DD153240A1 - Verfahren zur herstellung von standardmedien fuer immunoassays - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Standardmedien fuer Immunoassays, die nach dem Prinzip der Saetigungsanalyse arbeiten, wodurch die Aufgabe geloest wird, tierische Seren bezueglich ihrer Eigenschaften hormonfreien bzw. hormonarmen Humanseren anzugleichen. Das Verfahren besteht darin, dass das Tierserum entweder mit Assaypuffer verduennt oder dass es konzentriert wird bzw. dem Tierserum Proteine, insbesondere Albumin, zugesetzt wird, bis identische oder nahezu identische antiserumspezifische Bindungen im Tier- und Humanserummilieu erzielt werden. Die Auswahl des tierischen Serums muss so erfolgen, dass eine Kreuzreaktion zwischen dem in ihm enthaltenen Hormon und dem als Standard verwendeten bzw. zu bestimmendem Hormon vermieden wird, was eine vorherige Austestung notwendig macht. Zur Bestimmung des Hormons TSH eignet sich besonders Herdeserum.

Description

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Verfahren zur Herstellung "von Standardinedien für Immunoassays

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Präparation von Standardmedien für Immunoassays, die nach dem Prinzip der Sättigungsanalyse arbeiten (Radioimmunoassay - RIA, Pluoreszenzimmunoassay - PIA, Enzymimmunoassay - EIA u. a.), wobei durch eine spezielle Zusammensetzung dieser Standardmedien eine genaue Bestimmung biologisch aktiver Substanzen, insbesondere von Hormonen, erreicht werden kann·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bei der Bestimmung biologisch aktiver Stoffe, vorwiegend von Hormonen, nach dem Prinzip der Sättigungsanalyse (Radioimmunoassay, Pluoreszenzimmunoassay, Enzymimmunoassay u. a.) hat es sich gezeigt, daß es im Hinblick auf die Richtigkeit der erzielbaren Ergebnisse notwendig ist, die Standards zur Ermittlung der Bezugskurven in Humanseren anzusetzen. Nur in diesem Palle ist ein weitestgehend gleiches Verhalten von Standards und Proben gewährleistet. Um Pehlbestimmungen zu vermeiden, können dazu nur Seren verwendet werden, in denen sich der Spiegel an dem zu bestimmenden. Hormon praktisch nicht von Null unterscheidet (Mangelseren, Null-Seren). Die Beschaffung derartiger Humanseren mit extrem niedrigem. Hormongehalt ist häufig

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schwierig, weshalb ausweichend oft Pufferlösungen zum Ansetzen der Standards verwendet werden· Die als Standards eingesetzten Hormone reagieren jedoch in Puffer - auch "bei Zusatz von Eiweißstoffen - anders als die Hormone im Probeserum. Dies kann von erheblicher Konsequenz für die klinische Diagnostik und Therapie sein.

Wegen der Schwierigkeiten, sogenannte Null-Seren zum Ansetzen der Standards in ausreichender Menge zu "beschaffen, wurde versucht, Normalseren künstlich an Hormonen zu verarmen oder auf Tierseren auszuweichen· Eine präparative Anreicherung des betreffenden Hormons aus dem Serum stößt dann auf große Schwierigkeiten, wenn diese Substanzen bezüglich ihrer chemischen und physikalischen Parameter denen der Serumproteine nahe kommen· Bei einer Extraktion würde sich der Eiweißgehalt insgesamt so sehr vermindern, daß kein natives Serum mehr vorliegt· Lediglich die ÄffinitätsChromatographie bietet die Möglichkeit einer selektiven Abreicherung; sie ist aber für Routinezwecke zu aufwendig.

Die Verwendung tierischer Seren zum Ansetzen der Standards stieß bisher auf Schwierigkeiten. So berichteten Pekary u· a· über die Verwendung von Kälberserum beim Radioimmunoassay zur Bestimmung des Proteohormons hTSH, womit sie falsch erhöhte Werte erhielten (J. elin. Endocr· Metab· 41 (1975), 676). Von Erhard wurde mitgeteilt, daß Standardkurven in Pferdeserum ebenfalls für TSH zu hohe Werte ergeben (Der liuklearmediziner 1, 2 (1979), 24). Bei Verwendung des nativen Pferdeserums für die Standards ergeben sich für Humanproben zu niedrige TSH-Werte·

Wie schon erwähnt, ist die Beschaffung nativer Humanseren mit dem erforderlichen extrem niedrigen Hormonspiegel schwierig. Im Falle des Proteohormons TSH findet man derartige Seren z. B. nur bei Probanden, die hypophysektomiert wurden, oder bei extremen Hyperthyreosen anderer Genese. Patienten mit entsprechenden Krankheitsbildern sind selten

und zudem oft nicht "bereit, größere Mengen an Blut zu spenden. Pur die Produktion eines Testsystems reichen die auf diese Weise zu gewinnenden Mengen an Serum nicht aus. Um nicht nur auf Patienten zurückgreifen zu müssen, wurde versucht, Probanden zu gewinnen,- die ihre Hypophyse durch Applikation τοη Schilddrüsenhormonen (T3 und/oder T4) supprimieren lassen und dann Blut spenden. Abgesehen davon, daß absolute Hormonfreiheit oder sehr niedrige TSH-Spiegel auch "bei dieser Vorbereitung nur selten erreicht werden, vielmehr häufig eine Restfunktion der Hypophyse mit entsprechendem TSH-Blutspiegel aufrechterhalten bleibt, ist der Aufwand sehr erheblich. Auch ist dieses Vorgehen nicht ohne Gefahren für den Probanden, weshalb,die Serumgewinnung an bestimmte Voraussetzungen gebunden ist.

Aus dem oben Gesagten geht hervor, daß das Milieu, in dem die Standards angesetzt werden, von großer Bedeutung für die Erzielung richtiger Jjaalysenwerte ist. Sowohl Pufferlösungen mit Proteinzusata als auch native Tierseren sind ungeeignete lösungsmittel zur Standardherstellung, da zu hohe bzw. zu niedrige Hormonwerte bestimmt werden, was erhebliche diagnostische und. therapeutische Konsequenzen zur Folge haben kann.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die Gewinnung von Seren, die sich als Standardmedien in Immunoassays eignen»

Darlegung des Wesens der "Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Präparation tierischer Seren, die bezüglich ihrer Eigenschaften als Standardmedien in Immunoassays praktisch hormonfreien bzw. hormonarmen Humanseren gleichen, anzugeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung tierischer

Seren als Stasdardmedien in Immunoassays "besteht darin, daß das Tierseruia entweder mit Assaypuffer verdünnt oder konzentriert wird, Ms identische oder nahezu identische antiserumspezifische Bindungen im Tier- und Humanserümmilieu erzielt werden· Die Auswahl des tierischen Serums muß so erfolgen, daß eine Kreuzreaktion zwischen dem in ihm enthaltenen Hormon und "dem als Standard verwendeten "bzw. zu bestimmenden Hormon vermieden wird (sogenannte Spezieskreuzreaktivität), was eine vorherige Austestung notwendig machte

Liegt die Staadardkurve im Tierserum links von der in hormonfreiem Humanserum, muß das Tierserum entsprechend verdünnt werden. Im anderen Falle, die Kurve ist nach rechts verschoben^ ist das Tierserum zu konzentrieren oder durch Zusatz von Proteinen anzupassen© Außer der Erzielung identischer antissrumspezifischer Bindungen im Tier- und Humanserummilien muß auch die sogenannte unspezifische Bindung in die Untersuchungen eingezogen werden; sie muß ebenfalls praktisch gleich sein.

Bei der Aufarbeitung des Assays wird die sogenannte B/i¹-Trennung, d. ii. die Trennung von antikörpergebundener und freier Aktivität, bevorzugt nach dem Doppelantikörperprinzip durchgeführt. Hierbei ist erfindungsgemäß so zu verfahren, daß keine Störung der Präzipitationsreaktion durch Bestandteile des Tierserums eintritt«

Die subtile Austestung der Doppelantikörperreaktion muß sowohl im Husian— als auch im modifizierten Tierserummilieu erfolgen.; zumeist bestehen kinetische Unterschiede. Es ist vorteilhaft, solche Arbeitsbedingungen auszuwählen, bei denen in beiden Milieus die Reaktionen dem Gleichgewichtszustand nahe kommen. Die unspezifischen Bindungen sind bei der Doppelantikörpermethode sehr niedrig und zwischen Seren verschiedener Provinienz kaum differenziert.

Für·den Radioimmunoassay zur Bestimmung des Hormons TSH

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eignet sich besonders Pferdeserum. In diesem Falle sollte vorzugsweise zweiter Antikörper von Ziegen eingesetzt werden. Eine Störung tritt dann auf, wenn als zweiter Antikörper Antikaninchen-Gamma-Globulin vom Esel (Maultier, Maulesel) verwendet wird, da eine partielle Antlgenverwandtschaft zwischen Pferd und Esel "besteht. Eine Kreuzreaktion zwischen dem Pferde-TSH und dem Human-TSH tritt nicht auf.

Ausführungsbeispiel

Figur 1 zeigt die Einstellung der Pferdeserumkonzentration, Figur 2 Standardkurveη in verschiedenen Seren·

Pur den Radioimmunoassay zur Bestimmung des Hormons TSH wurde Pferdeserum als Standardmedium gewählt. Durch Verdünnen von nativem gepooltem Pferdeserum mit Assaypuffer ?/erden die Lösungsmedien für die Standards präpariert. Der Puffer hat folgende Zusammensetzung:

7,58 g Fa₂HPO₄ + 2 H₂O

0,93 g KH₂PO₄

3,72 g Chelaplex III

1,0 g HaF₃

5,0 g Humanserum-AlTdumin·

Diese Substanzen werden auf einen Liter aufgefüllt, und der pH-Wert wird auf 7,4 eingestellt.

Pur die Ermittlung der optimalen Verdünnung wird eine Verdünnungsreihe Tierserum/Assaypuffer hergestellt. Mit Hilfe dieser Verdünnungsreihe wird zunächst der Nullpunkt des Systems eingestellt, wozu ein Vergleich mit einer Palette THS-armer Humanseren dient. Die Bindungsraten im Radioimmunoassay liegen für die untersuchten TSH-armeη Humanseren zwischen 24 000 und 25·300 Impulsen/5 min. Mit 50*$Sigem Pferdeserum wird eine Bindungsrate von 25 400 Impulsen/5 rein erhalten. Diese Konzentration ist als optimal anzusehen.

Wenn für den Assay 0,2 ml Probandenserum eingesetzt werden, sind die Standards in 0,2 ml 50$igem Pferdeserum befindlich.

Die auf den Nullpunkt abgestimmte Pferdeserumkonzentration muß darüber hinaus auch für den gesamten Standardkurvenbereich als brauchbar gesichert bzw. geringfügig korrigiert werden. Aus diesem Grunde wurden Standardkurven in Puffer mit 0,5 fo HSA (i), in bestem humanem Uullserum (II), in un~ behandeltem Pferdeserum (III) und in eingestelltem Pferdeserum (IV) aufgenommen.

Der Verlauf dieser Kurven zeigt eindeutig, daß im vorliegenden falle 50#iges Pferdeserum als Standardmedium eingesetzt werden kann und dieselben Ergebnisse bringt wie bestes humanes Nullserum.

Claims (5)

Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Präparation von Standarcimedien für Immunoassays, dadurch gekennzeichnet, daß Tierserum entweder mit Puffer verdünnt oder konzentriert wird, "bis identische antiserumspezifische Bindungen im Tier- und Humanserummilieu erzielt werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einstellung des Tierserums durch Zusatz von Proteinen, insbesondere von Albumin, vorgenommen wird· .

3· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß solches tierisches Serum ausgewählt wird,,das keine Kreuzreaktion zwischen dem in ihm enthaltenen Hormon und dem als Standard verwendeten "bzw, zu bestimmenden Humanhormon auftritt.

4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß "beim TSH-Immunoassay Pferdeserum eingesetzt wird·

5. Verfahren nach Punkt Λ und 4, dadurch gekennzeichnet, daß als zweiter Antikörper Antikörper von Ziegen verwendet wird.

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