EP1539958A2 - Verwendung von saccharomyces cerevisiae erg4-mutanten zur expression von glukosetransportern aus säugetieren - Google Patents

Verwendung von saccharomyces cerevisiae erg4-mutanten zur expression von glukosetransportern aus säugetieren

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Publication number
EP1539958A2
EP1539958A2 EP03797264A EP03797264A EP1539958A2 EP 1539958 A2 EP1539958 A2 EP 1539958A2 EP 03797264 A EP03797264 A EP 03797264A EP 03797264 A EP03797264 A EP 03797264A EP 1539958 A2 EP1539958 A2 EP 1539958A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
yeast cell
yeast
glucose
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03797264A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Günter Müller
Silke Dlugai
Dörthe VOSS
Eckhard Boles
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Aventis Pharma Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland GmbH, Aventis Pharma Deutschland GmbH filed Critical Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Publication of EP1539958A2 publication Critical patent/EP1539958A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Saccharomyces cerevisiae erg4 mutants for the expression of glucose transporters from mammals.
  • the invention relates to yeast strains in which the human Glut 4 and Glut 1 transporter can be functionally expressed.
  • heterotrophic cells transport glucose into the interior of the cell via special transporter proteins.
  • Different mechanisms that mediate glucose transport have developed in the various organisms, such as, in particular, proton support systems, Na + glucose transporters, binding protein-dependent systems, phosphotransferase systems and systems for facilitated diffusion.
  • GLUT glucose transporter
  • HXT hexose transporter
  • Glucose transport plays a major role in diseases that are associated with defective glucose homeostasis, such as diabetes mellitus or Fanconi-Bickel syndrome.
  • the transport of glucose in mammals has therefore been the subject of numerous studies.
  • thirteen proteins similar to glucose transporters GLUT1 to GLUT12, HMIT - H-myo-inositol transporter
  • the key roles of these transporters include the uptake of glucose in various tissues, their storage in the liver, their insulin-dependent uptake in muscle cells and adipocytes, and the measurement of glucose by the ß cells of the pancreas.
  • GLUT1 mediates glucose transport into the erythrocytes and through the blood-brain barrier, but is also expressed in many other tissues, while GLUT4 is restricted to insulin-dependent tissues, primarily muscle and adipose tissue. In these insulin-dependent tissues, the control of the targeting of GLUT4 transporters in intracellular compartments or Plasma membrane compartments are an important mechanism for regulating glucose uptake. In the presence of insulin, intracellular GLUT4 is redistributed to the plasma membrane to facilitate glucose uptake. GLUT1 is also expressed in these insulin-dependent tissues, and its distribution in the cell is also affected by insulin, but less so. In addition, the relative effectiveness with which GLUT1 or GLUT4 catalyze sugar transport is determined not only by the extent of each transporter's targeting to the cell surface, but also by their kinetic properties.
  • Yeast cells are unicellular eukaryotic organisms. For some proteins, they are therefore more suitable for expression than bacterial systems, in particular with regard to the implementation of screening assays for the identification of pharmaceutically active substances.
  • the present invention relates to a purified and isolated polynucleotide comprising a DNA sequence which codes for the GLUT4V85M protein.
  • This protein contains an amino acid exchange from valine to methionine at position 85 of the amino acid chain of the human GLUT4 protein.
  • This changed GLUT4V85M protein opens up further alternatives for the expression of a functional GLUT4 protein.
  • the glucose uptake can be determined either by transport measurements using radiolabelled glucose or by growth on medium with glucose as the only carbon source.
  • the purified and isolated polynucleotide comprising a DNA sequence which codes for a protein GLUT4V85M can comprise or consist of a sequence of the following groups: a) a nucleotide sequence, according to Seq ID No. 1, b) a nucleotide sequence which hybridizes under stringent conditions to a sequence of Seq ID No. 1 and which codes for a protein GLUT4V85M.
  • the purified and isolated polynucleotide preferably encodes a GLU4V85M protein which has an amino acid sequence of Seq ID No. 2.
  • the purified and isolated polynucleotide comprising a DNA sequence which codes for a protein GLUT4V85M as described above can be operatively linked to a promoter.
  • a promoter such as the Lac, trp, ADH or HXT7 promoter are suitable as promoters.
  • the part of the polynucleotide coding for the protein GLUT4V85M is operatively connected to a promoter if and only by means of this promoter, with the aid of a vector, an mRNA is formed in a bacterial or eukaryotic organism which can be translated into the protein GLUT4V85M.
  • Such a vector is, for example, the vector p4H7GLUT4V85M (Seq ID No. 3).
  • the protein GLUT4V85M can be expressed in yeast cells using this vector.
  • the polynucleotide described above, comprising a DNA sequence which codes for a protein GLUT4V85M, is suitable in a preferred embodiment for replicating this polynucleotide in a yeast cell or for expressing that for Protein GLUT4V85M coding part of the polynucleotide into the protein GLUT 4 V85M in a yeast cell.
  • a yeast cell from Saccharomyces cerevisiae is particularly suitable.
  • the polynucleotide For replication and expression in a yeast cell, the polynucleotide comprises a DNA sequence, which codes for a protein GLUT4V85M, as a yeast vector.
  • the region of the polynucleotide coding for the protein GLUT4V85M can be operatively linked to a promoter specific for yeast cells, such as, for example, the ADH promoter (alcohol dehydrogenase promoter) or HXT7 promoter (hexose transporter promoter).
  • the yeast vectors are a group of vectors that were developed for cloning DNA in yeast.
  • a yeast cell is preferably a yeast cell deposited as Saccharomyces cerevisiae DSM 15187 as in the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 16, 38124 Braunschweig).
  • the invention also relates to a yeast cell in which all glucose transporters are no longer functional and in which no functional Fgy1 protein and no functional Erg4 protein is contained.
  • the absence of an Erg4 protein or an Fgy1 protein can in particular be due to an interruption of the coding genome sections in question or to partial or complete removal of the coding genome sections.
  • a yeast cell which contains no functional glucose transporters, no functional Fgy1 protein and no functional Erg4 protein a yeast cell stored as Saccharomyces cerevisiae DSM 15184 as in the DSMZ is preferably used.
  • a yeast cell as described above is preferably used to express a GLUT1 protein or a GLUT4 protein of a mammal, such as, in particular, rats, mice, rabbits, pigs, cattle or apes.
  • the yeast cell is used to express a human GLUT4 or GLUT1 protein.
  • a yeast cell from Saccharomyces cerevisiae, all of whose glucose transporters and the Erg4 protein are no longer functional, can contain a polynucleotide of this invention which comprises a DNA sequence which codes for a protein GLUT4V85M. This yeast cell can also express the protein GLUT4V85M and thus contain this protein.
  • Such a yeast strain containing a polynucleotide, which comprises a DNA sequence coding for the protein GLUT4V85M is preferably the yeast strain Saccharomyces cerevisiae DSM 15185 deposited with the DSMZ.
  • a yeast cell, all of which glucose transporters and the Erg4 protein are no longer functional, which are a polynucleotide comprising a DNA sequence encoding a protein GLUT4V85M can be produced, for example, by a) providing a yeast cell, all of whose glucose transporters and the Erg4 protein are no longer functional, b) an isolated and purified polynucleotide, which comprises a DNA sequence coding for the protein GLUT4V85M and can be replicated in a yeast cell, c) the yeast cell from a) is transformed with the polynucleotide from b), d) a transformed yeast cell is selected, e) optionally the protein GLUT4V85M is brought to expression.
  • An isolated and purified polynucleotide which comprises a DNA sequence coding for the protein GLUT4V85M is preferably a vector which can be replicated in a yeast cell and in which the DNA sequence has been cloned.
  • a vector is, for example, p4H7GLUT4V85M (Seq ID No. 3).
  • the invention also relates to a yeast cell whose all glucose transporters and their proteins for Fgy1 and Erg4 are no longer functional and which contains a polynucleotide which comprises a DNA sequence coding for the protein GLUT4V85M.
  • This yeast cell can also express the protein GLUT4V85M and thus contain this protein.
  • a yeast strain preferably the yeast strain Saccharomyces cerevisiae DSM 15186 deposited with the DSMZ.
  • a yeast cell whose all glucose transporters and the proteins Fgy1 and Erg4 are no longer functional and which contains a polynucleotide comprising a DNA sequence which codes for the protein GLUT4V85M can be produced, for example, by a) a yeast cell, all of which glucose transporters as well the proteins Fgy1 and Erg4 are no longer functional, b) an isolated and purified polynucleotide which comprises a DNA sequence coding for the protein GLUT4V85M and can be replicated in a yeast cell is provided, c) the yeast cell from a) is provided is transformed with the polynucleotide from b), d) a transformed yeast cell is selected, e) optionally the protein GLUT4V85M is brought to expression.
  • the above-mentioned isolated and purified polynucleotide which comprises a DNA sequence coding for the protein GLUT4V85M, is preferably a vector which can be replicated in a yeast cell and in which the DNA sequence has been cloned.
  • a vector is, for example, p4H7GLUT4V85M (Seq ID No. 3).
  • the invention also relates to a yeast cell, the glucose transporters of which are no longer functional, which contains a polynucleotide comprising a DNA sequence which codes for the protein GLUT4V85M.
  • This yeast cell can also express the protein GLUT4V85M and thus contain this protein.
  • a yeast strain is preferably the yeast strain Saccharomyces cerevisiae 15188 deposited with the DSMZ.
  • a yeast cell whose all glucose transporters are no longer functional and which contains a polynucleotide comprising a DNA sequence which codes for the protein GLUT4 V85M can be produced, for example, by a) a yeast cell, the glucose transporter of which is no longer functional, is provided, b) an isolated and purified polynucleotide is provided, which comprises a DNA sequence coding for the protein GLUT4V85M and can be replicated in a yeast cell, c) the yeast cell transforming from a) with the polynucleotide from b), d) selecting a transformed yeast cell, e) optionally expressing the protein GLUT4V85M.
  • the above-mentioned isolated and purified polynucleotide which comprises a DNA sequence coding for the protein GLUT4V85M, is preferably a vector which can be replicated in a yeast cell and in which the DNA sequence has been cloned.
  • a vector is, for example, p4H7GLUT4V85M (Seq ID No. 3).
  • the invention also relates to a protein of the amino acid sequence according to Seq ID No. 2. This protein is a human GLUT4 protein in which a valine is replaced by a methionine at position 85 of the amino acid chain.
  • the invention also relates to a method for identifying a compound which stimulates the activity of a GLUT4 protein, characterized in that a) a yeast cell is provided, all of which glucose transporters and the Erg4 protein are no longer functional, and which comprise a polynucleotide comprising a DNA Sequence encoding a protein GLUT4V85M contains, b) a chemical compound is provided, c) the yeast from a) is brought into contact with the chemical compound from b), d) the glucose uptake of the yeast from c) is determined, e) the determined value of the glucose uptake from d) is related to the ascertained value of the glucose uptake in a yeast cell according to a) which has not been brought into contact with a chemical compound according to b), a compound which is an increase in the ingested
  • Amount of glucose in the yeast according to d) causes the activity of the GLUT4V85M protein to be stimulated.
  • the activity of the GLUT4V85M Stimulate proteins is believed to also stimulate GLUT4 activity.
  • the invention also relates to a medicament which contains a compound which has been identified by the method described above, and furthermore additives and auxiliaries for the formulation of a medicament.
  • the invention further relates to the use of a compound which has been identified by the method described above for the manufacture of a medicament for the treatment of type I and / or II diabetes.
  • the invention also relates to a medicament containing a compound which has been identified by the method described above, and additives and auxiliaries for formulating a medicament.
  • the invention further relates to the use of a compound which has been identified by the method described above for the production of a medicament for the treatment of diabetes.
  • the invention further relates to the use of a compound which has been identified by a method described above for the production of a medicament for the treatment of diabetes.
  • the present invention also includes a method for identifying a compound which has been identified by a method described above for the production of a medicament for the treatment of diabetes.
  • the present invention also includes a method for identifying a compound which has been identified by a method described above for the production of a medicament for the treatment of diabetes.
  • the present invention also includes a method for identifying a
  • Yeast cell can be replicated, b) a chemical compound is provided, c) the yeast from a) is brought into contact with the chemical compound from b), d) the glucose uptake of the yeast from c) is determined, e) the value determined Glucose uptake from d) is related to the determined value of glucose uptake in a yeast cell according to a), which is not brought into contact with a chemical compound according to b) was, wherein a compound that causes an increase in the amount of glucose in the yeast according to d) inhibits the activity of the protein Erg4.
  • the invention further relates to a method for identifying a compound which inhibits the corresponding protein of the FGY1 gene, characterized in that a) a yeast cell is provided, the glucose transporters and the Erg4 protein of which are no longer functional and which contains a GLUT4 protein , is provided, b) a chemical compound is provided, c) the yeast from a) is brought into contact with the chemical compound from b), d) the glucose uptake of the yeast from c) is determined, e) the determined value of the glucose uptake from d) is related to the determined value of the glucose uptake in a yeast cell according to a) which has not been brought into contact with a chemical compound according to b), a compound which shows an increase in the amount of glucose taken up in the yeast according to d ) causes the activity of the protein Fgy1 to be inhibited.
  • the invention also relates to a medicament containing a compound which was identified by the method described above, and additives and auxiliaries for the formulation of a medicament.
  • Hybridization means the assembly of two nucleic acid single strands that have complementary base sequences into double strands. Hybridization can take place between two DNA strands, one DNA and one RNA strand, and between two RNA strands.
  • hybrid molecules can be produced by heating the nucleic acids involved, which may initially be double-stranded, to such an extent that they become single-stranded molecules without Secondary structure decay. This is done, for example, by boiling in a water bath for 10 minutes. Then let them cool slowly. During the cooling phase, complementary chains are paired to form double-stranded hybrid molecules.
  • Hybridizations are usually carried out under laboratory conditions with the aid of hybridization filters onto which single-stranded or denaturable polynucleotide molecules are applied by blotting or electrophoresis.
  • the hybridization can be made visible with corresponding complementary polynucleotide molecules by providing these polynucleotide molecules to be hybridized with a radioactive fluorescent label.
  • Stringency describes the degree of agreement or accuracy of fit of certain conditions. With high stringency, the requirements for agreement are higher than with low stringency.
  • certain, differently stringent conditions are set depending on the application and the objective. In the case of high stringency, the reaction conditions in the hybridization are set such that only complementary molecules that match very well can hybridize with one another. Low stringency also enables partial hybridization of molecules with more or less large sections of unpaired or mismatched bases.
  • hybridization conditions should be understood as stringent, in particular if the hybridization is carried out in an aqueous solution containing 2x SSC at 68 ° C. for at least 2 hours and then first for 5 minutes in 2x SSC / 0.1% SDS at room temperature, then for 1 hour in 1x SSC / 0.1% SDS at 68 ° C and for 1 additional hour in 0.2% SSC / 0.1% SDS at 68 ° C.
  • a 2x SSC, 1x SSC or 0.2x SSC solution is prepared by diluting a 20x SSC solution.
  • a 20x SSC solution contains 3 mol / l NaCl and 0.3 mol / l Na citrate.
  • the pH is 7.0.
  • the skilled worker is familiar with the methods for hybridizing polynucleotides under stringent conditions. He finds corresponding instructions in specialist books, in particular the Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience; editor: Frederich M. Ausubel, Roger Brant, Robert E. Scientific, David J. Moore, JG Seidmann, Kevin Struhl; ISBN: 0-471 -50338-X).
  • Ylp vectors Yeast integrating plasmids
  • yeast vectors essentially correspond to the vectors used for cloning in bacteria, but contain a selectable yeast gene (eg URA3, LEU2).
  • plasmids are derived that can replicate autonomously due to eukaryotic ORIs (origin of replication).
  • yeast vectors are called YRp vectors (Yeast replicating plasmids) or ARS vectors (autonomously replicating sequence).
  • YEp vectors Yeast episonal plasmids
  • the class of YAC vectors (Yeast Artifical Chromosome) behaves like independent chromosomes.
  • a yeast vector containing a gene for expression so that it can be expressed is introduced into the yeast by transformation. Methods such as electroporation or the incubation of competent cells by vector DNA are suitable for this.
  • Suitable yeast expression promoters are known to those skilled in the art. Examples include the SOD1 promoter (superoxide dismutase), ADH promoter (alcohol dehydrogenase), the promoter for the acid phosphatase gene, HXT2 promoter (glucose transporter 2), HXT7 promoter (glucose transporter 7), GAL2 promoter (galactose transporter) and other.
  • the construct consisting of an expression promoter of a yeast and a gene for expression (e.g.
  • GLUT4V85M is part of a yeast vector for the purpose of expression.
  • this yeast vector can be present as a self-replicating particle independent of the genome of the yeast or can be stably integrated into the genome of the yeast.
  • anyone is suitable as a yeast vector Polynucleotide sequence that can be propagated in a yeast.
  • yeast plasmids or artificial yeast chromosomes can be used as yeast vectors.
  • Yeast vectors generally contain an "origin of replication" (2 ⁇ , ars) for the initiation of replication and a selection marker which usually consists of an auxotrophy marker or an antibiotic resistance gene.
  • pBM272, pCS19, pEMBCYe23, pFL26 are known to a person skilled in the art.
  • the selection of a cell in the sense of this invention is to be understood as its targeted enrichment on the basis of a selection marker, for example resistance to an antibiotic or the ability to grow on a certain minimal medium, and furthermore its isolation and subsequent cultivation on an agar plate or in submerged culture.
  • a selection marker for example resistance to an antibiotic or the ability to grow on a certain minimal medium, and furthermore its isolation and subsequent cultivation on an agar plate or in submerged culture.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae 17 hexose transporters and an additional three maltose transporters are known which, if they are expressed sufficiently enough, are able to transport hexoses into the yeast.
  • a strain is known from which all transporters which are suitable for taking up hexose have been removed by deletion. This strain only contains the two genes MPH2 and MPH3, which are homologous to maltose transport proteins. The two genes MPH2 and MPH3 are repressed in the presence of glucose in the medium. Manufacture and Characterization of this yeast strain is in Wieczorke et all, FEBS Lett. 464, 123-128 (1999).
  • This strain is unable to multiply on a substrate with glucose as the only source of carbon. From this strain, mutants can be selected which functionally express GLUT1 starting from a corresponding vector (strain hxt fgy1-1). If a plasmid vector which carries a GLUT4 gene under the control of a yeast promoter is transformed into the yeast strain hxt fgy1-1, very little glucose is nevertheless transported. The functional expression of GLUT4 requires further adjustments to this yeast strain in order to enable significant glucose transport using GLUT4. Such yeast strains, which take up glucose in cells by means of a single glucose transporter GLUT4, can be isolated on substrates with glucose as the only carbon source.
  • a yeast strain hxt fgy1-1 which carries a GLUT4 gene under the functional control of a yeast promoter, is transformed.
  • These yeast cells transformed in this way are placed on a nutrient medium which contains glucose as the sole carbon source and are incubated thereon. After a few days of incubation at, for example, 30 ° C., growth of individual colonies is observed. One of these colonies is isolated. If the yeast plasmid is removed from this colony, it does not multiply on the nutrient medium with glucose as the only source of carbon.
  • this strain is in turn able to concentrate on a medium with glucose as the only carbon source multiply.
  • yeast strains are the subject of international application PCT / EP02 / 01373 with the date of the application of February 9, 2002, which claims the priority of DE 10106718.6 of February 14, 2002.
  • Yeast strains all of which own transporters for hexoses (glucose transporters) are no longer functional, are used in the German Collection of
  • DSMZ Microorganisms and cell cultures GmbH
  • polynucleotide and amino acid sequences for GLUT4 are accessible, for example, via the following entries in Genbank: M20747 (cDNA; human), EMBL: D28561 (cDNA; rat), EMBL: M23382 (cDNA; mouse), Swissprot: P14672 (protein; human), Swissprot: P19357 (protein; rat) and Swissprot: P14142 (protein; mouse).
  • EMBL M20653 (cDNA; human), EMBL: M 13979 (cDNA; rat), EMBL: M23384 (cDNA; mouse), Swissprot: P11166 (protein ; Human), Swissprot: P11167 (protein; rat) and Swissprot: P17809 (protein; mouse).
  • Medicines are dosage forms of pharmacologically active substances for the treatment of diseases or physical malfunctions in humans and animals.
  • oral therapy for example, powders, granules, tablets, pills, lozenges, coated tablets, capsules, liquid extracts, tinctures, syrups are known.
  • aerosols, sprays, gels, ointments or powders are used.
  • Parenteral use is possible with injection or infusion solutions with ampoules, bottles or spray ampoules.
  • These and other medicinal products are known to those skilled in pharmaceutical technology (Galenics).
  • auxiliaries for the formulation of a drug enable the preparation of the active substance with the aim of enabling the active ingredient to be applied, distributed and developed in an optimal manner for the particular application.
  • auxiliaries are, for example, fillers, binders, disintegrants, or lubricants such as lactose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose, starch, dicalcium phosphate, polyglycols, alginates, polyvinylpyrrolidone, carboxymethyl cellulose, talc or silicon dioxide.
  • Diabetes or diabetes is manifested by the excretion of glucose in the urine when there is an abnormal increase in blood glucose (hyperglycaemia) due to a chronic metabolic disorder due to a lack of insulin or a reduced insulin effect.
  • the lack of or reduced insulin action leads to deficient absorption and utilization of the glucose absorbed into the blood by the body cells.
  • lipolysis increases in the adipose tissue with an increase in the free fatty acids in the blood.
  • Obesity is an abnormal weight gain due to a disturbed energy balance due to excessive calorie intake, which involves a health risk.
  • the amount of a hexose which is taken up by a yeast strain provided as described above can be determined by means of intake studies with radioactively labeled glucose.
  • a certain concentration of the yeast cells for example an amount of 60 mg wet weight per ml, is suspended in, for example, 100 ⁇ l of a buffer and a defined amount of ⁇ C- or 3H-labeled glucose is added as the only carbon source.
  • the cells are incubated and defined amounts of the cells are removed at certain times.
  • the amount of glucose consumed is determined using LSC (Liquid Scintillation Counting).
  • the determination of the amount of a hexose which is taken up by a yeast strain provided as just described can also be carried out by means of a growth test on media with glucose as the sole carbon source.
  • the growth rate of the strain after adding the compound is determined, for example, by regular measurements of the optical density of the culture at 600 nm and this value is compared to the growth rate of a control strain (e.g. wild-type yeast strain).
  • a compound is provided in particular by chemical synthesis or isolation of chemical substances from biological organisms.
  • the chemical Synthesis can also be automated.
  • the compounds obtained by synthesis or isolation can be dissolved in a suitable solvent.
  • suitable solvents are in particular aqueous solutions which contain a certain proportion of an organic solvent such as DMSO (dimethyl sulfoxide).
  • Seq ID No. 1 discloses a polynucleotide sequence comprising the coding region of the protein GLUT4V85M.
  • Seq ID No. 2 discloses the amino acid sequence of the protein GLUT4V85M.
  • Seq ID No. 3 discloses the polynucleotide sequence of the vector p4H7GLUT4V85M.
  • yeast strains described in the present work came from the strain CEN-PK2-1C (MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3- ⁇ 1MAL2-8 c SUC2).
  • the production of a yeast strain with deletions in the hexose transporter genes (HXT) was carried out by Wieczorke et al., FEBS Lett.
  • the media was based on 1% yeast extract and 2% peptone (YP), while the minimal media consisted of 0.67% Difco yeast nitrogen-free, non-amino acid (YNB) and additives for Auxotrophy needs as well as different carbon sources included.
  • the yeast cells were grown under aerobic conditions at 30 ° C on a rotary shaker or on agar plates. Cell growth was monitored by measuring the optical density at 600 nm (OD ⁇ D O ) or determining the diameter of the yeast colonies.
  • Glucose transport was measured as the uptake of D- [U- 14 C] glucose (Amersham) and the kinetic parameters were determined from Eadie-Hofstee graphics.
  • the cells were centrifuged, washed with phosphate buffer and resuspended in phosphate buffer at a concentration of 60 mg (wet weight) per ml.
  • the glucose uptake was determined at glucose concentrations between 0.2 and 100 mM, and the specific activity of the substrate ranged between 0.1 and 55.5 kBq ⁇ mol "1.
  • the cells and the glucose solutions were preincubated at 30 ° C.
  • a new heterologous expression system for glucose transporters from mammalian cells has been developed. This system is based on a S. cerevisiae strain from which all endogenous glucose transporters have been removed by destroying the coding genes. This strain is no longer able to absorb glucose via the plasma membrane and to grow with glucose as the only carbon source.
  • the heterologous glucose transporters of humans or others To integrate mammals, GLUT1 and GLUT4, in an active form into the plasma membrane of yeast, additional mutations had to be introduced into the yeast strain.
  • GLUT1 is only active in a fgy1-1 mutant strain, GLUT4 only in fgy1-1 fgy4-X double mutants.
  • the FGY1 gene could be cloned. It is the S. cerevisiae ORF YMR212c. The results show that either Fgy1 or a product produced by Fgy1 inhibits the activity of human glucose transporters or is involved in the fusion of the GLUT-transporting vesicles with the plasma membrane.
  • GLUT4 proteins in yeast are located in intracellular structures.
  • a total of nine recessive mutants could be isolated (fgy4-1 to fgy4-9), in which GLUT4 is now passed on to the plasma membrane and becomes active there with a simultaneous fgy1-1 mutation.
  • This enzyme, the sterol-C-24 (28) - reductase catalyzes the last step of the ergosterol biosynthesis and converts Ergosta-5,7,22,24, (28) -tetraenol into the end product ergosterol.
  • the Erg4 protein probably contains eight transmembrane domains and is located in the endoplasmic reticulum.
  • An erg4 mutant is viable because the incorporation of the ergosterol precursors into the yeast membranes compensates for the loss of ergosterol.
  • the inhibitory influence of Erg4 on the functionality of GLUT4 was confirmed by a targeted erg4 deletion in the hxt fgy1-1 strain.
  • the resulting strain (hxt fgy1-1 ⁇ erg4) was designated SDY022.
  • Table 3 shows the description of the yeast strains deposited in connection with this patent application at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) - Mascheroder Weg 1 b 38124 Braunschweig. Table: Growth of GLUT1 and GLUT4 transformants on glucose medium
  • Table 2 Growth of GLUT1 and GLUT4 transformants on glucose medium with and without ergosterol under anaerobic conditions
  • Table 3 Characteristics of the deposited yeast strains (Saccharomyces cerevisiae)
  • Base medium 0.67% Yeast Nitrogen Base without amino acids (Difco); pH 6.2. Supplementation of auxotrophies: leucine (0.44 mM), tryptophan (0.19 mM), histidine (0.25 mM9, uracil (0.44 mM). Maltose can be used between 1-2%.
  • This international depository accepts the microorganism designated under 1, which it received on 2002-09-03 (date of first deposit) 1 .
  • microorganism referred to under I was received by this International Depository on (date of first filing) and an application for the conversion of this first filing into a deposit under the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the request for conversion).
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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Hefestämme, in denen ein humaner GLUT4 Transporter oder ein humaner GLUT1 Transporter funktional zur Expression gebracht werden kann sowie auf bestimmte GLUT4 Transportproteine, die in Hefestämmen besonders einfach funktional exprimiert werden können.

Description

Verwendung von Saccharomyces cerevisiae erg4-Mutanten zur Expression von Glukosetransportern aus Säugetieren.
Die Erfindung betrifft Hefestämme, in denen der humane Glut 4 und Glut 1 Transporter funktioneil zur Expression gebracht werden kann.
Die meisten heterotrophen Zellen transportieren Glukose über spezielle Transporterproteine ins Zellinnere. Bei den verschiedenen Organismen haben sich unterschiedliche Mechanismen herausgebildet, die den Glukosetransport vermitteln, wie insbesondere Protonen-Symportsysteme, Na+-Glukosetransporter, bindungsproteinabhängige Systeme, Phosphotransferasesysteme sowie Systeme für die erleichterte Diffusion. Bei den Eukaryoten vermittelt eine Familie von Glukosetransportern, die bei Säugetieren von den GLUT-Genen (GLUT = Glucosetransporter) und bei Saccharomyces cerevisiae von den HXT-Genen (HXT = Hexosetransporter) codiert werden, die Glukoseaufnahme über erleichterte Diffusion. Diese Transporter zählen zu einer größeren Familie von Zuckertransportern. Sie sind durch das Vorliegen von 12 transmembranen Helices und durch mehrere konservierte Aminosäurereste gekennzeichnet. Der Glukosetransport spielt bei Krankheiten, die mit einer defekten Glukosehomöostase assoziiert sind, wie zum Beispiel Diabetes mellitus oder Fanconi- Bickel-Syndrom, eine große Rolle. Der Glukosetransport bei Säugetieren war deshalb Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind dreizehn Glukosetransporter-ähnliche Proteine (GLUT1 bis GLUT12, HMIT - H-myo- Inositol-Transporter)) identifiziert worden. Zu den Schlüsselrollen dieser Transporter zählen die Aufnahme von Glukose in verschiedene Gewebe, ihre Speicherung in der Leber, ihre insulinabhängige Aufnahme in die Muskelzellen und Adipozyten sowie die Glukose-Messung durch die ß-Zellen des Pankreas.
GLUT1 vermittelt den Glukosetransport in die Erythrozyten und durch die Blut-Hirn- Schranke, wird jedoch auch in vielen anderen Geweben exprimiert, während GLUT4 auf insulinabhängige Gewebe, in erster Linie auf Muskel- und Fettgewebe beschränkt ist. Bei diesen insulinabhängigen Geweben stellt die Kontrolle des Targetings von GLUT4-Transportern in intrazelluläre Kompartimente oder Plasmamembrankompartimente einen wichtigen Mechanismus für die Regulierung der Glukoseaufnahme dar. In Gegenwart von Insulin wird intrazelluläres GLUT4 auf die Plasmamembran zurückverteilt, um die Glukoseaufnahme zu erleichtern. GLUT1 wird in diesen insulinabhängigen Geweben ebenfalls exprimiert, und seine Verteilung in der Zelle wird ebenfalls von Insulin beeinflusst, jedoch weniger stark. Darüber hinaus wird die relative Wirksamkeit, mit der GLUT1 oder GLUT4 den Zuckertransport katalysieren, nicht nur von dem Ausmaß des Targetings jedes Transporters an die Zelloberfläche bestimmt, sondern auch von ihren kinetischen Eigenschaften.
Die Tatsache, dass unterschiedliche Glukosetransporter-Isoformen koexprimiert werden sowie der rasche Glukosemetabolismus hat Untersuchungen bezüglich der Rolle und der genauen Eigenschaften jeder Glukosetransporter-Isoform in diesen insulinabhängigen Geweben kompliziert gestaltet. Um diese Probleme zu lösen, wurden heterologe Expressionssysteme wie Xenopus-Oozyten, Gewebekulturzellen, Insektenzellen und Hefezellen verwendet. Es stellte sich jedoch heraus, dass eine Reihe von Schwierigkeiten bei diesen Systemen auftraten: zu schwache Aktivität der heterolog exprimierten Transporter, eigene Glukosetransporter bei diesen Systemen, die intrazelluläre Retention eines beträchtlichen Teils der Transporter, oder sogar die Produktion inaktiver Transporter.
Natürlich vorkommendes GLUT4 Protein von Säugetieren insbesondere dasjenige des Menschen kann in Stämmen von Saccharomyces cerevisiae unter bestimmten Bedingungen in funktioneller Weise zur Expression gebracht werden. Hefezellen sind einzellige eukaryotische Organismen. Sie eignen sich deshalb für manche Proteine besser zur Expression als bakterielle Systeme, insbesondere im Hinblick auf die Durchführung von Screeningassays zur Identifizierung von pharmazeutisch aktiven Substanzen.
Vorliegende Erfindung betrifft ein gereinigtes und isoliertes Polynukleotid umfassend eine DNA Sequenz, welche für das GLUT4V85M Protein codiert.
Dieses Protein enthält an Position 85 der Aminosäurekette des humanen GLUT4 Proteins einen Aminosäureaustausch von Valin nach Methionin. Dieses veränderte GLUT4V85M Protein eröffnet weitere Alternativen zur Expression eines funktioneilen GLUT4 Proteins. Ein GLUT4 Protein soll in Zusammenhang mit Saccharomyces cerevisiae als funktionell angesehen werden, wenn in einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae, dessen sämtliche Glukosetransporter inaktiv sind (=hxt(-)) nach Expression dieses GLUT4 Proteins eine Glukoseaufnahme zu beobachten ist. Die Glukoseaufnahme kann entweder durch Transportmessungen mittels radioaktiv markierter Glukose oder durch Wachstum auf Medium mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle festgestellt werden.
Das gereinigte und isolierte Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert, kann in einer bevorzugten Ausführungsform eine Sequenz der folgenden Gruppen umfassen oder aus ihr bestehen: a) eine Nukleotidsequenz, gemäß Seq ID Nr. 1 , b) eine Nukleotidsequenz, welche unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz der Seq ID Nr.1 hybridisiert und die für ein Protein GLUT4V85M kodiert.
Das gereinigte und isolierte Polynukleotid kodiert bevorzugt ein GLU4V85M Protein, welches eine Aminosäuresequenz der Seq ID Nr. 2 aufweist.
Das gereinigte und isolierte Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M wie vorstehend beschrieben kodiert, kann in operativer Weise mit einem Promotor verbunden sein. Als Promotor kommen insbesondere prokaryotische oder eukaryotische Promotoren wie beispielsweise der Lac-, trp-, ADH- oder HXT7-Promotor in Frage. Der für das Protein GLUT4V85M kodierende Teil des Polynukleotids ist genau dann in operativer Weise mit einem Promotor verbunden, wenn mittels dieses Promotors unter Zuhilfenahme eines Vektors in einem bakteriellen oder eukaryotischen Organismus eine mRNA gebildet wird, welche in das Protein GLUT4V85M translatiert werden kann. Ein solcher Vektor ist beispielsweise der Vektor p4H7GLUT4V85M (Seq ID Nr. 3). Das Protein GLUT4V85M kann mittels diesen Vektors in Hefezellen exprimiert werden. Vorstehend beschriebenes Polynukleotid umfassend eine DNA Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert, eignet sich in einer bevorzugten Ausführungsform zur Replikation dieses Polynukleotids in einer Hefezelle oder zur Ausprägung des für das Protein GLUT4V85M kodierenden Teils des Polynukleotides in das Protein GLUT 4 V85M in einer Hefezelle. Als Hefezelle eignet sich insbesondere eine aus Saccharomyces cerevisiae. Zur Replikation und Expression in einer Hefezelle liegt das Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert, als Hefevektor vor. Der für das Protein GLUT4V85M kodierende Bereich des Polynukleotids kann in operativer Weise mit einem für Hefezellen spezifischen Promotor wie beispielsweise dem ADH-Promotor (Alkohol-Dehydrogenase-Promotor) oder HXT7-Promotor (Hexosetransporter-Promotor) verbunden sein. Bei den Hefevektoren handelt es sich um eine Gruppe von Vektoren, die zur Klonierung von DNA in Hefen entwickelt wurde.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Hefezelle aus Saccharomyces cerevisiae, in welcher sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktioneil sind (=hxt (-)) und in welcher kein funktionelles Erg4 Protein enthalten ist. Bei einer solchen Hefezelle handelt es sich bevorzugt um eine wie bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 16, 38124 Braunschweig) als Saccharomyces cerevisiae DSM 15187 hinterlegte Hefezelle.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Hefezelle, in der sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind und in der kein funktionelles Fgy1 Protein und kein funktionelles Erg4 Protein enthalten ist. Das Fehlen eines Erg4 Proteins oder eines Fgy1 Proteins kann insbesondere auf eine Unterbrechung der betreffenden kodierenden Genomabschnitte oder auf teilweise oder vollständige Entfernung der kodierenden Genomabschnitte zurückzuführen sein. Als Hefezelle, welche keine funktioneilen Glukosetransporter, kein funktionelles Fgy1 Protein und kein funktionelles Erg4 Protein enthält, wird bevorzugt eine wie bei der DSMZ als Saccharomyces cerevisiae DSM 15184 hinterlegte Hefezelle verwendet. Eine wie vorstehend beschriebene Hefezelle wird bevorzugt zur Ausprägung (=Expression) eines GLUT1 Proteins oder eines GLUT4 Proteins eines Säugetieres, wie insbesondere von Ratte, Maus, Kaninchen, Schwein, Rind oder Menschenaffen verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Hefezelle zur Ausprägung eines menschlichen GLUT4 oder GLUT1 Proteins verwendet. Eine Hefezelle aus Saccharomyces cerevisiae deren sämtliche Glukosetransporter sowie das Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind, kann ein Polynukleotid dieser Erfindung enthalten, welches eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert. Diese Hefezelle kann das Protein GLUT4V85M auch zur Expression bringen und damit dieses Protein enthalten. Ein solcher Hefestamm enthaltend ein Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst, ist bevorzugt der bei der DSMZ hinterlegte Hefestamm Saccharomyces cerevisiae DSM 15185. Eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie das Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind, welche ein Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert, enthält, kann beispielsweise hergestellt werden, indem a) eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie das Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind, bereitgestellt wird, b) ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst und in einer Hefezelle repliziert werden kann, bereitgestellt wird, c) die Hefezelle aus a) mit dem Polynukleotid aus b) transformiert wird, d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird, e) gegebenenfalls das Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.
Ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst, ist bevorzugt ein in einer Hefezelle replizierbarer Vektor, in welchem die DNA-Sequenz Moniert wurde. Ein solcher Vektor ist beispielsweise p4H7GLUT4V85M (Seq ID Nr. 3).
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie deren Proteine für Fgy1 und Erg4 nicht mehr funktionell sind und die ein Polynukleotid enthält, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst. Diese Hefezelle kann das Protein GLUT4V85M auch zur Expression bringen und damit dieses Protein enthalten. Ein solcher Hefestamm ist bevorzugt der bei der DSMZ hinterlegte Hefestamm Saccharomyces cerevisiae DSM 15186.
Eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie die Proteine Fgy1 sowie Erg4 nicht mehr funktionell sind und die ein Polynukleotid umfassend eine DNA- Sequenz, welche für das Protein GLUT4V85M kodiert, enthält, kann beispielsweise hergestellt werden, indem a) eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter sowie die Proteine Fgy1 sowie Erg4 nicht mehr funktionell sind, bereitgestellt wird, b) ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst und in einer Hefezelle repliziert werden kann, bereitgestellt wird, c) die Hefezelle aus a) mit dem Polynukleotid aus b) transformiert wird, d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird, e) gegebenenfalls das Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.
Das vorstehend genannte isolierte und gereinigte Polynukleotid, welches eine DNA- Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst, ist bevorzugt ein in einer Hefezelle replizierbarer Vektor, in welchem die DNA-Sequenz kloniert wurde. Ein solcher Vektor ist beispielsweise p4H7GLUT4V85M (Seq ID Nr. 3).
Die Erfindung betrifft auch eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind, welche ein Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, die für das Protein GLUT4V85M kodiert, enthält. Diese Hefezelle kann das Protein GLUT4V85M auch zur Expression bringen und damit dieses Protein enthalten. Ein solcher Hefestamm ist bevorzugt der bei der DSMZ hinterlegte Hefestamm Saccharomyces cerevisiae 15188.
Eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind und die ein Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, die für das Protein GLUT4 V85M kodiert, enthält, kann beispielsweise hergestellt werden, indem a) eine Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind, bereitgestellt wird, b) ein isoliertes und gereinigtes Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst und in einer Hefezelle repliziert werden kann, bereitgestellt wird, c) die Hefezelle aus a) mit dem Polynukleotid aus b) transformiert wird, d) eine transformierte Hefezelle selektiert, e) gegebenenfalls das Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.
Bei dem vorstehend genannten isolierten und gereinigten Polynukleotid, welches eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein GLUT4V85M umfasst, handelt es sich bevorzugt um einen in einer Hefezelle replizierbaren Vektor, in welchem die DNA- Sequenz kloniert wurde. Ein solcher Vektor ist beispielsweise p4H7GLUT4V85M (Seq ID Nr. 3). Die Erfindung betrifft auch ein Protein der Aminosäuresequenz gemäß Seq ID Nr. 2. Dieses Protein ist ein humanes GLUT4 Protein, in welchem an Position 85 der Aminosäurekette ein Valin durch ein Methionin ausgetauscht ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität eines GLUT4 Proteins stimuliert, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle bereitgestellt wird, deren sämtliche Glukosetransporter sowie das Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind, und die ein Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, die für ein Protein GLUT4V85M kodiert, enthält, b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird, d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird, e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Vergrößerung der aufgenommenen
Glukosemenge in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des GLUT4V85M Proteins stimuliert. Von Verbindungen, welche die Aktivität des GLUT4V85M Proteins stimulieren, ist anzunehmen, dass sie auch die Aktivität von GLUT4 stimulieren.
Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, welches eine Verbindung, die durch vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde, enthält sowie weiterhin Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung, die durch vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes Typ I und/oder II.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, welche durch vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung, welche durch vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung einer Verbindung, welche durch ein vorstehend beschriebenes Verfahren identifiziert wurde zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes. Vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Identifizierung einer
Verbindung, welche das Protein, das durch das Erg4 Gen kodiert ist, inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle bereitgestellt wird, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind und die ein Polynukleotid enthält, welches eine DNA- Sequenz umfasst, die für das Protein GLUT4V85M kodiert und in einer
Hefezelle repliziert werden kann, b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird, d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird, e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Erhöhung der aufgenommenen Menge an Glukose in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des Proteins Erg4 inhibiert.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche das korrespondierende Protein des FGY1 Gens inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle bereitgestellt wird, deren sämtliche Glukosetransporter und deren Erg4 Protein nicht mehr funktionell sind und welche ein GLUT4 Protein enthält, bereitgestellt wird, b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird, d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird, e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Erhöhung der aufgenommenen Menge an Glukose in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des Proteins Fgy1 inhibiert.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, welche durch das vorstehend beschriebene Verfahren identifiziert wurde, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
Die Erfindung wird im folgenden bezüglich technischer Einzelheiten näher erörtert.
Hybridisierung bedeutet die Zusammenlagerung zweier Nukleinsäure-Einzelstränge, die komplementäre Basensequenzen besitzen, zu Doppelsträngen. Hybridisierung kann zwischen zwei DNA-Strängen, einem DNA- und einem RNA-Strang sowie zwischen zwei RNA-Strängen erfolgen. Grundsätzlich lassen sich Hybridmoleküle herstellen, indem man die beteiligten Nukleinsäuren, die zunächst doppelsträngig vorliegen können, soweit erhitzt, dass sie in einzelsträngige Moleküle ohne Sekundärstruktur zerfallen. Dies geschieht beispielsweise durch Kochen im Wasserbad für 10 Minuten. Anschließend lässt man sie langsam abkühlen. Während der Abkühlphase erfolgt die Paarung komplementärer Ketten zu doppelsträngigen Hybridmolekülen. Hybridisierungen werden unter Laborbedingungen gewöhnlich unter Zuhilfenahme von Hybridisierungsfiltem durchgeführt, auf weichen einzelsträngige oder denaturierbare Polynukleotidmoleküle durch Blotten oder Elektrophorese aufgebracht werden. Die Hybridisierung kann mit entsprechenden komplementären Polynukleotidmolekülen sichtbar gemacht werden, indem man diese zu hybridisierenden Polynukleotidmoleküle mit einer radioaktiven fluoreszierenden Markierung versieht. Stringenz beschreibt den Grad der Übereinstimmung oder Passgenauigkeit bestimmter Bedingungen. Bei hoher Stringenz sind die Anforderungen an die Übereinstimmung höher als bei niederer Stringenz. Bei der Hybridisierung von Nukleinsäuren werden je nach Anwendung und Zielsetzung bestimmte, unterschiedlich stringente Bedingungen eingestellt. Bei hoher Stringenz sind die Reaktionsbedingungen bei der Hybridisierung so eingestellt, dass nur sehr gut zueinander passende, komplementäre Moleküle miteinander hybridisieren können. Niedere Stringenz ermöglicht auch eine partielle Hybridisierung von Molekülen mit mehr oder weniger großen Abschnitten ungepaarter bzw. fehlgepaarter Basen.
Die Hybridisierungsbedingungen sollten als stringent insbesondere dann verstanden werden, wenn die Hybridisierung in einer wässrigen 2x SSC enthaltenden Lösung bei 68°C für mindestens 2 Stunden erfolgt und anschließend zuerst für 5 Minuten in 2x SSC/0,1 % SDS bei Raumtemperatur, dann 1 Stunde in 1x SSC/0,1 % SDS bei 68 °C und für 1 weitere Stunde in 0,2 % SSC/0,1 % SDS bei 68°C gewaschen wird.
Eine 2x SSC-, 1x SSC bzw. 0,2x SSC-Lösung wird durch entsprechende Verdünnung einer 20x SSC-Lösung hergestellt. Eine 20x SSC-Lösung enthält 3 mol/l NaCI und 0,3 mol/l Na-Citrat. Der pH-Wert beträgt 7,0. Dem Fachmann sind die Methoden für Hybridisierungen von Polynukleotiden unter stringenten Bedingungen vertraut. Er findet entsprechende Anleitungen in Fachbüchern wie insbesondere den Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience; Herausgeber: Frederich M. Ausubel, Roger Brant, Robert E. Kingston, David J. Moore, J. G. Seidmann, Kevin Struhl; ISBN: 0-471 -50338-X).
Bei den Hefevektoren können verschiedene Untergruppen unterschieden werden. Ylp- Vektoren (Yeast integrating plasmids) entsprechen im wesentlichen dem für Klonierungen in Bakterien eingesetzten Vektoren, enthalten aber ein selektierbares Hefe-Gen (z. B. URA3, LEU2).
Nur wenn es nach Einführung dieses Vektors zur Integration der Fremd-DNA in einem Hefe-Chromosom kommt, werden diese Sequenzen zusammen mit dem Chromosom repliziert und bei der Entstehung eines Klon an alle Tochterzellen stabil weitergegeben.
Von diesem Verfahren ausgehend sind Plasmide abgeleitet, die sich aufgrund von eukaryotischen ORIs (origin of replication) autonom replizieren können. Solche Hefevektoren werden YRp-Vektoren (Yeast replicating plasmids) oder ARS-Vektoren (autonomously replicating sequence) genannt. Weiterhin gibt es YEp-Vektoren (Yeast episonal plasmids), die sich von 2μm-Hefeplasmid ableiten und ein selektierbares Markergen enthalten. Die Klasse der YAC-Vektoren (Yeast artifical chromosome) verhält sich wie eigenständige Chromosomen.
Ein Hefevektor enthaltend ein Gen zur Expression wird, damit es zur Expression gebracht werden kann, durch Transformation in die Hefe eingeführt. Dazu eignen sich beispielsweise Methoden wie die Elektroporation oder die Inkubation kompetenter Zellen durch Vektor-DNA. Geeignete Expressionspromotoren der Hefe sind dem Fachmann bekannt. Solche sind beispielsweise der SOD1 -Promotor (Superoxiddismutase), ADH-Promotor (Alkoholdehydrogenase), der Promotor für das Gen der sauren Phosphatase, HXT2-Promotor (Glukosetransporter 2), HXT7-Promotor (Glukosetransporter 7), GAL2-Promotor (Galaktosetransporter) und andere. Das Konstrukt bestehend aus einem Expressionspromotor einer Hefe und einem Gen zur Expression (z. B. GLUT4V85M) ist für den Zweck der Expression Bestandteil eines Hefevektors. Dieser Hefevektor kann zur Durchführung der Expression als selbstreplizierendes Partikel unabhängig vom Genom der Hefe vorliegen oder stabil in das Genom der Hefe integriert sein. Als Hefevektor eignet sich grundsätzlich jede Polynukleotidsequenz, welche in einer Hefe vermehrt werden kann. Als Hefevektoren können insbesondere Hefeplasmide oder künstliche Hefechromosomen (Yeast Artifical Chromosomes) verwendet werden. Hefevektoren enthalten in der Regel einen „origin of replication" (2μ, ars) für die Einleitung der Replikation sowie einen Selektionsmarker, der üblicherweise aus einem Auxotrophiemarker oder einem Antibiotikumresistenzgen besteht. Einem Fachmann als Hefevektoren bekannt sind beispielsweise pBM272, pCS19, pEMBCYe23, pFL26, pG6, pNN414, pTV3, p426MET25, p4H7 oder andere.
Die Selektion einer Zelle im Sinne dieser Erfindung soll deren gezielte Anreicherung aufgrund eines Selektionsmarkers wie beispielsweise der Resistenz gegen ein Antibiotikum oder dem Wachstumsvermögen auf einem bestimmtem Minimalmedium, sowie weiterhin deren Isolierung und anschließende Anzucht auf einer Agarplatte oder in Submerskultur verstanden werden.
Für den Fachmann gehören Anzucht, Transformation und Selektion einer transformierten Hefezelle sowie Expression eines Proteins in einer Hefezelle zu üblicherweise verwendeten Methoden. Er findet Anleitungen hierzu in Standardlehrbüchern wie beispielsweise in „Walker Graeme M.: Yeast Physiology and Biotechnology, Wiley and Sons, ISBN: 0-471-9446-8" oder in „Protein Synthesis and Targeting in Yeast, Ed. Alistair J. P. Brown, Mick F. Fruite and John E. G. Mc Cartly; Springer Berlin; ISBN: 3-540-56521-3 oder in "Methods in Yeast Genetics, 1997: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual; Adams Alison (Edt); Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN: 0-87969-508-0".
Bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae sind 17 Hexosetransporter und zusätzlich drei Maltosetransporter bekannt, die, sofern sie stark genug exprimiert werden, in der Lage sind, Hexosen in die Hefe zu transportieren. Bekannt ist ein Stamm, dem durch Deletion sämtliche Transporter, die zur Hexoseaufnahme geeignet sind, entfernt wurden. Dieser Stamm enthält lediglich noch die beiden Gene MPH2 und MPH3, die zu Maltosetransportproteinen homolog sind. Die beiden Gene MPH2 und MPH3 werden bei Anwesenheit von Glukose im Medium reprimiert. Herstellung und Charakterisierung dieses Hefestammes ist in Wieczorke et all, FEBS Lett. 464, 123 - 128 (1999) beschrieben. Dieser Stamm ist nicht in der Lage, sich auf einem Substrat mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle zu vermehren. Aus diesem Stamm können Mutanten selektiert werden, die ausgehend von einem entsprechenden Vektor GLUT1 funktionell exprimieren (Stamm hxt fgy1-1 ). Transformiert man in den Hefestamm hxt fgy1-1 einen Plasmidvektor, welcher ein GLUT4-Gen unter Kontrolle eines Hefepromotors trägt, wird dennoch nur sehr wenig Glukose transportiert. Die funktionelle Expression von GLUT4 erfordert weitere Anpassungen dieses Hefestammes, um einen signifikanten Glukosetransport mittels GLUT4 zu ermöglichen. Solche Hefestämme, die Glukose mittels eines einzigen Glukosetransporters GLUT4 in Zellen aufnehmen, lassen sich auf Substraten mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle isolieren. Dazu wird ein Hefestamm hxt fgy1-1 , der ein GLUT4-Gen unter funktioneller Kontrolle eines Hefepromotors trägt, transformiert. Diese so transformierten Hefezellen werden auf einem Nährmedium ausgebracht, welches Glukose als einzige Kohlenstoffquelle enthält, und werden darauf inkubiert. Nach einigen Tagen der Inkubation bei beispielsweise 30 °C beobachtet man Wachstum von einzelnen Kolonien. Eine dieser Kolonien wird isoliert. Entfernt man aus dieser Kolonie das Hefeplasmid, unterbleibt die Vermehrung auf dem Nährmedium mit Glukose als einzige Kohlenstoffquelle. Wird diesem Stamm, der nun kein Vektorplasmid mehr enthält, wiederum ein Hefevektor, der ein GLUT4-Gen unter funktioneller Kontrolle eines Hefepromotors trägt, durch Transformation zugeführt, dann ist dieser Stamm wiederum in der Lage, sich auf einem Medium mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle zu vermehren.
Vorstehend genannte Hefestämme sind Gegenstand der internationalen Anmeldung PCT/EP02/01373 mit Tag der Anmeldung vom 9. Februar 2002, welche die Priorität der DE 10106718.6 vom 14. Februar 2002, in Anspruch nimmt.
Hefestämme deren sämtliche eigene Transporter für Hexosen (Glukosetransporter) nicht mehr funktionell sind, werden bei der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) bereits in Zusammenhang mit der internationalen Anmeldung PCT/EP02/01373 zu einem früheren Zeitpunkt unter der Nummer DSM 14035, DSM 14036 oder DSM 14037 hinterlegt.
Die Polynukleotid - und Aminosäuresequenzen für GLUT4 sind zugänglich beispielsweise über folgende Einträge in Genbank: M20747 (cDNA; Mensch), EMBL: D28561 (cDNA;Ratte), EMBL: M23382 (cDNA; Maus), Swissprot: P14672 (Protein; Mensch), Swissprot: P19357 (Protein; Ratte) und Swissprot: P14142 (Protein; Maus).
Polynukleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen für GLUT1 sind offenbart unter den folgenden Code-Nummern der angegebenen Datenbanken: EMBL: M20653 (cDNA; Mensch), EMBL: M 13979 (cDNA;Ratte), EMBL: M23384 (cDNA; Maus), Swissprot: P11166 (Protein; Mensch), Swissprot: P11167 (Protein; Ratte) und Swissprot: P17809 (Protein; Maus).
Arzneimittel sind Darreichungsformen pharmakologisch aktiver Substanzen zur Therapie von Krankheiten oder körperlicher Fehlfunktionen bei Mensch und Tier. Für die orale Therapie kennt man beispielsweise Pulver, Granulate, Tabletten Pillen, Pastillen, Dragees, Kapseln, flüssige Extrakte, Tinkturen, Sirup. Für eine äußerliche Anwendung verwendet man beispielsweise Aerosole, Sprays, Gele, Salben oder Puder. Eine parenterale Anwendung ist möglich mit Injektions- oder Infusionslösungen mit Ampullen, Flaschen oder Spritzampullen. Dem Fachmann der pharmazeutischen Technologie (Galenik) sind diese und andere Arzneimittel bekannt.
Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels ermöglichen die Zubereitung der wirksamen Substanz mit dem Ziel, eine auf die jeweilige Anwendung optimal abgestimmte Ausbringung, Verteilung und Entfaltung des Wirkstoffes zu ermöglichen. Solche Hilfsstoffe sind beispielsweise Füll-, Binde-, Spreng-, oder Gleitmittel wie Lactose, Saccharose, Mannit, Sorbit, Cellulose, Stärke, Dicalciumphosphat, Polyglykole, Alginate, Polyvinylpyrrolidon, Carboxymethylcellulose, Talkum oder Siliciumdioxid. Diabetes oder Zuckerkrankheit äußert sich durch Ausscheidung von Glukose mit dem Harn bei krankhafter Erhöhung des Blutglukosespiegels (Hyperglycämie) aufgrund einer chronischen Stoffwechselstörung, die auf Mangel an Insulin oder herabgesetzter Insulinwirkung beruht. Die fehlende oder reduzierte Insulinwirkung führt zu mangelhafter Resorption und Verwertung der ins Blut aufgenommenen Glukose durch die Körperzellen. Im Fettgewebe kommt es unter der Einwirkung Insulinantagonistischer Hormone zu gesteigerten Lipolyse mit Erhöhung der freien Fettsäuren im Blut.
Bei der Fettleibigkeit (Adipositas, Obesitas) handelt es sich um abnorme Gewichtszunahme aufgrund einer gestörten Energiebilanz durch übermäßige Kalorienaufnahme, die ein Gesundheitsrisiko beinhaltet.
Die Bestimmung der Menge einer Hexose, die von einem wie eben vorstehend beschriebenen bereitgestellten Hefestamm aufgenommen wird, kann mittels Aufnahmestudien mit radioaktiv markierter Glukose erfolgen. Dazu wird eine bestimmte Konzentration der Hefezellen beispielsweise eine Menge von 60 mg Nassgewicht pro ml in beispielsweise 100 μl eines Puffers suspendiert und mit einer definierten Menge von ^C- oder 3H- markierter Glukose als einzige Kohlenstoffquelle versetzt. Man inkubiert die Zellen und entnimmt zu bestimmten Zeiten definierte Mengen der Zellen. Die Bestimmung der aufgenommenen Menge an Glukose erfolgt mit Hilfe von LSC (Liquid Scintillation Counting = Flüssig-Szintillationszählung). Die Bestimmung der Menge einer Hexose, die von einem wie eben vorstehend beschriebenen bereitgestellten Hefestamm aufgenommen wird, kann aber auch mittels Wachstumstest auf Medien mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle erfolgen. Dazu bestimmt man die Wachstumsrate des Stammes nach Zugabe der Verbindung beispielsweise durch regelmäßige Messungen der optischen Dichte der Kultur bei 600 nm und vergleicht diesen Wert mit der Wachstumsrate eines Kontrollstammes (z. B. Wildtyphefestamm).
Die Bereitstellung einer Verbindung erfolgt insbesondere durch chemische Synthese oder Isolierung chemischer Stoffe aus biologischen Organismen. Die chemische Synthese kann auch automatisiert erfolgen. Die durch Synthese oder Isolierung gewonnenen Verbindungen können in einem geeigneten Lösungsmittel in Lösung gebracht werden. Geeignete Lösungsmittel sind insbesondere wässrige Lösungen, welche einen bestimmten Anteil eines organischen Lösungsmittels wie zum Beispiel DMSO (Dimethylsulfoxid) enthalten.
Das In-Kontakt-Bringen eines Stammes der Hefe mit einer Verbindung zur Identifizierung einer Verbindung im Sinne einer vorstehend genannten Erfindung, erfolgt insbesondere in dafür vorgesehenen Vorrichtungen eines Laborroboters. Solche Vorrichtungen können aus speziell präparierten Kammern mit Vertiefungen, aus Mikrotiterplatten, Eppendorfgefäßen oder Laborgläsern bestehen. Laborroboter sind in aller Regel auf hohe Durchsatzraten konzipiert. Ein Verfahren wie das vorstehend genannte ausgeführt mit Hilfe eines Laborroboters wird deshalb auch HTS (High Throughput Screening) genannt. Die Seq ID Nr. 1 offenbart eine Polynucleotidsequenz umfassend den codierenden bereich des Proteins GLUT4V85M. Die Seq ID Nr. 2 offenbart die Aminosäuresequenz des Proteins GLUT4V85M. Die Seq ID Nr. 3 offenbart die Polynucleotidsequenz des Vektors p4H7GLUT4V85M.
Beispiele
Verwendung der Hefestämme
Alle in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Hefestämme stammten vom Stamm CEN-PK2-1C (MATa leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1MAL2-8c SUC2) ab. Die Herstellung eines Hefestammes mit Deletionen in den Hexose-Transportergenen (HXT) wurde von Wieczorke et al., FEBS Lett. 464, 123 - 128 (1999) beschrieben: EBY-18ga (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagtl ΔstM leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8C SUC2), EBY.VW4000 (MATa Δhxt1-17 Δgal2 Δagtl Δmph2 Δmph3 ΔstM leu2-3, 112 ura3-52 trp1-289 his3-Δ1 MAL2-8C SUC2). Die Medien beruhten auf 1 % Hefeextrakt und 2 % Pepton (YP), während die Minimalmedien aus 0,67 % Difco-Hefe- Stickstoffbasis ohne Aminosäuren (YNB) bestanden und Zusätze für Auxotrophiebedürfnisse sowie unterschiedliche Kohlenstoffquellen enthielten. Die Hefezellen wurden unter aerobischen Bedingungen bei 30°C auf einem Rundschüttler oder auf Agarplatten gezüchtet. Das Zellwachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm (ODÖDO) oder Bestimmung des Durchmessers der Hefekolonien verfolgt.
Bestimmung der Glukoseaufnahme
Der Glukosetransport wurde als Aufnahme von D-[U-14C]-Glukose (Amersham) gemessen und die Kinetikparameter wurden aus Eadie-Hofstee-Graphiken bestimmt. Die Zellen wurden abzentrifugiert, mit Phosphatpuffer gewaschen und wieder in Phosphatpuffer in einer Konzentration von 60 mg (Nassgewicht) pro ml suspendiert. Die Glukoseaufnahme wurde bei Glukosezentrationen zwischen 0,2 und 100 mM bestimmt, und die spezifische Aktivität des Substrats bewegte sich zwischen 0,1 und 55,5 kBq μmol"1. Die Zellen und die Glukoselösungen wurden 5 Minuten bei 30°C vorinkubiert. Die Glukoseaufnahme wurde durch Versetzen der Zellen mit radioaktiver Glukose gestartet. Nachdem 5 Sekunden lang inkubiert worden war, versetzte man mit 10 ml eiskaltem Stoppuffer (0,1 M KiPO4) pH 6,5, 500 mM Glukose) und die Zellen wurden rasch auf Glasfaserfiltern (0 = 24 mm, Whatman) abgefiltert. Die Filter wurden dreimal rasch mit eiskaltem Puffer gewaschen und die eingebaute Radioaktivität wurde mit einem Flüssigkeits-Szintillationszähler gemessen. Die Hemmung durch Cytochalasin B (Endkonzentraion 20μM, gelöst in Ethanol) wurde in einem 15- Sekunden-Aufnahmetest mit 50 mM bzw. 100 mM radioaktiver Glukose gemessen, nachdem die Zelle 15 Minuten lang in Gegenwart des Hemmstoffs oder nur des Lösungsmittels inkubiert worden war.
Es wurde ein neues heterologes Expressionsystem für Glukosetransporter aus Säugetierzellen entwickelt. Dieses System basiert auf einem S. cerevisiae-Stamm, dem alle endogenen Glukosetransporter durch Zerstörung der kodierenden Gene entfernt wurden. Dieser Stamm ist nicht mehr in der Lage, Glukose über die Plasmamembran aufzunehmen und mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. Um die heterologen Glukosetransporter des Menschen oder aus anderen Säugetieren, GLUT1 und GLUT4, in einer aktiven Form in die Plasmamembran der Hefe zu integrieren, mussten zusätzliche Mutationen in den Hefestamm eingefügt werden. GLUT1 ist nur in einem fgy1-1 Mutantenstamm aktiv, GLUT4 nur in fgy1-1 fgy4-X Doppelmutanten.
Das FGY1-Gen konnte kloniert werden. Es handelt sich dabei um den S. cerevisiae ORF YMR212c. Aufgrund der Ergebnisse ergibt sich für die Funktion, dass entweder Fgy1 oder ein von Fgy1 erzeugtes Produkt die Aktivität menschlicher Glukosetransporter inhibiert oder an der Verschmelzung der GLUT-transportierenden Vesikel mit der Plasmamembran beteiligt ist.
Im Gegensatz zu GLUT1 und ähnlich zu Säugetierzellen ist ein großer Teil der GLUT4-Proteine in der Hefe in intrazellulären Strukturen lokalisiert. Es konnten insgesamt neun rezessive Mutanten isoliert werden (fgy4-1 bis fgy4-9), in denen GLUT4 nun weiter zur Plasmamembran geleitet wird und bei gleichzeitiger fgy1-1 Mutation dort aktiv wird.
Zur Komplementationsanalyse wurde die von Bruns et al. (Genes Dev. 1994; 8: 1087- 105) beschriebene Insertions-Genbank eingesetzt. Der hxt fgy1-1 Stamm wurde zunächst mit einem GLUT4-Plasmid und dann mit der mobilisierten Insertions- Genbank transformiert. Anschließend wurde nach Transformanten gesucht, die auf Glukosemedium wachsen konnten. Bei einer der untersuchten Mutanten stellte es sich heraus, dass das ERG4-Gen zerstört worden war. ERG4 kodiert für ein Enzym (Oxidoreduktase) der Ergosterolbiosynthese. Dieses Enzym, die Sterol-C-24(28)- Reduktase katalysiert den letzten Schritt der Ergosterolbiosynthese und wandelt Ergosta-5,7,22,24,(28)-Tetraenol in das Endprodukt Ergosterol um. Das Erg4-Protein enthält vermutlich acht Transmembrandomänen und ist im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Eine erg4-Mutante ist lebensfähig, da der Einbau der Ergosterolvorstufen in die Membranen der Hefe den Verlust von Ergosterol kompensiert. Der hemmende Einfluss von Erg4 auf die Funktionalität von GLUT4 wurde durch eine gezielte erg4-Deletion im hxt fgy1-1 Stamm bestätigt. Der resultierende Stamm (hxt fgy1-1 Δerg4) wurde mit SDY022 bezeichnet.
Proteininteraktionstests mit Hilfe des „Split-Ubiquitin"-Systems ergaben, dass das menschliche GLUT4 direkt mit Erg4 der Hefe interagiert. Es kann deshalb davon ausgegangen werden, dass das Erg4-Protein der Hefe im Endoplasmatischen Retikulum entweder direkt die weitere Translokation von GLUT4 verhindert oder dass es GLUT4 in irgendeiner Art und Weise modifiziert, die für die Translokation und/oder Funktion wichtig ist.
Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Deletion von ERG4 im hxt-Nullstamm alleine, also trotz funktionellem FGY1 , zwar GLUT1 aktiv macht aber nicht GLUT4. Die Ergebnisse der Wachstumstests sind in Tab. 1 zusammengefasst.
Um auszuschließen, dass Ergosterol selbst einen negativen Einfluss auf GLUT4 ausübt, wurden Wachstumstests auf Agarplatten mit Ergosterol unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Alle mit GLUT4 transformierten Hefestämme konnten unter diesen Bedingungen nicht wachsen (Tab. 2). Auch die GLUT1-Transformanten im hxt fgy1-1 Stamm zeigten im Gegensatz zu aerobem Wachstum unter anaeroben Bedingungen kein Wachstum auf Glukose. Nur nach der Deletion von ERG4 konnten GLUT1-Transformanten wachsen.
Der Austausch von Val85 in Met durch in vitro Mutagenese machte GLUT4 unabhängig von der fgy1-1 Mutation und führte dazu, dass GLUT4V85M bereits in einem hxt erg4 Stamm funktionell war. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass Fgy1 direkt oder indirekt auf diese Position, die sich innerhalb der zweiten Transmembranhelix der GLUT-Transporter befindet, wirkt.
In Tabelle 3 findet sich die Beschreibung der in Zusammenhang mit dieser Patentanmeldung bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) - Mascheroder Weg 1 b 38124 Braunschwei - hinterlegten Hefestämme. Tabellel : Wachstum von GLUT1- und GLUT4-Transformanten auf Glukosemedium
Tabelle 2: Wachstum von GLUT1- und GLUT4-Transformanten auf Glukosemedium mit und ohne Ergosterol unter anaeroben Bedingungen
Tabelle 3: Merkmale der hinterlegten Hefestämme (Saccharomyces cerevisiae)
Basismedium: 0,67% Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren (Difco); pH 6,2. Supplementierung der Auxotrophien: Leucin (0,44 mM), Tryptophan (0,19 mM), Histidin (0,25 mM9, Uracil (0,44 mM). Maltose kann zwischen 1-2% eingesetzt werden.
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ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
F R DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
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Aventis Pharma Deutschland GmbH Industriepark Höchst EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
D-65926 Frankfurt
L KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
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' DSM 15185
π. WISSENSCHAFTUCHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOM1SCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( X ) eine vorgeschlagene taxoπomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen).
UI. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter 1 bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 2002-09-03 (Datum der Erst- hinterlegung)1 eingegangen ist.
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst- hintcrlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig
Datum: 2002-09-10
1 Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 12/2001 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
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LEBENSFAHIGKEΓΓSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen
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2002-09-03 in. LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter H genannten Mikroorganismus ist am 2002-09-06 1 geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
( χ)3 lebensfähig
( nicht mehr lebensfähig
IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÄHIGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST*
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Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer u und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprüfung
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
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D. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter L bezeichneten Mikroorganismus wurde
( X ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( x ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen).
DJ. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 2002-09-03 (Datum der Erst- hinterlegung)' eingegangen ist.
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Veπrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
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' Falls Regel S.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 12/2001 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
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EL LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 2002-09-06 ' geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
( χ)3 lebensfähig
( Y nicht mehr lebensfähig
rv. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSF HIGKEITSPRUFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST"
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In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfahigkeitsprüfung.
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π. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
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( x ) eine wissenschaftliche Beschreibung
( x ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen).
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rv. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter 1 bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst- hiπterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Darum des. Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
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(/. &^
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' Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 12/2001 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
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( x)1 lebensfähig
( )' nicht mehr lebensfähig
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Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfahigkeitsprüfung.
Zutreffendes ankreuzen.
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' Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutπfft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 12/2001 BUDAPΞSTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE
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2002-09-03 in. LEBENSFÄHIGKEΓΓSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus- ist am 2002-09-06 ! geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
( χ)3 lebensfähig
( )J nicht mehr lebensfähig
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FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN von Mikroorganismen und Zellkultureπ GmbH
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Aventis Pharma Deutschland GmbH Industriepark Höchst
LEBENSFÄHGKEΓΓSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen
D-65926 Frankfurt INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
L HINTERLEGER H. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
Aventis Pharma Deutschland GmbH zugeteilte EINGANGSNUMMER: Industriepark Höchst
Anschrift: DSM 15184
D-65926 Frankfurt Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung':
2002-09-03 ffl. LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 2002-09-06 J geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(χ)] lebensfähig
( y nicht mehr lebensfähig
rv. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÄHIGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST4
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg 1b
D-38124 Braunschweig
Datum: 2002-09-10
Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprüfung.
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 12/2001

Claims

Patentansprüche
1. Gereinigtes und isoliertes Polynukleotid umfassend eine DNA-Sequenz, welche für ein Protein GLUT4V85M kodiert.
2. Polynukleotid nach Anspruch 1 , gekennzeichnet dadurch, dass dieses Polynukleotid eine Sequenz aus einer der folgenden Gruppen umfasst: a) eine Nukleotidsequenz gemäß Seq ID Nr. 1 b) eine Nukleotidsequenz, welche unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz der Seq ID Nr. 1 hybridisiert und die für ein Protein GLUT4V85M kodiert.
3. Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein GLUT4V85M eine Aminosäuresequenz gemäß Seq ID Nr. 2aufweist.
4. Polynukleotid nach Anspruch 1 bis 3, in welchem der kodierende Bereich für das Protein GLUT4V85M in operativer Weise mit einem Promotor verbunden ist.
5. Polynukleotid nach Anspruch 1 bis 4, welches in einer Hefezelle zur Replikation gebracht werden kann.
6. Polynukleotid nach Anspruch 5, mittels dessen in einer Hefezelle ein Protein zur Ausprägung gebracht werden kann.
7. Hefezelle aus Saccharomyces cerevisiae, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind und kein funktionelles Erg4 Protein enthalten ist.
8. Hefezelle aus Saccharomyces cerevisiae, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind, kein funktionelles Fgy1 Protein enthalten ist und kein funktionelles Erg4 Protein enthalten ist.
9. Hefezelle nach Anspruch 7 oder 8 gekennzeichnet dadurch, dass das ERG4-Gen ganz oder teilweise deletiert ist.
10. Hefezelle nach Anspruch 7 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae 5 DSM 15187.
11. Hefezelle nach Anspruch 8 oder 9 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae DSM 15184.
10 12. Verwendung einer Hefezelle gemäß Anspruch 15 bis 18 zur Ausprägung eines GLUT1 Proteins oder GLUT4 Proteins eines Säugetieres.
13. Verwendung nach Anspruch 12 zur Ausprägung eines menschlichen GLUT4 Proteins oder eines menschlichen GLUT1 Proteins.
15
14. Hefezelle gemäß Anspruch 7 enthaltend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 bis 6.
15. Hefezelle gemäß Anspruch 14 enthaltend ein Protein GLUT4V85M. 0
16. Hefezelle nach Anspruch 14 und/oder 15 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae DSM 15185.
17. Herstellung einer Hefezelle gemäß Anspruch 14 bis 16 gekennzeichnet dadurch, 5 dass a) eine Hefezelle gemäß Anspruch 7 bereitgestellt wird, b) ein Polynukleotid gemäß Anspruch 5 oder 6 bereitgestellt wird, c) die Hefezelle gemäß a) mit dem Polynukleotid gemäß b) transformiert wird, d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird,
30 e) gegebenenfalls ein Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.
18. Hefezelle gemäß Anspruch 8 oder 9 enthaltend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 bis 6.
19. Hefezelle nach Anspruch 18 enthaltend ein Protein GLUT4V85M. 5
20. Hefezelle nach Anspruch 18 und/oder 19 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae DSM 15186.
21. -Herstellung einer Hefezelle gemäß Anspruch 18 bis 20 dadurch gekennzeichnet, 10 dass a) eine Hefezelle gemäß Anspruch 8 oder 9 bereitgestellt wird, b) ein Polynukleotid gemäß Anspruch 5 oder 6 bereitgestellt wird, c) die Hefezelle gemäß a) mit dem Polynukleotid gemäß b) transformiert wird, d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird,
15 e) gegebenenfalls ein Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.
22. Hefezelle, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind enthaltend ein Polynukleotid gemäß Anspruch 1 bis 6.
20 23. Hefezelle gemäß 22 enthaltend ein Protein GLUT4V85M.
24. Hefezelle nach Anspruch 22 und/oder 23 wie hinterlegt als Saccharomyces cerevisiae DSM 15188.
25 25. Herstellung einer Hefezelle gemäß Anspruch 22 bis 24 dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle hergestellt wird, deren sämtliche Glukosetransporter nicht mehr funktionell sind, b) ein Polynukleotid gemäß Anspruch 5 oder 6 bereitgestellt wird,
30 c) die Hefezelle gemäß a) mit dem Polynukleotid gemäß b) transformiert wird, d) eine transformierte Hefezelle selektiert wird, e) gegebenenfalls ein Protein GLUT4V85M zur Expression gebracht wird.
26. Protein mit der funktionellen Aktivität eines Glukosetransporters gekennzeichnet dadurch, dass es durch eine Polynukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert ist.
27. Protein nach Anspruch 13 bestehend aus einer Aminosäuresequenz gemäß Seq. ID Nr. 2.
28. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität eines GLUT4 Proteins stimuliert, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 14 bis 17 bereitgestellt wird, b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird, d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird, e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wird, wobei eine Verbindung, die eine Vergrößerung der aufgenommenen Glukosemenge in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des GLUT4 Proteins stimuliert.
29. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 28 identifiziert werden, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
30. Verwendung einer Verbindung, welche mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 28 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes Typ I und/oder II.
31. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche das korrespondierende Protein des Fgy1 Gens inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle gemäß einem oder mehrerer der Ansprüche 7 bis 10, welche ein GLUT4 Protein enthält, bereitgestellt wird, b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird, d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird, e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Erhöhung der aufgenommenen Menge an Glukose in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität eines Proteins Fgy1 inhibiert.
32. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 31 identifiziert wurde, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
33. Verwendung einer Verbindung, welche mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 31 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.
34. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche das Protein, welches durch das ERG4 Gen kodiert ist, inhibiert, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Hefezelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 22 bis 25 bereitgestellt wird, b) eine chemische Verbindung bereitgestellt wird, c) die Hefe aus a) mit der chemischen Verbindung aus b) in Kontakt gebracht wird, d) die Glukoseaufnahme der Hefe aus c) festgestellt wird, e) der festgestellte Wert der Glukoseaufnahme aus d) in Beziehung gesetzt wird zum festgestellten Wert der Glukoseaufnahme in einer Hefezelle gemäß a), welche nicht mit einer chemischen Verbindung gemäß b) in Kontakt gebracht wurde, wobei eine Verbindung, die eine Erhöhung der aufgenommenen Menge an Glukose in der Hefe gemäß d) bewirkt, die Aktivität des Proteins Erg4 inhibiert.
35. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 34 identifiziert wurde, sowie Zusatz- und Hilfsstoffe zur Formulierung eines Arzneimittels.
36. Verwendung einer Verbindung, welche mittels eines Verfahrens gemäß Anspruch 34 identifiziert wurde, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes.
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