DE102012105613A1

DE102012105613A1 - Raffinationsverfahren

Info

Publication number: DE102012105613A1
Application number: DE201210105613
Authority: DE
Inventors: Herbert Riepl; Corinna Urmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2012-06-27
Publication date: 2014-01-23

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Raffinationsverfahren zur Abtrennung von insbesondere biologisch aktiven Substanzen und/oder Substanzgruppen aus einer Mischung, die eine Anzahl prenylierter Polyphenole umfasst, welches das Bereitstellen einer Lösung der Mischung, das Aufbringen der Lösung auf eine Festphase, das Eluieren von einer oder mehreren biologisch aktiven Subtanzen von der Festphase mit Hilfe einer schrittweisen Abfolge von unterschiedlichen Lösungsmitteln, wobei für wenigstens einen Schritt ein Lösungsmittelgemisch aus Lösungsmittel und einem Cylcodextrinderivat eingesetzt wird, und das Sammeln der jeweiligen im Schritt iii) gewonnenen Eluate, welche die biologisch aktiven Substanzen und/oder Substanzgruppen enthalten, umfasst. Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung des Raffinationsverfahrens zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen, insbesondere von prenylierten Polyphenolen, als pharmazeutisch aktives Mittel, und ein daraus herstellbares pharmazeutisch aktives Mittel, insbesondere angepasst zur Prävention oder Behandlung von neurodegenerativen und/oder karzinogenen Erkrankungen. Insbesondere betrifft die Erfindung das Gebiet der Naturstoffextrakte.

Description

Die Erfindung betrifft ein Raffinationsverfahren zur Abtrennung von insbesondere biologisch aktiven Substanzen und/oder Substanzgruppen aus einer Mischung, die eine Anzahl prenylierter Polyphenole umfasst, sowie die Verwendung des Raffinationsverfahrens zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen, insbesondere von prenylierten Polyphenolen, als pharmazeutisch aktives Mittel, und ein daraus herstellbares pharmazeutisch aktives Mittel, insbesondere angepasst zur Prävention oder Behandlung von neurodegenerativen und/oder karzinogenen Erkrankungen. Insbesondere betrifft die Erfindung das Gebiet der Naturstoffextrakte.
Der Einsatz von Naturstoffextrakten, wie z. B. Pflanzenextrakten, in der Phytotherapie ist limitiert durch die Konzentration der biologisch aktiven Substanzen und das Auftreten von Wechsel- und Nebenwirkungen gering konzentrierter Inhaltsstoffe. Gesucht wird nach Extrakten, welche auf eine bestimmte Wirkung zugeschnitten sind. Meist sind nur bestimmte Untergruppen bzw. Substanzklassen für bestimmte biologische Aktivitäten verantwortlich. Daher sind pharmazeutisch verwendete Extrakte regelmäßig auf diese Inhaltsstoffe standardisiert, d.h. ein Gehalt an einem dieser Inhaltsstoffe wird speziell beobachtet und eingestellt. Die Abtrennung bzw. Anreicherung dieser biologisch aktiven Gruppen ist eines der großen Probleme der Extraktherstellung für die Gewinnung von pharmazeutisch aktiven Mitteln.
Die Gewinnung bzw. Anreicherung dieser aktiven Substanzen wird herkömmlicherweise über komplizierte Verfahren wir z. B. Mazeration, Lösungsmittelextraktion, Gegenstromverteilung und seltener durch chromatographische Verfahren erreicht. Unter diese Verfahren fällt zum Beispiel die Auftrennung über eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Diese Verfahren gestalten sich aufwendig und sind meist sehr kostenintensiv. Beispielsweise benötigen sie den Einsatz von großen Mengen an Lösungsmitteln in der mobilen Phase oder an Säulenfüllmaterial der stationären Phase.
Aufgabe der Erfindung ist es ein verbessertes Verfahren zur Abtrennung und/oder Gewinnung von insbesondere biologisch aktiven Substanzen und/oder Substanzgruppen aus Mischungen mit einer Anzahl prenylierter Polyphenole, wie sie z. B. in polyphenolischen Pflanzenextrakten enthalten sind, zu erzielen. Insbesondere soll dieses Verfahren auch zur Gewinnung von Extrakten, in denen prenylierte Polyphenole mit einer bestimmten biologischen Aktivität angereichert sind, dienen.
Die Aufgabe wird durch ein Raffinationsverfahren nach Anspruch 1, die Verwendung des Raffinationsverfahrens zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen, insbesondere von prenylierten Polyphenolen als Reinsubstanzen oder als Gemisch von ein, zwei oder mehreren prenylierten Polyphenolen, als pharmazeutisch aktives Mittel nach Anspruch 10 und durch ein daraus herstellbares pharmazeutisch aktives Mittel nach Anspruch 12 gelöst, das insbesondere zur Prävention oder Behandlung von neurodegenerativen und/oder karzinogenen Erkrankungen angepasst ist.
Das erfindungsgemäße Raffinationsverfahren zur Abtrennung von insbesondere biologisch aktiven Substanzen und/oder Substanzgruppen aus einer Mischung, die eine Anzahl prenylierter Polyphenole umfasst, umfasst die folgenden Schritte:

i) Bereitstellen einer Lösung der Mischung,
ii) Aufbringen der Lösung auf eine Festphase,
iii) Eluieren von einer oder mehreren biologisch aktiven Subtanzen von der Festphase mit Hilfe einer schrittweisen Abfolge von unterschiedlichen Lösungsmitteln, wobei für wenigstens einen Schritt ein Lösungsmittelgemisch aus Lösungsmittel und einem Cylcodextrinderivat eingesetzt wird, und
iv) Sammeln der jeweiligen im Schritt iii) gewonnenen Eluate, welche die biologisch aktiven Substanzen und/oder Substanzgruppen enthalten.

Der Begriff Raffination bezeichnet im allgemeinen Sinne ein technisches Verfahren zur Reinigung, Veredlung, Trennung und/oder Konzentration von Rohstoffen, Nahrungsmitteln und technischen Produkten, z. B. aus einer Synthese über eine Anzahl (d. h. einen oder mehrere, z. B. zwei, drei, vier, usw.) Stufen, über mehrere aufeinanderfolgende Schritte, in denen unerwünschte Stoffe oder Verunreinigungen abgereichert und/oder das gewünschte Produkt angereichert oder als Reinsubstanz erhalten wird.
Das Raffinationsverfahren gemäß der Erfindung kann vorteilhafterweise einzelne oder Gruppen von prenylierten Polyphenolen, die z. B. in Naturstoffen meist nur in kleinen Konzentrationen vorkommen, mit Hilfe eines einfachen Filtrationsverfahrens trennen, d. h. anreichern und/oder die unerwünschten Substanzen in der Mischung abreichern. Unter den Begriff „prenylierte Polyphenole“ fallen Polyphenole, z. B. aus der Familie der Flavonoide wie Flavanone und Chalkone, welche mindestens eine prenylartige Seitenkette oder eine Pyrano- oder Furanoringstruktur besitzen. Prenylartige Seitenketten sind dabei z. B. eine Prenyl-(Isopentenyl-), Geranyl-, Farnesyl oder Lavandulyl-Seitenkette, bzw. eine optional verzweigte Alkenylseitenkette mit einer, zwei, drei oder mehreren Doppelbindungen.
Mit Hilfe einer Festphase bzw. festen Phase, auf welche die Mischung adsorbiert aufgebracht wird, und mit Hilfe einer bestimmten Abfolge von Lösungsmittelwaschschritten (Elution) wird eine Trennung oder Anreicherung erreicht. Bei der Elution werden bei jedem Schritt unterschiedliche Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische eingesetzt, um die Trennung bzw. An- oder Abreicherung zu erzielen. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass zur Abtrennung von prenylierten Poylphenolen von Fremdstoffen oder zur Trennung von prenylierten Poylphenolen untereinander Cyclodextrine als Additive zur flüssigen Phase vorteilhaft sind. Je nach eingesetztem Cyclodextrin und verwendetem Lösungsmittel sind dabei in der Klasse der prenylierten Polyphenole unterschiedliche Selektivitäten und somit auch Anreicherungsgrade an speziellen Substanzen erreichbar. Somit eignet sich das Raffinationsverfahren gemäß der Erfindung zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen und insbesondere von Pflanzenextrakten mit erhöhtem Anteil an bestimmten prenylierten Polyphenolen und wunschgemäß eingestelltem Verhältnis von Regioisomeren. Außerdem eignen sich die so hergestellten biologisch aktiven Substanzen bzw. Substanzmischungen insbesondere als pharmazeutisch aktive Mittel zur Prävention oder Behandlung von z. B. neurodegenerativen und kanzerogenen Erkrankungen.
Weitere Aufgaben und Vorteile der erfindungsgemäßen Gegenstände ergeben sich aus den nachstehend erläuterten bevorzugten Ausführungsbeispielen, wobei es nicht beabsichtigt ist, die Erfindung auf diese einzuschränken. Auch wenn manche bevorzugten Ausführungsformen nur für das Raffinationsverfahren erläutert sind, können diese auch mit den anderen Gegenständen der Erfindung kombiniert werden. Auch Kombinationen von beliebigen Ausführungsformen sind nicht vom Umfang der Erfindung ausgeschlossen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Raffinationsverfahren gemäß der Erfindung kann in dem Verfahren die biologisch aktive Substanz oder Substanzgruppe in wenigstens einem Elutionsschritt (Schritt iii)) angereichert werden, wenn in diesem Schritt ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch mit einem Cyclodextrinderivat eingesetzt wird. Vorzugsweise werden die zu trennenden Substanzen auf eine feste Phase aufgebracht, auf welcher die Polyphenole stark adsorbiert werden. Durch die spezielle Auswahl des Lösungsmittelgemisches und einer entsprechenden Verteilung einer oder einer Gruppe von Substanzen zwischen der flüssigen Phase und der festen Phase kann eine Anreicherung der gewünschten Substanz(en) erzielt werden. Um eine selektive Anreicherung oder sogar Reindarstellung zu erzielen, ist es bevorzugt, wenn nur eine Substanz oder Substanzgruppe aus der festen Phase in die flüssige Phase heraus gelöst wird. Zur Gewinnung von prenylierten Polyphenolen kann dies vorteilhafter Weise durch Zugabe eines Cyclodextrinderivats zu dem zur Elution verwendeten Lösungsmittel, d. h. als Additiv zu der flüssigen Phase, erfolgen. Dadurch kommt es zu einer selektiven Lösungsvermittlung und somit zur selektiven Anreicherung der gewünschten biologisch aktiven Substanzen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Raffinationsverfahrens umfasst die auf die Festphase zu gebende Mischung einen Naturstoffrohextrakt, insbesondere einen Pflanzenrohextrakt. Somit eignet sich das Raffinationsverfahren für die Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen aus Naturstoffen, bevorzugt mit möglichst wenigen Verunreinigungen beziehungsweise bevorzugt mit einem möglichst hohen Anteil an den gewünschten Produkten. Dabei können die eingesetzten Naturstoffextrakte direkt nach ihrer Gewinnung und insbesondere im Wesentlichen ohne vorherige Reinigung als Rohextrakte eingesetzt werden.
Im Bereich der polyphenolischen Pflanzenextrakte finden sich viele prenylierte Naturstoffe, z. B. aus der Familie der Flavonoide wie Flavanone und Chalkone. Dabei besitzen gemeinhin typische Flavonoide wie etwa Naringenin z. B. eine Prenyl-, Geranyl- oder Lavandulyl-Seitenkette, bzw. zusätzlich einen Pyrano- oder Furano-Ring. Durch die Anwesenheit der Prenylgruppe entsteht eine höhere Lipophilie, was eine bessere Aktivität vor allem an Membranen oder den Low-Density-Lipoproteinen bedingt. Die Anwesenheit der Prenylgruppe impliziert bei vielen biologischen Effekten einen Anstieg der z. B. antikanzerogen Aktivität oder östrogenartigen Aktivität. Naringenin zum Beispiel zeigt nur eine geringe östrogenartige Aktivität, während durch die Anwesenheit der Prenylgruppe das bis dato stärkste Phytoöstrogen 8-Prenylnaringenin entsteht. Dabei ausschlaggebend ist sowohl die Lage als auch die Art der Seitenkette. Während 8-Prenylnaringenin aus Hopfen als stärkstes bis dato bekanntes Phytoöstrogen eingestuft wird, zeigt das Isomer mit der Prenylgruppe an Position 6 oder das Isomer mit einer zur Geranylgruppe verlängerten Seitenkette, nämlich einer 8-Geranylnaringenin-Seitenkette, kaum eine östrogenartige Wirkung. Die Art und Lage der Seitenkette hat somit einen wesentlichen Einfluss auf die biologische Aktivität und daher auf die Pharmakotherapie. Die pharmazeutisch aktiven Mittel gemäß der Erfindung, z. B. Phytotherapeutika, werden deshalb bevorzugt auf die Gehalte solcher biologisch aktiver Isomere standardisiert.
Auf Grund ihrer pharmazeutischen Wirkungen, insbesondere bezüglich ihrer Eigenschaft zur neurodegenerativen und karzinogen Prävention oder Behandlung, kann das Raffinationsverfahren gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein oder eine Gruppe von prenylierten Polyphenolen, insbesondere prenylierte Flavonoide (z. B. Flavanone und/oder Chalkone), als biologisch aktive Substanz oder Substanzgruppe umfassen. Als beispielhafte prenylierte Polyphenole, die mit Hilfe des Raffinationsverfahrens gemäß der Erfindung getrennt werden können, können die nachstehend aufgeführten, beispielsweise in Hopfenextrakt oder anderen Pflanzenrohextrakten, wie z. B. unter anderem in unterschiedlichen Citrusarten vorkommende Verbindungen, bzw. deren synthetisch herstellbaren Derivate genannt werden:
Xanthohumol (XN),
Xanthohumol-C (XC),
4´´,5´´-Dehydroxanthohumol-C (DHC),
Isoxanthohumol (IX),
Isoxanthohumol-C (IXC),
8-Prenylnaringenin (8PN),
8-Prenylnaringenin-C (8PNC),
6-Prenylnaringenin (6PN),
6-Prenylnaringenin-C (6PNC),
6-Geranylnaringenin (6GN).
Diese können einzeln oder getrennt voneinander in den verschiedenen Eluaten angereichert bzw. abgetrennt werden.
Das Raffinationsverfahren gemäß einer weiteren Ausführungsform lässt sich auf die nachstehend dargestellten Naturstoffen anwenden. Das prenylierte Polyphenol kann demnach eine Verbindung sein, ausgewählt aus den Verbindungen der Gruppe mit den folgenden Strukturformeln:
wobei:
R₁ bis R₄ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, tert. Pentyl, usw.), C_2-6 Alkenyl (z. B. Ethenyl, Propenyl, Butenyl, Isobutenyl, Petenyl, Isopentenyl (Prenyl), usw.), prenylartigen Alkenylen (z. B. Geranyl, Farnesyl, Lavandulyl, usw.), C_2-6 Alkinyl (z. B. Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Pentinyl, Hexinyl und ihre Stereoisomere), -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O-, -CN oder zwei Substituenten überbrückenden Ringstrukturen (insbesondere z. B. aus Pyrano- bzw. Furanoringen);
R₆ bis R₁₀ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, tert. Pentyl, usw.), C_2-6 Alkenyl (z. B. Ethenyl, Propenyl, Butenyl, Isobutenyl, Petenyl, Isopentenyl (Prenyl), usw.), prenylartigen Alkenylen (z. B. Geranyl, Farnesyl, Lavandulyl, usw.), C_2-6 Alkinyl (z. B. Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Pentinyl, Hexinyl und ihre Stereoisomere), -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O-, -CN oder zwei Substituenten überbrückenden Ringstrukturen (insbesondere z. B. aus Pyrano- bzw. Furanoringen);
R₅ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, tert. Pentyl, usw.), C_2-6 Alkenyl (z. B. Ethenyl, Propenyl, Butenyl, Isobutenyl, Petenyl, Isopentenyl (Prenyl), usw.), prenylartigen Alkenylen (z. B. Geranyl, Farnesyl, Lavandulyl, usw.), C_2-6 Alkinyl (z. B. Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Pentinyl, Hexinyl und ihre Stereoisomere), -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O- oder -CN, wobei weiter bevorzugte Substituenten für R₅ H, -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -OR₃₀ sind und wobei R₃₀ insbesondere bevorzugt für prenylartige Alkylene wie z. B. Prenyl, Geranyl, Farnesyl oder Lavandalyl steht;
R₁₁bis R₁₅ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, tert. Pentyl, usw.), C_2-6 Alkenyl (z. B. Ethenyl, Propenyl, Butenyl, Isobutenyl, Petenyl, Isopentenyl (Prenyl), usw.), prenylartigen Alkenylen (z. B. Geranyl, Farnesyl, Lavandulyl, usw.), C_2-6 Alkinyl (z. B. Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Pentinyl, Hexinyl und ihre Stereoisomere), -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O-, -CN oder zwei Substituenten überbrückenden Ringstrukturen (insbesondere z. B. aus Pyrano- bzw. Furanoringen);
R₁₆ bis R₂₀ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, tert. Pentyl, usw.), C_2-6 Alkenyl (z. B. Ethenyl, Propenyl, Butenyl, Isobutenyl, Petenyl, Isopentenyl (Prenyl), usw.), prenylartigen Alkenylen (z. B. Geranyl, Farnesyl, Lavandulyl, usw.), C_2-6 Alkinyl (z. B. Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Pentinyl, Hexinyl und ihre Stereoisomere), -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O-, -CN oder zwei Substituenten überbrückenden Ringstrukturen (insbesondere z. B. aus Pyrano- bzw. Furanoringen).
R₂₅ und R₂₆ unabhängig ausgewählt sind aus O, S oder N(-OH);
R₃₀ ausgewählt ist aus prenylartigen Alkenylen (z. B. Prenyl, Geranyl, Farnesyl, Lavandulyl, usw.).
Die gestrichelte Linie steht entweder für eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung. Der Übersichtlichkeit wurden nur bei der ersten Erwähnung die beispielhaften Alkyl, Alkenyl bzw. Alkinylgruppen hinzugefügt. Diese bevorzugten Beispiele sollen für die gesamte Anmeldung gelten, auch wenn diese nicht explizit an dieser Stelle als Ausführungsbeispiele für diese Substituenten genannt sind.
Dabei können Substanzen mit R₂ oder R₃ (= unabhängige Auswahl von z. B. Prenyl, Geranyl, Lavandulyl, Farnesyl, Alkyl, Alkenyl, usw.) von den Substanzen R₁ oder R₄ (= unabhängige Auswahl von z. B. Prenyl, Geranyl, Lavandulyl, Farnesyl Alkyl, Alkenyl, usw.) auf Grund der Struktur bzw. des Substitutionsmusters abgetrennt werden.
Die vorstehend exemplarisch angeführten Substanzen können optional einen oder auch zwei oder drei kondensierte Pyranoringe an den optional substituierten Benzolringen als zwei Substituenten überbrückende Ringstrukturen enthalten:
wobei:
R₂₁ bis R₂₄ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, tert. Pentyl, usw.), C_2-6 Alkenyl (z. B. Ethenyl, Propenyl, Butenyl, Isobutenyl, Petenyl, Isopentenyl (Prenyl), usw.), Prenylartige Alkenyle (z. B. Geranyl, Farnesyl, Lavandulyl, usw.), C_2-6 Alkinyl (z. B. Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Pentinyl, Hexinyl und ihre Stereoisomere), -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O- oder -CN.
n, m stehen dabei für jeweils zwei benachbarte Kohlenstoffatome eines Benzolringes mit den jeweiligen Resten R₁ und R₂, R₂ und R₃, R₃ und R₄, R₆ und R₇, R₇ und R₈, R₈ und R₉, R₉ und R₁₀, bzw. mit den jeweiligen Resten R₁₁ und R₁₂, R₁₂ und R₁₃, R₁₃ und R₁₄, R₁₄ und R₁₅, R₁₆ und R₁₇, R₁₇ und R₁₈, R₁₈ und R₁₉, R₁₉ und R₂₀.
Alternativ oder in Kombination zu den Pyranoringen können auch ein zwei oder mehrere Furanoringe, d. h. sauerstoffhaltige Fünfringe, in den Substanzen enthalten sein. Diese können das gleiche Substitutionsmuster enthalten wie vorstehend bezüglich der Pyranoringe angeführt wurde. Um Wiederholungen zu vermeiden und zur Übersichtlichkeit wird hierauf vollumfänglich Bezug genommen.
Die Substanzen mit Pyrano- oder Furanoring können beispielsweise von Substanzen mit R₁, R₂, R₃, R₄, usw. (= unabhängige Auswahl von z. B. Prenyl, Geranyl, Lavandulyl, Farnesyl Alkyl, Alkenyl, usw.) mittels des erfindungsgemäßen Raffinationsverfahrens abgetrennt werden.
Insofern wird nachstehend ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel für das Raffinationsverfahren beschrieben mit dem ein Extrakt (Eluat) hergestellt werden kann, der besonders diese prenylierten Flavonoide angereichert hat, und insbesondere sogar ein Extrakt (Eluat), der ein spezifisches Verhältnis der Regioisomere, zum Beispiel 6-Prenylnaringenin und 8-Prenylnaringenin, angereichert hat. Dieses Raffinationsverfahren eignet sich sowohl als verbesserte Methode zur Anreicherung eines bestimmten Regioisomers als auch zur sequentiellen Reindarstellung in großen Mengen, d. h. als Herstellungsverfahren im präparativen Maßstab. Jedoch ist dieses Verfahren für eine Vielzahl an biologisch aktiven Substanzen anwendbar, auch wenn diese hier nicht explizit aufgeführt sind.
Des Weiteren kann eine Veränderung der Prenylgruppe z.B. zu einem Pyranoring die biologischen Eigenschaften verändern. So wurde zum Beispiel festgestellt, dass die Einführung des Pyranorings statt der Prenylgruppe am Xanthohumol eine Verschlechterung der anti-proliferativen Wirkung bei kanzerogenen Zellen mit sich bringt. In Untersuchungen zur neuronalen Differenzierung von Stammzellen allerdings, wurde eine signifikante Aktivitätssteigerung durch Umwandlung der Seitenkette zum Pyranoring erreicht. Insofern wird hier nachfolgend eine Extraktherstellung mittels des erfindungsgemäßen Raffinationsverfahrens beschrieben, in dem diese Pyranoflavonoide angereichert und somit von den Prenylkomponenten abgetrennt werden können. Dies kann sowohl der Reindarstellung der Pyranoflavonide dienen, als auch des Einsatzes des Extraktes in Prävention oder Behandlung von insbesondere neurodegenerativen und/oder kanzerogen Erkrankungen. Überraschender Weise konnte am Beispiel der Hopfenprenylflavonoide gezeigt werden, dass sich durch den Einsatz von Cyclodextrinen als Additive bzw. Lösungsvermittler in einer flüssigen Phase bei der Filtration an einer Festphase eine solche Anreicherung ergab. Die Erfindung soll durch diese beispielhaften Erläuterungen jedoch nicht auf die hierin genannten, bestimmten Beispiele beschränkt werden.
Cyclodextrine sind 1,4-glykosidische, cyclische Verbindungen von mehreren Glucosemolekülen. Die Einteilung der Cyclodextrine erfolgt, basierend auf der Anzahl der verbauten Zuckereinheiten. Bevorzugt eingesetzte Cyclodextrine sind α (6 Zuckereinheiten), β(7) und γ(8)-Cyclodextrin, die optional substituiert sein können. Sie haben eine torusartige Grundstruktur, die durch die cyclisch angeordneten Zuckereinheiten gebildet wird. Die torusartigen Makrozyklen können mit unterschiedlichen kleineren Molekülen Einschlusskomplexe bilden (vgl. 1). Dabei sind die unterschiedliche Größe der Cyclodextrine und die Flexibilität der Gastkomponente verantwortlich für die Selektivität der Einschlusskomplexe.
Die Struktur der Cyclodextrine bietet durch Derivatisierung der Hydroxygruppen vielfältige Möglichkeiten zur Veränderung der Eigenschaften. So kann gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform das Cyclodextrinderivat einen oder mehrere Substituenten aufweisen, wie zum Beispiel einen oder mehrere der folgenden Substituenten: Methyl, Hydroxypropyl, 6-O-sulfo, 2-Hydroxyethyl, 2,3,6-tri-O-benzoyl, Carboxymethyl, Acetyl, Succinyl, Succinyl-(2-hydroxypropyl), 2,3,6-tri-O-acetyl, Butyl, 2,3,6-tri-O-methyl, 2,6-di-O-pentyl und 6-O-t-butyldimethylsilyl. Bevorzugt werden Methyl- und/oder Hydroxypropylsubstituenten eingesetzt, da die Cyclodextrine wasserlöslicher gemacht werden können und diese kostengünstig erhältlich sind. Die verbesserte Wasserlöslichkeit ist beispielsweise für die anschließende Abtrennung und Regeneration der Cyclodextrine vorteilhaft.
Cyclodextrine werden im Multi-Tonnen Maßstab produziert und haben vielfältige Anwendung in der chemischen und pharmazeutischen Industrie. So werden sie z. B. als Drug-Carrier, zur Stabilisierung von Vitaminen und Aromastoffen sowie zur geschmacklichen Neutralisierung von Aromastoffen eingesetzt. Dabei bilden sie mit den Gastmolekülen Komplexe aus. Als Vorteil der Verwendung von Cyclodextrinen in dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die große Anzahl von unterschiedlichen Cyclodextrinen und somit eine vielfältige Trennung von Substanzen an zweckmäßigen Festphasen bei geringen Kosten genannt werden.
Cyclodextrine sind aufgrund der Zuckerstruktur im UV/VIS-Bereich transparent, so dass die Detektion eingeschlossener Substanzen ohne großen apparatetechnischen Aufwand möglich ist. Des Weiteren sind die Cyclodextrine in einem großen pH-Bereich stabil und können somit sowohl Komplexe mit geladenen wie auch neutralen Molekülen eingehen. Auch dies sind weitere Vorteile bei der Verwendung der Cyclodextrine als Additive in den Lösungsmittelgemischen des Filtrationsverfahrens.
Die hier beschriebene Erfindung nutzt dabei nicht die Trennung von Naturstoffen durch Aufarbeitung von stöchiometrischen Cyclodextrin-Substanzkomplexen oder die Auftrennung an langen Trennsäulen mit cyclodextrinhaltigem Material als stationärer Phase, sondern arbeitet durch Adsorption eines ursprünglichen Extrakts auf eine Festphase und anschließendem Waschen mit cyclodextrinhaltigen Lösungsmitteln. Bei dem Waschen werden die adsorbierten Substanzen unter Zuhilfenahme der Lösungsvermittelnden Funktion des jeweiligen Cylcodextrins in die flüssige Phase gebracht und dort angereichert. Die Abtrennung verläuft also nach einem Filtrationsprinzip und nicht nach dem Prinzip einer chromatographischen Trennung, bei der ständige Adsorptionseffekte an einer stationären Phase und das daran Entlangbewegen der mobilen Phase zu einer Gleichgewichtsverteilung und somit zu einer Auftrennung der einzelnen Substanzen führen. Solche cyclodextrinhaltigen flüssigen Phasen sind in keinster Weise mit klassischen flüssigen Phasen wie Lösungsmitteln vergleichbar, sie sind auch nicht vergleichbar mit der Chromatographie von Cyclodextrinkomplexen, was durch den folgenden Mechanismus erklärt werden kann.
Bei einer chromatographischen Auftrennung ist der Wert des Verteilungskoeffizienten k so, dass sich eine relativ große Konzentration der Substanzen in der mobilen Phase einstellt (siehe ) Durch die Bewegung dieses Volumenstroms und einer andauernden Adsorption und Desorption der Substanzen an die feste Phase und von ihr weg kommt es zu der charakteristischen Wanderungsgeschwindigkeit von Substanzen in dem Prozess. Durch kleine Unterschiede des k-Werts (Verteilungskoeffizient k einer Substanz zwischen stationärer und mobiler Phase) resultieren letztlich kleine Unterschiede in den Wanderungsgeschwindigkeiten der einzelnen aufzutrennenden Substanzen über die Länge der stationären Phase. Zweckmäßige Säulenlängen für den präparativen Maßstab im Labor liegen bei etwa 30 cm oder höher, um entsprechend genügend theoretische Trennstufen sicherstellen zu können.
In dem hier vorgestellten Prozess ist die Bindung der Substanzen in und an der Festphase jedoch so groß, dass es nicht zu einer Wanderung („Elution“) unter solchen einfachen Lösungsmittelströmen kommt. Bei der Auftragung auf die Festphase geht die gesamte Lösungsmittelkonzentration der Substanzen in die Festphase über und wird rückstandsfrei darin festgehalten. Auch durch sehr große Waschvolumina wird keine Substanzwanderung ermöglicht, weswegen Verunreinigungen sehr leicht weggewaschen werden können. Erst durch Zugabe eines Komplexbildners, einem lösungsvermittelnden Additiv wie einem Cyclodextrin, in die Waschlösung kommt es bei dem hier vorgestellten Prozess zu einer sehr selektiven Aufnahme einiger weniger, für das Cyclodextrin charakteristischer Substanzen bzw. Substanzarten in die flüssige Phase, z. B. in Form eines Cyclodextrin-Komplexes. Dabei wird die Selektivität des Cyclodextrins extrem verstärkt durch die Konkurrenz infolge des sehr starken Adsorptionsprozesses der gewünschten prenylierten Polyphenole an der Festphase, die ungefähr gleich gut für alle der hier betrachteten Substanzklassen ist. Im Unterschied zur Chromatographie gibt es bei dem hier betrachteten Prozess daher keine wesentliche Konzentration der freien Substanzen in der mobilen Phase. Außerdem findet keine sich wiederholende Adsorption und Desorption der herausgelösten Substanzen statt, die für eine für die Chromatographie zweckmäßige theoretische Trennstufenanzahl erforderlich ist.
Durch den Zusatz von kleinen Mengen Cyclodextrinen (CD) zu Mischungen mit den Naturstoffmolekülen M (M1, M2, (...), Mn) wird in der flüssigen Phase eine Selektion hinsichtlich Größe und Geometrie an einzelnen Molekülen gemäß dem Komplexierungsgleichgewicht (1) erreicht. In Kombination mit einer festen Phase wie sie erfindungsgemäß vorliegt, gilt zusätzlich zum Komplexierungsgleichgewicht (1) das Gleichgewicht von Cyclodextrin mit der Oberfläche einer festen Phase (2), für beide Spezies (3) und insbesondere für den freien Naturstoff M (4). Dies ist in der Gleichung (GL1) veranschaulicht:
Durch Anwesenheit eines Cyclodextrinzusatzes in einem Lösungsmittel kann die Löslichkeit der Spezies M1 von M2, (...), Mn stark selektiert werden. Dies ist der Fall, wenn sich das Gleichgewicht (1) bezüglich einer oder einer Gruppe von Substanzen (M1) auch nur geringfügig einstellen kann, und zwar weil das Gleichgewicht (4) sich gegenüber einer Substanz oder einer Gruppe von Substanzen verschiebt. Da die Komplexierung reversibel als Gleichgewichtsprozess erfolgt, ist es grundsätzlich möglich, die eingeschlossenen Substanzen mit einer hohen Ausbeute zu isolieren. Eine Trennung der einzelnen M1 bis Mn ist dann möglich, wenn die Substanzen zu dem jeweiligen in der mobilen Phase eingesetzten Cyclodextrin möglichst unterschiedlich hohe Affinitäten haben. Bevorzugt, hat nur jeweils eine Substanz (oder Substanzgruppe) eine gewisse, wenn auch meist nur geringfügige Affinität, wobei die anderen im Wesentlichen keine Affinität aufweisen und somit im Wesentlichen nicht von der festen Phase desorbiert werden.
Erfindungsgemäß können durch eine spezielle Abfolge von Lösungsmittelwaschschritten mit unterschiedlichen Lösungsmitteln und/oder Lösungsmittelgemischen aus einer Masse eines auf einer Festphase aufgezogenen Extrakts, der den Fall einer starken Adsorption erfüllt, sequentiell mit cyclodextrinhaltigen Lösungen selektiv Substanzen bzw. Substanzgruppen in großer Reinheit abgetrennt werden.
Als Modellsystem zur Abschätzung des Einflusses der unterschiedlichen Gleichgewichte (Verteilungskoeffizienten k) wurde eine dünnschichtchromatographische Untersuchung durchgeführt. Die aus diesen Untersuchungen hervorgegangen RF-Werte zeigten die grundsätzlichen Unterschiede der getesteten Festphasen und Cyclodextrine auf. Durch den Zusatz von Cyclodextrinen zum Laufmittel werden die Flavonoide komplexiert, ihre Löslichkeit im Laufmittel heraufgesetzt und die Wechselwirkung mit der stationären Phase herabgesetzt. Sie werden nun abhängig von ihrer Komplexierungsstärke (Affinität) und der Cyclodextrinkonzentration auf der DC-Platte transportiert. Ein normiertes Maß für die Bandenwanderung in dünnschichtchromatographischen Verfahren stellt der Retentionsfaktor (RF-Wert) dar (vgl. GL2). R_F = Laufstrecke Bande / Laufstrecke Laufmittel (GL2)
Mit der Erhöhung der Cyclodextrinkonzentration vergrößert sich die Laufstrecke der Banden relativ zur Laufmittelfront und somit der RF-Wert. Im Bereich der Nichtsättigung mit Cyclodextrinen verhält sich dieser Anstieg bei Bildung eines 1:1 Komplexes linear. Die aus einer Auftragung der Cyclodextrinkonzentrationen gegen die RF-Werte erhaltenen Steigungen (m) dienen als Maß zur Abschätzung der Elution der anschließend durchgeführten Anreicherung.
Das Modellsystem lieferte des Weiteren die Beweise, dass auch die beiden für die Modelluntersuchung synthetisch hergestellten Substanzen 8-Prenylnaringenin-C und 6-Prenylnaringenin-C, welche ebenfalls in der Natur vorkommen, von den Prenylflavanonen durch gezielte Auswahl des Lösungsmittelgemisches und insbesondere des verwendeten Cyclodextrins abgetrennt werden können.
Die durch das Modellsystem bestimmten Konditionen zur Trennung können auf das präparative Trennungsverfahren übertragen werden, so dass eine Anpassung der Lösungsmittelgemische und der Festphasen an die jeweilige Ausgangsmischung von diesem Modell aus möglich ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann als Lösungsmittel Wasser und/oder ein organisches Lösungsmittel, optional Methanol, Aceton, Acetonitril oder eine Mischung daraus eingesetzt werden. Polare Lösungsmittel, wie z. B. Wasser oder Alkohole, sind insbesondere im Schritt der Elution der biologisch aktiven Substanz bevorzugt, da sie gut mit Cylcodextrinen mischbar sind. Bevorzugt werden auch am Anfang des schrittweisen Eluierens reine Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemische, d. h. Lösungsmittelmischungen ohne Cylcodextrinzusatz, eingesetzt, da damit viele Verunreinigungen und unerwünschten Substanzen schon von der Festphase abgelöst werden können und demnach im späteren Verfahren nicht mehr stören. Nachfolgend enthalten dieses Lösungsmittel die Cyclodextrine in jeglicher Konzentration wobei eine Einschränkung durch die Viskosität gegeben ist. Zu bevorzugen sind Konzentrationen im Bereich von 0,01 mmol/l bis 3 mol/l.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Raffinationsverfahrens gemäß der Erfindung umfasst die Festphase ein Polyamid-Trägermaterial, wobei alle Arten an Polyamiden unter diese Definition fallen können. Des Weiteren können alle Festphasen verwendet werden, auf welchen die Polyphenole stark adsorbieren und nicht mit Lösungsmitteln wie z. B. Wasser ablösbar sind. Unter solche Festphasen fallen die Umkehrphasen wie z. B. RP18, RP8, RPPhenyl. Des weiteren können Phasen wie XAD, Polystyrole und Divinylbenzole im erfindungsgemäßen Verfahren als zweckmäßige Festphasen eingesetzt werden.
Aufgrund der Löslichkeit der Polyphenole bei basischem pH-Wert wird in einer weiteren Ausführungsform des Raffinationsverfahrens der pH-Wert im Elutionsschritt (Schritt iii)) im sauren bis neutralen Bereich, bevorzugt bei einem pH-Wert von etwa 1 bis 7, weiter bevorzugt bei einem pH-Wert von 3 bis 7 eingestellt. Die bevorzugten pH-Bereiche sind auf Grund der geringeren Ionenkonzentration im Lösungsmittel für effektivere Trennungen vorteilhaft.
Grundsätzlich kann die Anreicherungsmethode wie folgt durchgeführt werden.
Die Vorbereitung des Eluiervorgangs d. h. die Adsorption auf einer Festphase kann auf unterschiedliche Weisen erfolgen.

1. So kann der Extrakt durch Lösen in Lösungsmitteln (geeignet ist zum Beispiel Methanol, Ethylacetat oder Aceton oder sämtliche Lösungsmittel in welchen die Substanzen löslich sind), Zugabe der festen Phase und anschließendes wiederholtes Entfernen des Lösungsmittels auf die feste Phase aufgezogen werden.
2. Des Weiteren werden Naturstoffextrakte, auch zur Analyse, vielfach über das Verfahren der Festphasenextraktion gewonnen. Hier verbleiben bei Verwendung geeigneter herkömmlicher Lösungsmittelgemische die meisten prenylierten Naturstoffe auf der festen Phase und können in Folge dessen direkt mit der vorgestellten Methode weiterverarbeitet werden. Hierbei entfallen die Schritte i) und ii), da diese schon in der Vorbereitung durchgeführt wurden.
3. Eine weitere Möglichkeit ist das Lösen des Extraktes in einer geringen Menge an Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemischen. Die prenylierten Naturstoffe verbleiben bei Einsatz einer geeigneten festen Phase so auf dieser haften.

Nach der Adsorption der prenylierten Naturstoffe auf der festen Phase werden unterschiedliche Volumina von cyclodextrinfreien und cyclodextrinhaltigen flüssigen Phasen durch dieses feste Bett geleitet. Dabei kann die Durchleitung sowohl mit oder ohne Druck bzw. Unterdruck erfolgen und ist abhängig von der Schichtdicke der Festphase.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Raffinationsverfahren gemäß der Erfindung umfasst es den Schritt der Gewinnung der abgetrennten biologisch aktiven Substanzen aus dem jeweiligen gesammelten Eluat durch Ansäuren mit einer wässerigen Säure und Flüssigphasenextraktion der biologisch aktiven Substanz oder Substanzgruppe mit Hilfe eines in Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmittels. Die saure Aufarbeitung, in der die Cyclodextrinlösung mit einem Überschuss an Wasser versetzt wird, wird anschließend mit einer herkömmlichen Säure (wie z. B. HCl) auf pH ca. 1–2 gebracht. Dadurch werden die prenylierten Naturstoffe durch flüssig-flüssig-Extraktion mit nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln (z. B. Ethylacetat oder Dieethylether) aus der wasserhaltigen Cyclodextrinphase entfernt. Durch diese Aufarbeitungsmethode wird das Problem der großen Mengen an optional benötigen Selektoren gelöst, da die Cyclodextrine nach der Trocknung erneut eingesetzt werden können. Dies bedingt auch die günstigen Kosten des Verfahrens.
Die Gewinnung der Substanzen kann alternative auf folgende Arten erfolgen:

1. So können die Naturstoffe durch kleine Moleküle wie z. B. DMSO verdrängt werden. Anschließend können sie mit organischen, bevorzugt nicht oder nur wenig mit Wasser mischbaren Lösungsmittel aus einer wässrigen Phase abgetrennt werden.
2. Eine weitere Möglichkeit wäre die Behandlung der Cyclodextrine mit Enzymen, wie z.B. Amylase, so dass die Ringform der Dextrine geöffnet werden würde und die prenylierten Naturstoffe so freigesetzt werden. Die Naturstoffe können im Folgenden durch Filtration oder flüssig-flüssig-Extraktion gewonnen werden.

Das Prinzip der Erfindung wird im Folgenden anhand von Zeichnungen und aufgenommenen Chromatogrammen beispielshalber noch näher erläutert, wobei die Figuren zeigen:
1 eine schematische Darstellung des Einschlusses von Naringenin in ein Cyclodextrin,
2 schematisch die unterschiedlichen Prinzipien der Chromatographie und der Filtration,
3 eine schematische Darstellung der in den dünnschichtchromatographischen Untersuchungen erhaltenen Steigungen m,
4 ein HPLC-Chromatogramm der Elution mit Wasser,
5 ein HPLC-Chromatogramm der Elution mit HP-α-Cyclodextrin,
6 ein HPLC-Chromatogramm der Elution mit HP-γ-Cyclodextrin,
7 ein HPLC-Chromatogramm des Rohextraktes im Vergleich zu einem HPLC-Chromatogramm der Elution mit HP-β-Cyclodextrin,
8 ein HPLC-Chromatogramm des Rohextraktes im Vergleich zu einem HPLC-Chromatogramm der Elution mit Methanol,
9 ein HPLC-Chromatogramm des Produktgemisches (λ = 290 nm),
10 ein HPLC-Chromatogramm der aufgearbeiteten Cyclodextrinfraktion (λ = 290 nm),
11 ein HPLC-Chromatogramm der Methanolfraktion (λ = 290 nm).
1 zeigt eine schematische Darstellung des Einschlusses von Naringenin in ein Cyclodextrin, wobei verschiedene Reste des Naringenin wegen der besseren Veranschaulichung weggelassen wurden. Der Einschluss basiert auf Komplexbildungsreaktionen, insbesondere auf schwachen Wechselwirkungen wie van-der-Waals-Kräften.
In der 2 sind schematisch zur Erklärung der unterschiedlichen Grundprinzipien der Chromatographie und der Filtration die auf der Säule während der Trennung ablaufenden Einzelprozesse über die jeweilige Säulenlänge veranschaulicht. 2a zeigt wie sich die Konzentrationsverhältnisse der beiden Substanzen M1 und M2 an der stationären Phase SP bzw. mobilen Phase MP bei der Chromatographie über die Trennzeit t (bzw. Säulenlänge l) verändern. Der Verteilungskoeffizient bleibt über die gesamte Länge der Säule gleich und es stellen sich auf der gesamten Länge die gleichen Verteilungsverhältnisse zwischen der stationären Phase und der mobilen Phase ein. Durch die unterschiedlichen Affinitäten zu der stationären Phase SP wandern die Substanzen M1 und M2 mit unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten über die Säule und führen so zu unterschiedlichen Banden auf der Säule, d. h. sowohl in der stationären Phase SP als auch in der mobilen Phase MP.
Aus der 2b ist ersichtlich, dass bei der Filtration mit Hilfe des lösungsvermittelnden Additivs Cyclodextrin C, selektiv die Substanz M1 aus der festen Phase FP in die flüssige Phase fP gelöst wird, da die freien, in der flüssigen Phase fP gelösten Moleküle der Substanz M1 immer wieder durch Cyclodextrin C unter Bildung des Komplexes C-M1 komplexiert und ausgewaschen werden. Das heißt, der Verteilungskoeffizient wird mit Hilfe des Cyclodextrins in Richtung der flüssigen Phase verschoben. Die Substanz M2 verbleibt stationär auf der festen Phase FP zurück. Somit kann eine selektive Anreicherung der Substanz M1 in der flüssigen Phase fP in Form des Komplexes C-M1 erhalten werden.
Die Beschreibungen der 3 bis 11 finden sich an den jeweiligen Textstellen, insbesondere in der Beschreibung der folgenden Beispiele.
Im Folgenden wird die Erfindung an Hand von Beispielen erläutert, wobei diese nicht dazu gedacht sind, die Erfindung darauf zu beschränken.
Beispiel 1: Modellsystem
Für die Abschätzung des Komplexierungsverhaltens der Substanzen wurde eine Konzentrationsreihe der Cyclodextrine im Bereich von 0.00–0.20 mol/l erstellt. Dazu wurden DC-Platten mit F254 Fluoreszenzindikator von Machery und Nagel (Düren, Deutschland) verwendet. Von den zu untersuchenden Substanzen wurde 1 mg in 1 ml Methanol gelöst und davon je 2 µl auf die markierte Startlinie aufgetragen. Als Laufmittel dienten die verschiedenen Konzentrationen der Cyclodextrine in unterschiedlichen Lösungen: im Fall von Polyamid war das Lösungsmittel bidestilliertes Wasser. Nach zwei Stunden Equilibrierung des Laufmittels wurden die DC-Platten in die Entwicklungsgefäße (600 ml Bechergläser mit Deckel) gestellt. Nachdem die Laufmittelfront einen Punkt ca. 0,5–1,0 cm vor dem Ende der Platte erreicht hatte, wurde die Platte herausgenommen, die Laufmittelfront mit Bleistift markiert und die Platte an der Luft getrocknet. Die Bestimmung der Substanzen erfolgte mittels UV-Lampe bei λ = 254 nm und λ = 360 nm.
Bei Verwendung des Hydroxypropyl-Cyclodextrinderivats (siehe 3) zeigte 8-Prenylnaringenin keine Veränderung der RF-Werte, da es bei jeglicher getesteten Cyclodextrinkonzentration auf der Startlinie verblieb. Xanthohumol zeigte etwas höhere Werte der Steigung. 8-Prenylnaringenin-C 8-PNC wies eine signifikant größere Steigung als 8-Prenylnaringenin 8-PN auf. Bei Xanthohumol-C XC und 4´´,5´´-Dehydroxanthohumol-C DHC wurde eine signifikant höhere Steigung als bei Xanthohumol X festgestellt. Im Vergleich zwischen Isoxanthohumol-C IXC und Isoxanthohumol IX konnte eine signifikant größere Steigung des Pyranoflavonoids IXC nachgewiesen werden. 6-Prenylnaringenin 6-PN besaß im Vergleich zu 6-Prenylnaringenin-C 6-PNC eine signifikant geringere Steigung.
Die Steigungen von 8-Prenylnaringenin 8-PN und 6-Prenylnaringenin 6-PN unterschieden sich signifikant voneinander, so dass eine selektive Anreicherung bzw. Abtrennung der beiden Substanzen möglich zu sein schien.
Beispiel 2: typische Abfolge der Anreicherung mit qualitativer Auswertung
Es wurde ein käuflicher Hopfenextrakt, welcher reich an Prenylflavonoiden ist, als Rohextrakt verwendet. Die HPLC-Analytik wurde mit einem System der Firma Shimadzu mit zwei Pumpen LC-20AD, Probengeber SIL-20AC HT, Säulenofen CTO-20A und PDA-Detektor SPD-M20 durchgeführt. Als Säule wurde eine Luna RP C18(2) 4.6 × 250 mm, 5 u, 100 Å der Firma Phenomenex verwendet. Der verwendete Gradient setzt sich zusammen aus Lösungsmittel A (Wasser 1% Ameisensäure) und B: Acetonitril. Von 00.00–34.00 min wurde der Anteil des Lösungsmittel B von 40 auf 91 % erhöht. Im Anschluss wurde von 34.01–35.00 min der Anteil des Lösungsmittel B von 91 auf 95 % erhöht. Im weiteren Verlauf wurde von 35.01–37.50 min der Anteil des Lösungsmittel B auf 95 % gehalten.

i) Als erster Schritt wurde als flüssige Phase Wasser verwendet. Dies diente zum einen zum Konditionieren des Polyamids als fester Phase und zum anderen als erster Waschschritt für Verunreinigungen. Die 4 zeigt das erhaltene HPLC-Chromatogramm mit den abgetrennten Verunreinigungen.
ii) Im nächsten Schritt wurde eine α-cyclodextrinhaltige Phase zur Abtrennung weiterer kleinerer Moleküle und Verunreinigungen verwendet (siehe 5).
iii) Schon in der Modelluntersuchung war die Selektivität des γ-Cyclodextrins auf Isoxanthohumol (IX) aufgefallen. Auch im Anreicherungsverfahren führte die Verwendung dieses Cyclodextrins zu einer Fraktion, welche selektiv an Isoxanthohumol (RT = 11,01 min), angereichert war (siehe 6).
iv) Der wichtigste Anreicherungsschritt kam durch die Verwendung der β-Cyclodextrine zustande, da hier Substanzen aufgrund der Regioselektivität oder einer veränderten Prenylgruppe abgetrennt wurden (siehe 7). In der 7 ist oben ein HPLC-Chromatogramm des Rohextrakts und unten ein HPLC-Chromatogramm der Elution mit HP-β-Cyclodextrin gezeigt, so dass die Anreicherung der jeweiligen Substanzen in dieser Fraktion deutlich erkennbar ist. Wichtig ist hier, dass sowohl die Pyranoflavonoide wie Xanthohumol-C (XC) als auch die an Position 6 substituierten Naturstoffe, nämlich 6-Prenylnaringenin (6PN) und 6-Geranylnaringenin (6GN), von den Prenylflavonoiden bzw. an Position 8 substituierten Flavanonen abgetrennt wurden. Isoxanthohumol wurde schon im Schritt iii) abgetrennt. Ein an ersteren Substanzen angereicherter Extrakt eignet sich unter anderem für den Einsatz gegen neurodegenerative Erkrankungen.
v) Im Gegensatz dazu zeigte das Chromatogramm (vgl. 8) der auf der festen Phase verbleibenden Naturstoffe, welche nach Durchführung der Anreicherung mit Methanol vom Trägermaterial gelöst wurden, dass die an Position 8 substituierten Naturstoffe, wie 8-Prenylnaringenin (8PN) und 6,8-Diprenylnaringenin (6,8PN), und jene mit offener Seitenkette, wie Xanthohumol (XN) und 5´-Prenylxanthohumol (5´PX) bevorzugt auf der festen Phase verblieben. In der 8 ist oben ein HPLC-Chromatogramm des Rohextrakts und unten ein HPLC-Chromatogramm der Elution der festen Phase mit Methanol gezeigt, so dass die Anreicherung der jeweiligen Substanzen in dieser Fraktion deutlich erkennbar ist.

Beispiel 3: Präparative Trennung
Es wurde ein Hopfenextrakt, welcher reich an Prenylflavonoiden ist, verwendet.
Der Hopfenextrakt wurde in organischen Lösungsmitteln (Methanol oder Ethylacetat) gelöst und mit der fünffachen Menge an Trägermaterial Polyamid (Chromabond^® Sorbens PA, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) vermengt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und so der Rohextrakt auf das Trägermaterial aufgezogen. Eine 50 ml Glasspritze (Optima^®, Fortuna, Poulten Graf, Wertheim, Deutschland) wurde aufgrund der fehlenden Fritte mit einem Glasfaserfilter (25 mm Whatman^® Maidstone, England) versehen und eine Schicht aus Polyamid eingefüllt. Das Trägermaterial mit dem Hopfenextrakt wurde auf die untere Schicht gegeben und anschließend mit Quarzsand beschwert. Die unterschiedlichen Laufmittel wurden mit Unterdruck (max. 5 mHg; SPE-Vakuumblock) oder ohne Unterdruck durch die Säulenpackung geleitet. Die Auftrennung in Fraktionen erfolgte nach Lösungsmittelmenge oder visuell orientiert an den gelben Banden.
Je 200 mg Hopfenextrakt wurden in Methanol gelöst und auf 1 g Polyamid aufgezogen. Eine Optima Spritze (25 ml) wurde wie oben beschrieben befüllt, wobei 1,5 g Polyamid als untere Schicht verwendet wurden. Die Elution erfolgte mit je 20 ml Wasser, 20 ml der Cyclodextrinlösung (0,05 mol/l) und 20 ml Wasser. Die Flavonoide wurden aus den Cyclodextrinen freigesetzt. Die restlichen Flavonoide wurden mit Methanol vom Trägermaterial gelöst.
Die Masse der aufgearbeiteten und getrockneten Cyclodextrinfraktion betrug 7,6 mg, die der Methanolfraktion 183,3 mg. Dies entsprach 4 % des eingesetzten Extrakts. Die Massendifferenz ergab einen Verlust an Substanz von ca. 5 %. Dieser war begründet durch Verluste beim Umfüllen in die Filtrationsapparatur, sowie durch die unvollständige Ablösung der verbleibenden Substanzen vom Polyamid.
Somit konnten ca. 95 % des eingesetzten Rohextrakts nach der Raffination wieder zurückgewonnen werden.
Beispiel 4: Präparative Anreicherung von 8- und 6-Prenylnaringenin
Verwendet wurde ein Gemisch aus 8-Prenylnaringenin und 6-Prenylnaringenin. 117,6 mg des Gemisches wurden auf 588 mg Polyamid aufgezogen und die Anreicherung analog Beispiel 1 vorbereitet. Die Elution erfolgte mit 50 ml einer HP-β-Cyclodextrinlösung (c = 0,05 mol/l). Anschließend wurde mit 20 ml Wasser nachgewaschen und die restlichen Flavonoide mit 50 ml Methanol vom Trägermaterial eluiert.
Wie aus dem HPLC-Chromatogramm des Produktgemisches (siehe 9) ersichtlich ist, lagen 8-Prenylnaringenin und 6-Prenylnaringenin in nahezu gleichen Konzentrationen vor.
Das Produktgemisch wurde wie in Beispiel 3 beschrieben behandelt und die Flavonoide aus den Cyclodextrinen freigesetzt. Die Konzentration an 6-Penylnaringenin (RT = 21,30 Minuten) war wesentlich größer als die Konzentration an 8-Prenylnaringenin (RT = 16,57 Minuten). Dies ist an Hand der Peakgröße schon aus 10 (HPLC-Chromatogramm der aufgearbeiteten Cyclodextrinfraktion bei λ = 290 nm) ersichtlich.
Das in 11 gezeigte HPLC-Chromatogramm (λ = 290 nm) zeigt die Methanolfraktion, in welcher das 8-Prenylnaringenin (RT = 16,55 Minuten) angereichert wurde.
Aus diesem Beispiel lässt sich erkennen, dass an Position 6 substituierte Flavanone sich besser in Cyclodextrine einschließen lassen als ihre an Position 8 substituierten Isomere. Auch bei den geranylierten Flavanonen des Hopfens zeigte sich diese Phänomen (vgl. Beispiel 2, 7). 6-Geranylnaringenin konnte in der Cyclodextrinfraktion angereichert werden, während 8-Geranylnaringenin in der Methanolfraktion zu finden war.
Da es sich bei den vorhergehenden, detailliert beschriebenen Beispielen um Ausführungsbeispiele handelt, können sie in üblicher Weise vom Fachmann in einem weiten Umfang modifiziert werden, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen. Insbesondere können die in den Beispielen gezeigten Trennungen auch auf die anderen hierin allgemeiner beschriebenen Substanzgruppen angewendet werden. Auch eine allgemeine Verwendung der erhaltenen Extrakte als pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Erfindung umfasst und soll nicht nur auf die speziell genannten Indikationen beschränkt sein. Weiterhin schließt die Verwendung der unbestimmten Artikel „ein“ bzw. „eine“ nicht aus, dass die betreffenden Merkmale auch mehrfach vorhanden sein können.

Claims

Raffinationsverfahren zur Abtrennung von insbesondere biologisch aktiven Substanzen und/oder Substanzgruppen aus einer Mischung, die eine Anzahl prenylierter Polyphenole umfasst, umfassend die folgenden Schritte: i) Bereitstellen einer Lösung der Mischung, ii) Aufbringen der Lösung auf eine Festphase, iii) Eluieren von einer oder mehreren biologisch aktiven Substanzen von der Festphase mit Hilfe einer schrittweisen Abfolge von unterschiedlichen Lösungsmitteln, wobei für wenigstens einen Schritt ein Lösungsmittelgemisch aus Lösungsmittel und einem Cylcodextrinderivat eingesetzt wird, und iv) Sammeln der jeweiligen im Schritt iii) gewonnenen Eluate, welche die biologisch aktiven Substanzen und/oder Substanzgruppen enthalten.
Raffinationsverfahren nach Anspruch 1, wobei in dem Verfahren die biologisch aktive Substanz oder Substanzgruppe in wenigstens einem Elutionsschritt iii), in dem ein Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch mit einem Cyclodextrinderivat eingesetzt wird, angereichert wird.
Raffinationsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mischung einen Naturstoffrohextrakt, insbesondere einen Pflanzenrohextrakt, umfasst.
Raffinationsverfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die biologisch aktive Substanz oder Substanzgruppe ein oder eine Gruppe von prenylierten Polyphenolen, insbesondere prenylierte Flavonoide, umfasst.
Raffinationsverfahren nach Anspruch 4, wobei das prenylierte Polyphenol eine Verbindung ist, ausgewählt aus den Verbindungen der Gruppe mit den folgenden Strukturformeln:
wobei: R₁ bis R₄ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl, C_2-6 Alkenyl, prenylartigen Alkenylen, C_2-6 Alkinyl, -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O-, -CN oder zwei Substituenten überbrückenden Ringstrukturen; R₆ bis R₁₀ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl, C_2-6 Alkenyl, prenylartigen Alkenylen, C_2-6 Alkinyl, -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O-, -CN oder zwei Substituenten überbrückenden Ringstrukturen; R₅ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl, C_2-6 Alkenyl), prenylartigen Alkenylen, C_2-6 Alkinyl, -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O-, -CN wobei weiter bevorzugte Substituenten für R₅ H, -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -OR₃₀ sind; R₁₁bis R₁₅ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl, C_2-6 Alkenyl, prenylartigen Alkenylen, C_2-6 Alkinyl, -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O-, -CN oder zwei Substituenten überbrückenden Ringstrukturen; R₁₆ bis R₂₀ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl, C_2-6 Alkenyl, prenylartigen Alkenylen, C_2-6 Alkinyl, -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen (z. B. Cl, Br, I, F), -CF₃, -O-CH₂-O-, -CN oder zwei Substituenten überbrückenden Ringstrukturen; R₂₅ und R₂₆ unabhängig ausgewählt sind aus O, S oder N(-OH); R₃₀ ausgewählt ist aus prenylartigen Alkenylen, insbesondere aus Prenyl, Geranyl, Farnesyl, Lavandulyl.
Raffinationsverfahren nach Anspruch 5, wobei das prenylierte Polyphenol einen oder auch zwei oder drei kondensierte Pyranoringe an den optional substituierten Benzolringen enthält:
wobei: R₂₁ bis R₂₄ unabhängig ausgewählt sind aus H, C_1-6 Alkyl, C_2-18 Alkenyl, prenylartigen Alkenylen, C_2-6 Alkinyl, -OH, -O(C_1-6 Alkyl), -O(C_2-6 Alkenyl), -OR₃₀, -SH, -S(C_1-6 Alkyl), -NH₂, -NH(C_1-6 Alkyl), -N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), -CO-C_1-6 Alkyl, -CO-NH₂, -CO-NH-(C_1-6 Alkyl), -CO-N(C_1-6 Alkyl)(C_1-6 Alkyl), Halogen, -CF₃, -O-CH₂-O- oder -CN; R₃₀ ausgewählt ist aus prenylartigen Alkenylen. n, m stehen dabei für jeweils zwei benachbarte Kohlenstoffatome eines Benzolringes mit den jeweiligen Resten R₁ und R₂, R₂ und R₃, R₃ und R₄, R₆ und R₇, R₇ und R₈, R₈ und R₉, R₉ und R₁₀ bzw. mit den jeweiligen Resten R₁₁ und R₁₂, R₁₂ und R₁₃, R₁₃ und R₁₄, R₁₄ und R₁₅, R₁₆ und R₁₇, R₁₇ und R₁₈, R₁₈ und R₁₉, R₁₉ und R₂₀.
Raffinationsverfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Cylcodextrinederivat ausgewählt ist aus einem alpha-, beta- oder gamma-Cyclodextrin-Derivat, wobei die Cyclodextrine substituiert sein können.
Raffinationsverfahren nach Anspruch 7, wobei das Cyclodextrinderivat unter anderen Methyl- und/oder Hydroxypropylsubstituenten umfasst.
Raffinationsverfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Festphase ein Polyamid-Trägermaterial oder auch Umkehrphasen-Material umfasst.
Verwendung des Raffinationsverfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Gewinnung von biologisch aktiven Substanzen, insbesondere von prenylierten Polyphenolen, als pharmazeutisch aktives Mittel.
Verwendung nach Anspruch 10 zur Gewinnung eines pharmazeutisch aktiven Mittels mit einem spezifischen Verhältnis von Regioisomeren der aktiven Substanzen.
Pharmazeutisch aktives Mittel, herstellbar nach einem Raffinationsverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einem spezifischen Verhältnis von Regioisomeren der aktiven Substanzen, insbesondere angepasst zur Prävention oder Behandlung von neurodegenerativen und/oder kanzerogenen Erkrankungen