KR101277013B1 - 프라티코사이드를 고순도로 포함하는 길경 분획물의 분리정제 방법 - Google Patents

프라티코사이드를 고순도로 포함하는 길경 분획물의 분리정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고순도의 길경 프라티코사이드를 포함하는 길경 분획물의 분리정제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 1) 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득하는 단계; 2) 상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 물에 용해시키고 에틸아세테이트로 분배하여 물층을 농축하여 물 분획을 수득하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 물층에 수포화 부탄올을 혼합하고 물층과 부탄올층으로 층분리한 후 부탄올층을 농축하여 부탄올 분획을 수득하는 단계; 및, 4) 상기 부탄올 분획을 증류수에 용해시키고 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 길경 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는 길경 에탄올 추출물로부터 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 길경 사포닌인 프라티코딘 D(platycodin D)와 길경 프라티코사이드(platycosides)를 고순도 및 고농도로 함유하는 길경 분획물을 간단하고 경제적인 방법으로 단시간에 수득할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

Description

프라티코사이드를 고순도로 포함하는 길경 분획물의 분리정제 방법{A method for isolating and purifying of Platycodon gradiflorum fraction with highly purified platycosides}
본 발명은 길경에 함유된 사포닌인 프라티코사이드(platycosides)를 고순도로 함유하는 길경 분획을 얻고, 그로부터 고순도의 길경 프라티코사이드를 정제 및 분리하는 방법에 관한 것이다.
도라지(Platycodon grandiflorum A. DC)는 초롱꽃과(Campanulaceae)에 속하는 다년생 초본류로서 뿌리가 전통적인 생약재 및 식품으로 활용되고 있다. 이러한 도라지가 식품의 용도로 사용될 경우에는 “도라지”라고 일반적으로 칭하고, 약제의 용도로 사용될 경우에는 “길경”이라고 부르는 것이 일반적이나, 혼용되어도 큰 차이는 없다.
한편, 도라지 추출물의 인간에 대한 다양한 건강학적 장점이 보고되고 있는데, 특히 4 년근의 경우 기관지염, 천식, 폐결핵, 당뇨 및 염증성 질환에 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Takagi and Lee, 1972; Lee 1973). 최근에 그들의 면역약학적 효과가 연구되었으며(Nagao et al., 1986), 트리테르펜(triterpene)(Nikaido et al., 1990) 및 사포닌(saponin)(Ishii et al.,) 등의 몇몇 활성 물질들이 분리 동정되었다.
한편, 도라지의 사포닌 성분인 프라티코사이드는 도라지의 기본적인 생리활성물질로서 광범위한 효능을 포함하는 물질이라고 알려져 있다.
본 발명은 길경 에탄올 조추출물로부터 길경 사포닌인 프라티코딘 D 및 프라티코사이드를 고순도로 포함하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 길경 에탄올 추출물로부터 프라티코사이드를 고순도로 포함하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법, 1) 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득하는 단계; 2) 상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 물에 용해시키고 에틸아세테이트로 분배하여 물층을 수득하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 물층에 수포화 부탄올을 혼합하고 물층과 부탄올층으로 층분리한 후 부탄올층을 농축하여 부탄올 분획을 수득하는 단계; 및, 4) 상기 부탄올 분획을 증류수에 용해시키고 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법을 각 단계별로 구체적으로 설명한다.
1) 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득하는 단계이다.
먼저, 길경 에탄올 조추출물은 길경 건조 분말을 에탄올 함유 수용액으로 추출하여 얻어진다. 상기 에탄올 함유 수용액은 에탄올 40 내지 90 부피% 수용액을 사용하는 것이 적당하다. 추출을 위해 널리 알려진 다양한 추출 방법을 채택할 수 있으며, 초음파 추출을 수행하는 경우 추출 효율을 높일 수 있다. 추출한 다음 충분히 방치한 후 고형물을 여과하며, 여과 잔류물에 다시 에탄올 함유 수용액을 첨가하여 추출, 방치 및 여과 하는 과정을 수회 반복한다. 상기 반복은 3 회 이상, 추출 효율의 측면에서 3 내지 5회 반복하는 것이 바람직하다. 상기 추출액을 모아서 다시 여과하여 고형물을 제거한 여액을 50 내지 60 ℃ 조건에서 감압 농축하여 에탄올을 제거하도록 한다. 상기 감압 농축에 의해 에탄올을 다 날려 보낸 길경 에탄올 조추출물은 함유된 당성분에 의해 고형화가 되지 않기 때문에 물 상태까지 농축한 다음 -50℃ 이하의 저온에서 동결시키고 동결건조하여 분말로 가공한다. 상기 길경 에탄올 조추출물에 함유된 성분은 이를 메탄올에 녹여 수행한 HPLC 크로마토그램으로 확인할 수 있다[도 1].
상기 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득한다.
구체적으로, 상기 길경 에탄올 조추출물을 용해시키기 위하여 길경 에탄올 조추출물 10 g에 대하여 에탄올 약 1 L 수준의 비율로 사용한다. 이때, 침전물이 발생하게 되는데, 길경 에탄올 조추출물이 용해된 에탄올 용액은 조심스럽게 다른 용기에 옮기고, 용해되지 않은 잔류물에 계속 일정량의 에탄올을 넣어 계속 용해시킨다. 길경 에탄올 조추출물이 완전 용해된 용액에는 에탄올 사용량의 3 배 수준의 아세톤을 첨가한다.
일반적으로 길경의 사포닌이나 프라티코딘 D 등은 이를 분리하기 위하여 극성이 높은 용매로 추출한 후 물에 녹여 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 등의 순으로 분획하며, 그 중 부탄올 분획을 농축하고 HP-20 등과 같은 칼럼에 통과시키는 통상의 분리방법을 사용한다. 이 경우 길경 추출물로부터 사포닌을 얻기 위해서는 최소 4 회 이상의 오픈 칼럼 크로마토그래피를 수행하여야 하고, 각 단계별로 TLC 등에 의해 분획된 물질을 확인하고 LC-MS 등을 사용하여 구조 동정 및 순도 측정 등의 단계를 거치는 등 분리에 소요되는 시간만 최소 7 내지 9 개월이 걸리는 등 비경제적이고 비생산적인 문제점이 많았다.
이에, 본 발명의 본 단계에서는 기존과는 달리 아세톤을 특징적으로 사용한다. 길경 에탄올 조추출물이 용해된 에탄올 용액에 아세톤을 첨가하면 흰색의 침전물이 발생되는데, 이는 일부 용해도가 떨어진 수용성 다당체 및 단백질에 해당되는 것으로 여과하여 제거하도록 한다. 이때, 아세톤의 사용량은 길경 에탄올 조추출물을 용해시키기 위하여 사용한 에탄올의 2 내지 5 배 부피, 바람직하기로는 3 내지 4 배 부피인 것이 수용성 다당체와 단백질의 제거 효율 측면에서 바람직하다.
상기 흰색의 침전물을 제거한 여액은 완전히 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 얻는다.
2) 상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 물에 용해시키고 에틸아세테이트로 분배하여 물층을 농축하여 물 분획을 수득하는 단계이다.
상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 증류수에 완전히 용해하고, 여기에 사용된 증류수와 동량의 에틸아세테이트(EtoAC)를 첨가하고 격렬하게 흔들어서 물과 EtoAC 가 혼합되게 한 후 정치하여 상층인 EtoAC 층을 회수한다. 하층인 물층에 다시 동량의 EtoAC를 첨가하고 흔들어서 층분리시키는 과정을 수회 반복하여 물층과 EtoAC 층을 분리한다. 상기 층분리는 3 회 이상, 바람직하기로는 3 내지 5 회 반복수행하는 것이 효과적이며, 이 과정을 통해 EtoAC 층에 포함된 일부 당 성분과 비사포닌 계열의 중간극성 물질을 제거할 수 있다. 상기 EtoAC 층을 농축한 다음 메탄올에 용해하여 HPLC를 수행한 결과를 도 2에 나타내었으며, 이를 통하여 EtoAC 층에 당성분과 중간 극성의 물질이 포함되어 있었음을 확인할 수 있다. 상기 하층인 물층은 40 내지 50℃ 조건에서 감압농축기를 사용하여 농축하여 물층에 함유된 EtoAC 를 모두 날려 제거한다.
3) 상기 2) 단계의 물층에 수포화 부탄올을 혼합하고 물층과 부탄올층으로 층분리한 후 부탄올층을 농축하여 부탄올 분획을 수득하는 단계이다.
상기 2) 단계에서 EtoAC 를 제거한 물층에 동량의 수포화 부탄올을 첨가하고 흔들어 혼합한 후 정치하여 물층과 부탄올층으로 층분리시킨다. 상기 분리된 물층에 다시 수포화 부탄올을 첨가하고 흔들어 혼합한 후 정치하여 물층과 부탄올층으로 재 분리하는 층분리를 수회, 바람직하기로는 3 내지 5 회 수행하는 것이 효율적이다. 상층으로 분리된 부탄올층을 모두 회수하고 50 내지 60℃ 조건으로 감압농축하여 부탄올 분획을 얻는다. 상기 부탄올 분획에는 다수의 사포닌 계열 성분들이 집적되어 있음을 HPLC 수행 결과를 나타낸 도 3의 HPLC 크로마토그램에 의하여 확인할 수 있다. 한편, 층 분리된 하층의 물층에는 상기 2) 단계인 EtoAC 층 분리에 의하여 제거되지 않았던 고도의 극성화합물 및 당성분이 용해되어 있음을 도 4의 HPLC 크로마토그램을 통하여 확인할 수 있는 바, 본 단계의 수포화 부탄올을 사용한 분배에 의하여 이들이 제거되는 효과가 있다.
상기 수포화 부탄올은 부탄올과 초순수를 동량 혼합하고 격렬하게 흔들고 방치하여 완전히 층분리가 된 후 하층인 물층을 버리고, 상층을 회수하여 사용하는데, 사전에 미리 제조하여 준비하도록 한다.
4) 상기 부탄올 분획을 증류수에 용해시키고 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 길경 프라티코사이드를 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 단계이다.
도 3에 나타낸 상기 부탄올 분획의 HPLC 크로마토그램을 살펴보면 상대적으로 사포닌 성분과 비교하여 극성이 높은 성분이 부탄올 분획에 여전히 포함되어 있음을 확인할 수 있으며, 수차례에 걸친 EtoAC 와 수포화 부탄올을 사용한 용매분배에 의해서도 이들이 완전히 제거되지 않음을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 부탄올 분획을 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의하여 분리 정제하였다. 이때, 역상(C18) 카트릿지는 SEP-PAK vac 6cc를 사용할 수 있고, 이동상으로는 에탄올 함유 수용액을 사용할 수 있다. 증류수에 완전히 용해시킨 부탄올 분획을 역상(C18) 카트릿지에 하적하고 이동상에 해당하는 에탄올 함유 수용액의 에탄올 농도를 20 내지 90 부피% 범위로 순차적으로 변화시키면서 부탄올 분획을 용출시키면 에탄올의 함량에 따라 역상(C18) 카트릿지에 흡착되었던 도라지의 지표성분인 길경 사포닌인 프라티코사이드 및 프라티코딘 D를 용출시킬 수 있다.
즉, 길경 에탄올 조추출물로부터 상기한 방법으로 수득한 길경 분획물에는 고순도의 프라티코딘 D 및 프라티코사이드가 다량으로 함유되어 있음을 확인할 수 있다.
상기한 본 발명에 의하면, 길경 사포닌인 프라티코딘 D(platycodin D)와 길경 프라티코사이드(platycosides)를 고순도 및 고농도로 함유하는 길경 분획물을 간단하고 경제적인 방법으로 단시간에 수득할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 길경 에탄올 조추출물의 함유성분을 분석한 역상 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 EtoAC 층 분리에 의해 길경 에탄올 조추출물로부터 제거된 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 3은 부탄올 분획으로 회수된 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 길경 에탄올 조추출물[Crude extract]과 부탄올 분획으로 제거된 성분[water fraction after BuOH partition]을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 5 는 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 역상 카트릿지 크로마토그래피에 하적한 후 용출액에 의해 제거된 [Loading effluent of Sep-pak] 성분을 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 6은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 역상 카트릿지 크로마토그래피에 하적한 후 20 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 20 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 7은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 40 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 40 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 8은 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 60 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 60 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 9는 수포화 부탄올 분배에 의하여 얻어진 부탄올 분획[BuOH fraction]과 이를 상기 역상 카트릿지 크로마토그래피에 연속으로 80 % 에탄올 수용액으로 용출시 회수되는 성분[Sep-pak with 80 % EtOH]의 HPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 10은 도 8에서 용출된 성분 중 머무름시간이 21.13인 성분에 대해 LC/MS 질량분석을 수행한 결과의 예를 나타낸 것이고, 도 11은 도 8에서 용출된 성분을 동정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예 등에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
1) 길경 에탄올 조추출물의 제조
강원도 삼척시의 독농가가 재배한 6년근 도라지[길경(桔梗)]를 세척 및 건조하여 분말상태로 제조한 후 여기에 에탄올 80 부피% 함유 수용액을 분말 중량대비 20 배량을 첨가하여 40℃ 조건에서 30분간 초음파 추출 후 상온에서 30분 동안 방치하고, 와트만 No. 2번의 여과지를 사용하여 여과하였다. 상기 여과 후 잔류물에 다시 에탄올 80 부피% 함유 수용액을 처음과 동량 첨가하여 초음파 추출, 방치 및 여과를 3 회 반복 수행하였다. 상기 과정에서 얻어진 추출여액을 모두 모아 와트만 No. 2번의 여과지를 사용하여 다시 여과하고, 50 내지 60 ℃ 조건에서 감압 농축기를 사용하여 에탄올을 다 날려 보낸 후 물 상태까지 농축시켰다. 상기 농축물을 -50 ℃ 이하의 저온에서 동결 및 동결건조시켜 분말 상태로 가공하였다[길경 에탄올 조추출물].
상기 길경 에탄올 조추출물 일부를 메탄올에 용해하여 함유성분의 조성을 확인하고자 역상조건의 HPLC로 분석하였으며, 그 결과는 도 1의 크로마토그램과 같다. 도 1에 의하면, 수십 종의 함유성분이 공존하고 있는 양상을 확인할 수 있다.
2) 길경 부탄올 분획의 제조
상기 길경 에탄올 조추출물 10g 을 에탄올 약 1L에 용해시키며, 이때 침전물이 발생되는데 에탄올 용액은 조심스럽게 비이커에 옮기고, 잔류물에 다시 일정량의 에탄올을 넣어 용해시키며, 연속하여 잔류된 침전물에 에탄올을 첨가하여 용해시켰다.
상기 길경 에탄올 조추출물을 용해한 에탄올 용액 200 mL를 1000 mL 비이커에 옮기고 아세톤 600mL와 혼합하여 흰색의 침전물 형성을 유도하고, 이를 와트만 No. 2번의 여과지로 여과하여 일부 용해도가 떨어진 수용성 다당체 및 단백질을 제거하였다. 상기 흰색의 침전물이 여과된 에탄올과 아세톤 용액을 50 ℃ 조건에서 감압 농축기를 사용하여 완전히 농축하고 얻어진 농축물에 증류수 약 400 mL 를 첨가하여 용해시켰다. 여기에 농축물이 용해된 증류수와 동량의 EtoAC 를 첨가하여 층 분리를 연속하여 3회 실시하였다. 이 과정은 추출물에 포함되어 있는 일부 당 성분과 비사포닌 계열의 중간극성 물질을 제거하기 위함이다.
상기 층 분리 결과에 의해 얻어진 상층인 EtoAC 층을 모두 모아 농축 후 메탄올로 용해하고, EtoAC 층 분리에 의해 추출물로부터 제거된 성분을 HPLC 분석으로 확인하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에 의하면 길경 에탄올 조추출물로부터 층 분리된 EtoAC 층에는 HPLC 분석 시 머무름 시간 8분 내지 17분 사이에 해당되는 성분들이 많이 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 상기한 결과는 길경 에탄올 조추출물로부터 EtoAC 층 분리를 유도할 경우 이 부분에 해당되는 극성을 가진 물질이 제거됨을 의미하는 것으로 볼 수 있다.
상기 층 분리된 하층인 물층은 40 ℃ 조건의 감압농축기에 일부 농축하여 EtoAC 를 완전히 날려서 제거하며, EtoAC 를 제거한 물층으로부터 사포닌 계열의 물질을 회수하고, EtoAC 분획에서 제거되지 않았던 고도의 극성화합물 및 극성 당 성분을 제거하기 위하여 다시 동량의 수포화 부탄올을 넣어 층 분리를 동일하게 4회 실시하고, 층 분리 후 상층의 부탄올층을 회수하였다.
상기 수포화 부탄올은 부탄올과 초순수를 동량 넣어 격렬하게 흔들고 방치하여 완전히 층 분리가 된 후 상층을 회수하여 사용하며, 사전에 미리 제조하여 준비하도록 한다.
상기 상층으로 분리된 모든 부탄올층을 모아 60 ℃ 조건의 감압농축기를 사용하여 감압농축하여 부탄올 분획을 제조하였으며, 부탄올 분획에 의해 회수된 길경 사포닌 계열의 물질과 하층인 물층으로 분획되어 제거된 성분을 확인하기 위해 부탄올 및 물 분획 각각을 HPLC로 분석으로 하였으며, 그 결과는 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3에 의하면 부탄올 분획에는 길경 에탄올 조추출물로부터 EtoAC 분획에 의해 일부 성분이 제거되었지만 나머지 잔존하고 있던 성분들이 용출되어 나오는 양상을 확인할 수 있다. 특히 HPLC 분석 시 머무름 시간이 21 내지 25분 사이에 해당하며, 길경 사포닌 화합물로 추측되는 수종의 성분들이 다량 분리되어 나오는 경향을 확인할 수 있다. 도 4에서는 부탄올 분획 처리에 의해 길경 에탄올 조추출물로부터 제거된 물층에는 다량의 완전 극성화합물이 포함되어 있어 HPLC 분석 시 머무름 시간이 3분 내지 15분 사이에 해당하는 완전 극성화합물의 제거효과를 확인할 수 있다.
3) 길경 부탄올 분획의 분리 정제
상기 부탄올 층을 농축하여 얻은 부탄올 분획에는 길경의 지표성분에 해당하는 사포닌 성분으로 추측되는 프라티코딘 D 및 프라티코사이드가 다량 함유되어 있지만, 도 3의 결과에서 보는 바와 같이 EtoAC 및 부탄올 등 2차례의 용매분획에도 불구하고 아직 HPLC의 머무름 시간이 3분 내지 10분 사이에 해당하는 상대적으로 사포닌 성분에 비해 극성이 극히 높은 다수의 극성화합물이 포함되어 있음을 확인할 수 있다.
이들 성분은 더 이상 용매분획에 의해서는 제거될 수 없으므로 다른 방법의 분리 정제과정을 적용하였다.
즉, 상기 부탄올층을 농축하여 얻은 부탄올 분획물 2g을 증류수 100mL에 완전 용해시키고 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피(Sep-pak vac 6cc)에 하적한 후 에탄올 0 내지 80 부피% 함유 수용액을 20% 에탄올 농도 수준으로 달리하여 10mL 용량으로 순차 용출한 후 각 에탄올 농도별 용출성분을 HPLC로 확인하고, 각 용출 에탄올 농도별 극성화합물의 제거 양상 및 길경의 지표성분에 해당하는 사포닌 성분의 회수양상을 도 5 및 9에서 확인하였다.
도 5는 길경 추출물의 용매침전 및 2차례의 용매분배에 의해 획득된 길경 사포닌이 다량 함유되어 있는 것으로 추측되는 부탄올 분획과 이를 역상 카트릿지 크로마토그라피에 하적한 후 역상 카트릿지를 통과해 버려지는 용출액을 HPLC로 분석한 크로마토그램인데 결과에 의하면 부탄올 분획에 함유되어 있는 성분 중 머무름시간이 3분경에 해당하는 완전 극성화합물이 역상 카트릿지에 흡착되지 않고, 상당량 제거되는 양상을 확인할 수 있다.
도 6은 상기 도 5의 역상 카트릿지에 20% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 20% 에탄올 용액의 처리에 의해 머무름 시간 3분 내지 6분 사이의 극성화합물의 추가적인 제거를 확인할 수 있으며, 머무름 시간 10 분 이후의 상대적 중간극성 화합물의 용출은 전혀 확인할 수 없었다.
도 7은 상기 도 6의 역상 카트릿지에 연속하여 40% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 20% 에탄올 용액의 처리에 의해 제거된 머무름 시간 3분 내지 6분 사이의 극성화합물 중 일부 잔존하는 성분의 추가적인 제거와 머무름 시간 10 내지 15분 사이의 상대적 중간극성 화합물의 다량 용출을 확인할 수 있으며, 머무름 시간 15분 이후의 길경의 주요 사포닌 성분으로 추정되는 성분들의 용출은 전혀 확인되지 않았다.
도 8은 상기 도 7의 역상 카트릿지에 연속하여 60% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 40% 까지의 에탄올 용액 처리에 의해 머무름 시간 10분미만의 극성화합물 대부분이 거의 전량 제거된 양상을 확인할 수 있었고, 상대적으로 중간극성을 나타내는 머무름 시간 13 내지 15분 및 17 내지 18분 사이, 길경 주요 사포닌 성분으로 추정되는 머무름 시간 21 내지 24분 사이의 성분의 다량 용출을 확인할 수 있다.
도 9는 상기 도 8의 역상 카트릿지에 연속하여 80% 에탄올 용액 10 mL를 이용하여 흡착된 성분을 용출하여 분석한 결과인데, 60% 까지의 에탄올 용액 처리에 의해 거의 대부분의 부탄올 분획에 의해 분리된 성분이 용출되고 잔존물이 존재하지 않는 양상을 확인할 수 있다.
4) 길경 부탄올 분획 중 역상 카트릿지 정제 성분의 동정
길경에 함유되어 있는 사포닌 성분은 현재 전 세계적으로 지표성분인 프라티코딘 D 및 다양한 프라티코사이드를 포함하여 약 10종 정도 문헌적으로 보고된 바 있다.
따라서, 본 실시예에 의해 순차적 과정에 의해 최종적으로 정제된 60% 에탄올을 이용한 역상 카트릿지의 용출성분을 대상으로 LC/MS를 이용한 분자량 측정방식에 의해 화학구조를 동정하였다.
도 10은 60% 에탄올을 이용한 역상 카트릿지 분리에 의해 용출된 성분 중 길경의 주요 사포닌 성분으로 추정되는 머무름 시간 13 내지 24분 사이의 주요 성분 중 하나인 머무름 시간 21.13분대의 성분을 대표로 LC/MS 질량분석 결과를 도시한 것으로, 분석결과 분자량 1223.4를 나타내며 길경 활성의 지표성분으로 알려진 프라티코딘 D로 동정하였다. 아울러 동일한 방법에 의해 도 11에 보여진 60% 에탄올을 이용한 역상 카트릿지 분리에 의해 용출된 주요 성분 중 프라티코딘 D 외에 추가로 8종에 해당되는 프라티코사이드를 동정하였으며[표 1], 본 실시예에 의한 방법으로 길경 에탄올 조추출물로부터 순차적 정제과정에 의해 현재까지 보고된 길경에 함유된 총 10종의 프라티코사이드 중 길경의 지표성분으로 알려진 프라티코딘 D를 포함한 총 9종의 프라티코사이드를 HPLC 분석에 의한 자외선 흡광성분의 총 면적 대비 상대순도 70% 수준 이상으로 고순도 정제가 가능하였다.
Peak No. Retention time
(min.)		 Platycoside Molecular formula [M-H]-
1 13.14 Deapi-Platycoside E C64H104O34 1415.4
2 13.68 Platycoside E C69H112O38 1547.2
3 17.06 Platycodin D3 C63H102O33 1385.4
4 20.65 Deapi-Platycodin D C52H84O24 1091.4
5 21.13 Platycodin D C57H92O28 1223.4
6 21.57 Polygalacin D C57H92O27 1207.4
7 22.02 3"-O-acetyl polygalacin D C59H94O28 1249.4
8 22.67 Platycodin A C59H94O29 1265.4
9 23.20 2"-O-acetyl polygalacin D C59H94O28 1249.4
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
도 11에서 1 은 대피-프라티코사이드 E(Deapi-Platycoside E)이고, 2는 프라티고사이드 E(Platycoside E)이며, 3은 프라티코딘 D3(Platycodin D3)이고, 4는 대피-프라티코딘 D(Deapi-Platycodin D) 이며, 5는 프라티코딘 D(Platycodin D) 이고, 6은 폴리갈락신 D(Polygalacin D) 이며, 7 은 3“-O-아세틸 폴리갈락신 D(3"-O-acetyl polygalacin D) 이고, 8은 프라티코딘 A(Platycodin A) 이며, 9는 2"-O-아세틸 폴리갈락신 D(2"-O-acetyl polygalacin D) 이다.

Claims (6)

1) 길경 에탄올 조추출물을 에탄올에 용해시키고 아세톤을 첨가하여 형성되는 침전물을 제거하고 여액을 농축하여 길경 에탄올-아세톤 분획을 수득하는 단계;
2) 상기 길경 에탄올-아세톤 분획을 물에 용해시키고 에틸아세테이트로 분배하여 물층을 농축하여 물 분획을 수득하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 물층에 수포화 부탄올을 혼합하고 물층과 부탄올층으로 층분리한 후 부탄올층을 농축하여 부탄올 분획을 수득하는 단계; 및,
4) 상기 부탄올 분획을 증류수에 용해시키고 에탄올 함유 수용액을 용출용매로 하는 역상(C18) 카트릿지 크로마토그래피에 의해 길경 프라티코사이드를 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 단계;
를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 길경 에탄올 추출물로부터 프라티코사이드를 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 적어도 70%인 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 1) 단계에서 에탄올과 아세톤은 1 : 3 내지 5 부피비로 이루어지는 것을 특징으로 하는 길경 에탄올 추출물로부터 프라티코사이드를 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 적어도 70%인 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 4) 단계의 용출용매는 에탄올 20 내지 90 % 수용액인 길경 에탄올 추출물로부터 프라티코사이드를 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 적어도 70%인 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 1) 단계에서 제거되는 침전물은 수용성 다당체 및 단백질인 것을 특징으로 하는 길경 에탄올 추출물로부터 프라티코사이드를 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 적어도 70%인 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 2) 단계에서 제거되는 에틸아세테이트 분획은 머무름시간 8~17분 사이에 존재하며, 길경 함유 사포닌의 극성에 비해 극성이 높은 당 및 비사포닌계 중간 극성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 길경 에탄올 추출물로부터 프라티코사이드를 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 적어도 70%인 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 3) 단계에서 제거되는 물 분획은 극성 당 및 고도의 극성물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 길경 에탄올 추출물로부터 프라티코사이드를 자외선 흡광성분의 총면적 대비 상대순도가 적어도 70%인 고순도로 함유하는 길경 분획물을 분리 정제하는 방법.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Young Wan Ha 외 1명. Phytochemical Analysis. 2009, Vol. 20, pp. 207~213. *
Young Wan Ha 외 1명. Phytochemical Analysis. 2009, Vol. 20, pp. 207~213.*
김택제 외 3명. Journal of Korean Society of Analytical Science. 1990년, Vol. 3, No.3, pp. 399~404. *
김택제 외 3명. Journal of Korean Society of Analytical Science. 1990년, Vol. 3, No.3, pp. 399~404.*

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