DE102018127946B4

DE102018127946B4 - Verfahren zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein

Info

Publication number: DE102018127946B4
Application number: DE102018127946.9A
Authority: DE
Inventors: Susanne Steudler; Stephanie Stange; Hubertus Delenk; André Wagenführ; Christof Zeeb; Thomas Walther
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2018-11-08
Publication date: 2024-08-01
Anticipated expiration: 2038-11-09
Also published as: EP3877536A1; US11851693B2; US20210261994A1; WO2020094552A1; DE102018127946A1; WO2020094552A8

Abstract

Verfahren zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein in einem Bioreaktor, mit den Schrittena. Kontaktieren des Reaktorinhalts mit Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. und Rühren des Reaktorinhalts unter Bildung von Xylindein-haltiger Biomasse,b. Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse, die sich in Schritt a. gebildet hat,c. Extraktion des Xylindeins aus der in Schritt b. abgetrennten Biomasse mit einem Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse, mit der in Schritt a. kontaktiert wird, ungefärbte Biomasse ist.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung ist die biotechnologische Gewinnung eines Pilzpigmentes, das gewöhnlich als Färbemittel Verwendung findet.
Xylindein ist ein natürliches blaugrünes Pigment (Summenformel C₃₂H₂₄O₁₀, CAS-Nr. 3779-11-1), welches von Pilzen der Gattung Chlorociboria sp., Grünspanbecherlinge, produziert wird und die folgende chemische Struktur besitzt:
Bekannt ist dieses Pigment für die natürliche Blaugrünverfärbung von Holz. Dieses im Wald natürlich verfärbte Holz wird seit mehreren Jahrhunderten für Intarsien genutzt. Xylindein ist ebenfalls für die Nutzung als Fluoreszenzmarker oder als organischer Halbleiter vielversprechend. Derzeit gibt es keine Möglichkeit, Xylindein chemisch zu synthetisieren.
Aus der Literatur ist bekannt, Xylindein biotechnologisch herzustellen und aus grünverfärbtem Zellkulturüberstand und grünverfärbter Zellbiomasse zu isolieren.
Beispielsweise Harrison et al. (2017) kultivierten den Pilz Chlorociboria aeruginosa zuerst auf Malz-Agarose-Platten, um nach Transfer der Biomasse in einen Bioreaktor im 1L-Maßstab zu kultivieren.
Stange et al. (2018, Teil 1) offenbarten die Kultivierung der Pilzkultur in Lebensmittelreststoffen wie Orangensaft. Verschiedene Substrate wie Holz, Kaffeesatz, Heu oder Reis wurden getestet. Es wird auch beschrieben, dass nährstofflimitierte Bedingungen in der Form eines niedrigeren Stickstoffgehalts im Vergleich zur verfügbaren Kohlenstoffkonzentration für die Bildung von Xylindein günstig sind. Verschiedene N- und C-Quellen wurden getestet und gemischt. Auch die Heißwasserextraktion von Baumrinden zur Herstellung eines geeigneten Kultivierungsmediums, welche sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe beinhalten, wird beschrieben.
Weber et al. (2016) nutzen zur Kultivierung händisch gepflückte, grüne Pilzkörper um die Kultivierung zu starten. Der Fruchtkörper ist bereits mit dem Pigment Xylindein durchsetzt. Anschließend wird das Xylindein aus dem Zellkulturüberstand extrahiert und die zentrifugierte Pilzbiomasse verworfen.
Schon Robinson et al. (2014) wandten das Konzept an, Xylindein direkt aus der Pilzbiomasse und gefärbtem Feststoffsubstrat zu extrahieren, anstatt es aus dem Zellkulturüberstand einer Flüssigkultivierung zu gewinnen. Robinson et al. untersuchten auch die Löslichkeit des Xylindeins in u. a. Acetonitril, Tetrahydrofuran oder Ethanol.
Saikawa et al. (2000) extrahierten mittels heißem Chloroform aus mit Chlorociboria sp. befallenem Holz.
Weber et al. (2014) beschrieben die Extraktion von Xylindein mittels Dichlormethan aus einer Chlorociboria aeruginosa-Kultur aus Malzagarplatten, bestehend aus 2 % Malz und 1,5 % Agar.
Stange et al. (2018, Teil 2) nutzten dieses Konzept und färbten Vollholz durch Pilzkultivierung in Flüssigmedien wie beispielsweise Orangensaft. Ziel der Arbeit war es, geeignete Holzarten als Substrat für diese Pilzkultivierung zu finden. Sie entwickelten diesbezüglich einen Feststoffreaktor im Prototypenmaßstab zur gezielten mykologischen Holzverfärbung.
Zur Extraktion des Pilzpigments aus verfärbten Substraten wurde in US2017/0081540A1 Aceton, Tetrahydrofuran bzw. Acetonitril genutzt. Das Extrakt wurde in einem weiteren Schritt mit einem Öl vermischt, welches nach Evaporation des Lösungsmittels als Flüssigträger für das Pilzpigment fungierte. Somit konnte eine Suspension des Pigments in Öl hergestellt werden. Diese PigmentSuspension soll als Anstrichstoff eingesetzt werden.
Die Extraktion von Pigmenten mit heißem Wasser, sowohl aus befallenem Holz als auch aus Pilzmyzel, wird in EP1736053A1 nahegelegt. Als Reinigungsmethode wird das Ausfällen durch Ansäuern in Kombination mit Filtration beschrieben.
Zusammenfassend geht aus dem Stand der Technik hervor, dass eine Kultivierung bisher nur im 1 L-Maßstab realisiert werden kann. Die beschriebenen Kultivierungszeiten sind sehr lang. Sie betragen mindestens 6 Wochen. Die bei der Extraktion eingesetzten Lösungsmittel sind für die industrielle Anwendung aufgrund hoher Toxizität und der damit verbundenen notwendigen Sicherheitsvorkehrungen nicht praktikabel.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, dass kürzere Prozesszeiten erlaubt. Die Kultivierungszeit soll gering sein. Die Produktivität der Pilzkultur soll hoch sein. Insgesamt soll in kürzerer Zeit genauso viel oder mehrXylindein als bei bekannten Methoden aus dem Stand der Technik erhalten werden. Das Verfahren soll einfach durchführbar und ökologisch sein.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche. Vorzugsweise Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der jeweils rückbezogenen Unteransprüche.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein in einem Bioreaktor, mit den Schritten:

a. Kontaktieren des Reaktorinhalts mit Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. und Rühren des Reaktorinhalts unter Bildung von Xylindein-haltiger Biomasse,
b. Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse, die sich in Schritt a. gebildet hat,
c. Extraktion des Xylindeins aus der in Schritt b. abgetrennten Biomasse mit einem Lösungsmittel,

Die Schritte a, b und c finden nacheinander in dieser Reihenfolge statt.
Das erfindungsgemäße „Kontaktieren des Reaktorinhalts mit Biomasse derPilzkultur...“ wird als Impfen/Animpfen/Inokulieren verstanden, d. h. eine relativ kleine Menge an Pilzkultur wird zum relativ großen Reaktorinhalt gegeben, um sich zu vermehren.
Als Pilzkultur kommt Chlorociboria sp., d. h. Pilze vom Genus Chlorociboria zum Einsatz.
Es ist bei diesem Kontaktieren sowohl umfasst, dass der Reaktorinhalt mit isolierter Biomasse der Pilzkultur, beispielsweise in Form eines gereinigten Pilzmyzels kontaktiert wird, als auch, dass die Biomasse anhaftend auf einem Substrat zur Anwendung kommt, wie beispielsweise mit Pilzkultur befallenes Holz oder Agar.
Reaktorinhalt im Sinne der Erfindung bedeutet der Inhalt des erfindungsgemäßen Bioreaktors, insbesondere der meist flüssige Inhalt aus beispielsweise Nährmedium, Zusatzstoffen etc.
Biomasse im Sinne der Erfindung ist die Stoffmasse der Pilzkultur. Insbesondere das sogenannte Pilzmyzel ist damit umfasst.
Die Bezeichnung „ungefärbte Biomasse“ im Sinne der Erfindung steht für Biomasse der Pilzkultur, deren Metabolismus sich noch so eingerichtet hat, dass kein oder nur sehr wenig blaugrünes Pilzpigment Xylindein produziert wird. Die Biomasse ist folglich ungefärbt. Insbesondere hat sie augenscheinlich keine bzw. noch keine sichtbare blaugrüne Färbung. Man kann sie auch als helle Biomasse bezeichnen.
Es ist auch möglich, dass im Zellkulturüberstand kein Xylindein enthalten ist, die Pilzbiomasse aber schon stark blaugrün verfärbt ist und folglich Xylindein enthält, wobei man in diesem Fall nicht mehr von ungefärbter Biomasse spricht.
Vorteil der Erfindung ist, dass das Verfahren eine überraschend kurze Kultivierungsdauer erlaubt, was zu wesentlich kürzeren Prozesszeiten führt, und damit mehr Xylindein pro Zeit als mit herkömmlichen Verfahren gewonnen werden kann.
Prozesszeit im Sinne der Erfindung ist die Zeit, um eine bestimmte Menge Xylindein mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herzustellen, d. h. Zeit pro Masse Xylindein. Durch Kontaktieren des Reaktorinhalts (d. h. Animpfen bzw. Inokulieren) mit ungefärbter Biomasse wird die Kultivierungsdauer (d. h. die Dauer des Kontaktierens und Rührens in Schritt a.) um mindestens 33 % im Vergleich zur Nutzung von gefärbter, (vorrangig blaugrüner) Xylindein-haltiger Biomasse als Inokulum reduziert. Insbesondere verkürzt sich die Kultivierungsdauer bzw. die Prozesszeit des Gesamtverfahrens, d. h. mit eventuell vorher durchgeführten Vorkultivierungsschritten.
Ein sich aus diesem Zusammenhang ergebender anderer Vorteil ist, dass die Produktivität im erfindungsgemäßen Verfahren höher ist als bei herkömmlichen Verfahren. Produktivität ist die Masse des von der Pilzkultur gewonnenen Xylindeins pro Volumen Reaktorinhalt pro Zeit. Es wird dabei davon ausgegangen, dass die Verluste in Schritt b. und c. des erfindungsgemäßen Verfahrens vernachlässigbar klein sind und die Menge gewonnenen Xylindeins daher immerzu der von der Pilzkultur produzierten Menge Xylindeins proportional ist.
Ein weiterer Vorteil ist, dass das Verfahren holzfrei ist, d. h., dass im Verfahren kein Holz als Substrat für die Pilzkultur erforderlich ist.
Des Weiteren vorteilhaft ist, dass der Startpunkt der Produktion des Pilzpigments Xylindein anhand des Verlaufs des pH-Wertes des Reaktorinhalts vorhergesagt werden kann (2). Nach einem kontinuierlichen Anstieg des pH-Wertes während der Kultivierung der erfindungsgemäßen, ungefärbten Biomasse kommt es zu einer Verlangsamung des pH-Anstieges und schließlich zu einer kurzen Absenkung des pH-Wertes. An diesem Wechsel zwischen Anstieg und Abfall des pH-Wertes beginnt eine erhöhte Xylindein-Produktion durch die Pilzkultur und kurze Zeit später wird die blaugrüne Färbung der Pilzkultur sichtbar. Kurz vor diesem Wechselpunkt ist der Stickstoffgehalt limitiert, was den Grund für den Beginn solch eines Sekundärmetabolismus' darstellt.
Ein zusätzlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Lagerfähigkeit und damit verbunden auch die Transportfähigkeit des Zwischenprodukts, d. h. der in Schritt b. abgetrennten Xylindein-haltigen Biomasse, die getrocknet werden kann. Es ist damit vorteilhaft möglich, die Verfahrensschritte an unterschiedlichen Orten durchzuführen und dafür dieses Zwischenprodukt, vorzugsweise in getrockneter Form, zu transportieren.
In einer Ausführungsform ist ungefärbte Biomasse solche, die nach Trocknung bei 60 °C im Lab-Farbraum einen L-Wert von ≥ 67 aufweist, bevorzugt ≥ 70. Insbesondere wird bei 60 °C für 24 h getrocknet.
Im Lab-Farbraum ist L=0 als schwarz und L=100 als weiß definiert. Entsprechend dertypischen blaugrünen Färbung der von Chlorociboria sp. produzierten Xylindein-haltigen Biomasse kann also die Stärke des Xylindein-Gehalts in der Biomasse schon allein durch den L-Wert (Luminanz = Helligkeit) bestimmt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist ungefärbte Biomasse solche, die nach der oben genannten Trocknung im RAL-Farbsystem heller als RAL 130 90 20 ist. Bevorzugt ist sie heller als RAL 130 90 10, besonders bevorzugt heller als RAL 140 90 05.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung ungefärbter Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. zum Animpfen bei der biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein, insbesondere die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren.
Es kann angenommen werden, dass ein Zusammenhang besteht zwischen Zusammensetzung des Nährmediums, dem dazu angepassten Stoffwechsel des Pilzstamms und der Verstoffwechselung zu Xylindein oder zu anderen farbfreien Stoffwechselprodukten.
Diesbezüglich umfasst der Reaktorinhalt in einer Ausführungsform ein Nährmedium. Bevorzugt weist das Nähmedium eine Limitierung des verfügbaren Stickstoffs im Vergleich zum Gesamtkohlenstoffgehalt auf. Besonders bevorzugt liegt das Verhältnis von Stickstoff- zu Kohlenstoffquelle im Nährmedium bei 1/400 (in Form von Gesamtstickstoffgehalt zu Gesamtkohlenstoffgehalt, jeweils in g). Unter Stickstoff-limitierten Nährstoffbedingungen bildet die Pilzkultur vorrangig Xylindein, wogegen unter Stickstoff-reichen Nährstoffbedingungen vorrangig ungefärbte Biomasse produziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden während Schritt a. (Kontaktieren...) die Prozessparameter kontrolliert und geregelt. Das umfasst manuelles sowie automatisches Kontrollieren und Regeln.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse in Schritt b. eine Filtration. Besonders bevorzugt hat das Filtermaterial eine Maschenweite von maximal 80 µm, insbesondere 80 µm. Insbesondere ist das Filtermaterial ein Material, dass für große Volumina gut geeignet ist, wie beispielsweise ein Filtersack aus Polypropylengewebe.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet nach der Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse in Schritt b. und vor Schritt c. eine Trocknung und/oder Zerkleinerung der Biomasse statt. Besonders bevorzugt findet die Trocknung kombiniert mit anschließender Zerkleinerung durch beispielsweise Mahlen, statt. Insbesondere erfolgt diese Trocknung bei maximal 70 °C und/oder flächig bei einer Beladung von maximal 350 g feuchte Biomasse pro dm². Die Trocknungszeit ist bei 70 °C bevorzugt 24 h.
Vorteilhaft an dieser Ausführungsform ist, dass sich die Lagerfähigkeit des Zwischenproduktes, nämlich der in Schritt b. abgetrennten Xylindein-haltigen Biomasse, erhöht. Sie ist damit auch besser transportfähig.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Pilzkultur Chlorociboria sp. ausgewählt aus Chlorociboria aeruginascens und Chlorociboria aeruginosa. In einer bevorzugten Ausführungsform ist sie Chlorociboria aeruginascens, besonders bevorzugt ausgewählt aus den Stämmen ATCC® 24028, ATCC® 24029, ATCC® 200365, ATCC® 200366 und IHIA39 (NCBI BioSample: SAMN06706673).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dem Verfahren mindestens ein Vorkultivierungsschritt, vorzugsweise in einem Nährmedium wie an anderer Stelle bevorzugt ausgewählt, vorgeschalten. In diesen Schritten wird eine Vorkultur herangezogen und die Pilzbiomasse vermehrt.
In dieser Ausführungsform spricht man dann von Vorkultivierung/Vorkultur und Hauptkultivierung/Hauptkultur. Die Vorkultivierung und die Überführung der Pilzbiomasse aus kleineren in größere Maßstäbe ist eine bekannte Methode aus dem Stand der Technik und ist meist mehrstufig, wie beispielsweise in 3 dargestellt Dabei ist es erforderlich, den Pilz während der exponentiellen Wachstumsphase in den nächstgrößeren Maßstab zu überführen.
Vorzugsweise wird in dieser Ausführungsform sowohl in der Hauptkultur als auch bei jedem Vorkultivierungsschritt mit Pilzbiomasse angeimpft, die ungefärbt ist. Vorteilhaft verkürzt sich dabei die nötige Kultivierungsdauer in jedem dieser Schritte. Das heißt, dass die Biomasse in dem Stadium gehalten wird, indem sie noch ungefärbt ist und kein oder kaum Xylindein produziert. Der Pilz bildet bei der Vermehrung bekanntermaßen immer zuerst ungefärbte, helle Biomasse.
In einer Variante dieser Ausführungsform findet die Vorkultivierung in Stickstoff-reichem Nährmedium, wie beispielsweise einem 50 Vol%-igen Orangensaftagar statt, insbesondere bei 20-22 °C. Das Inokulieren, d. h. das erfindungsgemäße Kontaktieren mit ungefärbter Pilzbiomasse, findet dann vorzugsweise in Stickstoff-armem Medium, wie weiter oben beschrieben, statt.
Vorteilhaft an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass der Farbumschlag von ungefärbter Biomasse zu gefärbter, Xylindein-haltiger Biomasse anhand des pH-Wert-Verlaufes des Kulturmediums, d. h. des Reaktorinhalts, erkannt werden kann. Nach einem kontinuierlichen Anstieg des pH-Wertes während der Kultivierung der Pilzkultur kommt es zu einer Verlangsamung des pH-Wert-Anstieges und schließlich zu einer kurzen Absenkung des pH-Wertes. An diesem Wechsel zwischen Anstieg und Abfall beginnt die Xylindein-Produktion durch die Pilzkultur und kurze Zeit später wird die blaugrüne Färbung der Pilzkultur sichtbar. Insbesondere während der Vorkultivierungsschritte der letztgenannten Ausführungsform kann damit vorteilhaft der Zeitpunkt des Farbumschlags vorhergesehen werden. Das ist hilfreich, um die Pilzkultur in dem Stadium zu halten, in dem kein oder kaum Xylindein produziert wird.
In einer bevorzugten Variante der obigen Ausführungsform findet die Vorkultivierung zuerst auf gegossenen, nährstoffreichen Agar-Platten statt, die mit der erfindungsgemäßen Pilzkultur beimpft und bei 20-22 °C inkubiert werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Lösungsmittel in Schritt c. ein nicht-halogenhaltiges Lösungsmittel. Bevorzugt ist es ausgewählt aus Aceton, 2-Butanon oder einer Mischung daraus.
In einer vorteilhaften Ausführungsform enthält der Reaktorinhalt ein Nährmedium, das geeignet ist, die Pilzkultur der Erfindung am Leben zu halten. Je nach Zusammensetzung des Nährmediums wird die Pilzkultur ihren Metabolismus anpassen und die Stoffwechselprodukte werden u. U. verändert. Das erfindungsgemäße Verfahren funktioniert vorteilhaft auch mit Nährmedien, die Fruchtsäfte enthalten, auch wenn diese Fruchtsäfte schon älter sind als durch das Mindesthaltbarkeitsdatum angegeben. Dabei ist wichtig, dass die organischen Reststoffe Kohlenhydrate (bevorzugt Glucose, Mannose, Maltose oder Saccharose) sowie eine organische Stickstoffquelle (z. B. Proteine, Peptide, Hefeextrakt) enthalten.
Vorzugsweise umfasst der Reaktorinhalt in einer Ausführungsform ein Nährmedium (d. h. eine Kulturlösung), das bis zu 50 Vol-% Orangensaft enthält. Weiterhin ist ein Nährmedium umfasst, das eine 1-20 Vol-%ige Orangensaftlösung enthält, bevorzugt eine 3-15 Vol-%ige, insbesondere eine 5-10 Vol-%ige, besonders bevorzugt eine 5 Vol-%ige. Als 100%ige Orangensaftlösung wird Orangensaft mit 100 Vol-% Fruchtgehalt verstanden.
In dieser Ausführungsform erkennt man (bei Verfolgung des pH-Wertes im flüssigen Reaktorinhalt), dass der Farbumschlag, d. h. der Start bzw. die Verstärkung der Xylindein-Produktion umso später erfolgt, je höher die Konzentration des Orangensafts im Nährmedium zu Beginn der Kultivierung ist. Es wird angenommen, dass es umso länger dauert, bis der Stickstofflimitierte Zustand als Auslöser des Sekundärmetabolismus' erreicht wird, je höher die Konzentration des Orangensafts im Nährmedium ist.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Xylindein, erhalten in Schritt c., aufgereinigt durch die Schritte

d. Trocknung des Xylindeins und Wiederauflösen in einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel
e. Ausfällen gereinigten Xylindeins durch Zugabe von Wasser zu der Mischung aus Schritt d.

Bevorzugt ist die Trocknung in Schritt d. nur eine Entfernung des Großteils des Lösungsmittels, die beispielsweise in einem Rotationsverdampfer durchgeführt werden kann. Bevorzugt findet das Widerauflösen in einer geringen Menge Lösungsmittel statt. Das Ausfällen durch Zugabe von Wasser in Schritt e. erfolgt zweckmäßig bei einem Überschuss von Wasser, vorzugsweise in einem Volumenverhältnis von 1:10 (1 Teil wasserlösliches organisches Lösungsmittel aus Schritt d. und 10 Teile Wasser aus Schritt e.) Besonders bevorzugt wird nach dem Ausfällen in Schritt e. das Xylindein als Feststoff abfiltriert. Insbesondere schließt sich ein Waschen mit Wasser und ein Trocknen bei ca. 103 °C für vorzugsweise 24h an.
In einer ebenfalls vorteilhaften Ausführungsform wird aus dem in Schritt b. nach Abtrennung der Biomasse verbleibenden flüssigen Kulturüberstand weiteres Xylindein durch bekannte Methoden wie Filtration mit anschließender Ultrafiltration, bevorzugt nur Ultrafiltration, abgetrennt und aufkonzentriert.
Die Ultrafiltration, bevorzugt mit einer Porengröße ≤ 10 kDa, konzentriert dabei beispielsweise gelöstes Xylindein, suspendiertes Xylindein sowie Xylindein-haltige Myzelpartikel auf, welche weiter in Schritt c. des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird bei Schritt a. und b. des erfindungsgemäßen Verfahrens, bevorzugt nur bei Schritt a., steril gearbeitet und der Reaktorinhalt steril gehalten. Dabei erfolgt bevorzugt die Begasung mit Luft ebenfalls steril durch einen Filter. In einer Ausführungsform wird eine Sauerstoff-Limitierung während Schritt a. des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgeschlossen.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet das Rühren in Schritt a. bei maximal 0,52 m/s Rührgeschwindigkeit am Rand des Rührers, d. h. Tip-Speed (Rührerspitzengeschwindigkeit), statt.
In einer Ausführungsform hat der Bioreaktor ein Volumen von 70 L. Bevorzugt hat dabei der flüssige Reaktorinhalt ein Volumen von 55 L.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Bioreaktor mit seinem Inhalt, insbesondere Nährmedium, vor dem Kontaktieren in Schritt a. nach bekannten Methoden hitzesterilisiert.
Tabelle 1 zeigt Werte der Farbbestimmung an der Biomasse mittels Lab-Farbraum sowie anhand der RGB-Farbskala auf.
Tabelle 2 zeigt beispielhafte Kultivierungsparameter zur Herstellung einer Vorkultur aus Chlorociboria sp. (in mehreren Vorkultivierungsschritten) und der Hauptkultur bei der biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse eines Ausführungsbeispiels (Animpfen mit ungefärbter Biomasse) und eines Vergleichsbeispiels (Animpfen mit gefärbter Biomasse). Sowohl die Verkürzung der Kultivierungsdauer als auch die höhere Produktivität im Ausführungsbeispiel sind deutlich erkennbar.

1 zeigt den Verlauf zahlreicher Parameter, darunter des pH-Werts über die Kultivierungsdauer anhand eines Ausführungsbeispiels.
2 zeigt den Verlauf des pH-Wertes beim Animpfen (einer Hauptkultur) mit gefärbter bzw. ungefärbter Pilzbiomasse anhand eines Ausführungsbeispiels.
3 zeigt beispielhaft den Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Ausführungsform mit Vorkultivierung (erster, zweiter und dritter Teil von links) sowie Hauptkultur (rechter Teil), wobei in jedem Stadium anfangs mit ungefärbter Biomasse angeimpft (kontaktiert) wird.

Alle Ausführungsformen der Erfindung können in beliebiger Weise miteinander kombiniert werden.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele verdeutlicht ohne auf diese beschränkt zu sein.
Ausführungsbeispiel 1: Vorkultivierung des Xylindein-produzierenden Pilzes Chlorociboria sp.
Die Vorkultur für den in Ausführungsbeispiel 1 - Schritt a. beschriebenen Prozess zur Herstellung von blaugrüner Pilzbiomasse erfolgte in mehreren Kultivierungsschritten. Dabei wurde Eingangs eine Kultivierung im Petrischalenmaßstab zur Stammerhaltung (Erhaltung des Pilzkulturstamms) durchgeführt. Hierfür diente ein 50 Vol-%iger Orangensaftagar, bestehend aus 50 Vol% Orangensaft (als 100 Vol-%iger Orangensaft wird Orangensaft mit 100 Vol-% Fruchtgehalt verstanden) und mindestens 30 g/L Agar-Agar (auch genannt Agar, Chinesische/Japanische Gelatine oder Japanischer Fischleim). Das Nährmedium wurde bei 121 °C für 15 min autoklaviert. Die gegossenen Agar-Platten wurden mit einem Impfstück (Plaque, 1 cm²) einer älteren oder erworbenen Stammhaltungsplatte beimpft und bei 20 - 22 °C inkubiert. Aus dieser Kultivierung wurden zwei Plaques in den Schüttelkolbenmaßstab überführt und in einem wässrigen Nährmedium aus 5 Vol-% Orangensaft kultiviert. Im Anschluss wurden insgesamt 200 mL vorkultivierte Pilzbiomassesuspension (Vorkulturlösung) aus der Schüttelkolbenkultur in einen 3 L-Batchreaktor (Kultivierungsmedium: 5 Vol-% Orangensaft-Lösung) transferiert und weiterkultiviert. Der pH-Wert wurde kontinuierlich verfolgt und es wurden regelmäßig Proben der Kulturlösung zur Farbbestimmung der Pilz-Biomasse entnommen. Es wurde solange kultiviert, bis die Steigerung des pH-Wertes abnahm und der pH-Wert wieder zu sinken begann. Zur gleichen Zeit näherte sich der L-Wert aus der Farbbestimmung dem Grenzbereich an, bei dem ein Umschlag von ungefärbter zu gefärbter Biomasse auftrat. Die Kultivierung dieser Vorkultur wurde bei L=85 (Luminanz-Wert) gestoppt. Tabelle 1 zeigt die Werte der Farbbestimmung an der Biomasse mittels Lab-Farbraum sowie der RGB-Farben auf. Die Methode zur Farbbestimmung der Pilz-Biomasse und die erforderliche Vorbehandlung werden im folgenden Abschnitt beschrieben.
Während der Vorkultivierung ist es erforderlich, den Pilz während der exponentiellen Wachstumsphase in den nächstgrößeren Maßstab zu überführen. Hierfür wurde für den Pilz Chlorociboria aeruginascens IHIA39 für die Schüttelkolbenkultur 7 Tage und für die 5L-Kultivierung ebenfalls 7 Tage ermittelt. Damit wurde die Vorkultivierungsdauer um mindestens 50 % im Vergleich zur Nutzung von gefärbter, Xylindein-haltiger Biomasse als Inokulum reduziert.
Methode zur Farbbestimmung der Pilz-Biomasse
Nach Entnahme einer Probe der Flüssigkultur wurde die enthaltene Biomasse durch Filtration abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen und (direkt auf dem Filterpapier) bei 60°C für 24 h im Trockenofen getrocknet. Anhand der getrockneten Biomasse wurde die Farbe im Lab-Farbraum mittels eines Spektralphotometers (Datacolor ELREPHO) bestimmt. Die ermittelten Werte stellen Mittelwerte aus 5 Messwerten dar. Eine Umrechnung in beispielsweise RGB-Farben ist mit einer der verfügbaren Datenbanken möglich (beispielsweise http://www.cielabfarben.de/farbdaten bank.html).
Tabelle 1 - Bestimmung der Farbe der Biomasse in unterschiedlichen Stadien
Es sind Werte aufgeführt für ungefärbte Biomasse (zum Animpfen), für Biomasse bei Farbumschlag (von ungefärbter Biomasse zu gefärbter Biomasse) und für stark blaugrün gefärbte Biomasse.

R G B L a b

Animpfen 215 212 194 85 -1 9

Farbumschlag 160 165 126 67 -7 20

Blaugrün-Färbung 109 144 116 56 -16 11

85 111 97 44 -11 5
Als Grenze zur Unterscheidung zwischen gefärbter und ungefärbter Biomasse wurde ein L-Wert (Luminanz = Helligkeit) von ca. 70 bestimmt.
Vergleichsbeispiel 1b - Vorkultur mit gefärbter Biomasse
Es wurden parallel auch alle Kultivierungen im Rahmen der Vorkultivierung mittels gefärbter, d. h. Xylindein-haltiger Biomasse durchgeführt. Diese Vergleichsbeispiele wurden analog der obigen Vorschrift durchgeführt mit dem Unterschied, dass nach erster Impfung mit dem Impfstück nur noch mit gefärbter Biomasse angeimpft wurde.
Ausführungsbeispiel 1 - Schritt a: Herstellung von blaugrüner Pilzbiomasse im 70 L-Maßstab

Für die Hauptkultivierung zur Herstellung von blaugrüner Pilzbiomasse enthaltend Xylindein wurde ein 70 L-Bioreaktor (Applikon Biotechnology B.V.) mit 55 L 5Vol-%igem Orangensaft in Wasser beschickt. Im Bioreaktor wurde das Nährmedium bei 123 °C für 30 min („Sterilisation in Place“, SIP) hitzesterilisiert und die Prozessparameter (wie in Tabelle 2 aufgeführt) eingestellt. 5 L Vorkultur mit ungefärbter Biomasse (aus Ausführungsbeispiel 1, Vorkultivierung) wurden in den Reaktor überführt und für 14 Tage kultiviert. Mittels Prozessmonitoring wurde der Zeitpunkt des Farbumschlags der Pilzbiomasse von ungefärbt zu blaugrüngefärbt durch online-Messung des pH-Wertes bestimmt. Während der Kultivierung stieg der pH-Wert von pH 4 auf pH 4,2 an. Etwa ab Tag 4 sank der pH-Wert leicht auf 4,1 ab und stieg ab Tag 5 bis Tag 6 wieder auf pH 4,5 an. Dieses pH-Wert-Verhalten weist auf den Farbumschlag der Kultur hin. In Tabelle 2 sind die verwendeten Kultivierungsparameter. Tabelle 2 - Kultivierungsparameter einer Vor- und der Hauptkultur aus Chlorociboria sp. zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein.

Beschreibung	Herstellung der Vorkultur			Hauptkultivierung
Beschreibung	Vorkultivierun gs-schritt 1 in Schikanekolbe n	Vorkultivierung s-schritt 2 in 3 L-Bioreaktor	Vorkultivierung s-schritt 3 in 7 L-Bioreaktor	70 L-Bioreaktor
Volumen	500 mL	3 L	7 L	70 L
Arbeitsvolumen	200 mL	2 L	5,5 L	55 L
H/D Verhältnis	-	1,5	1,8	2,2
Rührerart	orbital	Scheibenrührer	Scheibenrührer	Scheibenrührer
Rühreranzahl	-	2	3	3
Rührerdurchmesser	-	4,8 cm	4,9 cm	10 cm
Rührerdrehzahl	120 rpm	150 rpm	150 rpm	100 rpm
Einbauten	3 Schikane	3 Strombrecher	3 Strombrecher	4 Strombrecher
Begasungsart	Membran	Ringbegaser	Ringbegaser	Ringbegaser
Begasungsrate	-	0,5 vvm	0,5 vvm	0,27 vvm
Temperierung	Schüttler	Stab/Heizmantel	Doppelmantel	Doppelmantel
Temperatur	22 °C	22 °C	22 °C	22 °C
Inokulum	2 × 1 cm²	200 mL	500 mL	5 L
K_La-Wert		4,5 h^-1	7,9 h^-1	4,7 h^-1
Tip-Speed		0,38 m/s	0,46 m/s	0,52 m/s
Leistungseintrag		0,02 kW/m³	0,04 kW/m³	0,02 kW/m³

Tabelle 3 - Vergleich der Ergebnisse der biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein, bei Animpfen mit gefärbter bzw. ungefärbter Biomasse

	Vergleichsbeispiel	Ausführungsbeispiel
Animpfen mit	gefärbter Biomasse	ungefärbter Biomasse
Quelle	Literatur (Boonloed et al. (2016))	Eigene Untersuchungen
Volumen	0,25 L	55 L
Kultivierungszeit (Hauptkultur)	10 Wochen	2 Wochen
Produktivität	3,5 mg/L/d	4,8 mg/L/d
Menge des gewonnenen Xylindeins	62 mg	3,7 g

Die Produktivität gibt die Menge Xylindein an, die pro Liter Reaktorinhalt pro Tag produziert wurde. Sie wird bestimmt, durch Wiegen des Xylindeins, dass im Verfahren gewonnen wurde und Division durch das Volumen des Kulturmediums sowie die Anzahl der Tage des Kontaktierens und Rührens (Schritt a.).
Dementsprechend wird die Ausbeute definiert als die Masse an gewonnenem Xylindein, dividiert durch das Volumen des Reaktorinhalts.
Ausführungsbeispiel 1 - Schritt b: Aufbereitung der Xylindein-haltigen Feuchtbiomasse zur Herstellung von blaugrüner Xylindein-haltiger Biotrockenmasse
Bei der Ernte des 70 L-Bioreaktors wurde die blaugrüne, Xylindein-haltige Feuchtbiomasse durch Filtration vom flüssigen Kulturüberstand abgetrennt. Hierfür wurde ein Filtersack aus Polypropylengewebe mit der Maschenweite von 80 µm genutzt. Der flüssige Kulturüberstand war ebenfalls blaugrün gefärbt. Mittels Ultrafiltration (10 kDa-Membran) wurde daraus zusätzlich ins Medium diffundiertes Xylindein sowie restliche, besonders kleine Biomassepartikel gewonnen. Die blaugrüne Xylindein-haltige Feuchtbiomasse wurde bei maximal 70 °C für 24 h durch flächiges Trocknen auf einem Blech in einem Ofen mit maximaler Beladung von 350 g_{Feuchtbiomasse}/dm² getrocknet. Die getrocknete blaugrüne Biomasse wurde in einer Ultrazentrifugalmühle zu Pulver verarbeitet (Partikelgröße < 0,5 mm).
Ausführungsbeispiel 1 - Schritt c: Extraktion des Xylindeins
Die pulverförmige Pilzbiotrockenmasse wurde mit dem Extraktionsmittel 2-Butanon (MEK) versetzt. Dabei löste sich das blaugrüne Pilzpigment Xylindein im Extraktionsmitel. Die Extraktlösung wurde vom Extraktionsrückstand durch Filtration abgetrennt. Durch Rotationsverdampfung wurde der Extraktlösung das Extraktionsmittel entzogen. Das somit gewonnene Extrakt wurde in 15 mL Lösungsmittel 2-Butanon (MEK) zurückgelöst und im Volumen-Verhältnis 1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt (1 Teil MEK und 10 Teile destilliertes Wasser). Dabei fiel das Pilzpigment Xylindein aus und wurde abfiltriert. Anschließend wurde das Xylindein mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 103 °C für 24 h getrocknet.
Literatur

Stange, S., Steudler, S.; Delenk, H.; Werner, A.; Walther, T.; Bley, T.; Wagenführ, A. Optimierung der Pigmentbildung vom holzverfärbenden Pilz Chlorociboria aeruginascens, Teil 1: Biomasse- und Pigmentsbildung auf Agar und in Flüssigmedien holztechnologie, 2018, 59, 1, 52-60
Stange, S., Steudler, S.; Delenk, H.; Stange, R., Werner, A.; Walther, T.; Bley, T.; Wagenführ, A.
Optimierung der Pigmentbildung des holzverfärbenden Pilzes Chlorociboria aeruginascens, Teil 1: Pigmentbildung im Holzsubstrat holztechnologie, 2018, 59, 2, 47-54
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Weber, G.; Chen, H-L.; Hinsch, E.; Freitas, S.; Robinson S. Pigments extracted from the wood-staining fungi Chlorociboria aeruginosa, Scytalidium cuboideum, and S. ganodermophthorum show potential for use as textile dyes Color. Technol., 2014, 130, 445-452
Robinson, S. C.; Hinsch, E.; Weber, G.; Freitas, S. Method of extraction and resolubilisation ofpigments from Chlorociboria aeruginosa and Scytalidium cuboideum, two prolific spalting fungi Color. Technol., 2014, 130, 221-225
Boonleod, A.; Weber, G. L.; Ramzy, K. M.; Dias, V. R.; Remcho, V. T. Centrifugal partition chromatography: A preparative tool for isolationand purification ofxylindein from Chlorociboria aeruginosa Journal of Chromatography A, 1478, 2016, 19-25
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Claims

Verfahren zur biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein in einem Bioreaktor, mit den Schritten a. Kontaktieren des Reaktorinhalts mit Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. und Rühren des Reaktorinhalts unter Bildung von Xylindein-haltiger Biomasse, b. Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse, die sich in Schritt a. gebildet hat, c. Extraktion des Xylindeins aus der in Schritt b. abgetrennten Biomasse mit einem Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomasse, mit der in Schritt a. kontaktiert wird, ungefärbte Biomasse ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Lösungsmittel in Schritt c. ausgewählt ist aus Aceton, 2-Butanon oder einer Mischung daraus.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei nach der Abtrennung der Xylindein-haltigen Biomasse in Schritt b. und vor Schritt c. eine Trocknung und/oder Zerkleinerung der Biomasse stattfindet.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Reaktorinhalt in Schritt a. ein Nährmedium umfasst, das bis zu 50 Vol-% Orangensaft enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Reaktorinhalt in Schritt a. ein Nährmedium umfasst, das eine 1 Vol-%ige bis 20 Vol-%ige Orangensaft-Lösung enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Xylindein, erhalten in Schritt c., aufgereinigt wird durch die Schritte d. Trocknung des Xylindeins und Wiederauflösen in einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel e. Ausfällen gereinigten Xylindeins durch Zugabe von Wasser zu der Mischung aus Schritt d.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei aus dem in Schritt b. nach Abtrennung der Biomasse verbleibenden flüssigen Kulturüberstand weiteres Xylindein durch Ultrafiltration abgetrennt und aufkonzentriert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Pilzkultur Chlorociboria sp. ausgewählt ist aus Chlorociboria aeruginascens und Chlorociboria aeruginosa.
Verwendung ungefärbter Biomasse der Pilzkultur Chlorociboria sp. zum Animpfen bei der biotechnologischen Gewinnung des blaugrünen Pilzpigments Xylindein.