JP2006517088A - 哺乳動物由来のグルコーストランスポーターの発現のための、サッカロミセス・セレビジエErg4突然変異体の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列、
b)ストリンジェントな条件下で配列番号1の配列にハイブリダイズし、タンパク質GLUT4V85Mをコードするヌクレオチド配列。
a)グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにErg4タンパク質も機能的ではなくなっている酵母細胞を提供すること、
b)GLUT4V85Mタンパク質をコードし、酵母細胞で複製することができるDNA配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドを提供すること、
c)a)からの酵母細胞をb)からのポリヌクレオチドで形質転換させること、
d)形質転換した酵母細胞を選択すること、
e)必要に応じて、GLUT4V85Mタンパク質を発現すること。
a)グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにタンパク質Fgy1およびErg4も機能的ではなくなっている酵母細胞を提供すること、
b)GLUT4V85Mタンパク質をコードし、酵母細胞で複製することができるDNA配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドを提供すること、
c)a)からの酵母細胞をb)からのポリヌクレオチドで形質転換させること、
d)形質転換した酵母細胞を選択すること、
e)必要に応じて、GLUT4V85Mタンパク質を発現すること。
a)グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっている酵母細胞を提供すること、
b)GLUT4V85Mタンパク質をコードし、酵母細胞で複製することができるDNA配列を含む単離および精製されたポリヌクレオチドを提供すること、
c)a)からの酵母細胞をb)からのポリヌクレオチドで形質転換させること、
d)形質転換した酵母細胞を選択すること、
e)必要に応じて、GLUT4V85Mタンパク質を発現すること。
a)グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにErg4タンパク質も機能的ではなくなっており、タンパク質GLUT4V85MをコードするDNA配列を含むポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程、
b)化学物質を提供する工程、
c)a)に記載の酵母とb)に記載の化学物質とを接触させる工程、
d)c)に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
e)b)に記載の化学物質と接触させたa)に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するd)で検出されたグルコース摂取値と、d)に記載の、酵母により摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物が前記GLUT4タンパク質の活性を刺激することとを関連付ける工程。GLUT4V85Mタンパク質の活性を刺激する化合物は、GLUT4活性も刺激すると考えられる。
a)グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、GLUT4V85Mタンパク質をコードするDNA配列を含み、酵母細胞で複製することができるポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程、
b)化学物質を提供する工程、
c)a)に記載の酵母とb)に記載の化学物質とを接触させる工程、
d)c)に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
e)b)に記載の化学物質と接触していないa)に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するd)で検出されたグルコース摂取値と、d)に記載の、酵母により摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Erg4の活性を刺激することとを関連付ける工程。
a)グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、さらにErg4タンパク質も機能的ではなくなっており、GLUT4タンパク質を含む酵母細胞を提供する工程、
b)化学物質を提供する工程、
c)a)に記載の酵母とb)に記載の化学物質とを接触させる工程、
d)c)に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
e)b)に記載の化学物質と接触していないa)に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するd)で検出されたグルコース摂取値と、d)に記載の、酵母により摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Fgy1の活性を刺激することとを関連付ける工程。
るが、選択可能な酵母遺伝子(例えば、URA3、LEU2)を含む。前記ベクター導入後に外来DNAが酵母染色体に組込まれた場合のみ、これら配列は染色体と共に複製され、クローンの形成を伴って、安定して全ての娘細胞にトランスファーされる。
分に高い場合にヘキソースを前記酵母内に輸送することができる。1種の既知の株で、ヘキソース摂取に適した全てのトランスポーターを欠失によって除去した。前記株には、マルトース輸送タンパク質に相同な2つの遺伝子MPH2およびMPH3だけが含まれる。2つの遺伝子MPH2およびMPH3は、培地中にグルコースが存在する場合に抑制される。Wieczorke等,FEBS Lett.464,123〜128(1999年)では、この酵母株の製造と特徴付けが説明されている。前記株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む基質上では増殖できない。前記株から、対応するベクター(hxt fgy1−1株)に起因する、GLUT1を機能的に発現する突然変異体を選択することが可能である。酵母株hxt fgy1−1が、酵母プロモーターの制御下にGLUT4遺伝子を有するプラスミドベクターで形質転換される場合、ほんのわずかなグルコースしか輸送されない。機能的なGLUT4発現は、GLUT4による顕著なグルコース輸送を可能にするために、この酵母株に対してさらなる調節を必要とする。このような、単一のグルコーストランスポーターGLUT4によって細胞がグルコースを摂取する酵母株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む基質で単離することができる。この目的のために、酵母プロモーターの機能的な制御下にGLUT4遺伝子を有する酵母hxt fgy1−1株は、形質転換される。これらの、この方法で形質転換された酵母細胞を、唯一の炭素源としてグルコースを含む栄養培地に塗布し、そこでインキュベートする。例えば30℃で2〜3日インキュベートした後、個々のコロニーの成長を観察する。これらコロニーの1つを単離する。前記コロニーから酵母プラスミドを除去すると、唯一の炭素源としてグルコースを含む栄養培地での増殖が妨害される。この、ベクタープラスミドをすでに含まない株が、再び酵母プロモーターの機能的な制御下にGLUT4遺伝子を有する酵母ベクターで形質転換されると、前記株は、再び唯一の炭素源としてグルコースを含む培地で増殖が可能になる。
物質の投薬形態である。経口療法のための投薬形態の例としては、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、液状抽出物、チンキ、および、シロップが挙げられる。外用塗布に用いられるものの例としては、エアロゾル、スプレー、ゲル、軟膏、または、粉末が挙げられる。注射用または不溶解性の溶液は、バイアル、ボトルまたは予め充填された注射器を用いて非経口投与を可能にする。これら、およびその他の医薬は、製薬技術分野の当業者に既知である。
列を開示している。配列番号2は、GLUT4V85Mタンパク質のアミノ酸配列を開示している。配列番号3は、p4H7GLUT4V85Mベクターのポリヌクレオチド配列を開示している。
本発明に記載された全ての酵母株は、CEN−PK2−1C株(MATa leu2−3,112 ura3−52 trp1−289 his3−Δ1MAL2−8c SUC2)から得た。ヘキソーストランスポーター遺伝子(HXT)が欠失した酵母株の製造は、Wieczorke等,FEBS Lett.464,123〜128(1999年)で説明されている:EBY−18ga(MATa Δhxt1−17 Δgal2 Δagt1 Δstl1 leu2−3,112 ura3−52 trp1−289 his3−Δ1MAL2−8c SUC2)、EBY.VW4000(MATa Δhxt1−17 Δgal2 Δagt1 Δmph2 Δmph3 Δstl1 leu2−3,112 ura3−52 trp1−289 his3−Δ1MAL2−8c SUC2)。培地は、1%酵母抽出物、および、2%ペプトン(YP)に基づくが、最小培地は、0.67%ディフコ(Difco)アミノ酸非含有酵母窒素ベース(YNB)で構成されており、栄養要求性に必要な添加剤と様々な炭素源を含む。酵母細胞を、回転式振盪機または寒天プレートで、好気性条件下で30℃で成長させた。細胞成長は、600nmで光学密度を測定することによって(OD600)、または、酵母コロニーの直径を測定することによってモニターした。
グルコース輸送をD−[U−14C]−グルコース(アマシャム(Amersham))の摂取として測定し、動力学的パラメーターをイーディー−ホフステープロットから決定した。遠心分離で細胞を分離し、リン酸緩衝液で洗浄し、リン酸緩衝液に1mlあたり60mg(湿重量)の濃度に再懸濁した。グルコース摂取は、グルコース濃度で0.2〜100mMと決定され、基質の特異的活性は、0.1〜55.5kBq/μmol-1と決定された。細胞とグルコース溶液を30℃で5分間プレインキュベートした。放射活性グルコースを細胞に添加することによってグルコース摂取を開始させた。5秒間インキュベートした後、氷冷したストップ緩衝液10ml(0.1MのKiPO4,pH6.5,500mMグルコース)を添加し、ガラス繊維フィルター(直径24mm,ワットマン(Whatman))でろ過によって細胞を即座に分離した。フィルターを即座に氷冷した緩衝液で3回洗浄し、取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。サイトカラシンBによる添加(最終濃度20μM,エタノールに溶解させる)を、阻害剤の存在下で、または、溶媒のみで15分間細胞をインキュベートした後の、50mMまたは100mMの放射活性グルコースを用いた15秒での摂取の分析で測定した。
産物のいずれかが、ヒトグルコーストランスポーターの活性を阻害すること、または、GLUT輸送小胞の細胞質膜への融合に関与することが結果で示されている。
Claims (36)
- タンパク質GLUT4V85MをコードするDNA配列を含む、精製および単離されたポリヌクレオチド。
- 下記の群:
a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列、
b)ストリンジェントな条件下で配列番号1の配列にハイブリダイズし、タンパク質GLUT4V85Mをコードするヌクレオチド配列
のいずれかからの配列を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 - タンパク質GLUT4V85Mは、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
- タンパク質GLUT4V85Mのコード領域は、使用可能にプロモーターに連結している、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 酵母細胞で複製することができる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
- 酵母細胞でタンパク質を発現するのに用いることができる、請求項5に記載のポリヌクレオチド。
- 全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており、機能的なErg4タンパク質を含まない、サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞。
- 全てのグルコーストランスポーターが機能的ではなくなっており、機能的なFgy1タンパク質および機能的なErg4タンパク質を含まない、サッカロミセス・セレビジエ由来の酵母細胞。
- ERG4遺伝子は、完全に、または部分的に欠失している、請求項7または8に記載の酵母細胞。
- サッカロミセス・セレビジエDSM15187として寄託された、請求項7に記載の酵母細胞。
- サッカロミセス・セレビジエDSM15184として寄託された、請求項8または9に記載の酵母細胞。
- 哺乳動物のGLUT1タンパク質またはGLUT4タンパク質を発現するための、請求項15〜18のいずれか一項に記載の酵母細胞の使用。
- ヒトGLUT4タンパク質またはヒトGLUT1タンパク質を発現するための、請求項12に記載の使用。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項7に記載の酵母細胞。
- タンパク質GLUT4V85Mを含む、請求項14に記載の酵母細胞。
- サッカロミセス・セレビジエDSM15185として寄託された、請求項14または1
5に記載の酵母細胞。 - 下記の工程:
a)請求項7に記載の酵母細胞を提供する工程、
b)請求項5または6に記載のポリヌクレオチドを提供する工程、
c)a)に記載の酵母細胞をb)に記載のポリヌクレオチドで形質転換させる工程、
d)形質転換した酵母細胞を選択する工程、
e)必要に応じて、タンパク質GLUT4V85Mを発現させる工程、
を含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載の酵母細胞の製造方法。 - 請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項8または9に記載の酵母細胞。
- タンパク質GLUT4V85Mを含む、請求項18に記載の酵母細胞。
- サッカロミセス・セレビジエDSM15186として寄託された、請求項18または19に記載の酵母細胞。
- 下記の工程:
a)請求項8または9に記載の酵母細胞を提供する工程、
b)請求項5または6に記載のポリヌクレオチドを提供する工程、
c)a)に記載の酵母細胞をb)に記載のポリヌクレオチドで形質転換させる工程、
d)形質転換した酵母細胞を選択する工程、
e)必要に応じて、タンパク質GLUT4V85Mを発現させる工程、
を含む、請求項18〜20のいずれか一項に記載の酵母細胞の製造方法。 - グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっており、請求項1〜6のいずれか一項にに記載のポリヌクレオチドを含む、酵母細胞。
- タンパク質GLUT4V85Mを含む、請求項22に記載の酵母細胞。
- サッカロミセス・セレビジエDSM15188として寄託された、請求項22または23に記載の酵母細胞。
- 下記の工程:
a)グルコーストランスポーターが全体として機能的ではなくなっている酵母細胞を製造する工程、
b)請求項5または6に記載のポリヌクレオチドを提供する工程、
c)a)に記載の酵母細胞をb)に記載のポリヌクレオチドで形質転換させる工程、
d)形質転換した酵母細胞を選択する工程、
e)必要に応じて、タンパク質GLUT4V84Mを発現させる工程、
を含む、請求項22〜24のいずれか一項に記載の酵母細胞の製造方法。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされる、グルコーストランスポーターの機能的な活性を有するタンパク質。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のタンパク質。
- 下記の工程:
a)請求項14〜17のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程、
b)化学物質を提供する工程、
c)a)に記載の酵母と、b)に記載の化学物質とを接触させる工程、
d)c)に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
e)b)に記載の化学物質と接触していないa)に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するd)で検出されたグルコース摂取値と、d)に記載の、酵母で摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がGLUT4タンパク質の活性を刺激することとを関連付ける工程、
を含む、GLUT4タンパク質活性を刺激する化合物を同定する方法。 - 請求項28に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬。
- Iおよび/またはII型糖尿病の治療のための医薬を製造するための、請求項28に記載の方法によって同定された化合物の使用。
- 下記の工程:
a)請求項7〜10のいずれか一項に記載のGLUT4タンパク質を含む酵母細胞を提供する工程、
b)化学物質を提供する工程、
c)a)に記載の酵母とb)に記載の化学物質とを接触させる工程、
d)c)に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
e)b)に記載の化学物質と接触していないa)に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するd)で検出されたグルコース摂取値と、d)に記載の、酵母で摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Fgy1の活性を刺激することとを関連付ける工程、
を含む、Fgy1遺伝子に対応するタンパク質を阻害する化合物を同定する方法。 - 請求項31に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬。
- 糖尿病を治療するための医薬を製造するための、請求項31に記載の方法によって同定された化合物の使用。
- 下記の工程:
a)請求項22〜25のいずれか一項に記載の酵母細胞を提供する工程、
b)化学物質を提供する工程、
c)a)に記載の酵母とb)に記載の化学物質とを接触させる工程、
d)c)に記載の酵母によるグルコース摂取を決定する工程、
e)b)に記載の化学物質と接触していないa)に記載の酵母細胞で検出されたグルコース摂取値に対するd)で検出されたグルコース摂取値と、d)に記載の、酵母で摂取されるグルコースの量の増加を引き起こす化合物がタンパク質Erg4の活性を阻害することとを関連付ける工程、
を含む、ERG4遺伝子によってコードされるタンパク質を阻害する化合物を同定する方法。 - 請求項34に記載の方法によって同定された化合物、および医薬を製剤化するための添加剤および賦形剤を含む医薬。
- 糖尿病を治療するための医薬を製造するための、請求項34に記載の方法によって同定された化合物の使用。
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