DD153240B1 - Verfahren zur herstellung von standardmedien fuer immunoassays - Google Patents

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Standardmedien für Immunoassays zur Bestimmung des HormonsTSH, die nach dem Prinzip der Sättigungsanalyse arbeiten (Radioimmunoassay, Fluoreszenzimmunoassay, Enzymimmunoassay und andere), wobei durch eine spezielle Zusammensetzung dieser Standardmedien eine genaue Bestimmung des Hormons erreicht werden kann.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bei der Bestimmung biologisch aktiver Stoffe, vorwiegend von Hormonen, nach dem Prinzip der Sättigungsanalyse (Radioimmunoassay, Fluoreszenzimmunoassay, Enzymimmunoassay und andere) hat es sich gezeigt, daß es im Hinblick auf die Richtigkeit der erzielbaren Ergebnisse notwendig ist, die Standards zur Ermittlung der Bezugskurven in Humanseren anzusetzen. Nur in diesem Falle ist ein weitestgehend gleiches Verhalten von Standards und Proben gewährleistet. Um Fehlbestimmungen zu vermeiden, können dazu nur Seren verwendet werden, in denen sich der Spiegel an dem zu bestimmenden Hormon praktisch nicht von Null unterscheidet (Mangelseren, Null-Seren). Die Beschaffung derartiger Humanseren mit extrem niedrigem Hormongehalt ist häufig schwierig, weshalb ausweichend oft Pufferlösungen zum Ansetzen der Standards verwendet werden. Die als Standards eingesetzten Hormone reagieren jedoch in Puffer — auch bei Zusatz von Eiweißstoffen — anders als die Hormone im Probeserum. Dies kann von erheblicher Konsequenz für die klinische Diagnostik und Therapie sein. Wegen der Schwierigkeiten, sogenannte Null-Seren zum Ansetzen der Standards in ausreichender Menge zu beschaffen, wurde versucht, Normalseren künstlich an Hormonen zu verarmen oder auf Tierseren auszuweichen. Eine preparative Abreicherung des betreffenden Hormons aus dem Serum stößt dann auf große Schwierigkeiten, wenn diese Substanzen bezüglich ihrer chemischen und physikalischen Parameter denen der Serumproteine nahe kommen. Bei einer Extraktion würde sich der Eiweißgehalt insgesamt so sehr vermindern, daß kein natives Serum mehr vorliegt. Lediglich die Affinitätschromatographie bietet die Möglichkeit einer selektiven Abreicherung; sie ist aber für Routinezwecke zu aufwendig.

Die Verwendung tierischer Seren zum Ansetzen der Standards stieß bisher auf Schwierigkeiten. So berichteten Pekary und andere über die Verwendung von Kälberserum beim Radioimmunoassay zur Bestimmung des Proteohormons hTSH, womit sie falsch erhöhte Werte erhielten (J. Clin. Endocr. Metab. 41 [1975] 676). Von Erhard wurde mitgeteilt, daß Standardskurven in Pferdeserum für TSH ebenfalls zu hohe Werte ergeben (Der Nuklearmediziner 1 [1979], Heft 2, S. 24). Bei Verwendung des nativen Pferdeserums für die Standards ergeben sich für Humanproben zu niedrige TSH-Werte.

Wie schon erwähnt, ist die Beschaffung nativer Humanseren mit dem erforderlichen extrem niedrigen Hormonspiegel schwierig. Im Falle des Proteohormons TSH werden derartige Seren z. B. nur bei Probanden, die hypophysektomiert wurden, oder bei extremen Hyperthyreosen anderer Genese gefunden. Patienten mit entsprechenden Krankheitsbildern sind selten und zudem oft nicht bereit, größere Mengen an Blut zu spenden. Für die Produktion eines Testsystems reichen die auf diese Weise zu gewinnenden Mengen an Serum nicht aus. Um nicht nur auf Patienten zurückgreifen zu müssen, wurde versucht. Probanden zu gewinnen, die ihre Hypophyse durch Applikation von Schilddrüsenhormonen (T3 oder/und T4) supprimieren lassen und dann Blut spenden. Abgesehen davon, daß absolute Hormonfreiheit oder sehr niedrigeTSH-Spiegel auch bei dieser Vorbereitung nur selten erreicht werden, vielmehr häufig eine Restfunktion der Hypophyse mit entsprechendem TSH-Blutspiegel aufrechterhalten bleibt, ist der Aufwand sehr erheblich. Auch ist dieses Vorgehen nicht ohne Gefahren für den Probanden, weshalb die Serumgewinnung an bestimmte Voraussetzungen gebunden ist.

Aus dem oben Gesagten geht hervor, daß das Milieu, in dem die Standards angesetzt werden, von großer Bedeutung für die Erzielung richtiger Analysenwerte ist. Sowohl Pufferlösungen mit Proteinzusatz als auch native Tierseren sind ungeeignete Lösungsmittel zur Standardherstellung, da zu hohe bzw. zu niedrige Hormonwerte bestimmt werden, was erhebliche diagnostische und therapeutische Konsequenzen zur Folge haben kann.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die Gewinnung von Seren, die sich als Standardmedium in Immunoassays eignen.

о

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Präparation von Pferdeserum, das bezüglich seiner Eigenschaften als Standardmedium in Immunoassayszur Bestimmung des Hormons TSH praktisch hormonfreien bzw. hormonarmen Humanseren gleicht, anzugeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Pferdeserum als Standardmedium in Immunoassays zur Bestimmung des HormonsTSH besteht darin, daß das Pferdeserum entweder mit Assaypuffer verdünnt oder konzentriert wird, bis identische oder nahezu identische antiserumspezifische Bindungen im Pferde- und im Humanserummilieu erzielt werden. Die Auswahl des Pferdeserums muß so erfolgen, daß eine Kreuzreaktion zwischen dem in ihm enthaltenen Hormon TSH und dem als Standard verwendeten bzw. zu bestimmenden TSH vermieden wird (sogenannte Spezieskreuzreaktivität), was eine vorherige Austestung notwendig macht.

Liegt die Standardkurve im Pferdeserum links von der in hormonfreiem Humanserum, muß das Pferdeserum entsprechend verdünnt werden. Im anderen Falle, d. h., die Standardkurve im Pferdeserum ist gegenüber der in hormonfreiem Humanserum nach rechts verschoben, ist das Pferdeserum zu konzentrieren oder durch Zusatz von Proteinen anzupassen. Außer der Erzielung identischer antiserumspezifischer Bindungen im Tier- und Humanserummilieu muß auch die sogenannte unspezifische Bindung in die Untersuchungen einbezogen werden; sie muß ebenfalls praktisch gleich sein.

Der Assaypuffer besteht z. B. aus

7,58g Na₂HPO₄ · 2H₂O

0,93 g KH₂PO₄

3,72g Chelaplex III

1,OgNaN₃

5,0g Humanserum-Albumin,

die mit destilliertem Wasser auf einen Liter ausgefüllt werden. Der pH-Wert des Puffers beträgt 7,4.

Bei der Aufarbeitung des Assays wird die sogenannte B/F-Trennung, d. h. die Trennung von antikörpergebundener und freier Aktivität, bevorzugt nach dem Doppelantikörperprinzip durchgeführt. Hierbei ist erfindungsgemäß so zu verfahren, daß keine Störung der Präzipitationsreaktion durch Bestandteile des Pferdeserums eintritt.

Die subtile Austestung der Doppelantikörperreaktion muß sowohl in Human- als auch im modifizierten Pferdeserummilieu erfolgen; zumeist bestehen kinetische Unterschiede. Es ist vorteilhaft, solche Arbeitsbedingungen auszuwählen, bei denen in beiden Millieus die Reaktionen dem Gleichgewichtszustand nahe kommen. Die unspezifischen Bindungen sind bei der Doppelantikörpermethode sehr niedrig und zwischen Seren verschiedener Provinienz kaum differenziert. Im Falle der Radioimmunoassays sollte vorzugsweise zweiter Antikörper von Ziegen eingesetzt werden. Eine Störung tritt dann auf, wenn als zweiter Antikörper Antikaninchen-Gammaglobulin vom Esel (Maultier, Maulesel) verwendet wird, da eine partielle Antigenverwandtschaft zwischen Pferd und Esel besteht. Eine Kreuzreaktion zwischen dem Pferde-TSH und dem Human-TSH tritt nicht auf.

Die Menge des dem Pferdeserum zuzusetzenden Puffergemisches muß in jedem Falle durch Austesten bestimmt werden. Dazu werden Verdünnungsreihen des Pferdeserums mit dem Puffergemisch hergestellt und die Ergebnisse der Doppelantikörperreaktion mit denen in hormonfreien bzw. hormonarmen Humanseren verglichen.

Ausführungsbeispiel

Figur 1: zeigt die Einstellung der Pferdeserumkonzentration, Figur 2: Standardkurven in verschiedenen Seren.

Durch Verdünnen von nativem gepooltem Pferdeserum mit Assaypuffer werden die Lösungsmedien für die Standards präpariert. Der Puffer hat die oben genannte Zusammensetzung. Für die Ermittlung der optimalen Verdünnung wird eine Verdünnungsreihe Pferdeserum/Assaypuffer hergestellt. Mit Hilfe dieser Verdünnungsreihe wird zunächst der Nullpunkt des Systems eingestellt, wozu ein Vergleich mit einer Palette TSH-armer Humanseren dient. Erfolgt die Bestimmung des Hormons TSH mittels Radioimmunoassay, wird als Marker ein Radioisotop eingesetzt, so daß die Bindungsraten leicht durch Radioaktivitätsmessungen bestimmt werden können. So liegen z. B. für die untersuchten TSH-armen Humanseren zwischen 24000 und 25300 Impulsen pro fünf Minuten. Mit 50%igem Pferdeserum wird eine Bindungsrate von 25400 Impulsen pro 5 Minuten erhalten. Diese Konzentration ist als optimal anzusehen.

Werden für die Immunoassay 0,2 ml Probandenserum eingesetzt, sind die Standards in 0,2 ml 50%igem Pferdeserum befindlich. Die auf den Nullpunkt abgestimmte Pferdeserumkonzentration muß darüber hinaus auch für den gesamten Standardkurvenbereich als brauchbar gesichert bzw. geringfügig korrigiert werden. Aus diesem Grunde wurden Standardkurven in Puffer mit 0,5% Humanserum-Albumin (I), in bestem humanem Nullserum (II), in unbehandeltem Pferdeserum (ItI) und in eingestelltem Pferdeserum (IV) aufgenommen. Der Verlauf dieser Kurven zeigt eindeutig, daß im vorliegenden Falle 50%iges Pferdeserum als Standardmedium eingesetzt werden kann und dieselben Ergebnisse bringt wie bestes humanes Nullserum.

Die Durchführung der Messungen erfolgt im Falle der anderen Immunoassays (Fluoreszens- bzw. Enzymimmunoassay) entsprechend den für diese Assays bekannten Vorschriften. Anstelle des im Radioimmunoassay verwendeten Radioisotops als Marker werden die entsprechenden Substanzen eingesetzt.

Claims (2)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Präparation eines Standardmediums für Immunoassays zur Bestimmung des Hormons TSH, gekennzeichnet dadurch, daß natives gepooltes Pferdeserum mit einer solchen Menge eines Assaypuffers vom pH = 7,4, der aus 7,58 g Na₂HPO₄-2H₂O

   0,93 g KH₂PO₄

   3,72g Chelaplex III

   1,OgNaN₃

   5,0g Humanserum-Albumin und

   der für einen Liter Lösung erforderlichen Menge destilliertem Wasser besteht, versetzt wird, daß die antiserumspezifischen Bindungen, gemessen im Doppelantikörpertest, denen in Humanserum entsprechen.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Ermittlung der Menge des zuzusetzenden Assaypuffers mit Hilfe von Verdünnungsreihen und deren Vergleich mit entsprechenden TSH-armen Humanseren erfolgt.