키기 위해, 첨가 돌연변이를 효모 균주로 도입시켰다. GLUT1은 fgy1-1 돌연변이 균주에서만 활성이고, GLUT4는 fgy1-1 fgy-X 이중 돌연변이체에서만 활성이다.
FGY1 유전자는 클로닝된 바 있다. 이는 에스. 세레비지애 ORF YMR212c이다. 기능과 관련하여, 그 결과는 Fgy1 또는 Fgy1에 의해 생산된 생성물이, 사람 글루코즈 수송체의 활성을 억제하거나 GLUT-수송 소포의 원형질막으로의 융합에 관여함을 나타낸다.
GLUT1과 대조적으로 및 포유동물 세포와 유사하게, 효모내의 대부분의 GLUT4 단백질은 세포내 구조에 위치한다. GLUT4가 추가로 원형질막으로 지시되는 총 9개의 억제성 돌연변이체(fgy4-1 내지 fgy4-9)가 분리었으며, 동시적 fgy1-1 돌연변이의 경우에 활성이 된다.
문헌[참조: Bruns et al., Genes Dev, 1994; 8:1087-105]에 기재된 삽입 진뱅크는 보충 분석을 위해 사용하였다. hxt fgy1-1 균주를 먼저 GLUT4 플라스미드로 형질전환시킨 다음, 동원된 삽입 진뱅크로 형질전환시켰다. 이어서, 글루코즈 배지상에서 성장할 수 있는 형질전환체에 대해 스크리닝하였다. 연구된 돌연변이체 중 하나에서 ERG4 유전자가 파괴된 것으로 판명되었다. ERG4는 에르고스테롤 생합성의 효소(옥시도리덕타제)를 암호화한다. 이러한 효소, 스테롤 C-24(28)-리덕타제는 에르고스테롤 생합성의 마지막 단계를 촉매하고 에르고스타-5,7,22,24,(28)-테트라에놀을 최종 산물 에르고스테롤로 전환시킨다. Erg4 단백질은 8개의 트랜스막 도메인을 함유하고 소포체내에 위치한다. 에르고스테롤 전구체가 효모 막으로 혼입되어 에르고스테롤 손실을 보상하기 때문에 erg4 돌연변이체는 가시적이다.
GLUT4 작용성에 대한 Erg4의 억제 영향은 hxt fgy1-1 균주의 특정 결실에 의해 확인하였다. 수득된 균주(hxt fgy1-1 Δerg4)는 SDY022로서 지칭되었다. 분할-유비퀴틴 시스템을 보조로 하는 단백질 상호작용 검정은 사람 GLUT4가 효모 Erg4와 직접적으로 상호작용함을 나타냈다. 따라서, 소포체내 효모 Erg4 단백질은 GLUT4의 추가 전위를 직접적으로 방지하거나, 전위 및/또는 기능에 중요한 일부 방식으로 GLUT4를 변형시키는 것으로 예상될 수 있다.
마찬가지로, 작용적 FGY1에도 불구하고 hxt 널(null) 균주내의 Erg4의 결실만은 GLUT1은 활성화시키지만 GLUT4는 활성화시키지 않는 것으로 나타났다. 성장 검정의 결과는 하기 표 1에 요약되어 있다.
에르고스테롤 자체가 GLUT4에 대해 음성적 영향을 발휘함을 배제하기 위해, 성장 검정을 호기성 조건하에 에르고스테롤을 함유하는 아가 플레이트에서 수행하였다. GLUT4로 형질전환된 효모 균주는 이러한 조건하에 성장할 수 없었다(표 2). hxt fgy1-1 균주내의 GLUT1 형질전환체는, 호기성 성장과 대조적으로, 혐기성 조건하에서는 글루코즈상에서 성장하지 않는 것으로 나타났다. GLUT1 형질전환체는 ERG4의 결실 후에만 성장할 수 있었다.
시험관내 돌연변이유발에 의한 Val85의 Met로의 교환은 GLUT4가 fgy1-1 돌연변이와 독립적이 되도록 하였으며 GLUT4V85M이 심지어 hxt erg4 균주에서도 작용적이 되도록 하였다. 이러한 관찰은 Fgy1이 GLUT 수송체의 제2 트랜스막 나선 내에 위치하는 상기 위치에 직접적으로 또는 간접적으로 작용함을 나타낸다.
표 3은 본 특허 출원과 관련하여 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(DSMZ, 독일 38124 브라운슈바이크 마쉐로더 벡 16 소재)에 기탁된 효모 균주의 설명을 제시한다.
글루코즈 배지상에서의 GLUT1 및 GLUT4 형질전환체의 성장
유전형 1% 글루코즈 1% 글루코즈
Δhxt fgy1-1 GLUT4 - GLUT1 ++
Δhxt fgy1-1 Δerg4 GLUT4 ++ GLUT1 ++
Δhxt fgy1-1 Δerg4 벡터 - 벡터 -
Δhxt fgy1-1 Δerg5 GLUT4 - GLUT1 ++
Δhxt fgy1-1 Δerg4Δerg5 GLUT4 + GLUT1 ++
Δhxt fgy1-1 Δerg4 GLUT4 - GLUT1 +
Δhxt fgy1-1 Δerg5 GLUT4 - GLUT1 -
혐기성 조건하에 에르고스테롤을 함유하거나 함유하지 않는 글루코즈 배지상에서의 GLUT1 및 GLUT4 형질전환체의 성장
유전형 1% 글루코즈 1% 글루코즈+33mg/에르고스테롤 ℓ
Δhxt fgy1-1 GLUT1 GLUT4 -- --
Δhxt fgy1-1Δerg4 GLUT1 GLUT4 -- ++-
Δhxt fgy1-1Δerg5 GLUT1 GLUT4 -- --
Δhxt fgy1-1Δerg4Δerg5 GLUT1 GLUT4 -- ++-
Δhxt Δerg4 GLUT1 GLUT4 -- (+)-
Δhxt Δerg5 GLUT1 GLUT4 -- --
기탁된 효모 균주(사카로마이세스 세레비지애)의 특성
DSMZ에 따른 기탁번호 유전형 표현형 플라스미드
DSM 15187 MATaΔhxt1-17 Δgal2Δagt1 Δstl1 Δmph2 Δmph3 Δerg4 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his-Δ1 MAL2-8C SUC2 탄소원으로서 1% 말토즈하의 균주 성장; 글루코즈, 류신, 트립토판, 히스티딘 및 우라실에 대한 영양요구성 -
DSM 15184 MATaΔhxt1-17 Δgal2 Δagt1Δstl1 Δerg4 fgy1-1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8C SUC2 탄소원으로서 1% 말토즈하의 균주 성장; 글루코즈, 류신, 트립토판, 히스티딘 및 우라실에 대한 영양요구성
DSM 15185 MATaΔhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 Δmph2 Δmph3 Δerg4 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8C SUC2 탄소원으로서 1% 말토즈하의 균주 성장; 글루코즈, 류신, 트립토판 및 히스티딘에 대한 영양요구성 p4H7GLUT4V85M(선별 마커 URA3), =서열 3
DSM 15186 MATaΔhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 Δerg4 fgy1-1 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8C SUC2 탄소원으로서 1% 말토즈하의 균주 성장; 글루코즈, 류신, 트립토판 및 히스티딘에 대한 영양요구성 p4H7GLUT4V85M(선별 마커 URA3), =서열 3
DSM 15188 MATaΔhxt1-17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 Δmph2 Δmph3 leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8C SUC2 탄소원으로서 1% 말토즈하의 균주 성장; 글루코즈, 류신, 트립토판 및 히스티딘에 대한 영양요구성 p4H7GLUT4V85M(선별 마커 URA3), =서열 3
기본 배지: 아미노산(Difco)를 함유하지 않는 0.67% 효모 질소 염기; pH 6.2. 영양요구성 보충물: 류신(0.44 mM), 트립토판(0.19mM), 히스티딘(0.25mM, 우라실(0.44mM), 말토즈는 1 내지 2%일 수 있다.
서열목록
본 발명은 사람 Glut4 및 Glut1 수송체가 작용적으로 발현될 수 있는 효모 균주에 관한 것이다.
대부분의 종속영양 세포는 특수한 수송체 단백질을 통해 글루코스를 세포 내부로 수송한다. 다양한 유기체는 특히, 양성자 공수송 시스템, Na+ 글루코즈 수송체, 결합 단백질-의존적 시스템, 포스포트랜스퍼라제 시스템 및 촉진 확산을 위한 시스템과 같이 글루코즈의 수송을 매개하는 다양한 기작을 발달시켜 왔다. 진핵생물에 있어, 포유동물에서는 GLUT 유전자(GLUT= 글루코즈 수송체)에 의해 암호화되고 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서는 HXT 유전자(HXT=헥소즈 수송체)에 의해 암호화되는 글루코즈 수송체 계열은 촉진 확산을 통해 글루코스 흡수를 매개한다. 상기 수송체는 당 수송체 거대 계열에 속한다. 이들은 12개의 트랜스막 나선의 존재와 다수의 보존된 아미노산 라디칼을 특징으로 한다. 글루코즈 수송체는 예를 들어, 진성 당뇨병 또는 프란코니-비켈(Fanconi-Bickel) 증후군과 같은 결손 글루코즈 항상성과 관련된 질환에서 중요한 역활을 한다. 따라서, 포유동물에서의 글루코즈 수송은 수많은 연구의 대상이 되어 왔다. 오늘날까지 13가지의 글루코즈 수송체형 단백질이 동정되었다(GLUT1 내지 GLUT12, HMIT-H-myo-이노시톨 수송체). 상기 수송체들은 각종 조직내로의 글루코즈 흡수, 간내의 이의 저장, 근육 세포 및 지방세포내로의 이의 인슐린-의존적 흡수 및 췌장의 β세포에 의한 글루코즈 측정을 포함하여 주요한 역활을 한다. GLUT1은 혈뇌 장벽을 통한 적혈구내로의 글루코즈 수송을 매개할 뿐만 아니라 많은 다른 조직에서도 발현되는 반면에, GLUT4는 인슐린-의존적 조직, 주로 근육과 지방 조직으로 제한된다. 상기 인슐린-의존적 조직에서, 세포내 구획 또는 원형질막 구획을 통한 GLUT4 수송체의 표적화를 조절하는 것은 글루코즈 흡수를 조절하기 위한 중요한 기작을 대표한다. 인슐린의 존재하에, 글루코즈 흡수를 촉진하기 위해 세포내 GLUT4는 원형질막을 통해 재분배된다. 마찬가지로, GLUT1도 상기한 인슐린-의존적 조직에서 발현되며 세포내 이의 분포도 마찬가지로 인슐린에 의해 영향을 받지만 강력하지는 않다. 또한, GLUT1 또는 GLUT4가 당 수송을 촉매하는 상대적 효능은 각 수송체의 세포 표면으로의 표적화 정도 뿐만 아니라 수송체의 반응속도론적 특성에 의해 측정한다.
상이한 글루코즈 수송체 동종형이 공동 발현된다는 사실과 신속한 글루코즈 대사는 이러한 인슐린-의존적 조직내 각 글루코즈 수송체 동종형의 역활과 정확한 특성에 관한 연구를 복잡하게 만든다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 아프리카발톱개구리(Xenopus) 난모세포, 조직 배양 세포, 곤충 세포 및 효모 세포와 같은 이종 발현 시스템이 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 시스템들과 관련하여 다수의 어려움이 나타난 것으로 판명되었다: 이종적으로 발현된 수송체의 너무 미약한 활성, 상기 시스템내의 고유의 글루코즈 수송체, 상당한 비율의 수송체의 세포내 보유 또는 심지어 불활성 수송체의 생산.
포유동물, 특히 사람의 천연 GLUT4 단백질은 특정 조건하에 사카로마이세스 세레비지애의 균주에서 작용적 방식으로 발현될 수 있다. 효모 세포는 단세포 진핵 유기체이다. 따라서, 일부 단백질의 경우, 특히 약제학적 활성 물질을 동정하기 위한 스크린 검정의 수행과 관련하여, 효모 세포가 세균 시스템에 비해 발현에 보다 적합하다.
본 발명은 GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 정제 및 분리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
상기 단백질은 사람 GLUT4 단백질의 아미노산 쇄의 85번 위치에 발린에서 메티오닌으로의 아미노산 교환을 함유한다. 이러한 변경된 GLUT4V85M 단백질은 작용적 GLUT4 단백질을 발현시키기 위한 추가의 대안을 제공한다. GLUT4 단백질은, 글루코즈 흡수가 이러한 GLUT4 단백질의 발현 후에 글루코즈 수송체 전체가 불활성(=hxt(-))인 사카로마이세스 세레비지애 균주에서 관찰될 수 있는 경우, 사카로마이세스 세레비지애와 연관하여 작용적인 것으로 간주되어야 한다. 글루코즈 흡수는 방사선 표지된 글루코즈를 사용한 수송 측정 또는 단독의 탄소원으로서 글루코즈를 함유한 배지상에서 성장에 의해 측정할 수 있다.
바람직한 양태에서, 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 정제 및 분리된 폴리뉴클레오타이드는 (a) 서열 1에 따른 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 엄격한 조건하에 서열 1의 서열과 하이브리드화하고 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹의 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어질 수 있다.
정제 및 분리된 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 GLUT4V85M 단백질을 암호화한다. 이미 논의한 바와 같이, 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 정제 및 분리된 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 적합한 프로모터는 특히, 예를 들어, Lac-, trp-, ADH- 또는 HXT7 프로모터와 같은 진핵생물 또는 원핵생물 프로모터이다. 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드의 일부분은, 엄밀히 세균 또는 진핵 유기체가 벡터를 보조로 하여 상기 프로모터에 의해서, 단백질 GLUT4V85M로 전사될 수 있는 mRNA를 생산하는 경우에 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 이러한 벡터의 예에는 벡터 p4H7GLUT4V85M(서열 3)이 있다. 단백질 GLUT4V85M은 상기 벡터에 의해 효모 세포에서 발현될 수 있다.
바람직한 양태에서, 상기한 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 효모 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드를 복제하는데 적합하거나 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부분을 효모 세포에서 발현시켜 GLUT4V85M을 수득하는데 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애로부터의 효모 세포가 특히 적합하다. 효모 세포에서의 복제 및 발현의 경우, 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 효모 벡터 형태로 존재한다. GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 영역은, 예를 들어, ADH 프로모터(알콜 데하이드로게나제 프로모터) 또는 HXT7 프로모터(헥소즈-수송체 프로모터)와 같은 효모 세포-특이적 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 효모 벡터는 효모내 DNA 클로닝용으로 개발된 벡터 그룹이다.
본 발명은 추가로 모든 글루코즈 수송체가 더이상 작용적이지 않고(hxt(-)) 작용적 Erg4 단백질을 함유하지 않는, 사카로마이세스 세레비지애로부터의 효모 세포에 관한 것이다. 이러한 효모 세포는 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 DSM 15187로서 DSMZ(도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하, 독일 38124 브라운슈바이크 마쉐로더 벡 16 소재)에 기탁된 효모 세포이다.
본 발명은 또한 모든 글루코즈 수송체가 더이상 작용적이지 않으며 작용적 Fgy1을 함유하지 않고 작용적 Erg4 단백질을 함유하지 않는 효모 세포에 관한 것이다. Erg4 단백질 또는 Fgy1 단백질의 결여는 특히 상응하는 암호화 게놈 영역의 중단 또는 상기 암호화 영역의 부분적 또는 완전한 제거에 기인할 수 있다. 작용적 글루코즈 수송체, 작용적 Fgy1 단백질 및 작용적 Erg4 단백질을 함유하지 않는 효모 세포로서, DSMZ에 사카로마이세스 세레비지애 DSM 15184로서 기탁된 효모 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 상기한 바와 같은 효모 세포는 바람직하게는 포유동물 GLUT1 단백질 또는 포유동물 GLUT4 단백질, 특히 랫트, 마우스, 래빗트, 돼지, 소 또는 영장류로부터의 단백질을 발현시키기 위해 사용한다. 바람직한 양태는 사람 GLUT4 또는 GLUT1 단백질을 발현시키기 위해 효모 세포를 사용한다. 글루코즈 수송체 전체 및 또한 Erg4 단백질이 더이상 작용적이지 않은 사카로마이세스 세레비지애 효모 세포는 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 본 발명의 폴리뉴클레타이드를 함유할 수 있다. 상기 효모 세포는 또한 GLUT4V85M 단백질을 발현하여 상기 단백질을 함유할 수 있다.
GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 이러한 종류의 효모 균주는 바람직하게는 DSMZ에 기탁된 사카로마이세스 세레비지애 DSM 15185 효모 균주이다. 글루코즈 수송체 전체 및 또한 Erg4 단백질이 더이상 작용적이지 않으며 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 효모 세포는 예를 들어, (a) 글루코즈 수송체 전체 및 또한 Erg4 단백질이 더이상 작용적이지 않은 효모 세포를 제공하는 단계,
(b) GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 효모 세포에서 복제될 수 있는, 분리 및 정제된 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계,
(c) 단계(a)로부터의 효모 세포를 단계(b)로부터의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환시키는 단계,
(d) 형질전환된 효모 세포를 선별하는 단계 및
(e) 경우에 따라 GLUT4V85M 단백질을 발현시키는 단계에 의해 제조할 수 있다.
GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리 및 정제된 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는, 효모 세포에서 복제될 수 있으며 상기 DNA 서열이 클로닝된 벡터이다. 이러한 벡터의 예는 p4H7GLUT4V85M(서열 3)이다.
본 발명은 또한 글루코즈 수송체 전체 및 Fgy1 및 Erg4에 대한 단백질이 더이상 작용적이지 않으며, GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 효모 세포에 관한 것이다. 상기 효모 세포는 또한 GLUT4V85M 단백질을 발현하여 상기 단백질을 함유할 수 있다. 이러한 종류의 효모 균주는 바람직하게는 DSMZ에 기탁된 사카로마이세스 세레비지애 DSM 15186 효모 균주이다.
글루코즈 수송체 전체 및 또한 단백질 Fgy1 및 Erg4가 더이상 작용적이지 않으며 GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 효모 세포는, 예를 들어, (a) 글루코즈 수송체 전체 및 또한 단백질 Fgy1 및 Erg4가 더이상 작용적이지 않은 효모 세포를 제공하는 단계,
(b) GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 효모 세포에서 복제될 수 있는, 분리 및 정제된 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계,
(c) 단계(a)로부터의 효모 세포를 단계(b)로부터의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환시키는 단계,
(d) 형질전환된 효모 세포를 선별하는 단계 및
(e) 경우에 따라 GLUT4V85M 단백질을 발현시키는 단계에 의해 제조할 수 있다.
GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 상기한 분리 및 정제된 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 효모내에서 복제될 수 있으며 상기 DNA 서열이 클로닝된 벡터이다. 이러한 벡터의 예는 p4H7GLUT4V85M(서열 3)이다.
본 발명은 또한 글루코즈 수송체 전체가 더이상 작용적이지 않으며 GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 효모 세포에 관한 것이다. 상기 효모 세포는 또한 GLUT4V85M 단백질을 발현하여 상기 단백질을 함유할 수 있다. 이러한 종류의 바람직한 효모 균주는 DSMZ에 기탁되어 있는 사카로마이세스 세레비지애 15188 효모 균주이다.
글루코즈 수송체 전체가 더이상 작용적이지 않으며 GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 효모 세포는, 예를 들어, (a) 글루코즈 수송체 전체가 더이상 작용적이지 않은 효모 세포를 제공하는 단계,
(b) GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 효모 세포에서 복제될 수 있는, 분리 및 정제된 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계,
(c) 단계(a)로부터의 효모 세포를 단계(b)로부터의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환시키는 단계,
(d) 형질전환된 효모 세포를 선별하는 단계 및
(e) 경우에 따라 GLUT4V85M 단백질을 발현시키는 단계에 의해 제조할 수 있다.
GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 분리 및 정제된 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 효모 세포에서 복제될 수 있으며 상기 DNA 서열이 클로닝된 벡터이다. 이러한 벡터의 예는 p4H7GLUT4V85M(서열 3)이다. 본 발명은 또한 서열 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다. 상기 단백질은 아미노산 쇄의 85번 위치에서 발린이 메티오닌으로 대체된 사람 GLUT4 단백질이다.
본 발명은 또한,
(a) 글루코즈 수송체 전체 및 또한 Erg4 단백질이 더이상 작용적이지 않으며 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 효모 세포를 제공하는 단계,
(b) GLUT4 단백질의 활성을 자극하여 단계(d)에 따른 효모내 글루코즈 흡수량을 증가시키는 화학적 화합물을 제공하는 단계,
(c) 단계(a)의 효모를 단계(b)의 화학적 화합물과 접촉시키는 단계,
(d) 단계(c)의 효모에 의한 글루코즈 흡수를 측정하는 단계 및
(e) 단계(b)에 따른 화학적 화합물과 접촉되지 않은 단계(a)에 따른 효모 세포에서 검출된 글루코즈 흡수 값에 대해 검출된 단계(d)의 글루코즈 흡수 값을 관련시키는 단계를 포함하여, 상기 GLUT4 단백질의 활성을 자극하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기한 방법으로 동정된 화합물을 함유하는 약제 및 추가로 약제를 제형화하기 위한 첨가제 및 부형제 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 I형 및/또는 II형 당뇨병 치료용 약제의 제조를 위한, 상기한 방법으로 동정된 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기한 방법으로 동정된 화합물을 함유하는 약제 및 추가로 약제를 제형화하기 위한 첨가제 및 부형제 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 당뇨병 치료용 약제의 제조를 위한, 상기한 방법으로 동정된 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 당뇨병 치료용 약제의 제조를 위한, 상기한 방법으로 동정된 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한,
(a) 글루코즈 수송체 전체가 더이상 작용적이지 않으며 GLUT4V85M 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하고 효모 세포에서 복제될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 효모 세포를 제공하는 단계,
(b) 단백질 Erg4의 활성을 자극하여 단계(d)에 따른 효모내 글루코즈 흡수량을 증가시키는 화학적 화합물을 제공하는 단계,
(c) 단계(a)의 효모를 단계(b)의 화학적 화합물과 접촉시키는 단계,
(d) 단계(c)의 효모에 의한 글루코즈 흡수를 측정하는 단계 및
(e) 단계(b)에 따른 화학적 화합물과 접촉되지 않은 단계(a)에 따른 효모 세포에서 검출된 글루코즈 흡수 값에 대해 검출된 단계(d)의 글루코즈 흡수 값을 관련시키는 단계를 포함하여, Erg4 유전자에 의해 암호화된 단백질을 억제하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로,
(a) 글루코즈 수송체 전체 및 Erg4 단백질이 더이상 작용적이지 않으며 GLUT4 단백질을 함유하는 효모 세포를 제공하는 단계,
(b) 단백질 Fgy1의 활성을 자극하여 단계(d)에 따른 효모내 글루코즈 흡수량을 증가시키는 화학적 화합물을 제공하는 단계,
(c) 단계(a)의 효모를 단계(b)의 화학적 화합물과 접촉시키는 단계,
(d) 단계(c)의 효모에 의한 글루코즈 흡수를 측정하는 단계 및
(e) 단계(b)에 따른 화학적 화합물과 접촉되지 않은 단계(a)에 따른 효모 세포에서 검출된 글루코즈 흡수 값에 대해 검출된 단계(d)의 글루코즈 흡수 값을 관련시키는 단계를 포함하여, Fgy1 유전자의 상응하는 단백질을 억제하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기한 방법으로 동정된 화합물을 포함하는 약제 및 약제를 제형화하기 위한 첨가제 및 부형제 관한 것이다
본 발명은 기술적 세부항목과 관련하여 하기에서 보다 상세히 예시될 수 있다.
하이브리드화는 이본쇄에 대해 상보적인 염기 서열을 갖는 2개의 핵산 일본쇄의 회합을 의미한다. 하이브리드화는 2개의 DNA 쇄 간에, 하나의 DNA와 하나의 RNA 쇄 간에 및 2개의 RNA 쇄간에 일어날 수 있다. 원칙적으로, 초기에 이본쇄 형태일 수 있는 핵산을 가열하고, 2차 구조를 갖지 않는 일본쇄 분자로 분해될 때까지 예를 들어, 수조에서 10분 동안 비등시켜 하이브리드 분자를 제조할 수 있다. 후속적으로, 이를 천천히 냉각시킬 수 있다. 냉각기 동안, 상보적 쇄가 쌍을 이루어 이본쇄 하이브리드 분자가 생성된다. 실험실 조건하에, 하이브리드화는 통상적으로 하이브리드화 필터를 보조로 하여 수행하는데, 이러한 하이브리드화 필터에는 일본쇄 또는 변성가능한 폴리뉴클레오타이드 분자가 블롯팅 또는 전기영동에 의해 적용된다. 하이브리드화하고자 하는 적절한 상보적 폴리뉴클레오타이드 분자에 방사성 형광 표지를 제공함으로써 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 사용하여 하이브리드화를 가시화할 수 있다. 엄격성은 특정 조건의 매치(matching) 또는 배열 정도를 말한다. 높은 엄격성은 낮은 엄격성보다 매치에 있어 높은 요구를 갖는다. 적용 및 목적에 따라서, 상이한 엄격성을 갖는 특정 조건을 핵산의 하이브리드화를 위해 설정한다. 높은 엄격성에서, 하이브리드화 반응 조건은 매우 잘 매치되는 상보적 분자만이 서로 하이브리드화될 수 있도록 설정한다. 낮은 엄격성은, 분자가, 비교적 대부분의 쌍을 이루어지 않았거나 잘못 쌍을 이룬 염기와도 부분적으로 하이브리드화될 수 있도록 한다.
하이브리드화 조건은 특히, 하이브리드화를 68℃에서 2시간 이상 동안 2×SSC를 함유하는 수용액에서 수행된 다음, 실온에서 5분 동안 2×SSC/0.1% SDS으로 먼저 세척하고 이어서 68℃에서 1×SSC/0.1% SDS로 1시간 동안 세척하고 이어서 68℃에서 다시 수시간 동안 0.2% SSC/0.1% SDS로 세척하는 경우에 엄격한 것으로서 이해될 것이다.
2×SSC, 1×SSC 또는 0.2×SSC 용액은 20×SSC 용액을 적절하게 희석시켜 제조한다. 20×SSC 용액은 3mol/NaCl ℓ및 0.3mol/나트륨 시트레이트 ℓ를 함유한다. pH는 7.0이다. 당해 숙련가는 엄격한 조건하에서의 폴리뉴클레오타이드의 하이브리드화 방법을 알고 있다. 적절한 지침은 특히, 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience; editors: Frederich M. Ausubel, Roger Brant, Robert E. Kinston, David J. Moore, J. G. Seidmann, Kevin Struhl; ISBN: 0-471-50338-X]과 같은 전문 서적에서 찾아볼 수 있다.
효모 벡터는 상이한 서브그룹으로 나뉘어질 수 있다. YIp 벡터(효모 통합 플라스미드)는 필수적으로 클로닝용 세균에서 사용되는 벡터에 상응하지만, 선별가능한 효모 유전자(예: URA3, LEU2)를 함유한다. 상기 벡터의 도입 후에 외래 DNA가 효모 염색체내로 통합된 경우에만, 이러한 서열이 염색체와 함께 복제되어 모든 딸 세포로 안정하게 전이되는 클론을 형성한다.
상기 방법에 기초하여, 진핵 ORI(복제 오리진)으로 인해 자율적으로 복제될 수 있는 플라스미드가 유도되었다. 이러한 효모 벡터는 YRp 벡터(효모 복제 플라스미드) 또는 ARS 벡터(자율 복제 서열)로서 언급된다. 또한, 효모 2㎛ 플라스미드로부터 유래되고 선별성 마커 유전자를 함유하는 YEp 벡터(효모 에피좀 플라스미드)가 있다. YAC 벡터(효모 인공 염색체) 부류는 독립적인 염색체처럼 행동한다.
발현시키고자 하는 유전자를 함유하는 효모 벡터는 상기 유전자가 발현될 수 있도록 하기 위해 형질전환을 사용하여 효모내로 도입시킨다. 이러한 목적에 적합한 방법의 예에는 전기천공 또는 컴피턴트(competent) 세포와 벡터 DNA의 항온처리가 있다. 적합한 효모 발현 프로모터는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 예로는 SOD1 프로모터 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), ADH 프로모터(알콜 데하이드로게나제), 산성 포스파타제에 대한 유전자의 프로모터, HXT2 프로모터(글루코즈 수송체 2), HXT7 프로모터(글루코즈 수송체 7), GAL2 프로모터(갈락토즈 수송체) 등이 있다. 효모 발현 프로모터와 발현될 유전자(예: GLUT4V85M)를 포함하는 작제물은 발현 목적상 효모 벡터의 일부분이다. 발현을 수행하기 위해, 상기 효모 벡터는 효모 게놈과 독립적인 자가 복제 입자일 수 있거나 효모 게놈내로 안정하게 통합될 수 있다. 적합한 효모 벡터는 원칙적으로 효모에서 증식할 수 있는 모든 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 사용될 수 있는 효모 벡터는 특히 효모 플라스미드 또는 효모 인공 염색체이다. 효모 벡터는 통상적으로 복제 과정을 개시하는 복제 오리진(2μ, ars), 및 통상적으로 영양요구성 마커 또는 항생제 내성 유전자를 포함하는 선별 마커를 함유한다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 효모 벡터의 예에는 pBM272, pCS19, pEMBCYe23, pFL26, pG6, pNN414, pTV3, p426MET25, p4H7 등이 있다.
본 발명에 따라서, 세포의 선별은 예를 들어, 항생제에 대한 내성 또는 특정 최소 배지에서 성장하는 능력과 같은 선별 마커로 인한 이의 특정 농도, 및 또한 이의 분리 및 아가 플레이트 또는 침지된 배양물에서의 후속적 배양을 의미한다.
당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 사용되는 방법 중에는 배양, 형질전환 및 형질전환된 효모 세포의 선별 및 또한 효모 세포내에서의 단백질 발현이 있다. 상기 방법에 관한 지침은 표준 교과서, 예를 들어, 문헌[참조: Walker Graeme M.: Yeast Physiology and Biotechnology, Wiley and Sons, ISBN: 0-471-9446-8 or Protein Synthesis and Targeting in Yeast, Ed. Alistair J. P. Brown, Mick F. Fruite and John E. G. Mc Cartly; Springer Berlin; ISBN: 3-540-56521-3 or "Methods in Yeast Genetics, 1997: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual; Adams Alison (Edt.); Cold Spring Harbor Laboratory ; ISBN : 0-87969-508-0"]에서 찾아볼 수 있다.
효모 사카로마이세스 세레비지애는 발현이 충분히 높은 경우에 상기 효모내로 헥소즈를 수송할 수 있는 17가지의 공지된 헥소즈 수송체 및 추가로 3가지의 공지된 말토즈 수송체를 갖고 있다. 한가지 공지된 균주에서, 헥소즈 흡수에 적합한 모든 수송체는 결실로 제거되었다. 상기 균주는 단지 말토즈 수송 단백질에 상동인 2개의 유전자 MPH2와 MPH3만을 함유한다. 두 유전자 MPH2와 MPH3은 배지 중의 글루코즈의 존재하에 억제된다. 문헌[참조: Wieczorke et al., FEBS Lett. 464, 123-128 (1999)]에는 상기 효모 균주의 제조법 및 특성화가 기재되어 있다. 상기 균주는 단독의 탄소원으로서 글루코즈를 함유하는 기질에서 증식할 수 없다. 상응하는 벡터(hxt fgy1-1 균주)로부터 출발하여 GLUT1을 작용적으로 발현하는 상기 균주 돌연변이체로부터 선별할 수 있다. 효모 균주 hxt fgy1-1이 효모 프로모터의 조절하에 GLUT4 유전자를 보유하는 플라스미드 벡터로 형질전환되는 경우, 여전히 매우 소량의 글루코즈만이 수송된다. 작용적 GLUT4 발현은 GLUT4에 의한 현저한 글루코즈 수송이 가능할 수 있도록 이러한 효모 균주에 대한 추가 조정을 필요로 한다. 세포가 단일 글루코즈 수송체 GLUT4에 의해 글루코즈를 흡수하는 이러한 효모 균주는 단독의 탄소원으로서 글루코즈를 갖는 기질상에서 분리시킬 수 있다. 이러한 목적을 위해, 효모 프로모터의 작용적 조절하에 GLUT4 유전자를 보유한 효모 hxt fgy-1 균주를 형질전환시킨다. 이러한 방식으로 형질전환된 이들 효모 세포는 단독의 탄소원으로서 글루코즈를 함유하는 영양 배지에 적용시키고 상기 영양 배지에서 항온처리한다. 항온처리한지 수일 후, 예를 들어, 30℃에서 개개 콜로니의 성장이 관찰된다. 이들 콜로니 중 하나를 분리시킨다. 상기 콜로니로부터 효모 플라스미드를 제거하여 단독의 탄소원으로서 글루코즈를 함유하는 영양 배지상에서의 증식을 방지한다. 더이상 벡터 플라스미드를 함유하지 않는 상기 균주가 효모 프로모터의 작용적 조절하에 GLUT4 유전자를 보유한 효모 벡터로 다시 형질전환되는 경우, 상기 균주는 단독의 탄소원으로서 글루코즈를 함유하는 배지상에서 다시 증식할 수 있다.
상기한 효모 균주는 2002년 2월 14일자의 우선권 독일 특허원 제10106718.6호를 주장하는 국제출원 제PCT/EP02/01373호의 주제이다.
고유한 헥소즈 수송체(글루코즈 수송체) 전체가 더이상 작용적이지 않은 효모 균주는 이미 국제 출원 제PCT/EP02/01373호와 관련하여 이전에 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하에 DSM 14035, DSM 14036 또는 DSM 14037로서 이미 기탁되었다
GLUT4의 폴리뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 예를 들어, 진뱅크에서 다음 번호를 통해 접근가능하다: M20747(cDNA; 사람), EMBL:D28561(cDNA; 랫트), EMBL:M23382 (cDNA; 마우스), 스위스프로트(Swissprot): P14672(단백질; 사람), 스위스프로트: P19357 (단백질: 랫트) 및 스위스프로트: P14142 (단백질; 마우스).
GLUT1의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 명시된 데이타베이스의 다음 코드 번호하에 개시되어 있다: EMBL:M20653(cDNA ; 사람), EMBL : M13979 (cDNA; 랫트), EMBL:M23384(cDNA; 마우스), 스위스프로트: P11166(단백질; 사람), 스위스프로트: P11167(단백질; 랫트) 및 스위스프로트: P17809 (단백질; 마우스).
약제는 사람 및 동물의 질환 또는 신체 기능장애의 치료요법을 위한 약리학적 활성 물질의 용량 형태이다. 경구 치료요법을 위한 용량 형태의 예는 산제, 입제, 정제, 환제, 로젠지제, 당의정, 캡슐제, 액체 추출물, 팅크제 및 시럽제이다. 외용으로 사용되는 예는 에어로졸, 분무제, 겔제, 연고제 또는 산제이다. 주사가능한 또는 주입가능한 액제는 바이알, 병 또는 사전충전된 주사기를 사용한 비경구 투여를 가능하게 한다. 이들 및 다른 약제는 약제 기술 분야의 숙련가에 공지되어 있다.
약제의 제형화를 위한 부형제는 특정 적용을 위한 활성 성분의 적용, 분포 및 작용 전개를 최적화시키기 위한 목적에 있어 활성 물질의 제조를 가능하게 한다. 이러한 부형제의 예는 충전제, 결합제, 붕해제 또는 활주제, 예를 들어, 락토즈, 슈크로즈, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로즈, 전분, 인산이칼슘, 폴리글리콜, 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 카복시메틸셀룰로즈, 활석 또는 이산화실리콘이다.
당뇨병은 인슐린 결핍 또는 감소된 인슐린 작용으로 인한 만성 대사 상태로 인해 혈당 수준의 비정상적 증가(고혈당증)를 동반하여 뇨와 함께 글루코즈가 배설되는 것으로 나타난다. 인슐린 작용이 결여되거나 감소되면, 세포가 혈중으로 흡수된 글루코즈를 불충분하게 흡수 및 전환시킨다. 지방 세포에서, 인슐린-길항 호르몬은 혈중 유리 지방산 수준의 증가를 동반한 지방분해를 증가시키는 효과를 갖는다.
지방증(비만증)은 과도한 열량 섭취에 의한 에너지 불균형으로 인한 비정상적 체중 증가로서, 건강에 위험이 된다.
바로 위에서 언급한, 제공된 효모 균주에 의해 흡수되는 헥소즈 양은 방사성 표지된 글루코즈를 사용한 흡수 연구로 측정할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 특정 농도의 효모 세포를 예를 들어, 완충액 100㎕ 속에 ㎖당 60mg(습식 중량)의 농도로 현탁시키고, 단독의 탄소원으로서 한정양의 14C- 또는 3H-표지된 글루코즈와 혼합한다. 세포를 항온처리하고 이의 한정양을 특정 시점에서 제거한다. 흡수된 글루코즈 양은 LSC(액체 신틸렌이션 계수)를 보조로 하여 측정한다. 그러나, 상기한 바와 같은 제공된 효모 균주에 의해 흡수되는 헥소즈 양은 단독의 탄소원으로서 글루코즈를 함유하는 배지상에서 성장 검정에 의해 측정할 수도 있다. 이러한 목적을 위해, 균주의 성장 속도를 화합물을 첨가한 후에, 예를 들어, 600nm에서 광학밀도를 규칙적 간격으로 측정함으로써 측정하고, 이 값을 대조 균주(예; 효모 야생형 균주)의 성장 속도와 비교한다.
화합물은 특히, 생물학적 유기체로부터 화학적 물질을 화학적 합성하거나 분리시킴으로써 제공한다. 또한, 자동화 방식으로 화학적 합성을 수행할 수도 있다. 합성 또는 분리에 의해 수득된 화합물은 적합한 용매 속에 용해시킬 수 있다. 적합한 용매는 특히, 특정 비율의 유기 용매, 예를 들어, DMSO(디메틸설폭사이드)를 함유하는 수용액이다.
상기 언급한 본 발명에 따른 화합물을 동정하기 위한 효모 균주와 화합물의 접촉은 특히 이를 위해 제공된 자동화 실험실 시스템에서 수행한다. 이러한 시스템은 가압(depression)되는 특수하게 제조된 챔버 또는 미세역가 플레이트, 에펜도르프 튜브 또는 실험실 유리 제품을 포함할 수 있다. 자동화 실험실 시스템은 통상적으로 고처리 속도용으로 디자인한다. 상기 언급한 바와 같은 방법은 자동화 실험실 시스템을 보조로 하여 수행하기 때문에 HTS(고처리량 스크리닝)으로 지칭되기도 한다.
서열 1에는 GLUT4V85M 단백질의 암호화 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 기재되어 있다. 서열 2에는 GLUT4V85M 단백질의 아미노산 서열이 기재되어 있다. 서열 3에는 p4H7GLUT4V85M 벡터의 폴리뉴클레오타이드 서열이 기재되어 있다.

Claims (36)

  1. 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 정제 및 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, (a) 서열 1에 따른 뉴클레오타이드 서열, (b) 엄격한 조건하에 서열 1의 서열과 하이브리드화하고 단백질 GLUT4V85M을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 그룹 중 어느 하나로부터 선택되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질 GLUT4V85M이 서열 2에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 GLUT4V85M에 대한 암호화 영역이 프로모터에 작동적으로 연결되는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 효모 세포에서 복제될 수 있는 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제5항에 있어서, 효모 세포내에서 단백질을 발현하는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드.
  7. 모든 글루코즈 수송체가 더이상 작용적이지 않으며 작용적 Erg4 단백질을 함유하지 않는, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 효모 세포.
  8. 모든 글루코즈 수송체가 더이상 작용적이지 않으며 작용적 Fgy1을 함유하지 않고 작용적 Erg4 단백질을 함유하지 않는, 사카로마이세스 세레비지애로부터의 효모 세포.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, ERG4 유전자가 완전히 또는 부분적으로 결실된 효모 세포.
  10. 제7항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 DSM 15187로서 기탁된 효모 세포.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 DSM 15184로서 기탁된 효모 세포.
  12. 포유동물 GLUT1 단백질 또는 GLUT4 단백질을 발현하기 위한 제15항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따른 효모 세포의 용도.
  13. 제12항에 있어서, 사람 GLUT4 단백질 또는 사람 GLUT1 단백질을 발현하기 위한 용도.
  14. 제7항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 효모 세포.
  15. 제14항에 있어서, 단백질 GLUT4V85M을 포함하는 효모 세포.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 DSM 15185로서 기탁된 효모 세포.
  17. (a) 제7항에 따른 효모 세포를 제공하는 단계,
    (b) 제5항 또는 제6항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계,
    (c) 단계(a)에 따른 효모 세포를 단계(b)에 따른 폴리뉴클레오타이드로 형질전환시키는 단계,
    (d) 형질전환된 효모 세포를 선별하는 단계 및
    (e) 경우에 따라, 단백질 GLUT4V85M을 발현시키는 단계를 포함하는, 제14항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 효모 세포의 제조방법.
  18. 제8항 또는 제9항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 효모 세포.
  19. 제18항에 있어서, 단백질 GLUT4V85M을 포함하는 효모 세포.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 DSM 15186으로서 기탁된 효모 세포.
  21. (a) 제8항 또는 제9항에 따른 효모 세포를 제공하는 단계,
    (b) 제5항 또는 제6항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계,
    (c) 단계(a)에 따른 효모 세포를 단계(b)에 따른 폴리뉴클레오타이드로 형질전환시키는 단계,
    (d) 형질전환된 효모 세포를 선별하는 단계 및
    (e) 경우에 따라, 단백질 GLUT4V85M을 발현시키는 단계를 포함하는, 제18항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 따른 효모 세포의 제조방법.
  22. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 모든 글루코즈 수송체가 더이상 작용적이지 않은 효모 세포.
  23. 제22항에 있어서, 단백질 GLUT4V85M을 포함하는 효모 세포.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 DSM 15188로서 기탁된 효모 세포.
  25. (a) 모든 글루코즈 수송체가 더이상 작용적이지 않은 효모 세포를 제공하는 단계,
    (b) 제5항 또는 제6항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계,
    (c) 단계(a)에 따른 효모 세포를 단계(b)에 따른 폴리뉴클레오타이드로 형질전환시키는 단계,
    (d) 형질전환된 효모 세포를 선별하는 단계 및
    (e) 경우에 따라, 단백질 GLUT4V85M을 발현시키는 단계를 포함하는, 제22항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 따른 효모 세포의 제조방법.
  26. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는, 글루코즈 수송체의 작용적 활성을 갖는 단백질.
  27. 서열 2에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 제13항에 따른 단백질.
  28. (a) 제14항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 따른 효모 세포를 제공하는 단계,
    (b) GLUT4 단백질의 활성을 자극하여 단계(d)에 따른 효모내 글루코즈 흡수량을 증가시키는 화학적 화합물을 제공하는 단계,
    (c) 단계(a)의 효모를 단계(b)의 화학적 화합물과 접촉시키는 단계,
    (d) 단계(c)의 효모에 의한 글루코즈 흡수를 측정하는 단계 및
    (e) 단계(b)에 따른 화학적 화합물과 접촉되지 않은 단계(a)에 따른 효모 세포에서 검출된 글루코즈 흡수 값에 대해 검출된 단계(d)의 글루코즈 흡수 값을 관련시키는 단계를 포함하여, 상기 GLUT4 단백질의 활성을 자극하는 화합물을 동정하는 방법.
  29. 제28항에 따른 방법으로 동정된 화합물 및 약제 제형화용 첨가제와 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  30. I형 및/또는 II형 당뇨병 치료용 약제의 제조를 위한, 제28항에 따른 방법으로 동정된 화합물의 용도.
  31. (a) GLUT4 단백질을 함유하는, 제7항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따른 효모 세포를 제공하는 단계,
    (b) 단백질 Fgy1의 활성을 자극하여 단계(d)에 따른 효모내 글루코즈 흡수량을 증가시키는 화학적 화합물을 제공하는 단계,
    (c) 단계(a)의 효모를 단계(b)의 화학적 화합물과 접촉시키는 단계,
    (d) 단계(c)의 효모에 의한 글루코즈 흡수를 측정하는 단계 및
    (e) 단계(b)에 따른 화학적 화합물과 접촉되지 않은 단계(a)에 따른 효모 세포에서 검출된 글루코즈 흡수 값에 대해 검출된 단계(d)의 글루코즈 흡수 값을 관련시키는 단계를 포함하여, Fgy1 유전자의 상응하는 단백질을 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
  32. 제31항에 따른 방법으로 동정된 화합물 및 약제 제형화용 첨가제와 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  33. 당뇨병 치료용 약제의 제조를 위한, 제31항에 따른 방법으로 동정된 화합물의 용도.
  34. (a) 제22항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 따른 효모 세포를 제공하는 단계,
    (b) 단백질 Erg4의 활성을 억제하여 단계(d)에 따른 효모내 글루코즈 흡수량을 증가시키는 화학적 화합물을 제공하는 단계,
    (c) 단계(a)의 효모를 단계(b)의 화학적 화합물과 접촉시키는 단계,
    (d) 단계(c)의 효모에 의한 글루코즈 흡수를 측정하는 단계 및
    (e) 단계(b)에 따른 화학적 화합물과 접촉되지 않은 단계(a)에 따른 효모 세포에서 검출된 글루코즈 흡수 값에 대해 검출된 단계(d)의 글루코즈 흡수 값을 관련시키는 단계를 포함하여, ERG4 유전자에 의해 암호화된 단백질을 억제하는 화합물을 동정하는 방법.
  35. 제34항에 따른 방법으로 동정된 화합물을 및 약제 제형화용 첨가제와 부형제를 포함하는 약제.
  36. 당뇨병 치료용 약제 제조를 위한, 제34항에 따른 방법으로 동정된 화합물의 용도.
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