DE2832853A1

DE2832853A1 - Mittel zur beschleunigung der praezipitation bei der immunoanalyse und immunoanalyseverfahren

Info

Publication number: DE2832853A1
Application number: DE19782832853
Authority: DE
Inventors: Giorgio Ricci
Original assignee: Biodata SpA
Current assignee: Biodata SpA
Priority date: 1977-07-27
Filing date: 1978-07-26
Publication date: 1979-02-08
Also published as: US4279999A; GB2001994B; DE2832853B2; GB2001994A; IT1203071B; CH643741A5; CA1115208A; DE2832853C3; AR218076A1

Description

KRAUS & WEISERT

PATENTANWÄLTE

DR WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-80O0 MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 · TELEX 05-212156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT

1958 AW/Ii

BIODATA S.p.A., Rom (Italien)

Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation bei der Immunoanalyse und Iininunoanalyseverfahren

809886/094

Die Erfindung liegt auf dem radioimmunologischen Gebiet. Sie betrifft insbesondere die immunologische Analyse und besonders ein Mittel zur Beschleunigung der Prazipitationsreaktionen der Immunoanalyse bzw* dem Immunoassay und dem entsprechenden Immunoanalysenverfahren bzw. Immunoassayverfahren.

Der Radioimmunoassay (RIA) ist ein analytisches Verfahren, das die Analyse unendlich kleiner Mengen an Hormonen oder anderen Substanzen, die in zu analysierenden biologischen Fluiden vorhanden sind, erlaubt.

Obgleich dieses Verfahren sehr präzise und empfindlich ist, besitzt es verschiedene Nachteile. Beispielsweise sind lange Versuchszeiten erforderlich. Beispielsweise wird bei einem oder bei den Grundverfahren bei der RIA, wie bei der Trennung des Immunokomplexes (Antigen-I-Antikörper) von überschüssigem freien Antigen normalerweise eine Prazipitationsreaktxon des Immunokomplexes durchgeführt, die Zeiten von etwa 24 Std. erfordert.Diese Art von Reaktionen erfolgt durch Zugabe eines zweiten Antikörpers (Anti-Gammaglobulinserum) zu dem Inkubationsmedium, wo der Immunokomplex festgestellt wird, und bewirkt, daß er ausfällbar ist, da er einen unlöslichen Antigen-I-Antigen-II-Antikörperkomplex bildet.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Verfahrenszeiten für den Immunoassay zu verkürzen, indem die Ausfällungszeit des Immunokomplexes verkürzt wird.

Erfindungsgemäß soll ein Mittel für die Beschleunigung der Insolubilisierungsreaktion und somit der Präzipitation des Immunokomplexes bei der Radioimmunoassay zur Verfügung gestellt werden.

Erfindungsgemäß soll ein anwendbares Immunoassayverfahren zur Verfügung gestellt werden, bei dem das gleiche Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation verwendet wird. Erfindungsgemäß

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soll ein Verfahren für die Herstellung (d.h. Extraktion) des oben angegebenen Beschleunigungsmittels zur Verfügung gestellt werden.

Wie es bekannt ist, wird die Präzipitationsreaktion des Immunokomplexes durch verschiedene Elemente beeinflußt, wie:

a) die Qualität des Anti-Gammaglobulinserums,

b) die Reaktionstemperatur,

c) das Reaktionsvolumen

d) den pH-Wert und die Proteinkonzentration des Inkubationsmediums ,

e) die Anwesenheit bestimmter Mengen von Salzen in dem Reaktionsmedium,

f) die Gamma-Globulinkonzentration der Tierspecies, in denen der I-Antikörper erzeugt wird.

Bei den Versuchen, die zu der vorliegenden Erfindung geführt haben, wurden die folgenden Versuchsbedingungen verwendet,die im folgenden in gleicher Reihenfolge abgehandelt werden wie die oben erwähnten, verschiedenen Faktoren.

a) Es wird ein spezifisches Antiserum für Gammaglobulin der Säugetier species, in dem der erste Antikörper gezüchtet wurde, verwendet, das einei zuvor festgestellten Antikörpertiter und eine zuvor festgestellte Affinität für Gammaglobulin aufweist.

b) Alle Reaktionen werden bei 20 bis 22°C durchgeführt.

c) Alle Reaktionen werden bis zu einem Endreaktionsvolumen von 0,4 ml durchgeführt.

d) Alle Reaktionen werden bei pH 7,5 und bei einer Proteinkonzentration von 3,3 mg/ml Rindeiserumalbumin durchgeführt.

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e) Die folgenden Salze werden in dem Inkubationsmedium hergestellt:

0/01 molare Phosphate,

das Natriumsalz von Äthylendiamintetraessigsäure (12,5 mg/ml).

f) Die Gamma-Globulinkonzentration beträgt 16 μg/ml des ersten Antiserums.

Von all diesen Faktoren, deren Standardisierung erforderlich ist, damit die Präzipitationsreaktion stattfindet, erlaubt keinerdie Beschleunigung der Reaktion.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß ein "Serumfaktor" existiert, der, wenn er zu dem Inkubationsmedium zugegeben wird, die Eigenschaft besitzt, die Präzipitationsreaktion zu beschleunigen. Es wurde gefunden, daß dieser Serumfaktor (der eine enzymatische Aktivität aufweist) in Sera und Antisera zahlreiche Lebewesenspecies bzw. Säugetierspecies, wie Menschen, Kaninchen, Schafen, Meerschweinchen, Pferden, vorhanden ist.

Die Extraktion des oben erwähnten Serumfaktors aus Serum erfolgt mit einem Dialyseverfahren. Das Dialyseverfahren wird wie folgt durchgeführt:

20 ml Menschenserum werden in ein Dialyserohr (Visking Tubing 24/32) gegeben. Das Rohr wird sorgfältig abgedichtet und in ein mit destilliertem Wasser gefülltes 21-Becherglas gegeben und 20 Std. für die Dialyse stehengelassen. Das destillierte Wasser wird konstant gerührt. Nach 20 Std. wird der Inhalt bei etwa 2000 g zentrifugiert. Das überstehende Material wird verworfen und der Feststoff (Serumfaktor) wird mit destilliertem Wasser gewaschen, erneut in 0,05 Phosphatpuffer gelöst und dann lyophilisiert.

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• ο -

Der so erhaltene Serumfaktor ist ein Protein, das das Aussehen eines weißen Pulvers besitzt und die folgenden chemisch-physikalischen Eigenschaften aufweist:

1) es besitzt ein Molekulargewicht über 50 000 (Sephadex G-100),

2) es gehört dem Euglobulintyp an, ist in destilliertem Wasser vollständig unlöslich,

3) es besitzt eine elektrophoretische Mobilität, die genau gleich ist wie die vom Serumalpha- oder Betaglobulinen,

4) es kann von irgendeiner Komponente des Serumkomplements nicht assimiliert werden,

5) an Sephadex G-100 ist es homogen,

6) es besitzt eine enzymatische Aktivität,

7) es ist thermolabil, d.h. es verliert 90% seiner Aktivität, wenn es auf 60⁰C während 30 min. erhitzt wird.

Die Beschleunigungswirkung ,die durch den Serqmfaktor bei der Präzipitationsreaktion bestimmt wird, ist eine Erscheinung, die von der Konzentration des Serumfaktors in dem Konzentrationsmedium abhängt. In der Tat hängt die Menge an Serumfaktor,ausgedrückt in mg oder in äquivalenten ml Serum, die zu dem Inkubat zugegeben werden muß, davon ab, wie stark die Präzipitationsreaktion beschleunigt werden soll.

Manchmal kann eine beschleunigende Wirkung erhalten werden, selbst wenn nicht-behandeltes Serum verwendet wird.

In diesem Fall können jedoch andere Nebenreaktionen den Assay stören, was die Verwendung von nicht behandeltem Serum ungünstig macht.

Beispiele

Die folgenden Beispiele werden unter Verwendung von RIA zur Bestimmung von menschenfollikel-stimulierendem Hormon(hFSH) durchgeführt. Alternativ können andere RIA-Modelle verwendet werden, wobei man ähnliche Ergebnisse erhält.

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-ir-

Im folgenden werden die Beispiele 1 (a), 1(b), 1(c) und 1(d) näher erläutert.

Für die Bildung des Immunokomplexes (erste Reaktion) folgt man dem im folgenden erläuterten mehrstufigen Reaktionsschema.

0,2 ml Anti-hFSH, erzeugt im Kaninchen und verdünnt auf 1: 200 000, werden mit 0,1 ml, äquivalent zu 0,08 Nanogramm, von 1-125 markiertem Menschen-FSH (spezifische Radioaktivität 150 μg) umgesetzt. Nach Erreichung des Gleichgewichts (nach Std.) wird der Immunkomplex Anti-hFSH-I-125-hFSH durch Zugabe zu dem Reaktionsmedium von 0,1 ml Kaninchen-Antigammaglobulinserum, erzeugt in Schafen und verdünnt auf 1:300 (präzipitierendes Antiserum),insolubilisiert. Dieser Vorgang erfolgt auf die folgenden vier unterschiedlichen Arten und dient zur Erläuterung eindeutiger erfindungsgemäßer Beispiele.

Beispiel 1(a):

Üblicher Weg. Gegen Ende der ersten Reaktion werden nur 0,1 ml des präzipitierenden Antiserums zugegeben. Eine maximale Präzipitation wird nach 24-stündiger Umsetzung erhalten.

Beispiel 1(b):

Erfindungsgemäß. Gegen Ende der ersten Reaktion wird Serumfaktor in einer Menge, äquivalent zu 0,01 ml Menschenserum, zusätzlich zu' dem präzipitierenden Antiserum zugegeben. Die maximale Präzipitation wird nach 15 Std. Reaktion erhalten. Die maximale Präzipitation wird nach 15 Std. Reaktion erhalten.

Beispiel 1(c):

Erfindungsgemäß. Gegen Ende der ersten Reaktion wird Serumfaktor in einer Menge, äquivalent zu 0,05 ml Mensehenserum, zusätzlich zu dem präzipitierenden Antiserum zugegeben. Die maximale Präzipitation wird nach 4 Std. Reaktion erhalten.

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Beispiel 1(d);

Erfindungsgemäß. Gegen Ende der ersten Reaktion wird Serumfaktor in einer Mänge, äquivalent zu 0,10 ml Menschenserum, zusätzlich zu dem Präzipitationsantiserum zugegeben.

Die maximale Präzipitation wird nach 1 Std. Reaktion erhalten.

Analoge Ergebnisse werden unter Verwendung von Serumfaktoren erhalten, deren andere Lebewesenspecies bzw. Tierspecies mit denen,die oben erwähnt wurden, erzeugt wurden.

Weiterhin wurde experimentell festgestellt, daß die Präzipita tionsreaktion des Immunokomplexes beschleunigt wird,selbst wenn der Serumfaktor zu dem den Immunokomplex enthaltenden Reaktionsmedium zugegeben wird, bevor die erste Reaktion ihr Gleichgewicht erreicht hat.

Ende der Beschreibung.

Claims

KRAUS & WEISERT _2Q3.

PATENTANWÄLTE

DR WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT D1PL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 ■ D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 · TELEX 05-212156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT

1958 AW/li Patentansprüche

Mittel zur Beschleunigung der Präzipitation bei dem Radio-Immunoassay, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Serumfaktor enthält, der durch Dialyse aus Säugetierserum oder Antiserum extrahiert worden ist.
2. Verfahren zur Extraktion des Serumfaktors nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum oder Antiserum gegenüber konstant gerührtem, destillierten Wasser dialysiert> dann zentrifugiert wird, der Feststoff mit destilliertem Wasser gewaschen, erneut in einem Puffer gelöst und dann lyophilisiert
wird.
3. Verbessertes Radio-Immunoassayverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß die Präzipitationsreaktion des Immunokomplexes
durch die Zugabe eines Serumfaktors nach Anspruch 1 beschleunigt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Serumfaktor zu dem gleichen Reaktionsmedium zugegeben wird,in dem der Immunokomplex vorhanden ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Serumfaktor von 0,01 bis 0,1 Äquivalent-ml Serum oder Antiserum beträgt, wobei höhere Mengen an Serumfaktor ermöglichen, daß kürzere Präzipitationszeiten erhalten werden.

ORIGINAL INSPECTED
80988S/Ö945