DE2832853C3 - Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation des Immunkomplexes bei einem Radioimmunoassy - Google Patents
Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation des Immunkomplexes bei einem RadioimmunoassyInfo
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Description
1. Er besitzt ein Molekulargewicht Ober 50 000 (SephadexG-100);
Z gehört dem Euglobulintyp an und ist in destilliertem Wasser vollständig unlöslich;
3. besitzt eine elektrophoretische Mobilität, die genau gleich ist wie die von Serumalpha- oder
Betaglobulinen;
4. kann von keiner Komponente des Serumkomplements assimiliert werden;
5. ist an SephadexG-100 homogen;
6. besitzt eine enzymatische Aktivität;
7. ist thermolabil, d.h. verliert 90% seiner Aktivität bei Erhitzung auf 600C während
30 min.
2. Verfahren zur Extraktion des Serumfaktors nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Serum oder Antiserum gegenüber konstant gerührtem, destillierten Wasser dialysiert, dann zentrifugiert
wird, der Feststoff mit destilliertem Wasser gewaschen, erneut in einem Puffer gelöst und dann
lyophilisiert wird.
3. Radio-Immunoassayverfahren nach der Doppelantikörpermethode,
dadurch gekennzeichnet, daß die Präzipitationsreaktion des Immunokomplexes durch die Zugabe eines Mittels nach Anspruch 1
beschleunigt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zu dem gleichen Reaktionsmedium zugegeben wird, in dem der Immunokomplex
vorhanden ist.
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation des Immunkomplexes bei einem
Radioimmunoassay nach der Doppelantikörpermethode.
Der Radioimmunoassay (RIA) ist ein analytisches Verfahren, das die Analyse unendlich kleiner Mengen an
Hormonen oder anderen Substanzen, die in zu analysierenden biologischen Fluiden vorhanden sind,
erlaubt.
Obgleich dieses Verfahren sehr präzise und empfindlich ist, besitzt es verschiedene Nachteile. Beispielsweise
sind lange Versuchszeiten erforderlich. Bei der Doppelantikörpermethode wird die Trennung des Immunokomplexes (Antigen-I-Antikörper) von überschüssigem
freien Antigen durch eine Präzipitationsreaktion des Immunokomplexes durchgeführt, die Zeiten von etwa
Std. erfordert. Diese Reaktion erfolgt durch Zugabe eines Zweiten Antikörpers (Anti-Gammaglobulinserum)
zu dem Inkubationsmedium, wo der Immunokomplex festgestellt wird, und besteht in der Bildung eines
unlöslichen Antigen-I-Antikörper-II-Antikörperkomplexes.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe
zugrunde, die Verfahrenszeiten für den Immunoassay zu verkürzen, indem die Ausfällungszeit des Immunokomplexes
verkürzt wird.
Wie bekannt ist, wird die Präzipitationsreaktion des
Immunokomplexes durch verschiedene Faktoren beeinflußt, wie:
a) die Qualität des Anti-Gammaglobulinserums,
b) die Reaktionstemperatur,
c) das Reaktionsvolumen
d) den pH-Wert und die Proteinkonzentration des Inkubationsmediums,
e) die Anwesenheit bestimmter Mengen von Calzen in dem Reaktionsmedium,
f) die Gamma-Globulinkonzentration der Tierspecies,
in denen der I-Antikörper erzeugt wird
Von all diesen Faktoren, deren Standardisierung erforderlich ist, damit die Präzipitationsreaktion stattfindet,
erlaubt keiner die Beschleunigung der Reaktion.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß ein »Serumfaktor« existiert, der, wenn er zu dem
Inkubationsmedium zugegeben wird, die Eigenschaft besitzt, die Präzipitationsreaktion zu beschleunigen. Es
wurde gefunden, daß dieser Serumfaktor in Sera und Antisera zahlreicher Säugetierspecies, wie Menschen,
Kaninchen, Schafen, Meerschweinchen, Pferden, vorhanden ist
Die Erfindung betrifft somit ein Mittel zur Beschleunigung
der Präzipitation des Immunokomplexes bei einem Radioimmunoassay nach der Doppelantikörpermethode,
enthaltend einen aus Säugetierserum oder -antiserum gewonnen Serumfaktor mit Proteinstruktur,
der die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften aufweist:
1. Er besitzt ein Molekulargewicht über 50 00 (SephadexG-100);
2. gehört dem Euglobulintyp und ist in destilliertem Wasser vollständig unlöslich;
3. besitzt eine elektrophoretische Mobilität, die genau gleich ist wie die von Serumalpha- oder Betaglobulinen,
4. kann von keiner Komponente des Serumkomplements assimiliert werden;
5. ist an Sephadex G-100 homogen;
6. besitzt eine enzymatische Aktivität, und
7. ist thermolabil, d. h. verliert 90% seiner Aktivität bei Erhitzung auf 60° C während 30 min.
Die Extraktion des oben erwähnten Serumfaktors aus Serum erfolgt mit einem Dialyseverfahren. Das
Dialyseverfahren wird wie folgt durchgeführt:
20 ml Menschenserum werden in ein Dialyserohr (Visking Tubing 24/32) gegeben. Das Rohr wird
sorgfältig abgedichtet und in ein mit destilliertem Wasser gefülltes 2 I-Becherglas gegeben und 20 Std. für
die Dialyse stehengelassen. Das destillierte Wasser wird konstant gerührt. Nach 20 Std. wird der Inhalt bei etwa
2000 g zentrifugiert. Das überstehende Material wird verworfen und der Feststoff (Serumfaktor) wird mit
destilliertem Wasser gewaschen, erneut in 0,05 Phosphatpuffer gelöst und dann lyophilisiert.
Der so erhaltene Serumfaktor ist ein Protein, das das Aussehen eines weißen Pulvers besitzt und die obigen
chemisch-physikalischen Eigenschaften aufweist.
es Die Beschleunigungswirkung, die durch den Serumfaktor bei der Präzipitationsreaktion bestimmt wird, ist
eine Erscheinung, die von der Konzentration des Serumfaktors in dem Konzentrationsmedium abhängt.
In der Tat hängt die Menge an Serumfaktor, ausgedrückt in mg oder in äquivalenten ml Serum, die zu
dem Inkubat zugegeben werden muß, davon ab, wie stark die Präzipitationsreaktion beschleunigt werden
solL
Die folgenden Beispiele werden unter Anwendung von RIA zur Bestimmung von menschenfollikel-stimulierendem Hormon (hFSH) durchgeführt. Alternativ
können andere RIA-Modelle verwendet werden, wobei man ähnliche Ergebnisse erhält
Für die Bildung des Immunokomplexes (erste
Reaktion) folgt man dem im folgenden erläuterten mehrstufigen Reaktionsschema.
0,2 ml Anti-hFSH, erzeugt im Kaninchen und verdünnt auf 1 :200 000, werden mit 0,1 ml, äquivalent
zu 0,08 Nanogramm, von 1-125 markiertem Menschen-FSH (spezifische Radioaktivität 150 μ§) umgesetzt Nach Erreichung des Gleichgewichts (nach 24
Std.) wird der Immunkomplex Anti-hFSH-I-125-hFSH
durch Zugabe zu dem Reaktionsmedium von 0,1 ml Kaninchen-Antigammaglobulinserum, erzeugt in Schafen und verdünnt auf 1 :300 (präzipitierendes Antiserum), insolubilisiert Dieser Vorgang erfolgt auf die
folgenden vier unterschiedlichen Arten.
Üblicher Weg. Gegen Ende der ersten Reaktion werden nur 0,1 ml des präzipitierenden Antiserums
zugegeben. Eine maximale Präzipitation wird nach 24stündiger Umsetzung erhalten.
Erfindungsgemäß. Gegen Ende der ersten Reaktion wird Serumfaktor in einer Menge, äquivalent zu 0,01 ml
Menschenserum, zusätzlich zu dem präzipitierenden Antiserum zugegeben. Die maximale Präzipitation wird
nach 15 Std. Reaktion erhalten. Die maximale Präzipitation wird nach 15 Std. Reaktion erhalten.
Erfindungsgemäß. Gegen Ende der ersten Reaktion wird Serumfaktor in einer Menge, äquivalent zu 0,05 ml
Menschenserum, zusätzlich zu dem präzipitierenden Antiserum zugegeben. Die maximale Präzipitation wird
nach 4 Std. Reaktion erhalten.
Erfindungsgemäß. Gegen Ende der ersten Reaktion wird Serumfaktor in einer Menge, äquivalent zu 0,10 ml
Menschenserum, zusätzlich zu dem Präzipitationsantiserum zugegeben.
Die maximale Präzipitation wird nach 1 Std. Reaktion erhalten.
Analoge Ergebnisse werden unter Verwendung von SerumfaUtoren erhalten, die von anderen Säugetierspecies erhalten wurden.
Es wurde experimentell festgestellt, daß die Präzipitationsreaktion. des Immunokomplexes auch dann beschleunigt wird, wenn der Serumfaktor zu dem den
Immunokomplex enthaltenden Rekationsmedium zugegeben wird, bevor die erste Reaktion ihr Gleichgewicht
erreicht hat.
Claims (1)
1. Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation des Immunkomplexes bei einem Radioimmunoassay
nach der Dcppelantikörpermethode, enthaltend einen aus Säugetierserum oder -antiserum gewonnenen
Serumfaktor mit Proteinstruktur, der die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften
aufweist:
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