DE10048822A1 - Verfahren zur Immobilisierung von Lipidschichten - Google Patents
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Abstract
Es wird ein Verfahren zum Immobilisieren von Lipidschichten auf Festkörperoberflächen bereitgestellt, bei welchem die Festkörperoberflächen derart modifiziert werden, dass die darauf deponierten Lipidschichten in ihren Eigenschaften, insbesondere in Bezug auf Diffusivität, denen nicht-immobilisierter Lipidschichten weitgehend entsprechen. Hierbei wird die Festkörperoberfläche zunächst mit Molekülen so modifiziert, daß eine im Wesentlichen hydrophile Fläche ausgebildet wird. In einem zweiten Verfahrensschritt werden auf dieser modifizierten Oberfläche Lipidschichten, insbesondere Lipiddoppelschichten, deponiert.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von auf
Oberflächen pulverförmiger Festkörper immobilisierten Lipid
schichten sowie modifizierte Festkörperoberflächen, immobili
sierte Lipidschichten und einen Kit, der zu deren Herstellung
geeignet ist.
Festkörperunterstützte Lipiddoppelschichten (im folgenden
Bilayer genannt) und festkörperunterstützte funktionelle
Biomembranen mit darin immobilisierten Membranproteinen haben
in den letzten Jahren im Bereich des Pharmascreenings, der
Chromatographie, der Biosensorik, und für Lipidbindungsstudi
en an Bedeutung gewonnen. Die ersten in der Literatur be
schriebenen festkörperunterstützten Bilayer waren nur durch
einen 1 bis 2 nm dicken Wasserfilm von der Festkörperober
fläche entfernt (Tamm, L. K.; McConnell, H. M. Biophysical
Journal 1985, 47, 105-113; Johnson, S. J.; Bayerl, T. M.;
McDermott, D. C.; Adam, G. W.; Rennie, A. R.; Thomas, R. K.;
Sackmann, E. Biophysical Journal 1991, 59, 289-294; Bayerl,
T. M.; Bloom, M. Biophysical Journal 1990, 58, 357-362),
wodurch wesentliche Bewegungseigenschaften des Bilayers (z. B.
Diffusion der Lipide in der Bilayerebene (M. Hetzer, S.
Heinz, S. Grage, T. M. Bayerl, Langmuir, 1998, 14, 982-984))
vom Festkörper dominiert wurden. Mit dieser Technik wurden
auch in Liposomen rekonstituierte Proteine mittels Fusion auf
unbehandelten, planaren Oberflächen immobilisiert (J. Salaf
sky, J. T. Groves, S. G. Boxer, Biochemistry, 1996, 35, 14773
-14781). Die daraus resultierenden Unterschiede zu natürli
chen Zellmembranen sowie der geringe Abstand zwischen Bilayer
und Festkörper erschwerten insbesondere die funktionelle
Immobilisierung von integralen Membranproteinen. So beschäf
tigen sich neuere Forschungsarbeiten insbesondere mit einer
Erhöhung des Abstandes zwischen Bilayer und Festkörper, um
eine dynamische Entkopplung des Bilayers zu erreichen und
integralen Membranproteinen im Bilayer einen ausreichend
großen Abstand zur häufig denaturierend wirkenden Festkörper
oberfläche zu ermöglichen. Dies ist beispielsweise eine
Voraussetzung für die Verwendung von Ionenkanälen im Bilayer
als Biosensor.
Aktuelle Strategien zur Erreichung dieses Ziels bestehen
insbesondere darin, Lipidmoleküle über hydrophile Spacer
("Abstandshalter") auf der Festkörperoberfläche chemisch oder
physikalisch anzubinden (B. A. Cornell, V. L. Braach-Maksvy
tis, L, G. King, P. D. Osman, B. Raguse, L. Wieczorek, R. J.
Pace, Nature, 1997, 387, 580; S. Lingler, I. Rubinstein, W.
Knoll, A. Offenhäuser, Langmuir, 1997, 13, 7085; H. J. Galla,
C. Steinem, K. Rheis, Patent DE 196 07 279), wobei der hydro
phile Spacer zur Entkopplung des aus weiteren Lipidmolekülen
gebildeten Bilayers vom Substrat dient, indem die gebundenen
Lipide als "Anker" wirken und damit die maximale Entfernung
zwischen Bilayer und Oberfläche durch die Länge des hydrophi
len Spacers vorgeben. Dabei können die Lipidmoleküle entweder
an polymere, oligomere oder niedermolekulare Spacer gebunden
sein. Nachteilig ist der hohe präparative Aufwand bei diesen
Strategien und die Abhängigkeit der Eigenschaften des Bilay
ers von der lateralen Dichte der Ankermoleküle, von der
Hydratisierbarkeit des hydrophilen Spacermaterials sowie von
den dynamischen Eigenschaften des Spacers selbst.
Einen weiteren Schritt zu einem weitgehend von der Festkör
peroberfläche entkoppelten Bilayer stellt deshalb die Verwen
dung von Festkörperoberflächen dar, die durch ein hydrophiles
Polymer (z. B. Dextran) modifiziert und anschließend mit einem
Bilayer beschichtet wurden (M. Kuhner, E. Sackmann, Langmuir,
1996, 12 (20), 4866; G. Elender, M. Kuhner, E. Sackmann,
Biosens. Bioelectron., 1996, 11, 565; E. Sackmann, Science,
1996, 271, 43; E. Györvary, B. Wetzer, U. B. Sieytr, A.
Sinner, A. Offenhäusser, W. Knoll, Langmuir 1999, 15, 1337).
In diesem Zusammenhang sind auch die im folgenden beschriebe
nen Arbeiten zu sehen, die als hydrophile Polymere Polyelek
trolytmono- oder -multilagen verwenden, um den Bilayer von
einer planaren Festkörperoberfläche zu entkoppeln. In (J.
Majewski, J. Y. Wong, C. K. Park, M. Seitz, J. N. Israelachvili,
G. S. Smith, Biophysical Journal 1998, 75, 2363) ist die
Möglichkeit beschrieben, eine bereits bestehende festkörper
unterstützte Lipidmembran auf einem planaren Quarzsubstrat
durch Behandlung mit einem verzweigten kationischen Polyelek
trolyten nachträglich von der Festkörperoberfläche zu entkop
peln, wobei allerdings ein schrittweiser Aufbau bzw. eine
direkte Fusion der Vesikel auf der Polykation-Lage nicht zu
einem definierten Bilayer führte. In (J. Y. Wong, J. Majewski,
M. Seitz, C. K. Park, J. N. Israelachvili, G. S. Smith, Biophy
sical Journal 1999, 77, 1445) wird gezeigt, daß eine defi
nierte Lipidmembran nur auf einer vorher getrockneten PEI-
(Polyethylenimin) Lage erhalten werden kann. Dagegen gelang
(U. Sohling, A. J. Schouten, Langmuir 1996, 12, 3912) der
Aufbau einer festkörperunterstützten Lipidmembran auf PEI-
modifizierten Oberflächen im Falle von negativ geladenen
Lipiden. In (B. Lindholm-Sethson, Langmuir 1996, 12, 3305)
ist beschrieben, daß definierte Bilayer aus partiell negativ
geladenen Lipiden ebenfalls auf anionischen PSS (Na-Polysty
rolsulfonat) Oberflächen durch Verwendung von Ca2+-Brücken
erhalten werden. In (B. Lindholm-Sethson, J. C. Gonzales, G.
Puu, Langmuir 1998, 14, 6705) wird schließlich gezeigt, daß
Cytochrom C-Oxidase enthaltende Proteoliposomen auf Polyelek
trolytmultilagen funktionell immobilisiert werden können.
Alle diese Arbeiten wurden jedoch auf planaren Substraten
vorgenommen, wodurch nur eine geringe Gesamtoberfläche zur
Verfügung steht, was beispielsweise chromatographische
Anwendungen unmöglich macht, und andere Anwendungen er
schwert.
Weitere Ansätze zur Herstellung polymerunterstützter Lipid
membranen nutzen sogenannte Filmwaagentechniken wie Langmuir-
Blodgett und Langmuir-Schäfer, und sind daher im wesentlichen
beschränkt auf planare Oberflächen, und ebenfalls nicht
geeignet für bestimmte Anwendungen. Ein Beispiel hierfür ist
beschrieben in (H. Hillebrandt, G. Wiegand, M. Tanaka, E.
Sackmann, Langmuir 1999, 15, 8451).
Der Verzicht auf Spacerelemente ermöglicht dem Bilayer bei
dieser Strategie eine höchstmögliche Entkopplung von der
Festkörperoberfläche und gleichzeitig können auf diese Weise
integrale Proteine in die Membran eingebettet werden ohne
direkt in Kontakt mit dem Festkörper zu gelangen. Das ent
scheidende Problem dieser Methode ist die Stabilität des
Bilayers auf der Polymeroberfläche, die ein wichtiges Krite
rium für Anwendungen in der Bioanalytik und Biosensorik ist.
Externe Kräfte (z. B. Flußkräfte eines vorbeiströmenden
Mediums) führen bei dieser Strategie daher leicht zur Ablö
sung von Teilen des Bilayers.
Weitere Strategien beruhen auf der Ausbildung von Lipidmono
lagen (im folgenden als Monolayer bezeichnet) auf Festkörper
oberflächen, die zuvor mittels Alkylsilan- oder Mercaptanmo
nolagen hydrophobisiert wurden. Der Nachteil ist hier offen
sichtlich: ein reales Entkoppeln von der Substratoberfläche
findet nicht statt, was die Dynamik und molekulare Ordnung
der Monolayer signifikant gegenüber denen eines Bilayers
verändert (Linseisen, F. M.; Hetzer, M.; Brumm, T.; Bayerl,
T. M. Biophysical Journal 1997, 72, 1659-1667) und den Einbau
von transmembranen Proteinen erschwert oder gar verhindert.
So zeigten C. Steinem et al. (Steinem, C.; Janshoff, A.;
Galla, H. J.; Sieber, M., Bioelectrochem. Bioenerg. 1997, 42
(2), 213-220), daß eine Fusion der Proteoliposomen zum Lipid
bilayer wahrscheinlich nicht stattfindet, sondern nur eine
Anlagerung bzw. Teilfusion, so daß letztlich immobilisierte
Vesikel auf der Oberfläche vorliegen. Ältere Arbeiten zu
diesem Thema untersuchten diese Möglichkeit nicht bzw. ihre
gezeigten funktionellen Daten lassen ebenso die Interpretati
on zu, daß kein direkter Proteineinbau in einem Lipidbilayer
stattfindet und die Enzymaktivität aus den vesikulären
Strukturen resultiert.
Die Erfindung stellt sich nun die Aufgabe, ein weitgehend
universell anwendbares Verfahren zur Verfügung zu stellen,
welches die beschriebenen Mängel der herkömmlichen Strategien
zur Immobilisierung von Lipidschichten vermeidet und auf eine
präparativ einfache Art die Entkopplung der Lipidschichten,
insbesondere der Lipiddoppelschichten, von der Membran
erlaubt. Bei dem neuen Verfahren soll die Festkörperober
fläche derart optimiert werden, daß die Eigenschaften der
festkörperunterstützten Lipidschichten bei hoher Stabilität
gegen äußere Kräfte möglichst nahe den Eigenschaften natürli
cher Membransysteme sind.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkma
len des Anspruchs 1. Bevorzugte Ausführungsformen des Verfah
rens sind in den Ansprüche 2 bis 24 dargestellt. Die Ansprü
che 25 bis 27 betreffen eine entsprechend modifizierte
Festkörperoberfläche, eine immobilisierte Lipidschicht bzw.
einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipidschichten.
Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezug
nahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Festkörperoberflä
chen zunächst derart modifiziert, daß diese optimale Bedin
gungen für die schonende Immobilisierung einer über der
modifizierten Oberfläche aufgebrachten Lipidschicht, insbe
sondere Lipiddoppelschicht bzw. Lipidmembran bieten. In
einem zweiten Schritt des Verfahrens werden sodann Lipid
schichten, beispielsweise Membranen aus nativen Zellen, so
auf der modifizierten Oberfläche immobilisiert, daß die
Eigenschaften der immobilisierten Lipidschichten im wesentli
chen denen nicht-immobilisierter Lipidschichten entsprechen.
Bevorzugt erfolgt dabei die Immobilisierung der Lipidschich
ten mittels Fusion von Vesikeln aus Pufferlösungen.
Bei den genannten Eigenschaften der Lipidschichten handelt es
sich zunächst um die Diffusivität der Lipidschicht. Eine
nicht-immobilisierte Lipidschicht, insbesondere eine Lipid
doppelschicht, zeichnet sich dadurch aus, daß die einzelnen
Lipide und andere Komponenten, beispielsweise Proteine,
innerhalb der Schicht und bei einer Doppelschicht auch
zwischen den beiden Schichten relativ frei beweglich sind.
Bei herkömmlichen Immobilisierungsmethoden wird diese Diffu
sivität der Lipidschichten extrem herabgesetzt. Bei einer
Doppelschicht wird vor allem in der Lipidlage, die der
Oberfläche des Substrates zugeordnet ist, die Bewegungsmög
lichkeit der Lipide deutlich abgebremst. Dies führt zu einer
drastischen Veränderung der Eigenschaften der herkömmlich
immobilisierten Membran. Bei der erfindungsgemäßen Immobili
sierungsmethode wird die Bewegungsmöglichkeit innerhalb der
Lipidschicht nicht eingeschränkt, so daß diese charakteristi
sche Eigenschaft bei den erfindungsgemäß immobilisierten
Lipidschichten erhalten bleibt.
Weiterhin wird durch die erfindungsgemäße Immobilisierungsme
thode durch die Modifizierung der Festkörperoberfläche eine
"weiche" Oberfläche erzielt, die zum einen die darauf immobi
lisierte Lipidschicht weitgehend unbeeinflußt läßt und zum
anderen auch einen ausreichenden Abstand zwischen Festkörper
oberfläche und Lipidschicht gewährleistet, so daß keine
denaturierenden Effekte der Festkörperoberfläche auf die
evtl. in der Lipidschicht enthaltenden Proteine, insbesondere
Enzyme, auftreten. Hierdurch wird erreicht, daß Aktivitäten
von in der Lipidschicht eingelagerten Proteinen erhalten
bleiben.
Dieses Merkmal der Erfindung ist ausgesprochen wichtig für
die verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung. Vor
allem in der Biosensorik sind immobilisierte Membranen, die
ihre nativen Eigenschaften, also beispielsweise enzymatische
Aktivitäten oder auch Kanalaktivitäten, beibehalten, ausge
sprochen wichtig. Mit herkömmlichen Methoden war eine derar
tige Immobilisierung von Membranen bei Erhalt der nativen
Eigenschaften nicht möglich. Durch die Erfindung erschließen
sich daher ganz neue Möglichkeiten in der Biosensorik und
natürlich auch in ganz verschiedenen anderen Bereichen, wie
beispielsweise in der Diagnostik oder in der Forschung
allgemein.
Nach dem bisherigen Wissenstand war es nicht vorstellbar, daß
solche "dynamisch" immobilisierten Membranen eine ausreichen
de Stabilität auf dem jeweiligen Träger aufweisen würden.
Vielmehr war der Fachmann davon ausgegangen, daß für eine
Immobilisierung eine konkrete Fixierung der Membran, insbe
sondere durch die bereits oben erwähnten Linker, notwendig
sei, damit die Membran sich nicht sofort vom Träger wieder
ablöst. Die andere bekannte Möglichkeit für eine ausreichend
stabil immobilisierte Lipidschicht war ein relativ geringer
Abstand der Lipidschicht zum Träger, wie er durch eine oben
erwähnte Immobilisierung mit Hilfe von Dextran oder Polyelek
trolyten erreicht wird. Der Fachmann war folglich davon
ausgegangen, daß eine immobilisierte Membran entweder kova
lent fixiert sein muß - mit dem Nachteil der fehlenden
Diffusivität innerhalb der Membran - oder daß die Membran
sehr nah an den Träger gebracht werden muß, wobei allerdings
der Träger denaturierende Effekte auf die Lipidschicht bzw.
auf die darin enthaltenen Proteine ausübt.
Die von den Erfindern erzielten Resultate mit erfindungsgemäß
modifizierten Membranen stellen daher sehr überraschende
Ergebnisse dar, da es sich zeigte, daß die "dynamisch"
immobilisierten Lipidschichten derart stabil auf ihren
Trägern immobilisiert sind, daß sie für alle denkbaren
Anwendungen geeignet ist. Die erfindungsgemäß immobilisierten
Lipidschichten weisen einen ausreichenden Abstand von dem
Träger auf, so daß keine denaturierenden Effekte des Trägers
auftreten. Darüberhinaus werden Linker vermieden, welche die
Membran an distinkten Stellen fixieren würden. Hierdurch wird
gewährleistet, daß eine erfindungsgemäß immobilisierte
Lipidschicht ihre dynamischen Eigenschaften, insbesondere die
Diffusivität der verschiedenen Lipidschichtkomponenten und
Aktivitäten von möglichen weiteren Schichtkomponenten,
beibehält.
In der nachfolgenden Beschreibung werden einige Fachbegriffe
aus der Biophysik und der Oberflächen- und Polymerchemie
verwendet, die hier kurz erläutert werden. Für eine ausführ
liche Erläuterung sei auf die Fachliteratur verwiesen (A.
Ulman "An Introduction to Ultrathin Organic Films", Academic
Press, Inc., 1991; Albert L. Lehninger "Prinzipien der
Biochemie" Walter de Gruyter 1987; R. W. Armstrong, U. P.
Strauss "Polyelectrolytes" in "Enzyclopedia of Polymer
Science and Technology", Eds. A. Klingsber, R. M. Piccinne,
A. Salvatore, John Wiley and Sons, 1969, Volume 10, 781; M.
Mandel "Polyelectrolytes" in "Enzyclopedia of Polymer Science
and Technology", Eds. N. M. Bikales, J. Conrad, A. Ruks, John
Wiley and Sons, 1988, Volume 11, 739; H. G. M. von de Steg,
M. A. Cohen Stuart, A. de Keizer, B. H. Bijsterbosch, Langmu
ir, 1992, 8, 2538).
Die im nachfolgenden Text beschriebenen "Polyionen" beschrei
ben allgemein Polymere, die ionische und/oder ionisierbare
Funktionalitäten entweder in den Seitenketten und/oder
entlang der Hauptkette tragen. Unter Polyionen sollen nach
folgend die Molekülklassen "Polyelektrolyte", "Polyampholyte"
und "Polyzwitterionen" verstanden werden.
"Polyelektrolyte" sind Polymere, die ionische oder ionisier
bare Gruppen in der Haupt- oder Seitenkette eingebaut haben.
"Polyelektrolyte" im nachfolgend verwendeten Sinn können auch
Copolymere aus ionischen/ionisierbaren und nichtionischen
Monomereinheiten sein. Polyelektrolyte können sowohl in
anionischer wie auch in kationischer Form vorliegen. Beispie
le für anionische Polyelektrolyte sind Poly(styrolsulfonsäu
re), Polyvinyl(sulfonat), Poly(acrylsäure), Dextransulfat,
PAMAM-Dendrimere (Poly(amidoamine), Carboxylterminierte,
halbzahlige Generation) und Carboxycellulose. Komplexere
Formen von anionischen Polyelektrolyten sind beispielsweise
Desoxyribonukleinsäuren (DNA) und Ribonukleinsäuren (RNA).
Beispiele für kationische Polyelektrolyte sind Poly(allyla
minhydrochlorid), Poly(vinylamin), Poly(ethylenimin), Poly(-
diallylammoniumchlorid), PANAN-Dendrimere (Aminoterminierte,
ganzzahlige Generation) und Poly(2-vinylpyridin). Beispiele
für ionische Copolymere sind Poly(acrylsäure-co-acrylamid)
und Poly(diallylammoniumchlorid-co-acrylamid). Aus dieser
kurzen Auflistung ist ersichtlich, daß typische funktionelle
Gruppen anionischer Polyelektrolyte Carboxyl-, Sulfat-,
Sulfonat-, Phosphat- und Phosphonatgruppen sind. Typische
kationische Funktionalitäten sind primäre, sekundäre, tertiä
re und quaternäre Amin-, sowie auch R3S(+)-Gruppen.
Der Gruppe der Polyelektrolyte verwandte Polymere sind
Polyampholyte, die in der Haupt- oder Seitenkette ionisierba
re funktionelle Gruppen tragen, und deren Netto-Ladungszu
stand von dem pH-Wert der Lösung abhängt. Unter Polyampholy
ten im allgemeinen Sinn sollen auch Proteine und Enzyme
verstanden werden.
Eine weitere Gruppe ionischer Polymere sind Polyzwitterionen,
die in der Haupt- oder Seitenkette permanente anionische und
kationische Ladungen tragen.
Die im nachfolgenden Text verwendeten Begriffe "Bilayer",
"Lipidmembran" und "Lipidbilayer" sind synonym und beziehen
sich auf eine Lipiddoppelschicht, die aus einem hydrophoben
inneren Bereich und einem hydrophilen äußeren Bereich be
steht, und die beispielsweise bei der Selbstorganisation von
natürlichen und synthetischen Lipiden oder lipi-dähnlichen
Substanzen in einer wäßrigen Phase spontan entstehen, oder
durch Übertragungstechniken (Langmuir-Blodgett-Technik)
erzeugt werden können.
Der Begriff "Vesikel" bezieht sich auf uni- und multilamella
re Aggregatformen, die Lipide und lipidähnliche Substanzen
bei Quellung in wäßriger Phase spontan, oder unter äußerem
Einfluß, wie beispielsweise durch Behandlung mit Ultraschall
oder durch Hochdruckfiltration (Extrusion), ausbilden.
Der im folgenden Text verwendete Begriff "Substrate" bezieht
sich auf in wäßriger Lösung unlösliche Festkörper aus organi
schem oder anorganischem Material, die als ausreichend feste
Oberflächen (Festkörperoberflächen) nach der Optimierung zur
Unterstützung der Lipidschichten dienen.
Die Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zur Optimierung
der Oberflächeneigenschaften von pulver- oder partikelförmi
gen Substraten beliebiger Geometrie mit dem Ziel, die Eigen
schaften der hierauf zu deponierenden Lipidschichten mög
lichst weit an jene einer natürlichen Membran anzunähern und
gleichzeitig die Immobilisierung integraler Membranproteine
ohne signifikanten Verlust ihrer Aktivität zu ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich in zwei Verfah
rensschritte unterteilen. Dies ist zum einen (a) die Modifi
zierung der Festkörperoberfläche (Substratoberfläche) mit
Molekülen zur Ausbildung einer im wesentlichen hydrophilen
Fläche und (b) das Deponieren der Lipidschichten auf der
modifizierten Festkörperoberfläche. Diese Verfahrensschritte
sind schematisch der Fig. 1 zu entnehmen, wobei der pulver
förmige Charakter des Festkörpers nicht dargestellt ist.
Durch den ersten Verfahrensschritt wird eine geeignete
Modifizierung der Substratoberfläche erreicht, die eine
weitgehende Entkopplung der im zweiten Verfahrensschritt zu
deponierenden Lipidschicht vom Substrat bei gleichzeitiger
hoher morphologischer Integrität und Stabilität gewährlei
stet. Hierbei wird die Verwendung von kovalent an das Substrat
gebundenen Spacerelementen vermieden. Die immobilisier
te Lipidschicht ist also frei, d. h. ohne punktuelle Verbin
dung an das Substrat, auf der modifizierten Oberfläche
immobilisiert.
Durch die Modifizierung der Oberfläche gemäß Verfahrens
schritt (a) kann insbesondere die Ausbildung einer hydrophi
len Oberfläche erreicht werden, die ionische Gruppen trägt,
d. h. vorzugsweise funktionelle Gruppen, die in wässriger
Umgebung dissoziieren.
Darüberhinaus ist die entstehende festkörperunterstützte
Lipidschicht den Eigenschaften ihres natürlichen (festkörper
unabhängigen) Analogons (z. B. dem Lipidvesikel im Fall von
reinen Lipiden oder der Biomembran im Fall von natürlichen
Lipidmischungen mit Proteinen, insbesondere Transmembranprot
einen) sehr ähnlich.
Für die Modifizierung der Festkörperoberfläche (Verfahrens
schritt (a)) sind im wesentlichen zwei Schritte notwendig.
Zunächst (aa) wird die Festkörperoberfläche funktionali
siert, d. h. es werden funktionelle Gruppen, insbesondere
chemisch funktionelle Gruppen, auf der Oberfläche fixiert.
In einem weiteren Schritt (ab) werden auf der funktionali
sierten Oberfläche wechselwirkende Moleküle adsorbiert/chemi
sorbiert. Weiterhin können in einem dritten Schritt (ac)
weitere Moleküle adsorbiert oder chemisorbiert werden. Diese
Moleküle können identisch mit den in Schritt (ab) eingesetz
ten Molekülen sein, oder es kann eine andere Molekülspezies
für diesen weiteren Schritt verwendet werden. Darüberhinaus
kann die Modifizierung auch noch weitere entsprechende
Teilschritte umfassen. Dies kann dann von Nutzen sein, wenn
der Abstand der Lipidschicht zur Festkörperoberfläche beson
ders groß ausgebildet sein soll. Eine Modifizierung in
wenigen Schritten ist jedoch oft auch im Hinblick auf den
präparativen Aufwand besonders vorteilhaft und bevorzugt.
Das Aufbringen der entsprechenden Moleküle kann beispielswei
se durch Deposition aus einer Lösung oder aus der Gasphase
vorgenommen werden.
Die Modifizierung der Oberfläche kann auch in einem Schritt
durchgeführt werden, insbesondere wenn ein geeignetes ober
flächenmodifizierendes Material kommerziell erhältlich ist.
Durch eine entsprechende Modifizierung der Festkörperoberflä
che (Verfahrensschritt (a)) wird die Ausbildung einer hydro
philen Oberfläche auf dem Substrat erreicht. Hierdurch wird
eine spontane Bildung einer Lipidschicht, insbesondere eines
Bilayers, auf der modifizierten Oberfläche (Verfahrens
schritt (b)) ermöglicht. Dies kann bevorzugt durch eine
herkömmliche Vesikelfusion auf der Oberfläche erzielt werden.
Nach beiden Verfahrensschritten (a) und (b) - Modifizierung
der Oberfläche und Deponierung bzw. Immobilisierung der
Lipidschicht - ist das Ergebnis eine stabile festkörperunter
stützte Lipidschicht, vorzugsweise ein Bilayer oder eine
festkörperunterstützte Biomembran mit enzymatischer Aktivität
der in ihr immobilisierten Proteine. Die Topologie der
Lipidschicht bzw. Bilayer- oder Membranoberfläche ist hierbei
weitgehend durch die des Substrates, also der Festkörperober
fläche, vorgegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich vorzugsweise
also dadurch aus, daß anorganische und/oder organische
Festkörperoberflächen chemisch und/oder physikalisch derart
modifiziert werden, daß
- a) die Oberflächeneigenschaften des Trägermaterials (Substrats) in gezielter Weise beeinflußbar und ein stellbar sind;
- b) das Aufbringen einer Lipidschicht auf die modifizier te Festkörperoberfläche ermöglicht wird;
- c) die Lipidschicht durch physikalische und/oder chemi sche Kräfte so an die modifizierte Festkörperoberfläche gebunden wird, daß sie diese vollständig umschließt, ohne daß jedoch die Diffusion der Lipidschichtbestand teile innerhalb der Schicht wesentlich beeinträchtigt ist;
- d) die Eigenschaften der immobilisierten Lipidschicht, insbesondere einer Lipidmembran, möglichst nahe den Eigenschaften der nicht-immobilisierten Lipidschicht bzw. der natürlichen Lipidmembran sind.
Kriterien für den Vergleich der Eigenschaften der durch das
erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen immobilisierten Lipid
schicht mit denen ihrer festkörperfreien Analoga sind bei
spielsweise Messungen der Phasenübergangstemperatur mittels
Differential-Mikrokalorimetrie (DSC), Messung der Fluidität
und Mobilität mittels Festkörper-Kernresonanz (NMR) oder
Bestimmung der Funktionalität bzw. Aktivität immobilisierter
Membranproteine.
Bei dem bevorzugten ersten Teilschritt der Modifizierung der
Festkörperoberfläche gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
(Teilschritt (aa)) werden funktionelle Gruppen auf der
Festkörperoberfläche eingeführt. In einer bevorzugten Ausfüh
rungsform geschieht dies durch eine Aminofunktionalisierung,
Epoxyfunktionalisierung, Halogenalkylfunktionalisierung
und/oder Thiofunktionalisierung. Dies erfolgt dadurch, daß
die Festkörperoberfläche mit entsprechend funktionellen
Molekülen behandelt wird. Vorzugsweise werden hierfür die
Moleküle, die die funktionellen Gruppen enthalten, in einer
Lösung, beispielsweise in einer wässrigen Lösung, gelöst und
das Oberflächenmaterial in diese Lösung gegeben bzw. die
Lösung auf das Oberflächenmaterial aufgebracht. Die Inkuba
tion kann beispielsweise bei Raumtemperatur über einige
Stunden erfolgen. Je nach gewähltem Material können natürlich
auch andere Reaktionsbedingungen gewählt werden. Weiterhin
stellen die aufgezählten Funktionalitäten lediglich Beispiele
dar, die von einem Fachmann um zusätzliche geeignete Möglich
keiten erweitert werden können.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfin
dungsgemäßen Verfahrens werden für die Funktionalisierung
Silane eingesetzt, die eine entsprechende Funktionalität
tragen. Besonders geeignet sind hierfür mono-, di- oder
trifunktionelle Silane. Es kann sich hierbei also folglich um
aminofunktionelle, epoxyfunktionelle, halogenalkylfunktionel
le und/oder thiofunktionelle Silane handeln.
Ein Beispiel für ein besonders geeignetes aminofunktionelles
Silan ist N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilan
(EDA). Geeignete epoxyfunktionelle, halogenalkylfunktionelle
bzw. thiofunktionelle Silane sind [3-(2,3-Epoxypropoxy)-
propyl]trimethoxysilan (EPOXY), [3-Iodopropyl]trimethoxysilan
bzw. [3-Thiopropyl]trimethoxysilan.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden für die
Funktionalisierung Mercaptane und/oder Disulfide eingesetzt.
Die Funktionalisierung mit Mercaptanen ist vor allem für
metallische Festkörperoberflächen zu bevorzugen. Als Disulfi
de sind besonders Alkyldisulfide geeignet. Vorteilhafterweise
tragen die Mercaptane und Disulfide funktionelle Gruppen.
Entsprechend wie bei den oben erwähnten Silanen können
Mercaptane unterschiedlicher Funktionalität verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als
aminofunktionelles Mercaptan Cysteaminhydrochlorid und/oder
Cysteamin eingesetzt. Selbstverständlich können auch andere
Mercaptane, beispielsweise auch epoxyfunktionelle oder
halogenalkylfunktionelle Mercaptane mit Erfolg eingesetzt
werden.
Weiterhin können auch andere funktionelle Moleküle für eine
Funktionalisierung der Festkörperoberfläche verwendet werden.
Ein besonders geeignetes Beispiel hierfür ist Polyethylenimin
(PEI), welches Aminofunktionen auf die Oberfläche bringt.
Als zweiter bevorzugter Teilschritt der Modifizierung der
Festkörperoberfläche (Teilschritt (ab)) werden wechselwirken
de Moleküle auf der funktionalisierten Oberfläche absorbiert.
Diese Absorption an die funktionalisierte Oberfläche erfolgt
insbesondere durch Wechselwirkung mit den funktionellen
Gruppen, die in dem ersten Teilschritt auf die Oberfläche
aufgebracht wurden. Es kann sich hierbei auch um eine soge
nannte Chemisorption handeln, bei welcher kovalente Bindungen
zwischen den wechselwirkenden Molekülen und den auf der
Oberfläche angebrachten funktionellen Gruppen ausgebildet
werden. Es kann sich jedoch auch um andere Wechselwirkungen
zwischen den wechselwirkenden Molekülen und der funktionali
sierten Oberfläche handeln, hierfür kommen beispielsweise
elektrostatische Wechselwirkungen und auch von der Waalsche
Kräfte in Frage.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden als wechselwirkende Moleküle Polymere
eingesetzt. Dies können auch Biopolymere sein. Selbstver
ständlich können auch Monomere verwendet werden. Als Polymere
sind besonders Polyelektrolyte, Polyampholyte und/oder
Polyzwitterionen geeignet. Als Polyelektrolyte kommen vor
zugsweise anionische Polyelektrolyte zum Einsatz. Zu den
Polyampholyten zählen bekanntermaßen auch Proteine, die für
diesen Teilschritt der Modifizierung der Festkörperoberfläche
sehr geeignet sein können.
Einige Beispiele für Polyanionen bzw. anionische Polyelektro
lyte, die besonders geeignet sind, sind Polysulfate, Polysul
fonate, Polycarboxylate, Polyphosphate und deren freie
Säuren, Polystyrolsulfonsäure, Polystyrolsulfonat (PSS),
PAMAM-Dendrimere (Carboxylterminierte, halbzahlige Generati
on), Polyacrylsäure, Polyacrylat, Polymethacrylsäure, Poly
methacrylat, Dextransulfat, Desoxyribonukleinsäure und
Ribonukleinsäure. Beispiele für geeignete Polykationen sind
Polyamine und deren Salze, Polyethylenimin, Polyallylamin,
PAMAM-Dendrimere (Aminoterminierte, ganzzahlige Generation),
Polyvinylamin, Polylysin, Poly(vinylpyridin) und deren Salze
sowie Poly(diallyldimethylammoniumchlorid).
Ein Beispiel für ein geeignetes Protein, welches als wechsel
wirkendes Molekül erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist
Rinderserumalbumin (BSA). Es sind natürlich auch eine Viel
zahl von weiteren Proteinen geeignet, insbesondere auch
Enzyme.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
werden als wechselwirkende (reaktive) Moleküle Substanzen
eingesetzt, die mit der funktionalisierten Oberfläche kova
lente Wechselwirkungen eingehen, wobei also eine sogenannte
Chemisorption stattfindet. Besonders bevorzugt sind hierbei
aminoreaktive Moleküle, die als wechselwirkende Moleküle für
eine aminofunktionalisierte Oberfläche eingesetzt werden.
Besonders geeignete Beispiele hierfür sind die Polymere
Poly(styrol-co-Maleinsäureanhydrid) (PSPMA) und Poly(ethy
len-co-Maleinsäureanhydrid) (PEPMA). Weitere geeignete amino
reaktive Substanzen sind 3,3',4,4'-Benzophenontetracarbonsäu
redianhydrid und 3,3',4,4'-Biphenyltetracarbonsäuredi
anhydrid.
Neben diesen aminoreaktiven Substanzen bzw. Polymeren werden
weitere wechselwirkende bzw. reaktive Moleküle von der
Erfindung mitumfasst, die sich einem Fachmann aus dem bisher
Gesagten ohne weiteres erschließen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungs
gemäßen Verfahrens wird die Oberfläche im ersten Teilschritt
der Modifizierung mit epoxyfunktionellen Gruppen versehen,
und in dem zweiten Teilschritt der Modifizierung mit entspre
chend geeigneten epoxyreaktiven Molekülen behandelt. Beispie
le für epoxyreaktive Polymere sind Polyethylenimin, Poly
allylamin, Polyallylaminhydrochlorid, Polyvinylamin, Poly
(ethylenglykol), Polyvinylalkohol und Dextran. Wie ersicht
lich können Polyamine sowohl in einem einstufigen Prozess als
Funktionalisierungsschicht, als auch in zweistufigen Prozes
sen als wechselwirkende Schicht aufgebracht werden. Dies ist
immer dann von Vorteil, wenn in dem ersten Schritt die
ursprünglichen Eigenschaften des Festkörpers durch eine
kovalente Umsetzung der Oberflächenfunktionalitäten verändert
werden sollen.
Auch für eine epoxyfunktionalisierte Oberfläche ist der
Einsatz von Proteinen, insbesondere von Enzymen, als wechsel
wirkende Moleküle geeignet. Als weitere epoxyreaktive Sub
stanzen kommen Natriumthiosulfat, Ethylendiaminhydrochlorid
oder Taurin in Frage.
Durch den Einsatz von geladenen Molekülen, insbesondere
Polymeren, bei der Modifizierung der Oberfläche können die
Oberflächeneigenschaften dahingehend optimiert werden, daß
die dem Oberflächenmaterial eigenen unerwünschten Ladungsef
fekte minimiert werden. Eine entsprechende Auswahl der
hierfür geeigneten Reagenzien ist je nach dem gewünschten
Versuchsziel zu treffen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfin
dungsgemäßen Verfahrens werden zwischen der Festkörperober
fläche und der aufzubringenden Lipidschicht weitere Moleküle,
die insbesondere eine weitere Funktionalität der Oberfläche
bewirken, eingefügt. So ist es beispielsweise möglich,
Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, Nanopartikel
oder Biomoleküle, wie beispielsweise Proteine, insbesondere
Enzyme, in die modifizierte Oberflächenschicht zu integrie
ren. Dies ermöglicht den Einbau von Sondenmolekülen in das
System festkörperunterstützter Lipidschichten bzw. Lipidmem
branen. Weiterhin ist es so möglich, chemisch oder photoche
misch reaktive Funktionalitäten in die modifizierte Oberflä
che einzubauen, was beispielsweise zur kovalenten Immobili
sierung von transmembranen Proteinen in einer ansonsten
fluiden, d. h. im wesentlichen flüssigen, Lipidmembran genutzt
werden kann. Diese zusätzlich einzubringenden Funktionalitä
ten können beispielsweise kovalent oder auch über andere
Wechselwirkungen mit der Festkörperoberfläche verbunden sein.
Als Festkörperoberflächen, also als Träger für die zu immobi
lisierende Lipidschicht oder Membran, kommen im Prinzip alle
im Stand der Technik bekannten pulverförmigen Trägermateria
lien in Frage. Vorteilhafterweise können diese Trägermateria
lien auch porös sein, um eine noch größere Oberfläche zur
Verfügung zu stellen.
Als Festkörperoberflächen sind insbesondere Silikatoberflä
chen bzw. Silikatpartikel geeignet. Weiterhin können poröse
oder nicht-poröse Aluminate, Borate oder Zeolithe mit Erfolg
eingesetzt werden. Außerdem geeignet sind kolloidale Lösungen
von Edelmetallen, Metallen usw.. In einer besonders bevorzug
ten Ausführungsform werden als Festkörperoberflächen pulver
förmige und vorzugsweise poröse Polymeroberflächen einge
setzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als
Festkörperoberflächen magnetische Träger eingesetzt, bei
spielsweise Polymerkügelchen mit einem Magnetkern. Weiterhin
können mit Vorteil Kern-Schalen-Polymerpartikel als Trägerma
terial verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden solche Materialien als Festkörperoberflä
chenmaterial eingesetzt, die in chromatographischen Säulen
als Packungsmaterial üblicherweise verwendet werden.
Darüberhinaus können als Oberflächenmaterialien Filme aus
pulverförmigen Metallen, Halbleitern, Edelmetallen und/oder
Polymeren eingesetzt werden, die auf insbesonders weitgehend
planaren Trägermaterialien aufgebracht sind oder auf diesen
aufgebracht werden können. Bei diesen Trägermaterialien kann
es sich beispielsweise um Unterlagen aus Papier, Glass,
Kunststoff oder dergleichen handeln, mit denen die Festkörper
in geeigneter Weise verbunden werden, insbesondere durch
verkleben oder verschmelzen.
Die Modifizierung der Festkörperoberfläche gemäß dem erfin
dungsgemäßen Verfahren macht die Oberfläche für die Immobili
sierung von ganz unterschiedlichen Lipidschichten geeignet.
Ganz besonders ist diese modifizierte Festkörperoberfläche
für eine Immobilisierung von Lipiddoppelschichten, und
insbesondere für eine Immobilisierung von Lipidmembranen
geeignet. Lipiddoppelschichten bzw. Lipidmembranen sind auch
von besonderem Interesse für die verschiedenartigen Anwendun
gen der Erfindung in der Forschung, Diagnostik und vor allem
in der Biosensorik, wobei die nativen Eigenschaften solcher
Schichten als Modelle für natürliche Systeme genutzt werden
können.
Erfindungsgemäß setzen sich die Lipidschichten aus Substanzen
aus den Stoffklassen der Lipide, Lipidderivate, lipidähnli
chen und/oder lipidanalogen Stoffe zusammen. Weiterhin können
die Lipidschichten auch Peptide, Proteine, Nukleinsäuren,
ionische oder nichtionische Tenside und/oder Polymere aufwei
sen. Durch diese weiteren Komponenten in den immobilisierten
Lipidschichten können natürliche Systeme abgebildet werden,
indem in den Lipidschichten beispielsweise Kanalproteine oder
Enzyme enthalten sind. Diese zusätzlichen Komponenten können
sich auf der Oberfläche der Lipidschicht oder eingebettet in
der Lipidschicht, also integral, befinden. Weiterhin können
sich die zusätzlichen Komponenten durch die ganze Schicht
bzw. Membran hindurch, also transmembran (schichtdurchspan
nend), erstrecken. Bei diesen Proteinen kann es sich um
Enzyme, Rezeptoren und/oder Liganden handeln, wobei sich die
Rezeptoren und/oder Liganden vorzugsweise auf der dem Träger
abgewandten Oberfläche der Lipidschicht zumindest teilweise
orientieren. Weiterhin kann die Lipidmembran aus Proteolipo
somen aufgebaut sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfin
dungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei den zu immobili
sierenden Lipidschichten zumindest teilweise um Membranfrag
mente aus natürlichen Zellen. Selbstverständlich können auch
entsprechende künstliche Lipidschichten bzw. Membranen in
vitro aus verschiedenen Komponenten zusammengefügt werden, so
daß hierdurch ein entsprechendes Membranmodell zur Verfügung
gestellt wird. In besonders bevorzugter Weise werden jedoch
Membranen von natürlichen Zellen isoliert und auf den erfin
dungsgemäß modifizierten Oberflächen deponiert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist die
immobilisierte Lipidschicht, insbesondere die Lipidmembran,
Proteine auf, die vorzugsweise transmembran und/oder integral
angeordnet sind, wobei diese Proteine wasserlösliche Proteine
peripher binden können bzw. gebunden haben.
Das Deponieren der Lipidschichten auf der modifizierten
Festkörperoberfläche geschieht vorzugsweise durch herkömmli
che Fusion von Lipidvesikeln. Bei diesen Vesikeln kann es
sich um Vesikel definierter Zusammensetzung aus beispielswei
se Phospholipiden handeln. Andererseits ist es natürlich
auch möglich, Membranvesikel aus natürlichem Material zu
isolieren und im Sinne der erfindungsgemäßen Erfindung zu
verwenden. Besonders geeignet hierfür sind beispielsweise
Membranvesikel, die aus dem sarkoplasmatischen Retikulum
gewonnen werden. Die Bereitstellung der Vesikel erfolgt nach
Methoden, die dem Fachmann bekannt sind. Ein großer Vorteil
des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß
derartige Vesikel lediglich mit der erfindungsgemäß modifi
zierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden müssen, wodurch
die Vesikel spontan miteinander verschmelzen und eine Lipid
schicht ausbilden. Von daher handelt es sich bei dem erfin
dungsgemäßen Verfahren um ein ausgesprochen leicht zu handha
bendes System, welches lediglich geringen präparativen
Aufwand erfordert.
Die Erfindung umfasst ferner eine modifizierte Festkörper
oberfläche, wie sie gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
herstellbar ist. Weiterhin umfasst sie eine entsprechend
immobilisierte Lipidschicht auf einer modifizierten Festkör
peroberfläche. Bezüglich der Merkmale der modifizierten
Festkörperoberfläche bzw. der immobilisierten Lipidschicht
wird auf die obige Beschreibung Bezug genommen.
Schließlich umfasst die Erfindung einen Kit zur Herstellung
von immobilisierten Lipidschichten auf Festkörperoberflächen.
Ein solcher Kit umfasst mindestens eine modifizierte Festkör
peroberfläche gemäß der obigen Beschreibung. In einer anderen
Variante umfasst der Kit Reagenzien zur Herstellung einer
entsprechend modifizierten Festkörperoberfläche. Weiterhin
kann es vorgesehen sein, daß der Kit zusätzlich Reagenzien
zur Deponierung von Lipidschichten auf einer modifizierten
Festkörperoberfläche aufweist. Es kann jedoch auch bevorzugt
sein, daß diese Reagenzien von dem jeweiligen Anwender selbst
bereitgestellt werden. Dies gilt vor allem dann, wenn es
darum geht, Membranen aus natürlichen Systemen zu isolieren
und diese erfindungsgemäß zu immobilisieren.
Die beschriebenen Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung
ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Beispielen
in Verbindung mit den Figuren und den Unteransprüchen.
Hierbei können die verschiedenen Merkmale jeweils für sich
oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Figuren ist das folgende dargestellt:
Fig. 1 zeigt schematisch die Vorgehensweise beim erfin
dungsgemäßen Verfahren.
Fig. 2 zeigt DSC-Meßkurven von mit Dielaidoylphosphati
dylcholin (DEPC) beschichteten, porösen Silikatpar
tikeln mit und ohne optimierter Oberfläche im
Vergleich mit natürlichen DEPC-Vesikeln ohne
Trägermaterial.
Fig. 3 zeigt Deuterium (2H)-NMR-Spektren von mit selektiv
kettendeuteriertem Dipalmitoylphosphatidylcholin
(DPPC)-d8 (7,7',8,8'-D2) beschichteten, nichtporö
sen Silikatpartikeln mit und ohne optimierter Ober
fläche im Vergleich mit natürlichen DPPC-d8 (7,7'
, 8, 8')-Vesikeln ohne Trägermaterial.
Fig. 4 zeigt DSC-Messungen von DEPC-beschichteten, porösen
Silikatpartikeln auf komplexen, optimierten Ober
flächen.
Eine Silanlösung, bestehend aus 1,05 ml N-(2-Aminoethyl)-3-
Aminopropyltrimethoxysilan (EDA) und 27 µl konzentrierter
Essigsäure in 100 ml entionisiertem Wasser, wurde frisch
hergestellt. Nach 5 Minuten wurden 5 g eines porösen Silikat
materials (Nucleosil 4000-30 von Macherey-Nagel, Düren) zu
der Silanlösung gegeben und unter Schütteln aufgeschlämmt.
Diese Dispersion wurde drei Stunden langsam rotiert, danach
wird das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entio
nisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Silanisierung wird
mittels Infrarotspektroskopie in diffuser Reflexion (DRIFT)
am getrockneten Silikatmaterial dokumentiert.
Zu einer Polyethylenimin (PEI)-Lösung bestehend aus 250 mg
PEI (50% Lösung in Wasser, Aldrich, Steinheim) in 50 ml
entionisiertem Wasser wurden 5 g eines porösen Silikatmate
rials (Nucleosil 4000-10 von Macherey-Nagel, Düren) gegeben
und drei Stunden langsam rotiert. Danach wurde das Silikat
material sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser
gewaschen. Der Erfolg der Silanisierung wurde mittels Infra
rotspektroskopie in diffuser Reflexion (DRIFT) am getrockne
ten Silikatmaterial dokumentiert.
Eine Silanlösung, bestehend aus 1 ml Mercaptopropyl-trime
thoxysilan (THIO) in 50 ml 2-Propanol, wurde frisch herge
stellt. Nach 5 Minuten wurden 5 g eines porösen Silikatmate
rials (Nucleosil 4000-30 von Macherey-Nagel, Düren) zu der
Silanlösung gegeben und unter Schütteln aufgeschlämmt. Diese
Dispersion wurde drei Stunden langsam rotiert, danach wurde
das Silikatmaterial sedimentiert und der Überstand entfernt.
Das Material wurde zunächst bei 80°C getrocknet und eine
Stunde bei 100°C getempert. Danach wurde dreimal mit 2-Propa
nol gewaschen. Der Erfolg der Silanisierung wurde mittels
DRIFT dokumentiert.
Eine Silanlösung, bestehend aus 2 ml [3-(2,3-Epoxypropoxy)-
propyl]trimethoxysilan (GPS) in 100 ml 2-Propanol wurde
frisch hergestellt. Nach 5 Minuten wurden 10 g eines porösen
Silikatmaterials (Nucleosil 4000-30 von Macherey-Nagel,
Düren) zu der Silanlösung gegeben und unter Schütteln aufge
schlämmt. Diese Dispersion wurde drei Stunden langsam ro
tiert, danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und der
Überstand entfernt. Das Material wurde zunächst bei 80°C
getrocknet und eine Stunde bei 100°C getempert. Danach wurde
dreimal mit 2-Propanol gewaschen. Der Erfolg der Silanisie
rung wird mittels DRIFT dokumentiert.
2 ml einer Suspension von magnetischen Polystyrolpartikeln
(Dynabeads® M-280, Tosylactivated, der Firma Dynal, Oslo,
Norwegen) werden mit 0,1 M NaCl in Wasser gewaschen. Zu der
entstehenden Suspension werden 5 ml einer Polyethylenimin
(PEI)-Lösung bestehend aus 250 mg PEI (50% Lösung in Wasser,
Aldrich, Steinheim) in 50 ml 0,1 M NaCl in entionisiertem
Wasser gegeben und drei Stunden langsam rotiert. Danach
werden die Partikel mit Hilfe eines Magneten abgetrennt und
dreimal mit 0,1 M NaCl in Wasser gewaschen. Der Erfolg der
Umsetzung wird mittels Titration bestimmt.
Zu einer Na-Polystyrolsulfonat (PSS)-Lösung bestehend aus
12,5 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 25 ml entionisiertem
Wasser wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1. amino
funktionalisiertem Silikatmaterial gegeben und drei Stunden
geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert
und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg
der Adsorption wurde mittels DRIFT und der Abnahme der
PSS-Konzentration in der Lösung dokumentiert.
Zu einer Na-Polystyrolsulfonat (PSS)-Lösung, bestehend aus
25 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 25 ml entionisiertem
Wasser, wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.2. amino
funktionalisiertem Silikatmaterials gegeben und drei Stunden
geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert
und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg
der Adsorption wurde mittels DRIFT und der Abnahme der
PSS-Konzentration in der Lösung dokumentiert.
Zu einer Lösung bestehend aus 3 ml 0,1 molarer Na-Polysty
rolsulfonat (Aldrich, Steinheim)-Lösung sowie 5 ml einer 4,8
molaren NaCl-Lösung wurden 4 ml einer Latexdispersion, beste
hend aus aminofunktionalisiertem Polystyrol-latices (K2-080,
Prolabo, France), gegeben und über Nacht geschüttelt. Danach
wurde das modifizierte Polymermaterial durch Zentrifugation
abgetrennt. Zum Waschen wurde das abgesetzte Polymermaterial
in 10 ml entionisiertem Wasser resuspendiert, geschüttelt und
im Anschluß wieder zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde
insgesamt viermal wiederholt und das Polymermaterial ab
schließend in 4 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Der
Erfolg der Adsorption wurde durch Titration der Oberflächen
ladungen dokumentiert.
Zu einer Poly(styrol-co-maleinsäureanhydrid) (PSPMA)-Lösung,
bestehend aus 250 mg PSPMA (Aldrich, Steinheim) in 200 ml
Aceton wurden 5 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1. amino
funktionalisiertem Silikatmaterials gegeben und drei Stunden
geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert
und dreimal mit Aceton gewaschen. Der Erfolg der Chemisorpti
on wurde mittels DRIFT dokumentiert.
Zu einer Poly(styrol-co-maleinsäureanhydrid) (PSPMA)-Lösung,
bestehend aus 250 mg PSPMA (Aldrich, Steinheim) in 200 ml
Aceton wurden 5 g eines entsprechend Beispiel 1.1.2. amino
funktionalisiertem Silikatmaterials gegeben und drei Stunden
geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert
und dreimal mit Aceton gewaschen. Der Erfolg der Chemisorpti
on wurde mittels DRIFT dokumentiert.
1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1. funktionalisierten
EDA-Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus 220 mg
Rinderserumalbumin (BSA, von Sigma-Aldrich, Steinheim) in
50 ml eines 25 mM HEPES-Puffer pH 7,1 (Puffer A), gegeben und
drei Stunden rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedi
mentiert, dreimal mit Puffer A gewaschen und anschließend
getrocknet. Der Erfolg der Beschichtung wurde durch DRIFT und
Messung der Abnahme der BSA-Konzentration in der Lösung
dokumentiert.
Zur Herstellung einer anionischen Oberfläche wurde 1 g eines
entsprechend Beispiel 1.1.4. hergestellten Materials für 16 h
in einer 0,1 molaren Natriumthiosulfatlösung rotiert.
Danach wurde das Material sedimentiert, dreimal mit entioni
siertem Wasser gewaschen und bei 80°C getrocknet. Der Erfolg
der Beschichtung wurde mittels DRIFT dokumentiert.
Zu einer Polyethylenimin (PEI)-Lösung bestehend aus 250 mg
PEI (50% Lösung in Wasser, Aldrich, Steinheim) in 50 mL
entionisiertem Wasser wurde 1 g eines entsprechend Beispiel
1.1.4. hergestellten Materials gegeben und drei Stunden
langsam rotiert. Danach wurde das Material sedimentiert und
dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der
Beschichtung wird mittels DRIFT dokumentiert.
Zur Herstellung einer modifizierten Oberfläche in einem
mehrstufigen Verfahren wurden zu einer Polyallylaminhydro
chlorid (PAH)-Lösung, bestehend aus 12,5 mg PAH (Aldrich,
Steinheim) in 25 ml entionisiertem Wasser, 1 g eines entspre
chend Beispiel 1.2.1. PSS-funktionalisiertem Silikatmaterial
gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Sili
katmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem
Wasser gewaschen. Der Erfolg der Adsorption wurde mittels
DRIFT dokumentiert. 0,5 g des erhaltenen PAH-funktionali
sierten Silikatmaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus
10 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 10 ml entionisiertem Wasser
gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Sili
katmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem
Wasser gewaschen. Der Erfolg der Adsorption wurde mittels
DRIFT dokumentiert.
Zu der entsprechend Beispiel 1.1.5. hergestellten Suspension
werden 5 ml einer Na-Polystyrolsulfonat (PSS)-Lösung beste
hend aus 12,5 mg PSS (Aldrich, Steinheim) in 25 ml 0,1 M NaCl
in entionisiertem Wasser gegeben und drei Stunden geschüt
telt. Danach werden die Partikel abgetrennt und dreimal mit
0,1 M NaCl in entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der
Adsorption wird mittels Titration und der Abnahme der PSS-
Konzentration dokumentiert.
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. funktionalisierten
EDA/PSS-Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus
0,2 g 3,3',4,4'-Benzophenontetracarbonsäuredianhydrid (BPA)
in 25 ml Aceton, gegeben und über Nacht rotiert. Danach wurde
das Trägermaterial sedimentiert, dreimal mit Aceton gewa
schen und getrocknet. Der Erfolg der Behandlung wurde mittels
DRIFT dokumentiert.
1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1 funktionalisierten
EDA-Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus 0,2 g
3,3',4,4'-Benzophenontetracarbonsäuredianhydrid (BPA) in 25 ml
Aceton, gegeben und über Nacht rotiert. Danach wurde das
Trägermaterial sedimentiert, dreimal mit Aceton gewaschen
und getrocknet. Der Erfolg der Behandlung wurde mittels
DRIFT dokumentiert.
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. funktionalisierten
EDA/PSS-Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus
0,1 g 3,3',4,4'-Biphenyltetracarbonsäuredianhydrid in 25 ml
Aceton, gegeben und über Nacht rotiert. Danach wurde das
Trägermaterial sedimentiert, dreimal mit Aceton gewaschen und
getrocknet.
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. funktionalisierten
EDA/PSS-Trägermaterials wurde in eine Lösung, bestehend aus 2 mg
Fluoresceinisothiocyanat (FITC) in 10 ml Ethanol, gegeben
und über Nacht rotiert. Danach wurde das Trägermaterial
sedimentiert, dreimal mit Ethanol gewaschen und getrocknet.
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.4. hergestellten EDA/PS-
PMA-Materials wurde für 16 Stunden in einer Lösung von 50 mg
Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) in Triethylamin/Chlo
roform rotiert. Danach wurde das Material sedimentiert und
dreimal mit Chloroform gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung
wurde mittels DRIFT dokumentiert.
1 g eines entsprechend Beispiel 1.2.1. hergestellten EDA-
/PSS-Materials wurde für 16 Stunden in einer Lösung von 50 mg
Dioctadecyldimethylammoniumbromid (DODAB) in Chloroform
rotiert. Danach wurde das Material sedimentiert und dreimal
mit Chloroform gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde
mittels DRIFT dokumentiert.
80 mg Dielaidoylphosphatidylcholin (DEPC) wurden in 16 ml
Beschichtungspuffer, bestehend aus 20 mM HEPES-Puffer pH 7,1
mit 30 mM NaCl, eine halbe Stunde bei Raumtemperatur gequol
len und anschließend 30 Minuten mit einem Stabbeschaller
(Branson Sonorex) ultrabeschallt. Das Ergebnis war eine klare
Vesikeldispersion mit Vesikeldurchmessern im Bereich 20-80 nm.
Die Bestimmung erfolgte mittels herkömmlicher dynamischer
Laserlichtstreuung ("Particle-Sizing").
Zu 16 ml einer entsprechend Beispiel 2.1 hergestellten
Vesikeldispersion wurde 1 g eines entsprechend Beispiel
1.2.1. optimierten porösen Silikatträgers zugegeben und 30
Minuten langsam rotiert. Danach wurde das Trägermaterial
sedimentiert und dreimal mit Beschichtungspuffer gewaschen.
Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DSC an dem in
Beschichtungspuffer dispergiertem Material (wie beschrieben
bei C. Naumann, T. Brumm, T. M. Bayerl, Biophys. J., 1992,
63, 1314) und DRIFT (nach Trocknung des Materials) dokumen
tiert.
Zu 4 ml einer entsprechend Beispiel 2.1 hergestellten Vesi
keldispersion wurden 1,3 ml eines entsprechend Beispiel
1.2.3. modifizierten Polymerträgers zugegeben und 30 Minuten
langsam rotiert. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert
und dreimal mit Beschichtungspuffer gewaschen. Der Erfolg der
Beschichtung wurde mittels DSC an dem in Beschichtungspuffer
dispergierten Material dokumentiert.
Zu 16 ml einer entsprechend Beispiel 2.1 hergestellten
Vesikeldispersion wurde 1 g eines entsprechend Beispiel
1.3.4. optimierten porösen Silikatträgers gegeben und 30
Minuten langsam rotiert. Danach wurde das Trägermaterial
sedimentiert und dreimal mit Beschichtungspuffer gewaschen.
Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DSC an dem in
Beschichtungspuffer dispergiertem Material und DRIFT (nach
Trocknung des Materials) dokumentiert.
Zu 16 ml einer entsprechend Beispiel 2.1 hergestellten
Vesikeldispersion wurde 1 g eines entsprechend Beispiel
1.4.1. optimierten porösen Silikatträgers gegeben und 30
Minuten langsam rotiert. Danach wurde das Trägermaterial
sedimentiert und dreimal mit Beschichtungspuffer gewaschen.
Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DSC an dem in
Beschichtungspuffer dispergiertem Material und DRIFT (nach
Trocknung des Materials) dokumentiert.
Aus dem Muskelgewebe eines Kaninchens wurden nach einem
Verfahren von W. Hasselbach und M. Makinose (Biochem Z. 1961,
333, 518-528) Membranvesikel des sarkoplasmatischen Retiku
lums hergestellt (SR-Vesikel). Diese Dispersion wurde an
schließend durch Ultraschallbehandlung in kleine, einschali
ge Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu
900 µl dieser Lösung (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden 50 mg
eines entsprechend Beispiel 1.2.1. optimierten porösen
Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inku
biert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4)
und 100 mM NaCl (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach
wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Inkuba
tionsspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde
mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die
Ca2+-ATPase-Aktivität auf dem Trägermaterial nach der Wa
schung im Inkubationspuffer erfolgte durch Bestimmung der
ATP-Hydrolyse-Aktivität in Abhängigkeit der Calciumionenkon
zentration und deren Hemmung durch den spezifischen Inhibitor
"Cyclopiazonic Acid". Dieser Funktionstest belegte eine zum
SR-Vesikel vergleichbare Ca2+-ATPase-Aktivität auf dem
Trägermaterial.
Aus dem Muskelgewebe eines Kaninchens wurden nach einem
Verfahren von W. Hasselbach und M. Makinose (Biochem Z. 1961,
333, 518-528) Membranvesikel des sarkoplasmatischen Retiku
lums hergestellt (SR-Vesikel). Diese Dispersion wurde an
schließend durch Ultraschallbehandlung in kleine, einschali
ge Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu
900 µl dieser Lösung (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden 50 mg
eines entsprechend Beispiel 1.2.8. optimierten porösen
Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inku
biert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4)
und 100 mM NaCl (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach
wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Inkuba
tionsspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde
mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die
Ca2+-ATPase-Aktivität auf dem Trägermaterial nach der Wa
schung im Inkubationspuffer erfolgte durch Bestimmung der
ATP-Hydrolyse-Aktivität in Abhängigkeit der Calciumionenkon
zentration und deren Hemmung durch den spezifischen Inhibitor
"Cyclopiazonic Acid". Dieser Funktionstest belegte eine zum
SR-Vesikel vergleichbare Ca2+-ATPase-Aktivität auf dem
Trägermaterial.
Die in Beispielen 2.2. bis 2.6 beschriebenen Systeme wurden
für die Dauer von 24 Stunden einem strömenden Medium (Be
schichtungspuffer nach Beispiel 2.1 bzw. Inkubationspuffer
nach Beispiel 2.6) in einem Testbad ausgesetzt. In Abständen
von 2 Stunden wurden jeweils gleiche Mengen Trägermaterial
aus dem Testbad entnommen, getrocknet und anschließend
mittels DRIFT auf ihre Beschichtung untersucht. Die in den
Beispielen 2.2 bis 2.5 beschriebenen Systeme wurden zusätz
lich mittels DSC untersucht. Weder mit DRIFT noch mit DSC
wurde eine meßbare Abnahme der Membranbeschichtung mit der
Zeit beobachtet.
Die in den Beispielen 2.2 bis 2.5 beschriebenen Systeme
wurden getrocknet und die auf ihnen befindlichen Lipidmenge
mittels DRIFT dokumentiert. Anschließend wurden die Proben im
Beschichtungspuffer resuspendiert und dreimal gewaschen. Nach
dieser Behandlung wurde die Probe erneut getrocknet und
mittels DRIFT vermessen. In allen Fällen war keine Verände
rung der auf dem Trägermaterial befindlichen Lipidmenge
nachweisbar.
Die in den Beispielen 2.2 bis 2.5 beschriebenen Systeme
wurden bei -80°C im dispergierten Zustand eingefroren und
anschließend wieder auf Raumtemperatur gebracht und getrock
net. Vergleichende DRIFT-Messungen vor und nach dem Einfrie
ren ergaben unveränderte Lipidmengen auf dem Trägermaterial.
Das in Beispiel 2.6 beschriebene System wurde nach der
Präparation über die Dauer von 3 Monaten bei -80°C aufbe
wahrt. Im Abstand von 1 Monat wurden Proben entnommen und
auf ihre Ca2+-ATPase-Aktivität mittels des in 2.6 beschriebe
nen Verfahrens untersucht. Nach 2 Monaten war die Aktivität
auf ca. 70% des ursprünglichen Wertes (unmittelbar nach der
Präparation und Waschung des Trägermaterials gemessen)
abgesunken. Im Überstand der gelagerten Proben konnte keine
Ca2+-ATPase-Aktivität gemessen werden.
Fig. 2 zeigt vergleichende differentialkalorimetrische
(DSC)-Messungen des Phasenübergangs festkörperunterstützter
Bilayer, bestehend aus dem synthetischen Lipid Dielai
doyl-sn-3-glycero-3-phosphocholin (im folgenden DEPC ge
nannt) auf einer nichtoptimierten Festkörperoberfläche
(Herstellung nach Stand der Technik, z. B. C. Naumann, T.
Brumm, T. M. Bayerl, Biophys. J., 1992, 63, 1314), auf einer
durch den obigen Schritt optimierten Oberfläche (wie im
Beispiel beschrieben) im Vergleich zum natürlichen Analogon,
den DEPC-Vesikeln ohne Festkörperunterstützung (Herstellung
nach Stand der Technik durch Quellen des Lipids und anschlie
ßende Extrusion gemäß M. J. Hope, M. B. Bally, G. Web, P. R.
Cullis, Biochim. Biophys. Acta 1985, 812, 55).
Diese Ergebnisse zeigen eine deutliche Verschiebung und
Verbreiterung des Phasenübergangs bei der nichtoptimierten
Oberfläche im Vergleich zu den (festkörperfreien) DEPC-Vesi
keln. Die Phasenübergangstemperatur auf der optimierten
Oberfläche wird nicht beeinflußt. Der Phasenübergang selbst
ist im Vergleich zum natürlichen Analogon nur unwesentlich
verbreitert.
Fig. 4 zeigt DSC-Messungen von DEPC-Lipidmembranen auf
verschiedenen komplexen Oberflächen. Dabei zeigen alle darge
stellten Beispiele nahezu keine Verschiebung der Phasenüber
gangstemperatur und nur eine unwesentliche Verbreiterung des
Phasenüberganges selbst.
Fig. 3 zeigt Deuterium (2H)-NMR-Messungen von kettendeu
teriertem Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC)-d8 (7,7',8,8')
beschichteten nichtporösen Silikatpartikeln mit und ohne
optimierter Oberfläche im Vergleich mit natürlichen DPPC-d8
(7,7',8,8')-Vesikeln. Die Quadrupolaufspaltung des von den
selektiv deuterierten Lipidketten herrührenden Signals ist
ein Maß für die molekulare Ordnung im Bilayer (Seelig, J.
Quarterly Reviews of Biophysics 1977, 10, 353-418). Für den
Fall der nichtmodifizierten Oberfläche resultieren zwei
Aufspaltungen, die bereits früher mit der durch die unmittel
bare Nähe der Festkörperoberfläche verursachten Asymmetrie
der molekularen Ordnung in der inneren und äußeren Monolage
des Bilayers erklärt wurde (M. Hetzer, S. Heinz, S. Grage, T.
M. Bayerl, Langmuir, 1998, 14, 982-984). Die zweifache
Aufspaltung findet sich weder bei dem optimierten System noch
bei dem natürlichen Analogon (Vesikel) und ist deshalb als
Beweis einer Äquivalenz der molekularen Ordnung in beiden
Monolagen des Bilayers anzusehen.
Claims (27)
1. Verfahren zum Immobilisieren von Lipidschichten, insbe
sondere Lipiddoppelschichten, auf Oberflächen pulverför
miger Festkörper, dadurch gekennzeichnet, daß die
Festkörperoberflächen derart modifiziert werden, daß die
darauf deponierten Lipidschichten in ihren Eigenschaf
ten, insbesondere in Bezug auf Diffusivität, denen
nicht-immobilisierter Lipidschichten weitgehend ent
sprechen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die folgenden
Verfahrensschritte:
- a) Modifizieren der Festkörperoberfläche mit Molekülen zur Ausbildung einer im wesentlichen hydrophilen Fläche und
- b) Deponieren der Lipidschichten auf der modifi zierten Festkörperoberfläche.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
das Modifizieren der Festkörperoberfläche die folgenden
Teilschritte umfaßt:
- a) Funktionalisieren der Festkörperoberfläche und/oder
- b) Adsorption oder Chemisorption von wechselwir kenden Molekülen.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Modifizieren der Festkörperober
fläche die folgenden Teilschritte umfaßt:
- a) Funktionalisieren der Festkörperoberfläche und/oder
- b) Adsorption oder Chemisorption von wechselwir kenden Molekülen und
- c) Adsorption oder Chemisorption weiterer wechsel wirkender Moleküle.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Funktionalisieren der Festkör
peroberfläche durch Aufbringen von Aminofunktionen,
Epoxyfunktionen, Halogenalkylfunktionen und/oder Thio
funktionen vorgenommen wird, wobei insbesondere die
Festkörperoberfläche mit aminofunktionellen, epoxyfunk
tionellen, halogenalkylfunktionellen und/oder thio
funktionellen Molekülen behandelt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß für die Funktionalisierung Silane
eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß für die Funktionalisierung Mercap
tane und/oder Disulfide, insbesondere Alkyldisulfide,
eingesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß für die Funktionalisierung N-(2-
Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilan (EDA), Poly
ethylenimin (PEI) und/oder Cysteamin, insbesondere
Cysteaminhydrochlorid eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß als wechselwirkende Moleküle Poly
mere, insbesondere Polyelektrolyte, vorzugsweise anioni
sche Polyelektrolyte, Polyampholyte, vorzugsweise
Proteine, und/oder Polyzwitterionen eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekenn
zeichnet, daß als wechselwirkende Moleküle Polystyrol
sulfonat (PSS), insbesondere Na-Polystyrolsulfonat,
und/oder Poly(styrol-co-Maleinsäureanhydrid) (PSPMA)
eingesetzt werden.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Modifizieren der
Festkörperoberfläche weitere Moleküle, insbesondere
funktionelle Moleküle, in die Oberfläche eingefügt
werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei den funktionellen Molekülen um Farbstoffe,
insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, und/oder um enzyma
tisch, chemisch und/oder photochemisch reaktive Moleküle
handelt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Festkörpern
um im wesentlichen poröse pulverförmigen Festkörper
handelt.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Festkörpern
um pulverförmige Silikate und/oder pulverförmige Poly
mere handelt.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Festkörpern
um pulverförmige magnetische Partikel und/oder Kern-
Schalen-Polymerpartikel handelt.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Festkörper auf einem im
wesentlichen planaren Träger aufgebracht sind oder auf
diesen aufgebracht werden.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Festkörper, insbesondere
bei der Modifikation ihrer Oberfläche, in Form einer
Dispersion, vorzugsweise in Form einer Dispersion in
Wasser und/oder Alkohol, eingesetzt werden.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Festkörper
oberfläche um eine Silikatoberfläche, Halbleiter
oberfläche, insbesondere Siliziumoberfläche, Edelme
talloberfläche, insbesondere Goldoberfläche, und/oder
Polymeroberfläche, insbesondere Polystyrol-Oberfläche
handelt.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten Lipiddop
pelschichten, insbesondere Lipidmembranen sind.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten aus
Lipiden, Lipidderivaten, lipidähnlichen und/oder lipid
analogen Substanzen aufgebaut sind.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten weiterhin
Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, ionische oder nicht
ionische Tenside und/oder Polymere aufweisen.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten ober
flächlich, schichtdurchspannend und/oder darin eingebet
tet Proteine, insbesondere Enzyme, Rezeptoren und/oder
Liganden aufweisen.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidschichten zumindest
teilweise aus Membranfragmenten von natürlichen Zellen
aufgebaut sind.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß das Deponieren der Lipid
schichten auf der modifizierten Festkörperoberfläche
durch Fusion von Lipidvesikeln vorgenommen wird.
25. Modifizierte Festkörperoberfläche herstellbar durch ein
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18.
26. Immobilisierte Lipidschicht auf einer modifizierten
Festkörperoberfläche herstellbar durch ein Verfahren
gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 24.
27. Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipidschichten
auf Festkörperoberflächen, mindestens umfassend eine
modifizierte Festkörperoberfläche gemäß Anspruch 25
und/oder Reagenzien zur Herstellung mindestens einer
modifizierten Festkörperoberfläche gemäß Anspruch 25
sowie vorzugsweise Reagenzien zur Deponierung von
Lipidschichten auf der modifizierten Festkörperober
fläche gemäß mindestens einem der Ansprüche 19 bis 24.
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