DE2621218A1

DE2621218A1 - Analysenverfahren fuer schilddruesenhormone

Info

Publication number: DE2621218A1
Application number: DE19752621218
Authority: DE
Inventors: Vito J Mangiardi; Howard Willner
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1975-05-16
Filing date: 1975-05-13
Publication date: 1976-12-02
Also published as: BR7603052A; CA1042328A; FR2311305A1; US4086059A; GB1541725A; JPS51141693A

Description

PATENTANWÄLTE DIPL.-INS. R. SPLANEMANN dipl-chem. dr. B. REITZNER - dipl-ins. J. RICHTER

MÜNCHEN HAMBURS

Bio-Kad Laboratories, Inc. eooo munchen ζ -jx

Tat 13

32nd and Gr if fin Avenue Telefon (089)226207/22620?

Telegramme: Inventius München

Sichmond, California
(T. St. A.)

Ihr Zeichen:

Patentanmeldung

Analysenverfahren für Schilddrüsenhormone

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Schilddrüsenfunktion durch Analyse einer Blutserumprobe. Nach einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung einer Blutserumprobe hinsichtlich der ScMlddrüsenfunktion, durch Anwendung der fcompetitiven Bindung, wobei das Schilddrüsenhormon im Serum und ein radioaktives Schilddrüsenhormon als Iracer um die verfügbaren Bindungsstellen eines exogenen Eroteins, das Schilddrüsenhormon kompetitiv bindet, in Wettbewerb treten.

Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß Schilddrusenhormone unter dem Einfluß von Säure in biologischen Systemen von ihren Binde substanzen abdissoziieren· Es wird z.B. verwiesen auf Bismuth, J., Casray, M. und Lissitzky, Glin. Chim. Acta 35 (1971) 285-298 und OJabochnik, Milton_s J. Biol.

Konten: Deutsche Bank AG, Mönchen, Konta-Nr. 20/14009 · Postscheck: Manchen 60060-807

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Ghem., Bd. 239; 4 (1964) 1242-124-9. Es wurde weiterhin erkannt, daß diese Bindungserscheinung vom pH-Wert abhängt, wie es in der USAr-PS $ 776 698 angegeben ist. Ih dieser Patentschrift ist ein Verfahren zur Bestimmung von Schilddrüsenhormon aus einer Serumprobe beschrieben, bei welchem das gleiche Prinzip wie bei der vorliegenden Erfindung, nämlich das Prinzip der kompetitiven Bindung, angewendet wird. Hach dieser Patentschrift ist wie bei anderen früheren kompetitiven Bindungsverfahren zur Analyse von Schilddrüsenhoreonen als erste Stufe die Isolierung von Schilddrüsenhormonen von ihren Serum-Begleitstoffen erforderlich. Diese Isolierung wurde auf unterschiedliche Weise, z.B. durch lösungsmittelextraktion, Ballung durch Hitze oder chemische Substanzen und (im 3?alle der genannten Patentschrift) durch Adsorption der Schilddrüsenhormone auf einem teilchenförmigen Substrat und anschließender Eluierung nach Abtrennung des teilchenförmigen Substrats von den Serum-Begleitstoffen durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß eine Isolierung der Sehilddrüsenhormone von ihren Serumbindeproteinen nicht erforderlich ist. Die Erfindung betrifft somit ein Yerfahren, bei welchem ein Serum mit Säure soweit vorbehandelt wird, daß die Bindung von Schilddrüsenhormon durch das Serumprotein, welches Schilddrüsenhormon bindet, inaktiviert wird. Es wurde gefunden, daß die Inaktivierung in Gegenwart eines Puffers bei einem pH-Wert von 8,6 anhält, d.h. bei einem pH-Wert,der gewöhnlich als optimal für die thyroidbindende Proteinfunktionalität angesehen wird. Die Losung wird dann ohne vorherige Abtrennung des inaktivierten Serum-Schilddrüsenhormon- indenden "Proteins direkt mit einem gepufferten Gemisch aus radioaktivem fracer und biologischen Binder in solchen Anteilen kombiniert _s daß sich in an sich bekannter Weise ein kompetitives Proteinbindungs-Gleichgewicht einstellt. Es wird auf diese Weise

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eine wesentliche Vereinfachung gegenüber den bekannten Verfahren erzielt. Diese Vereinfachung beruht einmal darauf, daß die bei den bekannten Isolierungsstufen verwendeten Substanzen und Reagenzien entfallen können, und, was noch wichtiger ist, zum anderen darauf, daß der bei den bekannten Isolierungsverfahren erforderliche Arbeitsaufwand wegfällt.

Wach der kompetitiven Itoteinbindung kann die lösung in der gewünschten Weise und in Anlehnung an bekannte Analysenverfahren weiterverarbeitet werden. Beispielsweise können die gebundenen Hormone von den ungebundenen Hormonen nach einem der bekannten Verfahren getrennt werden. Es kann die Radioaktivität der gebundenen oder der ungebundenen Hormone ausgezählt werden, woraus Daten über den Zustand bzw. die !Punktion der Schilddrüse gewonnen werden können. Die Erfindung kann, also allgemein für die Bestimmung von Schilddrüsenhormon nach einem kompetitiven Bindungsverfahren angewendet werden. So kann das exogene, kompetitiv bindende Protein das trhyroidhormon-bindende Globulin nach der USA-PS 3 776 698 sein, wobei die Trennung des gebundenen vom ungebundenen Hormon nach dem dort beschriebenen Verfahren durchgeführt wird. Das Verfahren ist gleichermaßen anwendbar auf einen Radioimmunoassay, wie er beispielsweise in der USA-Patentanmeldung 557 722 vom 12. März 1975 (3M· Radioimmunoassay) oder in der USA-Patentanmeldung 530 920 vom 9· Dez. 1974- CE-3 Radioimmunoassay) beschrieben ist, wobei das verwendete kompetitiv bindende Protein ein geeigneter Antikörper ist, der für das zu untersuchende Schilddrüsenhormon selektiv ist.

Im allgemeinen kann eine Serumprobe-Testlösung in der üblichen Menge und Verdünnung verwendet werden. Es haben sich Serumproben sowohl von 50 als auch von 100yul als brauchbar erwiesen. Ei Tie solche Probe wird zunächst mit

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Satire versetzt, um die Bindung des Schilddrüsenhormons durch Serumproteine zu inaktivieren. Im allgemeinen ist die kritische Säuremenge erreicht, wenn der pH-Vert der Probenlösung etwa 3 oder weniger beträgt, d.h. die Lösung stärker sauer ist.

Sobald eine ausreichende Menge Säure zugesetzt ist, hat die Zugabe weiterer Säure keine wesentliche Wirkung mehr. Die einzige Beschränkung besteht darin, daß die zugesetzte Säuremenge nicht so groß sein soll, daß Serumkomponenten ausgefällt werden, oder daß die Säurekonzentration bis auf einen solchen Wert erhöht wird, bei dem die Pufferkapazität des anschließend verwendeten kompetitiven Bindungsgemisches nicht mehr ausreicht. Wie noch gezeigt wird, können geeignete pH-Bedingungen mit verschiedenen anorganischen und organischen Säuren erreicht werden. Bevorzugte Säuren sind starke Mineralsäuren, wobei Chlorwasserstoff säure aus praktischen Gründen ausgewählt wird. Andere brauchbare Säuren sind Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Perchlorsäure, Ameisensäure und Trichloressigsäure.

Die Inaktivierung der Bindung des Schilddrüsenhormons in der Serum-Sestlösung ist in einigen Minuten (gewöhnlich nicht mehr als etwa 5 Minuten) bei Baumtemperatur beendet. An diesem Punkt kann die Testlösung mit exogenem thyroidhormonbindendem Protein, mit einem radioaktiven Isotop markierten Schilddrüsenhormon in einer Spurenmenge und einem Puffer vermischt werden, um die kompetitive Bindung zu ermöglichen. Im allgemeinen soll der pH-Wert im kompetitiven Bindungsgemisch in einem an sich bekannten Bereich liegen, wobei der bevorzugte pH-Wert in der Lösung nach Vereinigung aller Komponenten (einschließlich der angesäuerten Serum-Testlösung) bei etwa 8,6 liegt. Die gewünschte Pufferung kann mit verschiedenen Puffersubstanzen, z.B. Phosphaten usw., erreicht werden. Besonders gute Ergebnisse wurden mit

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3?ris erhalten. Vorzugsweise ist das Paffersystem ein Barbitalpuffer. Im allgemeinen erhält man den gewünschten pH-Wert in der kompetitiven Bindungslösung, wenn die Puff er substanz in einer 0,05 - 0,1-molaren Konzentration vorliegt.

Die Auswahl des exogenen kompetitiv bindenden Proteins hängt von dem jeweils durchgeführten liest ab. Ih vielen Pällen ist das kompetitiv bindende Protein das vorstehend genannte thyroidbindende Globulin (TBG). Wenn ein Radioimmunoassay durchgeführt wird, so ist das kompetitiv bindende Protein ein geeigneter Antikörper. Die Verdünnung der kompetitiv bindenden Proteinlösung und die Menge des darin enthaltenen kompetitiv bindenden Proteins werden so eingestellt, daß die gewünschte Dosisreaktion (dose response) erhalten wird, wobei gewöhnlich eine lineare Kurve aus den Analysenwerten von Thyroidserumstandards erhalten wird. Im allgemeinen soll die Menge des zugesetzten kompetitiv bindenden Proteins ausreichen, um mit Ihyroidhormon-Serumkonzentrationen von 2-16 meg je 100 ml eine Reaktion zu erzeugen. Torzugsweise wird eine ausreichende Menge an kompetitiv bindendem Protein verwendet, um für die Standardkurve eine Steigung von 0,16 oder mehr entsprechend der nachstehenden Formel zu erhalten:

cpm für 6,15 meg Ϊ-4 - cpm für 12,3 mcg T-A-

cpm für 6,15 mcg T-4 (cpm a Impulse pro Minute)

Die Leistungsfähigkeit des vorliegenden Verfahrens wird anhand einer Korrelationsuntersuchung gegenüber dem unter der Bezeichnung "TESRA-COUHO?" bekannten Verfahren der Anmelderin nachgewiesen. Dieses Verfahren ist im einzelnen in der DiD-OS 2 410 755 beschrieben. Die Ergebnisse der

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Korrelationsuntersucirung mit insgesamt 54 Eroben ergaben eine Korrelation von 0,92. Diese Korrelation enthielt weiterhin einen Vergleich der G-esamtprot einwerte bei den gleichen Proben, wobei praktisch keine Korrelation gefunden wurde.

Es wurde folgende Arbeitsweise angewendet: Reagenzien

0,025 H

Normales Kontrollserum Hr. 2080 Hyper-Kontrollserum Br. 2351^w ^ Verschiedene Standardseren mit den nachstehend angegebenen Konzentrationen Reagens Σ

a. kompetitiv bindendes Protein (!EBG)

b. Spurenmenge J-* (100.000 cpm)

c. 0,075 M Hatriumbarbital, pH « 8,6

Arbeitsweise

0,025 H ^f

Probe HOL· Reagens Σ <Ü

Standard,, 0,1 ml 0,5 ml g 3,5 m^ g.-g ^ Standard' « « g η .gijf-g^

Standard, " " S ."§ " % S α>!

Standard, » ■ "835 ■ ItSS¹SS

Standard^ ■ ⁿ §$ £ ⁿ g5^H ^₄₃

Kontrolle^ « » Jg

Kontrolle^

(1) Hr. 2080 ist ein normales Kontrollserum mit einem angegebenen T-4- meg #-Wert von 4·,5 ± 0,4

(2) Hr. 2351 ist ein Hyper-Kontrollserum mit einem angegebenen OM- meg #-Vert von 9,0 ±1*0

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Die vorstehende Arbeitsweise wurde zur Gewinnung der nachstehenden Werte angewendet, um die Erfindung zu erläutern. Die nach dem Verfahren der DlJ-OS 2 410 755 angegebenen Werte sind daneben angegeben. Alle Impulse pro Minute (cpm) beziehen sich auf das Eluat der Ionenaustauschersäulen.

	Erfindung	1	Mcg% W- Jod	cpm	Verfahren nach DOi-OS 2 410 755	cpm	Hcg% T-4 Jod
		2	10,4	29851 30117		47104 48390	10,4
Std	5	8,1	33834 35263	Std 1	53259 53291	8,1
Std	4	6,5	35419 35060	Std 2	59075 59208	6,5
Std	5	5,5	39890 59771	Std 3	73119 74558	5,5
Std	1,65	41280 41354	Std 4	81001 80426	1,65
Std		Std 5

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Verfahren nach DT-OS 2 410 755

Patienten- serumprobe	cpm	Patienten- serumprobe	cpm	Patienten- serumprobe	cpm	77380
1	58254	19	64150	37	64383	69783
2 3	55773 62723	20 21	67607 55095	38 Versuch nicht beendet 39 69263	52040
4	70962	22	52166	40	71572
5	60735	23	69244	41	68392
6	59881	24	67299	42	70074
7	63443	25	74215	43	55384
8	67541	26	66510	44	55796
9	68130	27	66840	45	73361
10	74104	28	71587	46	69560
11	70660	29	65093	47	81855
12	60979	30	58188	48	64880
13	68074	31	71342	49	73251
14	66390	32	71606	50	56327
	70192	33	73037	51	70435
16	68502	34	64735	52	cpm
17	68O9I	35	72133	53	52251
18	72547	36	71481	54	52214
	cpm		cpm
Er. 2080 Eontrolle	70996	Mischung der Eontrollen	58724	Nr. 2351 Eontrolle
Hr. 2080 Eontrolle	69287	Mischung der Eontrollen	58984	Er. 2351 Eontrolle

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-	c-pm	- 9 - Erfindung	cpm	Patienten- serumxirobe	cpm
Patienten- serumprobe	35780	Patienten- serumprobe	36588	37	36741
1	334-17	19	38390	38	35013
2	37030	20	32463	39	38544
3	39373	21	3324-7	40	39090
4	35624	22	39038	41	37937
5	37588	23	37986	42	33387
6	36964-	24	39279	43	38553
7	38109	25	37710	44	37974
8	39190	26	3724-3	45	37295
9	3964-2	27	38620	46	33945
10	384-38	28	37848	47	34468
11	36939	29	35473	48	38786
12	38403	30	39719	49	39511
13	38654-	31	38120	50	40956
14	37518	32	39216	51	37924
15	37922	33	37257	52	39456
16	38973	34	39476	53	33307
17	39022	35	39135	54	38310
18	cpm	3?	cpm		cpm
	38734-		35800	Hr. 2351 Eontrolle	33067
Nr. 2080 Eontrolle	38804-	Mischung der Eontrollen	36224 .	Hr, 2351 Kontrolle	32535
Hp. 2080 Eontrolle	Mischung der Eontrollen

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- ίο -

Es wurde eine Bestimmung des Gesamtproteingehalts der obigen 54 !toben und Eontrollen nach der Biuret-Beaktion von Henry, Sobel und Berkman, Bei. 2665, Seite 182, Clinical Chem. Itinciples and Techniques, Richard J. Henry durchgeführt· Die T-4—Werte aus der vorausgegangenen Arbeit sind ebenfalls angegeben. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Erfindung DT-OS 2 410 755 Gesamtprotein mcg% T-4- mcg% Τ-4-Jod g Erotein/100 ml Erobe Jod Serum

1	6,3	6,8	6,4
2	8,0	7,5	8,0
3	5,4	5,7	6,9
4	3,7	3,9	7,6
5	6,4	6,2	7,5
6	5,0	6,4	6,8
7	5,4-		7,1
8	4-,6	4,6	6,8
9	3,8	4,5	6,9
10	3,5	3,2	6,5
11	4-,4-	3,9	7,0
12		6,1	7,0
13	4,4-	4,5	6,5
14	4,2	4,9	7,1
15	5,1	4,0	6,0
16	4,8	4,4	7,3
17	4,0	4,5	8,6
18	4,0	3,5	7,1
19		5,4	7,5
20	4,4	4,6	7,1
21	8,7	7,6	6,4
22	8,1	8,6	6,5
23	4,0	4,3	7,0
24	4,7	4,7	6,8
25	3,8	3,2	7,0

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!Probe	Erfindung mcg% W- Jod	4,2	DiD-OS 2 410 755 mcg% Τ-4-Jod	4,2	Ge samtprotein g Erotein/100 ml Serum
26	4,9	8,7	4,8	8,6	7,5
27	5,3	6,0	4,8	6,3	6,3
28	4,3	3,7	7,5
29	4,8	5,1	6,9
30	6,5	6,8	7,0
31	3,5	3,8	8,4
32	4,6	3,7	6,8
33	3,8	3,4	7,9
	5,2	5,2	6,5
35	3,6	3,6	6,8
36	3,9	3,7	7,2
37	5,6	5,3	6,7
38	6,8		beendet
39	4,3		7,0
40	4,0		6,7
41	4,8		7,8
42	8,0		7,8
43	4,3		6,9
44	4,7		6,2
45	5,2		6,8
46	7,7		6,9
47	7,2		7,2
48	4,2		7,2
49	3,6		5,8
50	2,6	Versuch nicht	7,2
51	4,8	4,3	6,6
52	3,7	2,5	6,7
53	8,1	4,2	7,4
54 '	4,5	8,7	7,3
Hc. 2080 Kontrolle	4,2	3,8
Hc. 2351 Kontrolle	8,7	4,4
Gemisch, der 6,3 Kontrollen	4,1
	7,5
	7,4
	3,3
	4,2
	1,4
	5,2
	4,3
	7,3
	4,0
	3,9
	8,6
	6,4

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Es wurden auch ausgezeichnete Ergebnisse mit den Immunoassay-Verfahren nach den vorstehend genannten TJSA-Patentanmeldungen 530 920 (T-3) und 557 722 (T-4) erhalten. Bei diesen Versuchen diente die Inaktivierung mit Säure gemäß der Erfindung als Ersatz für das Bentonit-Adsorbens nach der USA-Anmeldung 557 722 bzw· für das Verdrängungsmittel nach der USA-Patentanmeldung 530 920.

- Patentansprüche -

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Claims

- 13 Patentansprüche

1. Kompetitives Bindungsverfahren zur Bestimmung von Serum-Schilddrüsenhormon, wobei eine Serum-Testlösung verarbeitet wird, um das Schilddrüsenhormon vor der Stufe der kompetitiven Bindung von dem das skihilddrüsenhormön-bindenden Protein abzutrennen, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Serum-Testlösung mit Säure in Abwesenheit eines Puffers auf etwa 3 oder weniger einstellt und die Lösung dann direkt mit einer Lösung vermischt, die exogenes, ashilddrüsenhormon-bindendes Protein, mit einem radioaktiven Isotop markiertes Schilddrüsenhormon und eine Puffersubstanz enthält, um die Stufe der kompetitiven Bindung bei einem pH-Wert von etwa 8,6 durchzuführen·

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß man den pH-Wert der Serum-Testlösung durch Zugabe einer starken Mineralsäure einstellt·

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als starke Mineralsäure Chlorwasserstoffsäure verwendet,

4-. Klinisch-diagnostischer Test auf Τ-4-Schilddrüsenhormon, dadurch gekennzeichnet, daß man zu einer Testlösung, die eine Serumprobe enthält, in welcher das !-^Schilddrüsenhormon an die Serumproteine gebunden ist, eine ausreichende Menge einer ungepufferten Säure zusetzt, um die Bindung des T-4—Schilddrüsenhormons durch endogenes serumschilddrüsenhormönbindendes Protein zu inaktivieren, daß man die Komponenten der angesäuerten Lösung, einschließlich ungebundenes T-4-Schilddrüsenhormon und inaktiviertes endogenes schilddrüsenhormonbindendes Protein, mit einer gepufferten Lösung, die exogenes schilddrüsenhormonbindendes Protein und mit einem radioaktiven Isotop markiertes Schilddrüsenhormon als Tracer

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kombiniert» um eine !competitive Bindung des "ungebundenen T-4—Schilddrüsenhormons und des radioaktiven T-4—Tracers mit dem exogenen schilddrüsenhormonbindenden Proteins bei einem pH-Wert von etwa 8,6 zu erzielen, daß man die kompetitiv bindende Lösung in eine fraktion, die das T-4-Schilddrüsenhormon gebunfeo. an das exogene Schilddrüsenhormonbindende Protein und in eine iraktion, die das T-4—Schilddriisenhormon nicht an das exogene schilddrüsenhormonbindende Irotein gebunden enthält, trennt, und daß man die Intensität der Kadioaktivität mindestens einer dieser beiden Iraktionen bestimmt.

5- Test nach -Ansprach 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure zur Inaktivierung der Bindung des T-4—Schilddrüsexihormons durch das endogene schilddriisenhormonbindende Protein Chlorwasserstoff säure in einer solchen Menge zusetzt, daß in der Testlosung ein pH-¥ert von etwa 1 bis 3 erreicht wird.

6. lest nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pufferlösung eine Barbitalpufferlösung mit einer ausreichenden Menge an Ptifferionen verwendet, um nach der Kombination der angesäuerten Testlösung und der Pufferlösung einen pH-¥ert von etwa 8,6 in der Lösung zu erzeugen.

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