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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Transfektionslösung
zur Herstellung von Transfektionskomplexen sowie Verfahren zur Transfektion
von Zellen.
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Die
Einführung von Molekülen, einschließlich Nukleinsäuren,
insbesondere DNA, RNA, Proteine oder chemische Substanzen in Zellen
(Transfektion) und insbesondere in eukaryontische Zellen wird zum einen
zur Untersuchung der Funktion und Regulierung von Genen und Proteinen
durchgeführt, um beispielsweise die Funktionsweise eines
bestimmten Gens genauer zu analysieren oder auch für die
genetische Veränderung von Zellen. Darüber hinaus
können Transfektionen auch zu therapeutischen Zwecken erfolgen,
beispielsweise um Oligonukleotide, Small Molecules oder siRNAs in
Zellen einzubringen.
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Verschiedene
Transfektionsverfahren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen
beispielsweise die Calciumphosphatfällung, das DEAE-Dextranverfahren,
die Elektroporation, Mikroinjektion, rezeptorvermittelte Endozytose
sowie der Erzeugung von Liposomen und die Transfektion durch Einsatz
von Virusvektoren.
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Eine
weit verbreitete Transfektionstechnik beinhaltet die Verwendung
kationischer amphiphiler Moleküle als Transportvehikel.
Eines der am besten bekannten Amphiphile ist das quartäre
Ammonium-Amphiphil DOTMA (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid,
das in Kombination mit Dioleyl-phosphatidyl-ethanolamin (DOPE) im
Handel unter dem Namen Lipofectine
TM erhältlich ist.
Beide Moleküle sind lipidisch (Analoge), die Liposome ausbilden,
die bspw. mit den negativ geladenen Nukleinsäuren Komplexe
bilden können. Der genaue Mechanismus ist nicht bekannt,
jedoch wird vermutet, dass die Liposomen mit der Plasmamembran verschmelzen
oder endozytotisch aufgenommen werden. Weitere bekannte kationische
amphiphile Verbindungen, die dazu geeignet sind, als Transfektionsreagenz
eingesetzt zu werden, sind beispielsweise in der
EP 0 755 924 , in der
WO 97/30024 ,
WO 02/090329 sowie der
WO 2006/043811 beschrieben.
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Die
Transfektion von Zellen und insbesondere von eukaryontischen Zellen
stellt eine große Herausforderung dar, da die Effizienz
der Transfektion die Aussagekraft der Ergebnisse stark beeinflusst.
In den letzten Jahren hat die Transfektion von Oligonukleotiden
und vor allem small interferring RNAs (siRNAs) an Bedeutung gewonnen.
Die Transfektion von entsprechenden kleinen Oligonukleotiden ist eine
große Herausforderung, insbesondere auch aufgrund der eingesetzten
geringen Mengen. Durch die inzwischen weite Verbreitung von Transfektions-Experimenten,
insbesondere RNAi-Experimenten, besteht ferner die Notwendigkeit,
Transfektionen oft im Hochdurchsatzformat (HTS) durchzuführen.
Um vergleichbare Datensets zu erhalten, werden oftmals Stocklösungen
der für die Transfektion eingesetzten Reagenzien und entsprechend
auch für das Transfektionsreagenz angesetzt.
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Im
Stand der Technik erfolgt die Komplexierung der zu transfizierenden
Substanz, beispielsweise einer siRNA, mit dem Transfektionsreagenz üblicherweise
im Kulturmedium. Hierzu wird das Transfektionsreagenz mit Medium
verdünnt, wodurch eine Transfektionslösung hergestellt
wird, die dann zur Ausbildung der Transfektionskomplexe mit der
zu transfizierenden Substanz in Kontakt gebracht wird. Hierbei besteht
jedoch das Problem, dass bei Ansatz einer Transfektionslösung
mit Medium (ohne Serumzusatz), die entsprechende Transfektionslösung
nur für wenige Stunden aktiv bleibt. Die Transfektionslösungen
sind daher nur für wenige Stunden stabil und können
nur für einen begrenzten Zeitraum zur Herstellung der Transfektionskomplexe
eingesetzt werden, da die Transfektionseffizienz stark abnimmt,
wodurch keine vergleichbaren Ergebnisse erzielt werden. Ein Lösungsansatz
für dieses Problem ist das Kühlen der vorgefertigten
Transfektionslösung auf 4°C. Das Kühlen
ist jedoch umständlich und erschwert die Automation eines
entsprechenden Transfektionsexperiments.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Transfektionslösung
bereitzustellen, die über mehrere Stunden aktiv bleibt
und entsprechend geeignet ist, aktive Transfektionskomplexe mit
der zu transfizierenden Substanz auszubilden. Eine solche Transfektionslösung
wäre insbesondere als Stocklösung geeignet, um
durch Mischung mit der zu transfizierenden Substanz Transfektionskomplexe
auszubilden.
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Erfindungsgemäß wird
gemäß einer ersten Ausführungsform eine
Transfektionslösung zur Herstellung von Transfektionskomplexen
bereitgestellt, die wenigstens einen Puffer und wenigstens ein Transfektionsreagenz,
das wenigstens ein kationisches Lipid aufweist, enthält.
Die Erfinder haben festgestellt, dass das Problem der geringen Lagerstabilität
der Transfektionslösungen/Verdünnungen dadurch
gelöst werden kann, dass anstelle von Medium ein Puffersystem
zur Herstellung der Transfektionslösung eingesetzt wird.
Die so hergestellte Transfektionslösung bleibt für
mehrere Stunden aktiv und kann daher ohne Aktivitätverlust
beispielsweise als Stocklösung zur Herstellung aktiver
Transfektionskomplexe eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße,
lagerungsstabile Transfektionslösung ist daher insbesondere
für HTS-Anwendungen geeignet. Die erfindungsgemäße
Transfektionslösung/Verdünnung kann auch bei Raumtemperatur
gelagert werden und entsprechend als Stocklösung für
die Herstellung verschiedener Transfektionskomplexe (beispielsweise
mit unterschiedlichen zu transfizierenden Substanzen) eingesetzt
werden. Hierfür wird die vorgefertigte Transfektionslösung
mit der jeweils zu transfizierenden Substanz in Kontakt gebracht,
um entsprechend Transfektionskomplexe enthaltend die zu transfizierende
Substanz auszubilden. Die kationischen Lipide bilden in wässrigen
Lösungen Liposomen micellarer Struktur aus, die an ihrer
Oberfläche positiv geladen sind. Gibt man dann bspw. eine
negativ geladene zu transfizierende Substanz wie bspw. eine Nukleinsäure
hinzu, bindet diese an die positiv geladene Oberfläche
der Liposomen und bildet so den Transfektionskomplex aus, der von
den Zellen aufgenommen wird, wobei die zu transfizierende Substanz
in der Zelle wieder freigesetzt wird.
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Die
verbesserte Stabilität und Aktivität der erfindungsgemäßen
Transfektionslösung bei der Ausbildung von Transfektionskomplexen
ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass Medium,
das konventionell zur Herstellung der Transfektionslösungen
eingesetzt wird, eine hochkomplexe Mischung unterschiedlichster
Ionen, Aminosäuren und anderer biologisch relevanter Substanzen
darstellt. Durch den Verzicht auf eine Verdünnung des Transfektionsreagenz
mit Medium werden entsprechende Wechselwirkungen ausgeschlossen.
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Die
erfindungsgemäße Transfektionslösung enthält
gemäß einer Ausführungsform daher keine störenden
Mengen Kulturmedium, vorzugsweise wird überhaupt kein Medium
eingesetzt, um die Transfektionslösung herzustellen. Die
erfindungsgemäße Transfektionslösung
enthaltend wenigstens einen Puffer und wenigstens ein Transfektionsreagenz
ist gemäß einer Ausführungsform für
wenigstens 6, 8 und vorzugsweise für wenigstens 12 Stunden
stabil und daher geeignet, bei Kontakt mit der zu transfizierenden
Substanz aktive Transfektionskomplexe auszubilden.
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Als
Transfektionsreagenz können verschiedene kationische Lipide
zum Einsatz kommen. Vorzugsweise enthält das Transfektionsreagenz
kationische amphiphile Verbindungen, da diese eine hohe Effizienz
für die Einführung von Nukleinsäuren
und anderen Makromolekülen, einschließlich beispielsweise
Proteinen und Arzneimitteln, in einer Zelle, aufweisen. Geeignete
Transfektionsreagenzien sind beispielsweise in
EP 0 755 924 ,
WO 97/30024 ,
WO 02/090329 und
WO 2006/043811 beschrieben. Der Inhalt
dieser Druckschriften wird hinsichtlich der beschriebenen kationischen
Verbindungen vollumfänglich zum Gegenstand der vorliegenden
Offenbarung gemacht.
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Gemäß einer
Ausführungsform weist das Transfektionsreagenz als kationisches
Lipid Verbindungen der allgemeinen Formel I auf:
in der: R
1 eine
(C
1-C
5)Alkyl-, Ar(Alkyl)-
oder eine Alkylgruppe mit einer kationischen funktionellen Gruppe
wie (C
1-C
5)N
+ ist; oder in der R
1 (C
1-C
5Alkylen)R
5 ist, worin R
5 eine
Struktur mit der allgemeinen Formel I ohne R
1 ist,
X
ein Halogenid-Gegenion ist, das ausgewählt ist aus Cl
–, I
–,
Br
–; und in der
R
3 Wasserstoff
ist und R
2 und R
4 gleich
oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, die
verzweigtes oder lineares (C
10-C
20)Alkyl, ein mono- oder polyungesättigtes
(C
10-C
20)Alkenyl, O-CO-Alkyl,
oder Ar(alkyl) aufweist, oder in der R
2 und
R
4 Wasserstoff sind und R
3 -CH(R
5)
2 ist, wobei R
5 (C
10-C
20)Alkyl,
mono- oder polyungesättigtes (C
10-C
20)Alkenyl, O=C-O-Alkyl, O-CO-Alkyl oder
Aralkyl aufweist.
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Entsprechende
Verbindungen haben sich als besonders vorteilhafte Transfektionsreagenzien
bewährt.
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Gemäß einer
Ausführungsform weist das Transfektionsreagenz neben dem
wenigstens einem kationischen Lipid auch wenigstens ein neutrales
Lipid auf. Das Transfektionsreagenz ist entsprechend eine Mischung
aus einem kationischen Lipid und einem neutralen Lipid. Das Mischungsverhältnis
liegt üblicherweise zwischen 10 zu 1 und 1 zu 10 Vorzugsweise
liegt das Mischungsverhältnis bei ca. 1:1. Der Einsatz
einer Mischung aus wenigstens einem kationischen Lipid und wenigstens
einem neutralem Lipid als Transfektionsreagenz ist insbesondere
zur effizienten Einbringung und Freisetzung von Nukleinsäuren
und insbesondere RNAi Substanzen wie siRNA in Zellen geeignet. Geeignete
neutrale Lipide sind beispielsweise DOPE, DLPE, DSPE, DPPE, DLPC, DHPE
und DOPC. Gemäß einer Ausführungsform wird
das Transfektionsreagenz HiPerFect (QIAGEN, kommerziell erhältlich)
eingesetzt. Gemäß einer anderen Ausführungsform
wird als Transfektionsreagenz eine Mischung von DOTMA und DOPE eingesetzt.
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Die
erfindungsgemäße Transfektionslösung enthält
wenigstens einen Puffer und wenigstens ein Transfektionsreagenz
wie oben beschrieben und ist dem Grunde nach eine Verdünnung
des Transfektionsreagenz. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, dass das
Transfektionsreagenz mit dem Puffer in einem Mischungsverhältnis
von 1 zu 1 bis 1 zu 10.000, bevorzugt 1 zu 10 bis 1 zu 100 vorliegt.
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Ein
Puffer ist eine Lösung, dessen pH-Wert (Konzentration der
Wasserstoffionen) sich bei Zugabe einer Säure oder Base
wesentlich weniger stark ändert, als dies in einem ungepufferten
System der Fall wäre. Vorzugsweise wird erfindungsgemäß ein biologischer
Puffer eingesetzt, der eine Pufferkapazität zwischen 6,5
und 8,5 aufweist. Ein Beispiel für einen besonders gut
geeigneten Puffer ist HEPES. HEPES ist die Kurzbezeichnung für
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure.
HEPES weist eine Säurekonstante von ca. pKs =
7,55 (bei 20°C) auf. HEPES ist besonders gut für
die Herstellung einer Transfektionslösung geeignet, da
die so erzeugten Transfektionslösungen/verdünnungen über
einen besonders langen Zeitraum stabil sind und entsprechend dazu
eingesetzt werden können, aktive Transfektionskomplexe
mit der zu transfizierenden Substanz auszubilden. Weitere geeignete
Puffersysteme sind beispielsweise Phosphatpuffer insbesondere basierend
auf Natrium- und Kaliumphophatsalzen sowie MOPS-Puffer.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform wird ein Puffer eingesetzt,
der folgende Merkmale aufweist:
- a) 1–100
mM Puffersubstanz, vorzugsweise 5–20 mM, besonders bevorzugt
ca. 10 mM,
- b) einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise ca. 7–8,
besonders bevorzugt bei ca. 7,3–7,5 mM,
- c) 10–200 mM Salz, vorzugsweise 50–150 mM, besonders
bevorzugt 100 mM.
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Als
Salze können Alkalisalze wie bspw. Lithium, Natrium und
Kaliumsalze eingesetzt werden. Alkalisalze haben einen stark polaren
Charakter und wirken sich vorteilhaft auf die Stabilisierung der Transfektionskomplexe
aus. Vorzugsweise wird Natriumchlorid als Salz eingesetzt.
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Die
erfindungsgemäße Transfektionslösung wird
zur Herstellung der Transfektionskomplexe mit der zu transfizierenden
Substanz in Kontakt gebracht, wodurch Transfektionskomplexe ausgebildet werden
(siehe oben). Die Ausbildung der entsprechenden Komplexe ist im
Stand der Technik wohlbekannt, wir verweisen insbesondere auch auf
die in die vorliegende Offenbarung übernommenen Dokumente
zu kationischen Transfektionsreagenzien (siehe oben).
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Verschiedenste
Substanzen können mit der erfindungsgemäßen
Transfektionslösung komplexiert und damit für
die Transfektion aufbereitet werden. Beispielhaft seien genannt
Nukleinsäuren, lineare und zirkuläre Nukleinsäuren,
insbesondere DNA, RNA, cDNA, RNAi-Substanzen, Oligonukleotide, ncRNA,
siRNA, miRNA, Vektoren, Cosmide, Plasmide, mRNA, Peptide, Small
Molecules und chemische Substanzen. Als besonders vorteilhaft hat
sich die erfindungsgemäße Transfektionslösung
zur Transfektion von RNAi-Substanzen und insbesondere siRNA erwiesen.
siRNAs sind kurze Oligonukleotide, die oftmals auch nur in geringen
Konzentrationen eingesetzt werden, was die effiziente Transfektion
erschwert. Die erfolgreiche Transfektion von siRNA und anderen RNAi
Substanzen ist daher eine besondere Herausforderung. Mit der erfindungsgemäßen Transfektionslösung
lassen sich insbesondere kurzkettige Oligonukleotide effizient komplexieren
und transfizieren.
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Verschiedene
Zellen können mit den erfindungsgemäß hergestellten
Transfektionskomplexen transfiziert werden. Beispielhaft genannt
seien eukaryontische Zellen, humane Zellen, Kidney-Epithel-Zellen,
melanoma Zellen, A545-Zellen, AGS-Zellen, B16 und B16-F1 Zellen,
HeLa-Zellen, hepG-2-Zellen, K562-Zellen, Huh-7-Zellen, H10-Zellen,
Jurkartzellen und andere.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ferner die Verwendung wenigstens eines
Puffers zur Herstellung einer Transfektionslösung mit wenigstens
einem Transfektionsreagenz, das ein kationisches Lipid aufweist.
Erfindungsgemäß einsetzbare Transfektionsreagenzien
sowie bevorzugte Ausführungsformen davon sind ausführlich
oben beschrieben, wie verweisen auf unsere obigen Ausführungen.
Gleiches gilt für die erfindungsgemäß eingesetzten
Puffer, die vorzugsweise biologische Puffer wie oben beschrieben
sind.
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Die
Erfindung umfasst ferner einen Kit, aufweisend wenigstens einen
Puffer und wenigstens ein Transfektionsreagenz, das wenigstens ein
kationisches Lipid aufweist, zur Herstellung einer Transfektionslösung.
Die Zurverfügungstellung eines solchen Kits, der bereits
den Puffer sowie das Transfektionsreagenz zur Herstellung einer
Transfektions-Stocklösung enthält, bietet dem
Anwender in vorteilhafter Weise die Möglichkeit, standardisierte
Transfektionsreagenzverdünnungen anzusetzen. Dies ist insbesondere
mit Blick auf Hochdurchsatzexperimente vorteilhaft. Die erzielten
Ergebnisse werden durch die Standardisierung vergleichbarer und
reproduzierbar.
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Erfindungsgemäß wird
ferner ein Verfahren zur Transfektion von Zellen zur Verfügung
gestellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine erfindungsgemäße
Transfektionslösung enthaltend wenigstens einen Puffer
und wenigstens ein Transfektionsreagenz, das wenigstens ein kationisches
Lipid aufweist, zur Herstellung von Transfektionskomplexen eingesetzt
wird. Zur Herstellung der Transfektionskomplexe wird die erfindungsgemäße
Transfektionslösung/verdünnung mit der jeweils
zu transfizierenden Substanz zur Ausbildung der Komplexe in an sich
bekannter Weise in Kontakt gebracht. Erfindungsgemäß erfolgt
entsprechend die Ausbildung der Transfektionskomplexe in einem Minimalpuffer und
nicht wie im Stand der Technik üblich in Medium. Entsprechend
weist die Transfektionslösung vorzugsweise keine störenden
Mengen und vorzugsweise überhaupt kein Medium auf.
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Substanzen,
die mit den erfindungsgemäßen Transfektionslösungen
komplexiert werden können, um Transfektionskomplexe herzustellen,
sind oben in Detail beschrieben. Wir verweisen auf unsere obigen Ausführungen.
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BEISPIEL
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MCF-7-Zellen
wurden im 24-Well-Format entsprechend der Angaben der Handbücher
mit den Reagenzien HiPerFect (Qiagen) oder LipofectamineTM RNAi MAX (Invitrogen) transfiziert. Bei
beiden Reagenzien handelt es sich um Mischungen aus kationischen
und neutralen Lipiden. Die Reagenzien wurden direkt mit der siRNA
komplexiert (fresh) oder waren zuvor für unterschiedliche
Zeiträume bei Raumtemperatur in RPMI-Medium ohne Serum,
OptiMEM-Medium (Invitrogen) oder einem erfindungsgemäßen
Transfektionspuffer (10 mM HEPES; pH 7,4; 100 mMl NaCl gelagert
worden. Als Test siRNA wurde 25 nM Lamin A/C spezifische siRNA verwendet.
Die Analyse erfolgte nach 48 Stunden auf RNA-Ebene mittels Real
time qRT-PCR. Die Laminexpression wurde auf die GAPDH-Expression
normalisiert.
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Die
Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Bei der Verwendung
von Medium ohne Serumzusatz oder dem bekannten OptiMEM-Medium, fällt
das Silencing nach spätestens 6 Stunden Lagerung für
HiPerFect und Lipofectamine RNAiMAX deutlich niedriger aus, die
Transfektionskomplexe haben daher an Aktivität verloren.
Durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Puffers
an Stelle von Medium zur Herstellung der Transfektionslösungen
erhält man für die getesteten kationischen Lipidmischungen
HiPerFect und Lipofectamine RNAi MAX die besten Ergebnisse. Die entsprechenden
Daten belegen, dass das erfindungsgemäße Verfahren
dem Stand der Technik überlegen ist, und dass das Konzept
auch für verschiedene Transfektionsreagenzien funktioniert.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - EP 0755924 [0004, 0011]
- - WO 97/30024 [0004, 0011]
- - WO 02/090329 [0004, 0011]
- - WO 2006/043811 [0004, 0011]
