DE4430010C1 - Verfahren zur Abtrennung von Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure von einem Hauptbestandteil Äpfelsäure - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure von einem Hauptbestandteil Äpfelsäure.

Die Herstellung von Äpfelsäure (englisch: malic acid) für pharmazeutische und chemi­ sche Anwendungen gewinnt an Bedeutung. Äpfelsäure wird großtechnisch chemisch, enzymatisch oder mikrobiologisch durch Hydratisierung von Fumarsäure oder fermen­ tativ aus billigen Substraten wie z. B. Melasse hergestellt.

Synthetisierte Äpfelsäure enthält als substanzverwandte Verunreinigungen im allge­ meinen Reste von Fumarsäure, bei bestimmten Produktionsverfahren treten auch Ver­ unreinigungen aus Maleinsäure und Bernsteinsäure auf. Alle drei Verunreinigungen sind wegen ihres zur Äpfelsäure sehr ähnlichen chemischen und physikalischen Ver­ haltens mit herkömmlichen Methoden nur schwer und unter großen Ausbeuteeinbußen an dem gewünschten Produkt Äpfelsäure abtrennbar.

Zu beachten ist dabei auch, daß insbesondere Interesse an einer L-Äpfelsäure be­ steht, die etwa biokatalytisch aus Fumarsäure synthetisiert werden kann. Bei der bioka­ talytischen Umsetzung von gelösten Fumarsäuresalzen zu den entsprechenden Salzen der L-Äpfelsäure können bedingt durch die Lage des chemischen Gleichgewichts die­ ser Reaktion im Regelfall nur 85% der Fumarsäuresalze zu Malat (Äpfelsäuresalz) um­ gesetzt werden. Nach Überführung der Salze in die freien Säuren läßt sich durch Kon­ zentration der Lösung bis zur Löslichkeitsgrenze der L-Äpfelsäure (ca. 50 g in 100 g Lösung bei 20°C) die schwer lösliche Fumarsäure (ca. 0,5 g in 100 g gesättigter Äpfel­ säurelösung) größtenteils entfernen. Der Restanteil an Fumarsäure bezogen auf L-Äpfelsäure beträgt bedingt durch das Verhältnis der Löslichkeitsprodukte beider Substanzen in Wasser etwa 1% und ist durch einfache Umkristallisation aus wässeri­ ger Lösung nicht mehr zu entfernen.

Dieser Restanteil ist für die heutigen Anforderungen an pharmazeutische Anwendun­ gen zu hoch, die maximal 0,15% an Fumarsäure zulassen, siehe Deutsches Arznei­ buch, 10. Ausgabe mit 3. Nachtrag 1994.

Daher ist ein aus der DE 35 42 861 A1 bekanntes Verfahren, bei dem fermentativ her­ gestellte Äpfelsäure mittels Elektrodialyse aufgereinigt wird, nicht geeignet.

Nicht ausreichend ist auch ein aus der DE 32 47 981 A1 bekanntes Verfahren, bei dem keine Aufreinigung erfolgt, sondern in einem Austauschschrift Salze der Äpfelsäure und der Fumarsäure in die freien Säuren im gleichen Verhältnis überführt wird. Das Verfahren arbeitet im übrigen mit einfacher Kristallisation von Äpfelsäure.

Verschiedene Methoden zur Abtrennung der Restfumarsäure sind bekannt, so etwa eine unvollständige Umkristallisierung der L-Äpfelsäure unter Ausnutzung der unter­ schiedlichen Kristallisationsgeschwindigkeit der beiden Säuren (Fumarsäure und Äp­ felsäure). Dieses Verfahren liefert technisch kaum reproduzierbare Ergebnisse und ist mit hohen Ausbeuteverlusten an Äpfelsäure verbunden.

In der DE 22 37 685 B2 wird ein extraktives Aufreinigungsverfahren vorgeschlagen. Hierbei kommt das Produkt infolge der Lösemittel Extraktion mit organischen Verun­ reinigungen in Kontakt und wird mit diesen kontaminiert, was mindestens eine weitere Nachreinigung erforderlich macht. Weiterhin erfordert die Verwendung organischer Lösungsmittel aufgrund von deren Toxizität und Entflammbarkeit hohe Investitionen in die gesetzlich vorgeschriebenen Sicherheitsvorrichtungen und Immissionsschutzmaß­ nahmen. Unter ökologischen Gesichtspunkten sollte die Verwendung organischer Lö­ sungsmittel vermieden werden.

Weiter bekannt ist eine Umkristallisation aus einem geeigneten organischen Lö­ sungsmittel, z. B. Isopropanol oder Aceton, in dem sich die Fumarsäure deutlich besser löst als in Wasser. Die Methode erfordert einen erhöhten apparativen Aufwand und kann zu Lösungsmittelverunreinigungen im Endprodukt führen, was selbstverständlich ebenfalls unerwünscht ist.

Diese Methode hat somit die gleichen Nachteile wie extraktive Verfahren, zumal in bei­ den Fällen das Lösemittel aufwendig zurückgewonnen werden muß.

Aus der DE 15 18 522 B2 ist ein Verfahren bekannt, bei dem mit einer aufwendigen Kombination von mindestens 4 bis 5 adsorptiven Verfahrensschritten eine befriedigen­ de Aufreinigung chemisch synthetisierter D-/L-Äpfelsäure vorgeschlagen wird.

Aufgabe der Erfindung ist es demgegenüber, ein auch im technischen Maßstab nutz­ bares Verfahren zur Abtrennung von Fumarsäureverunreinigungen aus Äpfelsäure vorzuschlagen, wobei auch eine Herstellung von pharmazeutisch anwendbarer Äpfel­ säure möglich sein soll.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst,

• - daß Säulenchromatographie mit einer stationären und einer mobilen Phase eingesetzt wird,
• - daß als stationäre Phase ein Trennmaterial verwendet wird, welches eine höhere Affinität zu Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure aufweist als zu Äpfelsäure,
• - daß als mobile Phase eine wässerige Lösung freier Äpfelsäure verwendet wird, die mit mindestens einem der vorgenannten Nebenstandteile verunreinigt ist,
• - daß aus der mobilen Phase zunächst an die stationäre Phase gebundene Äpfelsäure im Laufe der Chromatographie überwiegend von den Nebenbestandteilen verdrängt wird,
• - daß als Eluat bis zum Durchbruch der Nebenstandteile eine von Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure bis zu einem willkürlich festgelegten Grenzwert befreite Äpfelsäurelösung gewonnen wird.

Nachdem im Stand der Technik eine chromatographische Trennung von Äpfelsäure einerseits und insbesondere Furmarsäure andererseits wirtschaftlich nicht möglich ist, konnte überraschend festgestellt werden, daß eine Reihe technischer Chromatogra­ phiematerialien höhere Affinitäten zu Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäu­ re als zu Äpfelsäure selbst haben, und daß schon bei geringfügigen Affinitätsunter­ schieden bei Durchführung einer Verdrängungschromatographie eine selektive Bin­ dung der genannten Verunreinigungen möglich ist.

Die vorliegende Erfindung nutzt diesen Effekt aus. Die mit Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure verunreinigte Äpfelsäurelösung wird über eine ausreichend lange mit der entsprechenden stationären Phase gefüllten Kolonne unter definierten Bedingungen durch Verdrängungschromatographie gereinigt.

Zunächst nehmen die Äpfelsäuremoleküle, da mengenmäßig eindeutig in der Über­ zahl, praktisch alle verfügbaren Bindungen zum Trennmaterial in der Chromatogra­ phiesäule ein; die von der Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure belegten Bindungsplätze entsprechend zu Beginn der Chromatographie dem Anteil der Verun­ reinigung in der Ausgangslösung, beispielsweise 1% bezogen auf Äpfelsäure.

Nachdem die Bindungen alle besetzt sind, beginnt als Eluat Äpfelsäure aus der Chro­ matographiesäule zu laufen. Die Fumarsäure hat eine zumindest geringfügig größere Affinität zum Trennmaterial als die Äpfelsäure. Das bedeutet, daß eine Fumarsäure­ verunreinigung bevorzugt nicht die Chromatographiesäule durchlaufen wird, sondern statt dessen ein entsprechendes Äpfelsäuremolekül aus seiner Bindung zum Trennma­ terial verdrängt, so daß nun das Äpfelsäuremolekül zum Eluat stößt.

Solange eine genügend große Zahl von Bindungen des Trennmaterials mit Äpfelsäure besetzt sind, werden die Fumarsäureverunreinigungen die Chromatographiesäule da­ her nicht durchlaufen, sondern eben diese Bindungen besetzen. Im Eluat entsteht da­ her ein wesentlich niedriger Verunreinigungsgrad als in der Ausgangslösung.

Erst dann, wenn in der Chromatographiesäule ein sehr großer Prozentsatz der Bin­ dungen bereits mit Fumarsäureverunreinigungen besetzt ist, beginnen auch weitere nachfließende Fumarsäuremoleküle die Chromatographiesäule zu durchlaufen.

Wie Versuche ergeben haben, ist dieser Moment z. B. durch UV-Absorptionsmessung sehr deutlich feststellbar und entsprechend kann genau in diesem Moment das Verfah­ ren abgebrochen werden, um den niedrigen Verunreinigungsgrad zu erhalten.

Da die Äpfelsäure jetzt nicht durch ein separates Elutionsmittel, sondern durch ihre eigene Verunreinigung, nämlich die Fumarsäure, selektiv vom Trennmaterial eluiert wird, können Zyklusausbeuten von erheblicher Größenordnung erzielt werden.

Die Entfernung von Fumarsäure-, Maleinsäure- und/oder Bernsteinsäureverunreini­ gungen aus Äpfelsäurelösungen wird durch Verdrängungschromatographie an einer stationären Phase realisiert, die eine nur geringfügig höhere Affinität zu den Verunrei­ nigungen als Äpfelsäure besitzt. Es kann dabei in einem Chromatographielauf eine Menge an Äpfelsäure aufgereinigt werden, die einem Vielfachen der Bindungskapazität der stationären Phase entspricht.

Es wird also eine Chromatographiesäule mit einem Trennmaterial gepackt, welches eine höhere Affinität insbesondere zu Fumarsäure als zu Äpfelsäure aufweist, eine wässerige Lösung der vor allem mit Fumarsäure verunreinigten Äpfelsäure wird in die Chromatographiesäule gegeben, das Eluat bis zum Durchbruch der Äpfelsäure wird verworfen und das Eluat gewonnen, bis ein willkürlich festgesetzter Grenzwert an Fu­ marsäure im Eluat überschritten wird.

Das Verfahren verläuft umso effektiver, je größer die Affinitätsunterschiede der Fumar­ säure und der Äpfelsäure zum Trennmaterial sind. Es ist daher bevorzugt, wenn als Chromatographiematerial Aktivkornkohle, ein basischer Anionenaustauscher oder ein Adsorberharz verwendet wird.

Besonders bevorzugt ist es, wenn ein Trennmaterial aus der Gruppe Chemviron CPG, Amberlite IRA 416, Amberlite IRA 420, Lewatit M 500, Amberlite IRA 68, Amberlite IRA 93 SP, Amberlite XAD 7 verwendet wird, da diese Trennmaterialien sich besonders bewährt haben und ein hohes Affinitätsverhältnis von über 2,0 besitzen.

Das Verfahren ist nicht nur geeignet, Fumarsäure-, Maleinsäure- und/oder Bernstein­ säureverunreinigungen aus L-Äpfelsäure abzutrennen, sondern auch solche aus D- oder D/L-Äpfelsäure abzutrennen.

Die Chromatographiesäule kann nach Abstoppen des eigentlichen Verfahrens problem­ los wieder gereinigt werden; die gesammelten Abläufe enthalten die restliche Äpfel- und Fumarsäure, welche dann entweder erneut mit geeigneten Verfahren zu Äpfelsäu­ re weiterverarbeitet werden können.

Das Verfahren gewährleistet eine wirtschaftliche und umweltverträgliche Entfernung von Fumarsäureverunreinigungen aus Äpfelsäure. Es zeigt sich, daß verschiedenste Ausgangslösungen für das erfindungsgemäße Trennverfahren in Frage kommen, bei­ spielsweise Lösungen kommerziell erhältlicher Äpfelsäure, die mit Fumarsäure verei­ nigt ist, Äpfelsäurelösungen aus biokatalytischen Fumarsäureumsetzungen, Äpfelsäu­ re, die chemisch hergestellt ist oder auch sonstige Rohprodukte.

Die stationären Phasen werden in Chromatographiesäulen gepackt, das Höhen/ Durchmesserverhältnis des Harzbettes beträgt mindestens 1, vorzugsweise < 3. Die Trennmaterialien werden in den Säulen nach Herstellerangaben vorbereitet und rege­ neriert. Die Chromatographie kann sowohl von oben nach unten als auch von unten nach oben erfolgen. Die Auftragslösung passiert die Säule mit einer Flußrate zwischen 0,2 und 5 BV/h, vorzugsweise mit einer Flußrate von 2 Bettvolumen/h. Die Tempera­ tur beträgt 0°C-50°C. Es wird solange Äpfelsäurelösung nachgeführt, bis Fumarsäure im Eluat nachweisbar wird, bzw. bis ein willkürlich festgesetzter Grenzwert an Fumar­ säure im Eluat überschritten wird.

Beispiele Beispiel 1

Die Ausgangslösung ist eine wäßrige 1 M L-Äpfelsäurelösung (13% w/v) ohne weitere Zusätze; die Äpfelsäure wurde nach einem biotechnologischen Verfahren hergestellt und durch Kristallisation aufgereinigt. Die Äpfelsäure entspricht "p.a." Qualität, ist je­ doch mit 0,4% an Fumarsäure (bezogen auf L-Äpfelsäure) verunreinigt. Das Trennma­ terial ist der schwach basische Anionenaustauscher Amberlite IRA 68. 60 ml des Trennmaterials sind in einer Glassäule (2 × 50 cm) gepackt. Das Trennmaterial wird für die Chromatographie vorbereitet, indem es (i) mit Wasser zur Entfernung feinkörniger Bestandteile rückgespült wird; (ii) mit 150 ml 1M NaOH bei einer Flußrate von 2 BV/h regeneriert wird; (iii) mit H₂O bei einer Flußrate von 5 BV/h bis zur Neutralität gewa­ schen wird; (iv) mit 150 ml 1 M HCl bei einer Flußrate von 2 BV/h beladen wird; (v) mit H₂O bis zur Neutralität gewaschen wird; (vi) mit 200 ml IM NaOH bei einer Flußrate von 2 BV/h regeneriert wird und (vii) mit Wasser bis zur Neutralisation gewaschen wird. Die Chromatographie erfolgt bei Raumtemperatur absteigend, die Flußrate beträgt 2 BV/h. Der Durchbruch der L-Äpfelsäure erfolgt nach etwa 100 ml, die L-Äpfelsäure erhält eine Restverunreinigung an Fumarsäure von 0,07%. Bis zu einem Auftragsvolumen von etwa 350 ml bleibt dieser Fumarsäureanteil Konstant, danach steigt er annähernd linear an.

In dem aufgeführten Beispiel wird die Chromatographie nach 400 ml Auftragsvolumen beendet und die Säule mit 100 ml Wasser gewaschen. Das gesammelte Eluat und Waschwasser enthält 44,5 g L-Äpfelsäure und etwa 0,04 g Fumarsäure, entsprechend 85,6% der aufgegebenen L-Äpfelsäure und 19,2% der aufgegebenen Fumarsäure.

Das Trennmaterial wird mit 200 ml 1 M NaOH bei einer Flußrate von 2 BV/h regeneriert und anschließend mit H₂O neutral gewaschen. Die gesammelten Abläufe enthalten die restliche Äpfel- und Fumarsäure 7,5 g bzw. 0,16 g.

Beispiel 2

Die Ausgangslösung entspricht der Ausgangslösung in Beispiel 1.

Das Trennmaterial ist der schwach basische Anionentauscher Amberlite IRA 93 SP. Für die Dimensionen der Trennsäule, das Harzvolumen, die Vorbereitung des Trenn­ harzes und die Chromatographiebedingungen gelten die im Beispiel 1 gemachten An­ gaben.

Der Durchbruch der L-Äpfelsäure erfolgt nach etwa 80 ml, die L-Äpfelsäure enthält eine Restverunreinigung an Fumarsäure von 0,038%. Auch bei diesem Trennmaterial erfolgt der eigentliche Durchbruch der Fumarsäure erst bei einem Auftragsvolumen von etwa 350 ml. Danach steigt die Fumarsäurekonzentration annähernd linear an.

In dem aufgeführten Beispiel wird die Chromatographie nach 400 ml Auftragsvolumen beendet und die Säule mit 100 ml Wasser gewaschen. Das gesammelte Eluat und Waschwasser enthält 45,8 g L-Äpfelsäure und etwa 0,022 g Fumarsäure, entspre­ chend 88,1% der aufgegebenen L-Äpfelsäure und 10,6% der aufgegebenen Fumar­ säure. Das Trennmaterial wird mit 200 ml 1 M NaOH bei einer Flußrate von 2 BV/h re­ generiert und anschließend mit H₂O neutral gewaschen. Die gesammelten Abläufe enthalten die restliche Äpfel- und Fumarsäure, 6,2 g bzw. 0,18 g.

Beispiel 3

Die Ausgangslösung ist eine 2 M L-Äpfelsäurelösung. Der Äpfelsäure wurde Fumar­ säure zu einem Gewichtsanteil von 1,0% zugegeben. Das Trennmaterial ist der schwach basische Anionenaustauscher Amberlite IRA 93 SP. 700 ml des Trennmate­ rials sind in einer Doppelwandglassäule (3,8 × 100 cm) gepackt. Das Trennmaterial wird für die Chromatographie vorbereitet, indem es (i) mit Wasser zur Entfernung fein­ körniger Bestandteile rückgespült wird; (ii) mit 1,6 l IM NaOH bei einer Flußrate von 2 BV/h regeneriert wird, (iii) mit H₂O bei einer Flußrate von 5 BV/h bis zur Neutralität ge­ waschen wird; (iv) mit 1,6 l 1 M HCl bei einer Flußrate von 2 BV/h beladen wird; (v) mit H₂O bis zur Neutralität gewaschen wird; (vi) mit 2,1 l IM NaOH bei einer Flußrate von 2 BV/h regeneriert wird und (vii) mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen wird.

Die Chromatographie erfolgt bei Raumtemperatur absteigend, die Flußrate beträgt 2 BV/h. Der Durchbruch der L-Äpfelsäure erfolgt nach etwa 850 ml, die L-Äpfelsäure enthält eine Restverunreinigung an Fumarsäure von unter 0,1%. Nach mehr als 4,5 l Auftragsvolumen beginnt die Fumarsäurekonzentration im Eluat annähernd linear an­ zusteigen.

In dem aufgeführten Beispiel wird die Chromatographie nach 4,5 l Auftragsvolumen beendet und die Säule mit 1100 ml Wasser gewaschen. Das gesammelte Eluat und Waschwasser enthält 86,0 g L-Äpfelsäure und etwa 0,064 g Fumarsäure, entspre­ chend 82,7% der aufgegebenen L-Äpfelsäure und 6,2% der aufgegebenen Fumar­ säure. Das Trennmaterial wird mit 2,2 l 1 M NaOH bei einer Flußrate von 2 BV/h rege­ neriert und anschließend mit H₂O neutral gewaschen. Die gesammelten Abläufe ent­ halten die restliche Äpfel- und Fumarsäure: 1,0 g bzw. 0,97 g.

Beispiel 4

Die Ausgangslösung entspricht der Ausgangslösung in Beispiel 1:

Das Trennmaterial ist Kornaktivkohle (Fa. Chemviron). Für die Dimensionen der Trenn­ säule, das Harzvolumen, die Vorbereitung des Trennharzes und die Chromatographie­ bedingungen gelten die in Beispiel 1 gemachten Angaben.

Der Durchbruch der L-Äpfelsäure erfolgt nach etwa 50 ml, bis zu einem Volumen von 750 ml ist Fumarsäure im Eluat nicht nachweisbar. Danach steigt die Fumarsäurekon­ zentration im Eluat annähernd linear an.

In dem aufgeführten Beispiel wird die Chromatographie nach 900 ml Auftragsvolumen beendet und die Säule mit 100 ml Wasser gewaschen. Das gesammelte Eluat und Waschwasser enthält 115 g L-Äpfelsäure und etwa 0,04 g Fumarsäure, entsprechend 98,3% der aufgegebenen L-Äpfelsäure und 3,4% der aufgegebenen Fumarsäure. Das Trennmaterial wird mit 200 ml 1 M NaOH bei einer Flußrate von 2 BV/h regeneriert und anschließend mit H₂O neutral gewaschen. Die gesammelten Abläufe enthalten die restliche Äpfel- und Fumarsäure, 2,1 g bzw. 1,1 g.

Claims (7)

1. Verfahren zur Abtrennung von Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure von einem Hauptbestandteil Äpfelsäure, dadurch gekennzeichnet,

• - daß Säulenchromatographie mit einer stationären und einer mobilen Phase eingesetzt wird,
• - daß als stationäre Phase ein Trennmaterial verwendet wird, welches eine höhere Affinität zu Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure aufweist als zu Äpfelsäure,
• - daß als mobile Phase eine wässerige Lösung freier Äpfelsäure verwendet wird, die mit mindestens einem der vorgenannten Nebenbestandteilen verunreinigt ist,
• - daß aus der mobilen Phase zunächst an die stationäre Phase gebundene Äpfelsäure im Laufe der Chromatographie überwiegend von den Nebenbestandteilen verdrängt wird,
• - daß als Eluat bis zum Durchbruch der Nebenbestandteile eine von Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure bis zu einem willkürlich festgelegten Grenzwert befreite Äpfelsäurelösung gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als stationäre Phase eine dampfaktivierte Kornkohle, insbesondere Chemviron CPG, verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als stationäre Phase ein hydrophobes Adsorberharz auf Polyacrylesterbasis, insbesondere Amberlite XAD 7, verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als stationäre Phase ein schwach basischer makroporöser Anionenaustauscher auf Polystyrolbasis mit tertiärem Amin als Ankergruppen, insbesondere Amberlite IRA 93 SP, verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als stationäre Phase ein stark basischer Anionenaustauscher (Geltyp) auf Po­ lystyrolbasis mit quartärem Amin als Ankergruppen, insbesondere Amberlite IRA 416, Amberlite IRA 420 oder Lewatit M 500 verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchbruch der Nebenbestandteile am Ausgang der Trennsäule quantitativ durch Messung der UV-Absorption des Eluates verfolgt wird.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die an die stationäre Phase gebundene Fumarsäure, Maleinsäure und/oder Bernsteinsäure sowie noch gebundene Äpfelsäure bei der Regeneration des Trennmaterials zerstörungsfrei von der Säule eluiert und einer Weiterverarbeitung zugeführt wird.