DE2832853B2 - Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation des Immunkomplexes bei einem Radioimmunoassay - Google Patents

Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation des Immunkomplexes bei einem Radioimmunoassay

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Description

2. Verfahren zur Extraktion des Serumfaktors nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum oder Antiserum gegenüber konstant gerührtem, destillierten Wasser dialysiert, dann zentrifugiert wird, der Feststoff mit destilliertem Wasser gewaschen, erneut in einem Puffer gelöst und dann lyophilisieri wird.
3. Radio-Immunoassayverfahren nach der Doppelantikörpermethode, dadurch gekennzeichnet, daß die Präzipitationsreaktion des Immunokomplexes durch die Zugabe eines Mittels nach Anspruch 1 beschleunigt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zu dem gleichen Reaktionsmedium zugegeben wird, in dem der Immunokomplex vorhanden ist.
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation des Immunkomplexes bei einem Radioimmunoassay nach der Doppelantikörpermethode.
Der Radioimmunoassay (RIA) ist ein analytisches Verfahren, das die Analyse unendlich kleiner Mengen an Hormonen oder anderen Substanzen, die in zu analysierenden biologischen Fluiden vorhanden sind, erlaubt.
Obgleich dieses Verfahren sehr präzise und empfindlich ist, besitzt es verschiedene Nachteile. Beispielsweise sind lange Versuchszeiten erforderlich, bei der Doppelantikörpermethode wird die Trennung des Immunokomplexes (Antigen-I-Anlikörper) von überschüssigem freien Antigen durch eine Präzipitalionsreaktion des Immunokomplexes durchgeführt, die Zeiten von etwa Std. erfordert. Diese Reaktion erfolgt durch Zugabe eines Zweiten Antikörpers (Anti-Gammaglobulinserum) zu dem Inkubationsmedium, wo der Immunokomplex festgestellt wird, und besteht in der Bildung eines unlöslichen Antigen-1-Antikörper-H-Antikörperkomplexes.
Der vorliegenden Erfindung lieg; die Aufgabe
zugrunde, die Verfahrenszeiten für den Immunoassay zu verkürzen, indem die AusfällungszeU des Immunokomplexes verkürzt wird
Wie bekannt ist, wird die Präzipitationsreaktion des Immunokomplexes durch verschiedene Faktoren beeinflußt, wie:
a) die Qualität des Anti-Gammaglobulinserums,
b) die Reaktionstemperatur,
c) das Reaktionsvolumen
d) den pH-Wert und die Proteinkonzentration des Inkubationsmediums,
e) die Anwesenheit bestimmter Mengen von Salzen in dem Reaktionsmedium,
f) die Gamma-Globulinkonzentration der Tierspecies, in denen der !-Antikörper erzeugt wird.
Von all diesen Faktoren, deren Standardisierung erforderlich ist, damit die Präzipitationsreätction stattfindet, erlaubt keiner die Beschleunigung der Reaktion.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß ein »Serumfaktor« existiert, der, wenn er zu dem Inkubationsmedium zugegeben wird, die Eigenschaft besitzt, die Präzipitationsreaktion zu beschleunigen. Es wurde gefunden, daß dieser Serumfaktor in Sera und Antisera zahlreicher Säugetierspecies, wie Menschen, Kaninchen, Schafen, Meerschweinchen, Pferden, vorhanden ist
Die Lrfindung betrifft somit ein Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation des Immunokomplexes bei
in einem Radioimmunoassay nach der Doppelantikörpermethode, enthaltend einen aus Säugetierserum oder -antiserum gewonnen Serumfaktor mit Proteinstruktur, der die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften aufweist:
1. Er besitzt ein Molekulargewicht über 50 00 (Sephadex G-IOO);
Z gehört dem Euglobulintyp und ist in destilliertem Wasser vollständig unlöslich;
3. besitzt eine elektrophoretische Mobilität, die genau gleich ist wie die von Serumalpha- oder Betaglobulinen,
4. kann von keiner Komponente des Serumkomplements assimiliert werden;
5. ist an Sephadex G-100 homogen;
6. besitzt eine enzymatische Aktivität, und
7. ist thermolabil, d. h. verliert 90% seiner Aktivität bei Erhitzung auf 60' C während 30 min.
Die Extraktion des oben erwähnten Serumfaktors aus
Serum erfolgt mit einem Dialyvdverfahren. Das Dialyseverfahren wird wie folgt durchgeführt:
20 ml Menschenserum werden in ein Dialyserohr (Visking Tubiiig 24/32) gegeben. Das Rohr wird sorgfältig abgedichtet und in ein mit destilliertem Wasser gefülltes 2 I-Becherglas gegeben und 20 Std. für die Dialyse stehengelassen. Das destilPertn Wasser wird konstant gerührt. Nach 20 Std. wird der Inhalt bei etwa 2000 g zentrifugiert. Das überstehende Material wird verworfen und der Feststoff (Serumfaktor) wird mit destilliertem Wasser gewaschen, erneut in 0,05 Pliosphaipuffer gelöst und dann lyophilisiert.
Der so erhaltene Serumfaktor ist ein Protein, das das Aussehen eines weißen Pulvers besitzt und die obigen chemisch-physikalischen Eigenschaften aufweist.
fi5 Die Beschleunigungswirkung, die durch den Serumfaktor bei der Präzipitationsreaktion bestimmt wird, ist eine Erscheinung, die von der Konzentraiion des Serumfaktors in dem Konzentrationsmedium abhängt.
In der Tat hängt die Menge an Serumfaktor, ausgedrückt in mg oder in äquivalenten ml Serum, die ψ dem Inkubat zugegeben werden muß, davon ab, wie stark die Präzipitationsreaktion beschleunigt werden soll.
Beispiele
Die folgenden Beispiele werden unter Anwendung von RIA zur Bestimmung von menschenfollikel-stimulierendem Hormon (hFSH) durchgeführt Alternativ to können andere RIA-Modelle verwendet werden, wobei man ähnliche Ergebnisse erhält
Für die Bildung des Immunokomplexes (erste Reaktion) folgt man dem im folgenden erläuterten mehrstufigen Reaktionsschema. l-i
0,2 ml Anti-hFSH, erzeugt im Kaninchen und verdünnt auf 1 :200 000, werden mit 0,1 ml, äquivalent zu 0,08 Nanogramm, von 1-125 markiertem Menschen-FSH (spezifische Radioaktivität 15C^g) umgesetzt Nach Erreici.ung des Gleichgewichts (nach 24 Std.) wird der Immunkomplex Anti-hFSH-!-!25-hFSH durch Zugabe zu dem Reaktionsmedium von 0,1 ml Kaninchen-Antigammaglobulinserum, erzeugt in Schafen und verdünnt auf 1 :300 (präzipitierendes Antiserum), insolubilisiert Dieser Vorgang erfolgt auf die 2r> folgenden vier unterschiedlichen Arten.
Beispiel l(a)
Üblicher Weg. Gegen Ende der ersten Reaktion werden nur 0,1 ml des präzipitierenden Antiserums zugegeben. Eine maximale Präzipitation wird nach 24stündiger Umsetzung erhalten.
Beispiel l(b)
Erfindungsgemäß- Gegen Ende der ersten Reaktion wird Serumfaktor in einer Menge, äquivalent zu 0,01 ml Menschenserum, rasätzlich zu dem präzipitierenden Antiserum zugegeben. Die maximale Präzipitation wird nach 15 Std. Reaktion erhalten. Die maximale Präzipitetion wird nach 15 Std. Reaktion erhalten.
Beispiel 1(C1)
Erfindungsgemäß. Gegen Ende der ersten Reaktion wird Serumfaktor in einer Menge, äquivalent zu 0,05 ml Menschenserum, zusätzlich zu dem präzipitierenden Antiserum zugegeben. Die maximale Präzipitation <vird nach 4 Std. Reaktion erhalten.
Beispiel l(d)
Erfindungsgemäß. Gegen Ende der ersten Reaktion wird Serumfaktor in einer Menge, äquivalent zu 0,10 ml Menschenserum, zusätzlich zu dem Präzipitationsantiserum zugsgeben.
Die maximale Präzipitatio.i wird nach 1 Std. Reaktion erhalten.
Analoge Ergebnisse werden unter Verwendung von Serumfaktoren erhalten, die von anderen Säugetierspecies erhalten wurden.
Es wurde experimenteüfestgestellt, daß die Präzipitationsreaktion des Immunokomplexes auch dann beschleunigt wird, wenn der Serumfaktor zu dem den Immunokomplex enthaltenden Rekationsmedium zugegeben wird, bevor die erste Reaktion ihr Gleichgewicht erreicht hat

Claims (7)

Patentansprüche:
1. Mittel zur Beschleunigung der Precipitation des Immunkomplexes bei einem Radioimmunoassay nach der Doppelantikörpermethode, enthaltend einen aus Säugetierserum oder -antiserum gewonnenen Serumfaktor mit Proteinstruktur, der die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften aufweist:
1. Er besitzt ein Molekulargewicht Ober 50 000 (SephadexG-100);
2. gehört dem Euglobulintyp an und ist in destilliertem Wasser vollständig unlöslich;
3. besitzt eine elektrophoretische Mobilität, die genau gleich ist wie die von Serumalpha- oder Betaglobulinen;
4. kann von keiner Komponente des Serumkomplements assimiliert werden;
5. ist an Sephadex G-100 homogen;
6. besitzt eine enzymaiische Aktivität;
7. ist thermolabil, d.h. verliert 90% seiner Aktivität bei Erhitzung auf 600C während 30 min.
DE2832853A 1977-07-27 1978-07-26 Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation des Immunkomplexes bei einem Radioimmunoassy Expired DE2832853C3 (de)

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