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Verfahren zur Gewinnung eines kristallinen Trypsins Die Erfindung
bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung eines kristallinen Trypsins für medizinische
Zwecke aus enzymhaltigen. Geweben, die mit einem mit Wasser mischbaren organischen
Lösungsmittel vorbehandelt wurden, insbesondere den bei der Extraktion von Insulin
aus Pankreas verbleibenden methanol-, äthanol- oder acetonhaltigen Rückständen.
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Die Gewinnung des Insulins aus frischem Pankreas erfolgt gewöhnlich
durch Extraktion mit einem angesäuerten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel,
wie z. B. niedere Alkohole oder Ketone. Die vorzugsweise gebrauchten Lösungsmittel
sind Methanol, Äthanol und Aceton. Um die Enzyme inaktiv und unlöslich zu halten
und die Zerstörung des Insulins oder eine Verunreinigung des Insulinextraktes zu
verhindern, stellt man das wäßrige, etwa, 50 bis 851/o, organisches Lösungsmittel
enthaltende Extraktionsmittel auf ein PH unter 4,0 ein.
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Die nach der Extraktion verbleibenden enzymhaltigen Pankreasrückstände
wurden jedoch verworfen, weil die Auffassung bestand, daß die starke Konzentration
des organischen Lösungsmittels und/oder das niedrige PH der Extraktionslösung die
proteolytischen Enzyme zerstören.
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Die Gewinnung eines Gemisches von nicht kristallinen Enzymen aus frischem
Pankreas ist bekannt. Man hat auch schon reine kristalline Enzyme laboratoriumsmäßig
aus frischem Pankreas gewonnen. Neuerdings ist zwar bekanntgeworden, daß auch die
Rückstände von Pankreas als Ausgangsstoffe für die Gewinnung von Enzympräparaten
geeignet sind, nach diesem Verfahren erhält man jedoch lediglich ein unreines Gemisch
von verschiedenen Enzymen.. Die Konzentration des organischen Lösungsmittels wird
dabei reduziert, um die Enzyme in die wäßrige Phase zu bringen. Als unterste Grenze
der Konzentration für das organische Lösungsmittel werden 20 Volumprozent angegeben.
Die beschriebenen Versuche wurden jedoch mit wesentlich höher liegenden Konzentrationen
durchgeführt.
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Kristalline; Enzyme, insbesondere kristallines Trypsin, kann man jedoch
auf diese Weise nicht gewinnen. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die Gewinnung
eines kristallinen Trypsins erst möglich ist, wenn die Konzentration des organischen
Lösungsmittels auf mindestens 4 Volumprozent reduziert wird. Durch Verringerung
der Konzentration des organischen Lösungsmittels auf unter 4 Volumprozent konnte
die Ausbeute an Enzymen, insbesondere kristallinem Trypsin, stark erhöht werden,
optimale Ergebnisse wurden bei etwa 1 Volumprozent oder noch weniger erreicht.
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Die, Konzentration von 4 Volumprozent stellt damit. für die Gewinnung
von kristallinen Enzymen aus den bei der Extraktion von Insulin aus Pankreas verbleibenden
Rückständen einen kritischen Punkt dar. Theoretisch ist dies vielleicht darauf zurückzuführen,
daß die Rückstände aus vielen anorganischen und organischen Stoffen bestehen. In
diesem Zusammenhang sei auf die Mannigfaltigkeit von. prote.in-und lipoMähnlichen
Stoffen hingewiesen. Der Charakter der bei einer Extraktion erhaltenen Lösung ist
deshalb von der Zusammensetzung und Konzentration des Lösungsmittels in hohem Grade
abhängig.
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Der zur Enzymextraktion verwendete Organbrei soll nicht mehr als 14
Gewichtsteile des wäßrigen Extraktionsmittels auf 1 Teil fester Gewebeteile in der
Mischung enthalten. Um eine den Transport erleichternde Pumpfähigkeit der Extraktionsmischung
zu ermöglichen, soll diese aber wenigstens 6 Gewichtsteile Flüssigkeit auf 1 Teil
fester Bestandteile enthalten. Optimale Ergebnisse werden. erreicht, wenn die Extraktionsmischung
zwischen 9 und 11 Gewichtsteilen wäßrigen Extraktionsmittels auf 1 Teil fester Bestandteile
enthält. Die Verringerung der Konzentration des organischen Lösungsmittels auf wenigstens
4 Volumprozent durch einfaches Verdünnen des Gemisches mit Wasser erfordert außerordentlich
große Wassermengen, die bei der weiteren
Durchführung des Verfahrens
sehr lästig sind. Es ist deshalb zweckmäßiger, das organische-Lösungsmittel teilweise
z. B. in bekannter Weise durch Destillation unter verringertem Druck zu entfernen.
Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, dem Gemisch vor der Vakuumdestillation
6 bis 20 Teile Wasser, vorzugsweise 10 Teile, je Teil fester Gewebeteile zuzugeben..
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Eine Verringerung der Konzentration des organischen Lösungsmittels
kann man auch dadurch erreichen, daB das Gemisch zunächst mit Wasser so weit verdünnt
wird, daß die Konzentration des Lösungsmittels 15 bis 25 Volumprozent beträgt, das
enzymhaltige Material -abtrennt und darauf mit so viel Frischwasser versetzt, .bis
die Konzentration des organischen Lösungsmittels weniger als 4 Volumprozent beträgt.
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Die Gewinnung des Enzyms erfolgt durch Rühren des Organbreis in Extraktionsapparaten
und Einhalten eines pH unter 6,5, vorteilhaft unter 4,0 und niedriger Temperatur,
damit eine Zerstörung des Enzyms verhindert wird. Die, besten Resultate werden bei
Temperaturen unter 30° C, vorzugsweise von 15 bis 20° C, erhalten. Bei der auf Grund
eingehender Versuche getroffenen Wahl der Temperatur sind zwei verschiedene Gesichtspunkte
zu berücksichtigen. Die Geschwindigkeit der Extraktion ist sowohl für die begrenzte
Haltbarkeit der Rohstoffe als auch für die wirtschaftliche Ausnutzung der verwendeten
Apparatur von Bedeutung. Sie wird um so. größer, je höhere Temperaturen angewandt
werden. Die Temperaturempfindlichkeit der Enzyme verbietet jedoch eine Steigerung
der Temperatur über die angegebene Grenze hinaus.
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Das extrahierte Gewebe wird dann von der enzymhaltigen Flüssigkeit
durch Zentrifugieren oder Filtrieren getrennt und aus der Flüssigkeit in bekannter
Weise durch Fraktionierung, z. B. mit Ammonsulfat, das kristalline Trypsin gewonnen.
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Besonders günstige Ergebnisse werden durch das erfindungsgemäße Verfahren
erzielt, wenn man das organische Lösungsmittel mit Mineralsäuren, wie Phosphorsäure,
Salzsäure oder Schwefelsäure, ansäuert.
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Außer den bisher als Ausgangsstoffe genannten insulinfreien Rückständen
von Pankreas sind erfindungsgemäß auch alle anderen trypsinhaltigen Gewebe zur Gewinnung
kristallinen Trypsins geeignet, welche aus bestimmten Gründen, z. B. zur Konservierung
mit organischen Lösungsmitteln, versetzt wurden.
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Durch die nachfolgenden Beispiele soll das beanspruchte Verfahren
näher erläutert werden. Beispiel I Folgendes Verfahren ist zur Gewinnung von Trypsin
aus insulinfreien Rückständen von Rinderpankreas geeignet: Die Extraktionsrückstände
des Pankreas bestehen zu etwa 70 Gewichtsprozent aus flüssigen und zu 30 Gewichtsprozent
aus festen Bestandteilen. Der flüssige Anteil, der zu 65 Volumprozent aus Äthanol
besteht, wird mit Phosphorsäure auf p$ 2,85 gebracht. 450 kg der Rückstände werden
in 15001 Leitungswasser, das mit 2200 cms konzentrierter H2 S O4 versetzt ist, suspendiert.
Durch Vakuumdestillation aus einem Topf werden bei 15 bis 20° C, maximal 30° C,
6501 Flüssigkeit mit einem Gehalt von etwa 30% Äthanol entfernt. Die Alkoholkonzentration
im Destillationsrückstand beträgt nunmehr etwa 1%. Zur Förderung der Pumpfähigkeit
wird das Konzentrat mit 2501 Leitungswasser verdünnt. Nach Rückführung in den ersten
Behälter wird auf 4° C abgekühlt. Extrahiert wird in zwei Durchgängen von je 30
Minuten mit einer dreiflügeligen Kreiselpumpe. Zwischen und nach den Durchgängen
wird die Suspension 15 Minuten lang zur Entfernung der Fettpartikel mit einem Flügelradrührwerk
langsam gerührt. Die Entfernung der Fettpartikel erfolgt hierbei durch Abschöpfen.
Die Suspension wird anschließend in einer Bird-Zylinderzentrifuge getrennt. Das
Gewebe aus der ersten Zentrifugierung wird in 8501 Leitungswasser aufgeschwemmt,
das 340 em3 konzentrierte H2 S 04 enthält. Anschließend wird 30 Minuten im Durchgang
durch eine Kreiselpumpe gewaschen, nochmals zentrifugiert und das erhaltene Zentrifugat
mit dem der ersten Zentrifugierung vereinigt.
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Der Extrakt wird in bekannter Weise durch Fraktionierung mit Ammonsulfat
auf kristallines Trypsin verarbeitet. Dabei werden in der ersten Stufe neutrale
Substanzen niedergeschlagen und durch Ausschleudern und Filtrieren abgeschieden.
Danach wird die Konzentration des Ammonsulfats erhöht, um das Trypsinogen und die
anderen Pro-Enzyme zu fällen. Das Trypsinogen wird isoliert und durch wiederholte
Rekristallisation wie bei der Herstellung kristallinen Trypsins aus frischem Pankreas
gereinigt.
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Beispiel II Statt Rinderpankreas kann auch Schweinepankreas benutzt
werden. Der höhere Gehalt an Fett und Lipoiden Stoffen im Schweinepankreas, der
30 bis 40% gegenüber 5 bis 10% im Rinderpankreas beträgt, stört jedoch die Gewinnung
des kristallinen Trypsins. Deshalb muß der Organbrei nach der Destillation auf etwa
0° C gekühlt und bei dieser Temperatur auch während der anschließenden Extraktion
und während der Zentrifugierungen belassen werden. Dadurch wird die Abscheidung
der Fetteilchen, gefördert.
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Das Zentrifugat wird nach der Abscheidung der verbrauchten Rückstände
in einen kleinen Abschöpfbehälter gebracht, um die Fetteilchen an der Oberfläche
abzuschöpfen. Durch diese Maßnahmen wird ein im wesentlichen fettfreier Extrakt
erhalten.
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Beispiel III Insulinfreie Pankreasrückstände werden in 4 Teilen Wasser,
das mit Salzsäure auf pH 1,8 angesäuert ist, suspendiert. Das pH wird mit Salzsäure
dann wieder auf 1,8 eingestellt. Danach wird die Äthanolkonzentration durch Destillation
unter vermindertem Druck auf 3 % verringert. Die Enzymextraktion des Organbreies
wird bei 3° C und einem pH von 1,8 innerhalb von 48 Stunden vervollständigt.
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Das Gewebe wird dann durch Zentrifugieren abgetrennt und verworfen,
Dem Zentrifugat wird Ammonsulfat zugefügt bis zu einem Sättigungsgrad. von 400/0.
Die hierbei entstehende Suspension läßt man bei 5° C 48 Stunden absetzen, filtriert
und verwirft den Niederschlag, der die Proteinfraktion enthält. Der Sättigungsgrad
des Filtrates an Ammonsulfat wird nunmehr auf 70% erhöht. Die entstehende Suspension
läßt man wiederum bei 5° C 48 Stunden absetzen. Der die rohen Enzyme enthaltende
Niederschlag wird abgetrennt, die überstehende Flüssigkeit verworfen.
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Der Niederschlag, der durch die Erhöhung des Sättigungsgrades mit
Ammonsulfat auf 70% entstanden ist, wird in 10 Teilen destillierten Wassers gelöst
und bei 5° C nochmals mit Ammonsulfatlösungen der Sättigungsgrade von 40 und 70%
fraktioniert. Der zuletzt erhaltene Niederschlag kann nochmals durch Lösen in 3
Teilen destillierten Wassers
und neuerlicher Ammonsulfatsättigung
von 40 bzw. 70% bei 25° C fraktioniert werden. Der nun erhaltene Niederschlag wird
in 1,5 Teilen destillierten Wassers bei 25° C gelöst. Dazu gibt man gesättigte Ammonsulfatlösung,
bis ein Sättigungsgrad von 25% erreicht ist. Das pH wird mit 5 N Na OH auf 5,0 eingestellt.
Die Lösung wird mit einigen Chymotrypsinogenkristallen beeimpft und wird zur Vervollständigung
der Kristallisation 48 bis 72 Stunden bei 25° C gehalten. Anschließend wird filtriert.
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Das pH des Filtrates wird nach der Abscheidung des rohen Chymotrypsinogens
mit 5 N H2 S 04 auf 3,0 gebracht. Die Lösung wird bis zu einen Sättigungsgrad von
701/9 mit Ammonsulfat versetzt und filtriert; das Filtrat wird verworfen.. Der Niederschlag
wird in 3 Teilen Wasser gelöst und bei 25° C mit Ammonsulfatlösungen eines Sättigungsgrades
von 40 bzw. 70% versetzt. Der mit 70% gesättigter Ammonsufatlösung erhaltene Niederschlag
wird bei 10° C in 1,5 Teilen eines Boratpuffers vom p$ 9,0 gelöst und das pH der
Lösung mit 5 N Na O H auf 7,0 gebracht. Es wird nun mit Magnesiumsulfat bis zur
halben Sättigungskonzentration versetzt. Die Lösung wird einige Tage auf 5° C gehalten,
bis die Kristallisation des Trypsins beendet ist. Der kristalline Niederschlag wird
filtriert und das Filtrat verworfen. Die kristalline Masse des Trypsins kann dann
bei -5° C gehalten oder in 10 Teilen Wasser suspendiert und gefriergetrocknet werden.
Beispiel IV Es werden insulinfreie Rückstände von Pankreas mit 30 bis 40 Gewichtsprozent
fester Anteile verwendet. Der flüssige Anteil enthält 60 bis 70 Volumprozent Äthanol
und ist auf ein px unter 4,0 eingestellt. 450 kg dieser Rückstände werden mit 675
1 Wasser versetzt, gründlich gemischt und der Hauptteil des Wassers durch Zentrifugieren
entfernt.
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Die ausgewaschenen. Rückstände werden. in 13501 Wasser suspendiert.
Die Enzyme werden aus dem Organbrei im Durchgang durch eine Kreiselpumpe 30 bis
60 Minuten lang entweder ununterbrochen oder mit Abständen von 5 bis 15 Minuten
extrahiert. Im letzteren Fall muß der Inhalt des Behälters gerührt werden. Die Extraktion
kann auch in einem mit Rührwerk ausgestatteten Extraktionsapparat mit Solemantel
erfolgen. Der Organbrei wird in .diesem Behälter 12 bis 48 Stunden bei einer Temperatur
zwischen - 1° C und -I- 2° C belassen. Die verbrauchten Rückstände werden zentrifugiert.
Der Extrakt wird weiterhin auf einer Temperatur zwischen - 1° C und -I- 2° C gehalten.
Um ein im wesentlichen von Verunreinigungen freies Rohenzym zu erhalten, das auf
kristallines Trypsin verarbeitet werden kann, wird wie im Beispiel I mit Ammonsulfat
behandelt. Beispiel V Aus 2700 g Rinderpankreas, das auf Insulin. extrahiert worden
ist, verbleiben etwa 1800 g Gewebe, das noch zu 500% alkoholische Extraktionslösung
enthält. Diese Menge wird in 6000 ccm kaltes Wasser eingetragen und 10 Stunden bei
5° C gehalten. Die Lösung hat ein pH von 2,4. Die festen Bestandteile werden durch
Zentrifugieren entfernt. Anschließend wird nochmals mit 3000 ccm kaltem Wasser extrahiert.
Die beiden Extrakte werden zusammen klar filtriert und mit Ammonsulfat bis zur 80%igen
Sättigung versetzt. Die gefällten proteolytischen Proenzyme werden abfiltriert,
gelöst und weitergereinigt. Vor der Abscheidung des kristallinen Trypsins, das in,
guter Ausbeute anfällt, wird noch aktiviert.
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Beispiel VI Wie im Beispiel V werden die Rückstände von 2700 g auf
Insulin verarbeitetem, gefrorenem Rinderpankreas verwendet. Diese werden in 4000
ccm Wasser eingetragen und bei 30° C zur Entfernung des Alkohols im Vakuum destilliert.
Nach Übergang von etwa 1000 ccm Wasser wird auf -f- 5° C gekühlt und 3 Stunden.
lang kräftig gerührt. Die zweite Extraktion und die folgende Aufarbeitung geschieht
nach neuerlicher Einstellung des pH auf 2,4 in gleicher Weise, wie im Beispiel V
beschrieben.