CH643741A5

CH643741A5 - Verfahren zur gewinnung eines serumfaktors zur beschleunigung der ausfaellung bei radioimmunbestimmungsmethoden.

Info

Publication number: CH643741A5
Application number: CH805178A
Authority: CH
Inventors: Giorgio Ricci
Original assignee: Biodata Spa
Priority date: 1977-07-27
Filing date: 1978-07-26
Publication date: 1984-06-29
Also published as: CA1115208A; US4279999A; GB2001994B; DE2832853C3; AR218076A1; DE2832853A1; IT1203071B; GB2001994A; DE2832853B2

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiete der Radioimmunchemie, bei der mit der Zuhilfenahme von radioaktiv indizierten Verbindungen Immunbestimmungsmethoden durchgeführt werden. Für diese Bestimmungsmethoden ist auch im Deutschen die Bezeichnung «Radioimmunoassay» gebräuchlich. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Mittels zur Beschleunigung der Ausfällung bei Radioimmunbestimmungsmethoden gemäss Oberbegriff des Patentanspruchs 1. Durch Radioimmunoassay (RIA) ist es möglich, unendlich kleine Mengen von Hormonen oder andere Substanzen, die in biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind, zu bestimmen.

Obwohl diese Technik sehr genau und empfindlich ist, weist sie verschiedene Nachteile auf, beispielsweise erfordert ' sie verhältnismässig viel Zeit für die Durchführung. Bei einer der Grundoperationen in der RIA, der Abtrennung des Immunkomplexes (Antigen-I-Antikörper) von überschüssigem freien Antigen, ist beispielsweise eine Fällungsreaktion des Immunkomplexes üblich, die einen Zeitaufwand von etwa 24 Stunden erfordert. Diese Art der Reaktion erfolgt bei Zugabe eines zweiten Antikörpers (Anti-Gammaglobulinserum) zum Inkubationsmedium, worin sich der Immunkomplex findet, und macht diesen fällbar, da es einen neuen unlöslichen Antigen-I-Antikörper-II-Komplex bildet.

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Ausführangszeiten für Immunbestimmung durch Verminderung der Fällzeit des Immunkomplexes zu vermindern.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Serumfaktors zur Beschleunigung der dèr Ausfällung des Immunkomplexes bei der Radioimmunoassay und ist im Anspruch 1 definiert.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Serumfaktors aus dem Verfahren für eine Radioimmunbestim-mungsmethode, bei der das neue Mittel zur Beschleunigung der Ausfällung eingesetzt wird, und ist im Anspruch 2 definiert.

Wie bekannt ist, wird die Ausfällung des Immunkomplexes durch verschiedene Bedingungen beeinflusst, beispielsweise:

a) die Qualität des Anti-Gammaglobulinserums,

s b) die Reaktionstemperatur,

c) das Reaktionsvolumen d) die Wasserstoffionen- und Protein-Konzentration des Inkubationsmediums,

e) das Vorhandensein bestimmter Mengen von Salzen im io Reaktionsmedium,

f) die Gammaglobulinkonzentration der Tierart, in der der Antikörper I gebildet wurde.

Bei Versuchen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurden die folgenden Reak-is tionsbedingungen angewendet, bei denen dieselbe Reihenfolge und Bezeichnungen wie oben angewendet wurden.

a) Es wird ein spezifisches Antiserum für Gammaglobulin der Tierart, in der der erste Antikörper erzeugt wurde, verwendet, der einen vorher festgestellten Antikörpertiter

20 und einer vorher festgestellte Affinität für Gammaglobulin aufweist.

b) Sämtliche Reaktionen werden bei einer Temperatur von 20 bis 22 °C durchgeführt.

c) Sämtliche Reaktionen werden in einem Endreaktions-25 volumen von 0,4 ml durchgeführt.

d) Sämtliche Umsetzungen werden bei einem pH-Wert von 7,5 durchgeführt und bei einer Proteinkonzentration von 3,3 mg/ml Rinderserum Albumin.

e) Die folgenden Salze sind in dem Inkubationsmedium 30 vorhanden:

- 0,01m Phosphate

- das Natriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure (12,5 mg/ml).

f) Die Gammaglobulinkonzentration beträgt 16 |ig/ml des 35 ersten Anti-Serums.

Unter allen diesen Faktoren, deren Standardisierung erforderlich ist, um die Ausfällung auszuführen, befindet sich keine, die eine Beschleunigung der Reaktion erlaubt. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, 40 dass es einen «Serumfaktor» gibt, der bei Zugabe zum Inkubationsmedium die Eigenschaft der Beschleunigung der Fällreaktion hat. Es wurde festgestellt, dass dieser Serumfaktor (der Enzymaktivität aufweist) in Sera und Anti-Sera zahlreicher Tierarten, wie beispielsweise Menschen, Kanin-45 chen, Schafen, Meerschweinchen und Pferden, vorhanden ist.

Die Extraktion des oben erwähnten Serumfaktors aus Serum erfolgt mittels eines Dialyseverfahrens. Die Dialyse 50 wird wie folgt ausgeführt:

20 ml menschliches Serum werden in ein Dialyserohr (Visking-Rohr 24/32) gefüllt. Das Rohr wird sorgfältig verschlossen (versiegelt) und in ein 2-Liter-Becherglas mit destilliertem Wasser plaziert und 20 Stunden lang der Dialyse 55 überlassen, wobei das destillierte Wasser fortlaufend gerührt wird. Nach 20 Stunden wird der Inhalt mit ungefähr 2000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, und der Feststoff (Serumfaktor) wird mit destilliertem Wasser gewaschen, in 0,05m Phosphatpuffer aufgelöst und dann 60 gefriergetrocknet.

Der so erhaltene Serumfaktor ist ein Protein, das aussieht wie ein weisses Pulver und die folgenden chemischphysikalischen Eigenschaften aufweist:

es 1. es hat ein Molekulargewicht von mehr als 50 000 (Se-phadex G-100),

2. es ist vom Euglobulin-Typ, vollständig unlöslich in destilliertem Wasser,

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3. es hat bei der Elektrophorese eine Wanderungsgeschwindigkeit, die genau die gleiche ist, wie für Serum alpha-oder -beta-Globuline,

4. es kann nicht irgendeiner Komponente des Serumkomplements assimiliert werden,

5. es ist auf Sephadex G-100 homogen,

6. es hat Enzymaktivität,

7. es ist thermolabil, d.h. verliert 90% seiner Aktivität, wenn es 30 Minuten lang auf 60 °C erhitzt wird.

Der für den Serumfaktor auf die Fällungsreaktion ermittelte Beschleunigungseffekt ist ein Phänomen, das von der Konzentration des Serumfaktors im Reaktionsmedium abhängt. Tatsächlich ist die Menge an Serumfaktor, ausgedrückt in mg oder in Äquivalent ml Serum, das dem Inkubat zugesetzt werden muss, abhängig davon, um wieviel die Fällreaktion beschleunigt werden soll.

Manchmal kann ein Beschleunigungseffekt erzielt werden, selbst wenn unbehandeltes Serum verwendet wird.

In diesem Fall stören jedoch andere Nebenreaktionen die Bestimmung und machen die Verwendung von unbehandeltem Serum nicht wünschenswert.

Im folgenden werden anhand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert. Sie werden unter Verwendung von RIA zur Bestimmung von menschlichem follikelstimulierendem Hormon (hFSH) ausgeführt. Wahlweise können andere RIA-Modelle verwendet werden, wobei ähnliche Resultate erhalten werden.

Beispiel

Es folgt eine allgemeine Ausführungsart für die Beispiele l(a), l(b), l(c) und l(d).

Zur Bildung des Immunkomplexes (erste Reaktion) wird das folgende Operationsschema angewendet:

0,2 ml Anti-hFSH, erzeugt in Kaninchen, im Verdünnungsverhältnis 1 : 200 000 wurden mit 0,1 ml, äquivalent zu 0,8 ng, und 1-125 eingestelltem menschlichen FSH (spezifische Radioaktivität 5,5 • 109 ■ S_1ng = 150 Microcurie per Microgramm) umgesetzt. Nach Erreichung des Gleichgewichtszustands (nach 24 Stunden) wurde der Immunkomplex Anti-hFSH-I-125-hFSH unlöslich gemacht, indem zum

Raktionsmedium 0,1 ml Kaninchen-Anti-Gammaglobulin-serum, erzeugt in Schafen, zugegeben wurde und im Verhältnis 1 : 300 verdünnt wurde (Ausfällung von Anti-Serum). Diese Operation wurde auf folgende vier verschiedene Wege 5 ausgeführt, um eindeutige Beispiele für die Erfindung zu liefern.

Vergleichsbeispiel l(a)

Herkömmlicher Weg Am Ende der ersten Reaktion wurden lediglich 0,1 ml io des fällenden Anti-Serums zugegeben. Das Maximum der Ausfällung wurde nach 24 Stunden Umsetzung erhalten.

Beispiel l(b)

Gemäss vorliegender Erfindung 15 Am Ende der ersten Reaktion wurde Serumfaktor in einer Menge äquivalent zu 0,01 mi menschlichem Serum zugegeben, sowie das fällende Anti-Serum. Das Maximum der Ausfällung wurde nach 15 Stunden Reaktion erhalten.

20 Beispiel l(c)

Gemäss vorliegender Erfindung Am Ende der ersten Reaktion wurden zusätzlich zu dem fällenden Anti-Serum Serumfaktor in einer Menge äquivalent zu 0,05 ml menschlichem Serum zugegeben. Hauptaus-25 fällung wurde nach 4 Stunden Umsetzung erhalten.

Beispiel l(d)

Gemäss vorliegender Erfindung Am Ende der ersten Reaktion wurde zusätzlich zu dem 30 fällenden Anti-Serum Serumfaktor in einer Menge äquivalent zu 0,10 ml menschlichem Serum zugegeben. Das Maximum der Fällung wurde nach 1 Stunde Umsetzung erhalten.

Analoge Ergebnisse wurden erzielt, wenn ein Serumfaktor verwendet wurde, der in anderen Tierarten, die oben an-35 gegeben sind, erzeugt wurde.

Ausserdem wurde experimentell festgestellt, dass die Fällreaktion des Immunkomplexes beschleunigt wird, selbst wenn der Serumfaktor zu dem Reaktionsmedium zugesetzt wird, das den Immunkomplex enthält, bevor die erste Reak-40 tion den Gleichgewichtszustand erreicht hat.

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Claims

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1. Verfahren zur Gewinnung eines Serumfaktors zur Beschleunigung der Ausfällung des Immunkomplexes bei Ra-dioimmunbestimmungsmethoden durch Extraktion mittels Dialyse aus einem tierischen Serum oder Anti-Serum, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum oder Anti-Serum gegen ständig gerührtes destilliertes Wasser dialysiert wird, das erhaltene Produkt zentrifugiert und der Feststoff mit destilliertem Wasser gewaschen, in einer Pufferlösung gelöst und dann gefriergetrocknet wird.

2. Verwendung des nach dem Verfahren nach Anspruch 1 hergestellten Serumfaktors für Radioimmunbestimmungs-methoden, dadurch gekennzeichnet, dass die Fällungsreaktion des Immunkomplexes durch Zugabe eines durch Dialyse aus einem tierischen Serum oder Anti-Serum gewonnenen Serumfaktors beschleunigt wird.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verwendung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Serumfaktor dem gleichen Reaktionsmedium zugesetzt wird, in dem der Immunkomplex vorhanden ist.

4. Verwendung gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Serumfaktor in einer Menge im Bereich von 0,01 bis 0,1 Äquivalent-Milliliter Serum oder Anti-Se-rum zugesetzt wird, wobei grössere Mengen an Serumfaktor kürzere Ausfällzeiten erzielen.