DE3028977A1

DE3028977A1 - Verfahren zur ausstellung von antikoerperserum mit erhoehter agglutinationsaktivitaet

Info

Publication number: DE3028977A1
Application number: DE19803028977
Authority: DE
Inventors: William A. Spring Tex. Broach; David E. Houston Tex. Hatcher
Original assignee: Gamma Biologicals Inc
Current assignee: Gamma Biologicals Inc
Priority date: 1979-12-26
Filing date: 1980-07-30
Publication date: 1981-07-02
Also published as: GB2066259B; AU6071780A; ES8106834A1; ES495177A0; IT8049473A0; GB2066259A; NZ194363A; JPS5694267A

Description

Beschreibung

Im menschlichen Blut wurden über dreihundert unterschiedliche Blutgruppenantigene identifiziert..Nicht alle dieser Antigene treten im Blut der meisten Menschen auf. Abhängig von einer Reihe von Faktoren, von denen einige bekannt und einige unbekannt sind, wird eine Kombination solcher Antigene im Blut jedes Individuums festgestellt. Wird daher das Blut eines Individuums in den Kreislauf eines anderen eingeführt, wie z.B. bei der Transfusion oder bei der Schwangerschaft, bestehen Chancen, daß das Blut des Spen~ ders ein oder mehrere Antigene enthält, die in den roten Zellen des Empfängers nicht vorhanden sind. Wenn dies der Fall ist, kann der Immunmechanismus des Empfängers auf die Anwesenheit dieser fremden Antigene ansprechen, indem in dem Empfänger Antikörper gebildet werden. Abhängig von der Zahl und den Eigenschaften der spezifischen, entsprechenden Antigene, wird die Anwesenheit dieser Antikörper im Blutserum des Empfängers Wirkungen mit sich bringen, die sehr ernst sein können und die analysiert werden müssen und bei nachfolgenden Transfusionen oder Schwangerschaften beachtet werden müssen.

Um ein potentiell nachteiliges Immunansprechen zu vermeiden oder mindestens gering zu halten, wurden Systeme und Verfahren entwickelt, um Blut zu typisieren und vor der Transfusion das Blut des Spenders und des Empfängers so abzustimmen, daß die beiden Blutsorten zueinander passen. Die Identifizierung im Labor der meisten klinisch signifikanten Antigene auf die roten Blutzellen wird typischerweise unter Verwendung im Handel erhältlicher "Anti-Seren" durchgeführt, d.h. von Blutseren, die bekannte Antikörper enthalten. Die Anwesenheit jedes der relevanten Antigene wird bestimmt, indem man die roten Blutzellen, die typisiert werden sollen, mit dem erforderlichen Antiserum mit-

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tels spezifischer Testverfahren testet. Die Agglutination der roten Blutzellen, die geprüft werden, bedeutet einen positiven Test und zeigt an, daß das Antigen, das dem verwendeten Antiserum entspricht, vorhanden ist, während keine Agglutination einen negativen Test bedeutet und anzeigt, daß das entsprechende Antigen nicht vorhanden ist. Die Agglutination findet statt durch die Bindung der roten Blutzellen als Ergebnis des Antikörpers in dem Antiserum, das sich mit den Antigenen an zwei oder mehreren Blutzellen verbindet.

Antikörper zeichnen sich dadurch aus, daß sie "vollständig" oder "unvollständig" sind, abhängig davon, ob sie die Eigenschaft aufweisen,eine Agglutination der roten Blutzellen in Salzlösung zu ergeben, oder nicht. Antikörper, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind, können in beiden Formen auftreten, normalerweise in unterschiedlichen Verhältnissen, abhängig von dem Individuum. Es gibt derzeit keinen lieg vorherzusagen, bevor das Individuum einem besonderen Antigen ausgesetzt wird, ob und in welchem Ausmaß die Antikörper, die von dem Individuum in Ansprechen auf das Antigen gebildet werden, eine Agglutination bewirken. Im allgemeinen werden mehr "unvollständige" als "vollständige" Antikörper erzeugt. Die technischen Lieferanten spezifischer Antiseren können das Antikörperserum verschiedener unterschiedlicher Spender zusammen vereinigen, um ein Antiserum mit geeigneter Agglutinationsqualität herzustellen (bestimmt durch eine kombinierte Betrachtung der Aktivität, d. h. der Bindungsaktivität des spezifischen Antikörpers und des Titers, d.h. der Potenz).

Antikörper werden weiterhin klassifiziert entsprechend der Natur des Immunoglobulinproteinmoleküls, welches den Antikörper ergibt; das IgM-Molekül ist das, welches natürlich "vollständigen" Antikörper enthält, und das IgG-Molekül enthält den "unvollständigen" Antikörper. Man nimmt im all-

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gemeinen an, daß die beiden Immunoglobulinmoleküle aus ähnlichen Grundpolypeptiden hergestellt sind, der wesentliche Unterschied ist der, daß, im Gegensatz zu IgM, das IgG-Molekül nicht groß genug ist, um eine ■Verbindungsbrücke zwischen den antigentragenden roten Blutzellen in Salzsuspension zu bilden. Antiseren, die von IgG-Antikörpern erzeugt werden, erfordern eine Verdünnung in einer hohen Proteinlösung, die makromolekulare Additive enthält, was sje für eine falsche positive Agglutination in bestimmten Fällen, wie es im folgenden näher erläutert wird, anfällig macht.

Weitere Untersuchungen haben bestätigt, daß die IgG-MoIeküle tatsächlich aus vier Polypeptidketten zusammengesetzt sind, einem Paar sog. "leichter" Ketten und einem Paar sog. "schwerer" Ketten, die als Moleküleinheit durch Disulfidbindungen und nicht-kovalente Zwischenwirkungen zusammengehalten werden, wie es in Fig. 1 der Zeichnungen dargestellt ist. An den beiden "Fab"-Teilen der Moleküle treten die spezifischen Antigenbindungsstellen auf, während der "Fc"-Teil keine Antigenbindungsstellen enthält. Man nimmt weiterhin an, daß, obgleich die beiden Antigenbindungsteile des IgG-Moleküls voneinander getrennt sind (sie sind nur über die Disulfidbindung verbunden, welche .-ie beiden Ketten verbindet), die Fc miteinander an einer zweiten Stelle verbunden sind, die in Fig. 1 als Linie 2-2» dargestellt ist.

Es wurde weiterhin postuliert und in der Literatur beschrieben, daß bei bestimmten Reduktionsbedingungen die Disulfidbindung, die die Polypeptidketten verbindet, gebrochen werden kann, ohne daß die Intraketten-Disulfidbindungen und die nicht-kovalenten Zwischenwirkungen zwischen den Fragmenten, die den Fc-Teil enthalten, wesentlich beeinflußt werden. Bei solchen Bedingungen nimmt man an, daß, wie in

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Fig. 2 gezeigt ist, die beiden Fab-Teile sich auseinanderbewegen, während die Fragmente des Fc-Teils bei der Linie. 2-2' verbunden bleiben. Man nimmt an, daß die Moleküle eine Spanne zwischen den beiden Antigenbindungsstellen bilden-_f die lang genug ist, daß eine interzellulare Brücke gebildet wird. Die Bildung dieser interzellularen Brücken beseitigt die gegenseitigen Abstoßkräfte zwischen den roten Zellen, in Salzsuspension und eine Agglutination findet statt. Das so gebildete, modifizierte IgG-Molekül funktioniert in der Tat als "vollständiger" Antikörper.

In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine Darstellung der physikalischen Struktur eines IgG-Moleküls, wie es natürlich vorkommt. Durch die Darstellung soll der unterschiedliche Charakter der verschiedenen Teile der Polypeptidketten, die das Molekül ergeben, erläutert werden und es soll gezeigt werden, wie dieee Ketten miteinander verbunden sind; und

Fig. 2 eine Darstellung des gleichen IgG-Moleküls, wie es in Fig. 1 erläutert wurde, jedoch nachdem es der Reduktionsbehandlung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen worden ist.

Erfindungsgemäß wird Blutserum, das Antikörper enthält, die spezifisch sind auf ein besonderes Humanblutgruppen-Antigen, zuerst zur Entfernung und Erhaltung irgendeines IgM-Antikörpers behandelt. Dabei bleibt eine Lösung zurück, die nur IgG-Antikörper enthält. Diese Lösung wird dann milden Reduktionsbedingungen unterworfen, die ausreichen, die Disulfidbindung zwischen den Polypeptidketten des IgG-Moleküls zu spalten, während gleichzeitig sie nicht ausreichen, um andere Teile des Moleküls wesentlich zu reduzieren. Diese Reaktion ist leicht reversibel, bedingt durch Reoxidation. Daher muß das modifizierte Molekül "fixiert" werden, um eine Reoxidation im wesentlichen

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zu verhindern. Dies kann zweckdienlich durchgeführt werden, indem man die Lösung, die das modifizierte Molekül . enthält, mit einem Alkylierungsmittel, wie Jodessigsäure oder Jodacetamid, behandelt.. In der Praxis kann man irgendeine Verbindung, die mit den Sulfhydrilgruppen, die bei dem Reduktionsverfahren gebildet werden, reagieren und die selbst bei den Bindungen, unter denen das modifizierte Proteinmolekül anschließend behandelt und/oder gelagert wird, nicht oxidiert wird, verwenden.

Nach der Fixierstufe werden irgendwelche Reduktions- und Fixiermittel aus der Lösung, die das modifizierte IgG-Molekül enthält, nach einem geeigneten, an sich bekannten Verfahren entfernt. Die Lösung wird anschließend mit der IgM-Fraktion, die man zuvor entfernt hatte und aufbewahrt hatte, vereinigt. Das Gesamtprotein und der Salzgehalt werden eingestellt, um sicherzustellen, daß das Antikörperserum eine geeignete Reaktionsfähigkeit und Potenz besitzt.

Wie es offensichtlich ist, ist das kritische Verfahren bei dem oben beschriebenen Verfahren die tatsächliche Reduktionsstufe. Der Ausdruck "milde Reduktionsbedingungen'¹ bedeutet irgendwelche Bedingungen, die bewirken, daß die Zwischenketten-Disulfidbindungen, die die Polypeptidketten des IgG-Moleküls verbinden, auseinandergespalten werden. Gleichzeitig müssen die Reduktionsbedingungen so gewählt werden, daß die verbleibenden Teile des Moleküls im wesentlichen nicht angegriffen werden. Insbesondere ist es wichtig festzustellen, daß, wenn die Reduktionsbedingungen zu stark sind, die Spezifizität des Antikörpers gegenüber dem gewünschten Antigen verlorengehen kann. Die Reduktionsbedingungen werden durch solche Faktoren, wie das Reduktionsmittel selbst, den pH-Wert des Systems, die Konzentration der Reaktionsteilnehmer und die Zeit der Einwirkung der Reduktionsbedingungen, beeinflußt.

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Irgendein chemisches Verfahren, das als Endzweck die Modifizierung einer Antikörperproteinstruktur ohne Änderung der Antikörperaktivität und Spezifizität des Proteinmoleküls hat, muß mit extremer Sorgfalt durchgeführt werden. Daher muß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die vollständige Antikörperfraktion von dem Serum entfernt werden, bevor die Serumlösung den Reduktionsbedingungen unterworfen wird. Irgendwelche IgM-Moleküle, die in der Lösung verbleiben, werden bei dem empfohlenen Verfahren reduziert und als Folge werden ihre Aktivität und Spezifizität nachteilig beeinflußt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Zusammensetzungen besitzen eine Agglutinationsaktivität, die man in der Vergangenheit nur unter Verwendung eines Hochproteinverdünnungsmittels, das bestimmte makromolekulare Substanzen zur Beschleunigung der Agglutination enthält, erreicht hat- Die modifizierten IgG-Immunoglobulinmoleküle verhalten sich im wesentlichen in ihrer Agglutinationsaktivität wie IgM-Moleküle. Die Agglutinationsqualitat eines spezifischen Antiserums kann so wesentlich erhöht werden. Da kein Hochproteinverdünnungsmittel oder eine andere makromolekulare Substanz erforderlich ist, um die gewünschte Agglutinationsaktivität zu ergeben, verstärken die zusammengesetzten erfindungsgemäßen Seren nicht die spontante Agglutination von mit Immunoglobulin beschichteten roten Blutzellen (wie sie häufig in bestimmten Krankheitszuständen gefunden werden). Sie haben weiterhin gegenüber Reagentien, die aus Seren hergestellt wurden, die nur native IgM-Antikörper enthalten, den Vorteil, daß sie eine makroskopische Agglutination von antigen-positiven Zellen ohne verlängerte Inkubation ergeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei Antiseren gegenüber vielen humanen Blutgruppenantigenen durchgeführt werden. Insbesondere wurden Blutgruppierungsseren hergestellt, die

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spezifisch sind gegenüber den Rh-Antigenen D, C, E, c, e, CD, DE iind CDE und gegenüber anderen Blutgruppen-Antigenen, wie Kell, Fy^a und S.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Blutgruppenseren, die die direkte Agglutination von menschlichen Erythrocyten in Salzlösung ergeben, hergestellt. Die direkte Hämagglutination ist mit den erfindungsgemäßen Zusammens et zungen durchführbar.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können aus dem Serum eines einzigen Spenders hergestellt werden, von dem bekannt ist, daß er spezifische Antikörper besitzt, oder sie können aus gesammeltem Serum verschiedener Spender hergestellt werden. Die Konzentration an IgG-Molekülen im Serum kann nach an sich bekannten Verfahren bestimmt werden, z.B. durch einfache radiale Immunodiffusion. Die IgG-Praktion und die IgM-Fraktion werden zuerst getrennt. Dies kann ebenfalls gemäß Verfahren erfolgen, die routinemäßig auf diesem Gebiet üblich sind und typischerweise eine partiale Verarmung bewirken, wie durch Zentrifugieren nach Durchführung eines Verfahrens, gemäß dem die schweren Molekülteile präzipitiert worden sind. Bei einem Verfahren kann die Fraktionierung und Präzipitation v. archgef ührt werden, indem man das Serum mit Ammoniumsulfat behandelt und anschließend eine Anionenaustauschchromatographie mit Wahtman DE-52 Cellulose durchführt. Bei einem anderen Verfahren wird das rohe Serum in einen Dialyseschlauch gegeben, der seinerseits in einen Überschuß an entionisiertem Wasser eingetaucht wird. Die Dialyse bewirkt, daß der Salzgehalt des Serums auf den Wert fällt, wo das IgM-MoIekül nicht langer löslich ist. Nach Erreichen dieses Wertes erfolgt eine Zentrifugierung, wodurch das ausgefällte IgM aus dem löslichen IgG abgetrennt werden kann.

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Reduktionsmittel

Man kann irgendwelche der milderen Reduktionsmittel, von denen bekannt ist, daß sie die S-S-Bindung in Polypeptidmolekülen spalten, ohne daß sie eine starke Affinität für andere Bindungen und Zwischenkettenbindungen aufweisen, verwenden. Beispiele geeigneter Reduktionsmittel sind 2-Mercaptoäthanol, Cystein, Dithiothreit (DTT, auch als Cleland's Reagens bekannt), Dithioerythrit (DTE) und Mercaptoäthylamin. Bevorzugt wird DTT verwendet, da es eine geringere Neigung besitzt, eine "Überreduktion" zu ergeben, und somit leichter eine kontrollierte milde Reduktion ermöglicht.

Konzentration

Im allgemeinen wird der annehmbare Konzentrationsbereich des Reduktionsmittels von der Art des Reduktionsmittels und in gewissem Ausmaß von der besonderen Natur des zu reduzierenden IgG-Moleküls abhängen. Zu allen Zeiten wird die kritische Determinante die Erzeugung der kontrollierten Reduktionsbedingungen sein, die die gewünschte Spaltung ergeben, ohne daß die Aktivität und die Spezifizität des Antikörpers· beeinflußt werden. Es wurde gefunden, daß sowohl für DTT als auch für DTE eine Konzentration im Bereich von 0,5 bis 1,0 g/l recht annehmbar ist.

Um eine Modifizierung der Spezifizität des Antikörpers mit irgendeinem der erwähnten Reduktionsmittel zu vermeiden, wurde gefunden, daß eine besondere Aufmerksamkeit darauf verwandt werden muß, einen geeigneten pH-Wert in der Lösung aufrechtzuerhalten. Der bevorzugte Bereich für den pH-Wert wird zwischen etwa 7,8 und etwa 8,3 liegen. Die Verwendung eines Puffers wird zur Stabilisierung des pH-Wertes innerhalb dieses Bereichs empfohlen. Ein besonders bevorzugter Puffer ist der als Tris bekannte, der im Handel als Gemisch aus Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid und Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan erhältlich ist.

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Reaktionszeit

Ein wesentlicher Faktor für die Aufstellung geeigneter milder Reduktionsbedingungen umfaßt die Art und Zeit der Einwirkung des Reduktionsmittels auf die Lösung. Im allgemeinen wird die Zeit der Einwirkung, die erforderlich ist, um die gewünschte Spaltung zu bewirken, umso langer sein, je niedriger die Konzentration ist. Wird das Reduktionsmittel direkt zu der Lösung zugegeben, sollte die Lösung gut gerührt werden und anschließend während einer geeigneten Zeit bei Zimmertemperatur stehengelassen werden. Alternativ können höhere Konzentrationen an Reduktionsmittel langsam zu der Lösung unter konstantem Rühren und/oder konstantem Durchblasen von Stickstoff durch die Lösung zugegeben werden. Es wurde weiterhin gefunden, daß es annehmbar ist, die Lösung gegenüber einem größeren Volumen einer das Reduktionsmittel enthaltenden Lösung zu dialysieren.

Anhand der Fig. 1 und 2 der Zeichnungen wird eine schematische Darstellung des hypothetischen Extrems in Segmentflexibilität in einem IgG-Antikörper vor (Fig. 1) und nach (Fig. 2) milder Reduktion dargestellt. Das Antikörpermolekül ist so dargestellt, daß es zwei Disulfidbindungen enthält (welche typischerweise CYS 226 un£ CYS 229 sind). Die Antigen-Bindungsbereiche des Moleküls sind als Fab (Antigen-Bindungsfragment) bezeichnet, von denen jedes über eine flexible "Gelenk"-Disulfidbindung an ein Fc(kristallines) -Fragment gebunden ist. Das kristalline Fragment seinerseits enthält zwei ausgeprägte Domänen, die ungefähr gleich in Größe- und Form sind. Die beiden unteren Domänen sind, wie gezeigt, an der Linie 2-2^! unter Bildung eines Dimeren mit starker gegenseitiger Beeinflussung verbunden, welches, wie gezeigt wurde, bei der milden Reduktion unverändert verbleibt. Die oberen Domänen des kristallinen Fragments sind glycosylierte Peptide und zeigen daher keine starken gegenseitigen Zwischenwirkungen. Sie

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sind über die doppelte Disulfidbindung, wie dargestellt, verbunden, welche bei der milden Reduktion längs der Linie 1-1 · leicht gespalten wird. Offensichtlich erlauben die verbleibenden Bindungen eine ausreichende Flexibilität nach der milden Reduktion, so daß die Fab-Bereiche und die oberen Domänen der kristallinen Fragmente die in Fig. 2 dargestellte Stellung einnehmen können.

Die Zwischenketten-Disulfidbindungen wurden chemisch unter Bildung von Sulfhydrilgruppen reduziert, wobei jedes Schwefelatom sich mit einem Wasserstoffatom verbunden hat. Diese Reaktion ist jedoch leicht reversibel und tritt.beispielsweise fast sofort nach der Dialyse auf. Nach der milden Reduktion muß das in Fig. 2 dargestellte modifizierte Molekül "fixiert" werden, indem man die Wasserstoffatome der Sulfhydrilgruppen durch chemische Gruppen ersetzt, die nicht leicht oxidiert werden. Ein geeignetes Verfahren wird als "Alkylierung" bezeichnet, bei der der Sulfhydrilwasc^rstoff durch eine niedrige Alkylgruppe ersetzt wird. Das bevorzugte Alkylierungsmittel ist entweder Jodessigsäure oder Jodacetamid. Es ist leicht erkennbar, daß irgendeines der Reagentien, das die Wiederbildung der Disulfidbindung wirksam verhindert, ohne die Antikörper-Aktivität oder -Spezifizität zu ändern, das gewünschte Endergebnis ergibt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiele 1 bis 3

Das erfindungsgemäße Verfahren wird verwendet, um verschiedene "unvollständige" Anti-D-Präparationen zu reduzieren, um einen modifizierten Antikörper herzustellen, der eine direkte Agglutination von D-positiven roten Blutzellen in einer Salzlösung ergibt.

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Ein Pool von 150 ml Anti-D-Serum wird erhalten und in drei getrennte, grob gleiche Teile geteilt. Diese werden wie folgt behandelt;

(1) 40 ml des Rohserums werden in einem 35 mm Dialyseschlauch 7 h bei Zimmertemperatur gegenüber 2 1 entionisiertem Wasser dialysiert. Nach 7 h zeigt das Serum ein Volumen von 46 inl und ißt etwas trübe. Dieses Volumen wird 30 min bei 2000 U/min zentrifugiert, um das unlösliche Material zu präzipitieren, welches dann entfernt und in Salzlösung erneut gelöst wird. Das verbleibende Serum von der Dialyse besitzt jetzt ein Volumen von etwas unter 46 ml und wird mit einem gleichen Volumen einer 0,01 M Lösung von DTT (Dithiothreit) in einem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer (0,1 M) bei pH 8,2 vermischt. Dieses Gemisch wird 1 h bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dann werden 0,425 g kristallines Jodacetamid bis zu einer Endkonzentration von 25 mMol zugegeben. Das Gemisch wird dann kurz gerührt, um das Jodacetamid zu lösen, und anschließend wird es 1 h in der Dunkelheit stehengelassen. Danach wird die Lösung in ein 35 mm Dialysegehäuse gegeben und über Nacht bei Zimmertemperatur in Anwesenheit eines großen Überschusses an 0,05 M Tris-Puffer bei pH 7,8 und 0,15 M NaGl dialysiert. Man gewinnt 86 ml Lösung. Dazu gibt man die Salzlösung, die man durch Auflösen des Niederschlags von der ersten Dialysestufe erhält. Die Anti-D-Aktivität gegenüber D-positiven roten Zellen in Salzlösung der Lösung hat sich wesentlich erhöht gegenüber der Aktivität, die vor der Behandlung gemessen wurde.

(2) Ein zweiter Teil, der 50 ml des Serumpools enthält, wird mit 50 ml 0,01 M DTT in 0,1 M Tris bei pH 8,2 vermischt. Das Gemisch wird 1 h bei Zimmertemperatur stehengelassen. Danach werden 0,462 g kristallines Jodacetamid zugegeben und unter konstantem Rühren gelöst. Diese Lösung wird ihrerseits 1 h bei Zimmertemperatur stehenge-

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lassen und dann in ein 35 mm Dialysegehäuse gegeben lind über Nacht bei Zimmertemperatur gegenüber 3,5 1 einer Pufferlösung aus 0,15 M NaCl und 0,05 M Tris bei pH 7,8 dialysiert. Das gewonnene Volumen beträgt 94 ml und wird untersucht, um zu zeigen, daß es eine Hämagglutinationsaktivität äquivalent einem IgM-Titer, der wesentlich höher ist, besitzt.

(3) Der letzte 50 ml Teil des Serumpools wird mit 50 ml Kaliumphosphatpuffer (Ionenstärke =0,1) bei pH 7,0 vermischt. Unter Rühren bei Zimmertemperatur werden 43 ml einer 50%igen Polyäthylenglykol 4000-Lösung zugegeben, um die PEG- Konzentration auf 15% einzustellen. Das entstehende Gemisch wird 30 min gerührt. Während dieser Zeit bildet sich ein Niederschlag. Dieser wird wie im obigen Beispiel 1 durch Zentrifugieren gesammelt. Der Niederschlag wird dann erneut in 50 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung aufgelöst. Die Überstehende Lösung wird gegenüber 3»5 1 einer 0,15 M NaCl-Lösung bei Zimmertemperatur dialysiert. Nach der Dialyse über Nacht wird die Lösung zentrifugiert, um eine geringe Menge an unlöslichem Material zu entfernen. Man erhält ein Endvolumen von etwa 55 ml. Eine BiuretproteinBestimmung zeigt, daß die Lösung etwa 15 mg Protein/ml enthält. Zu 50 ml dieser Lösung gibt man 77,2 mg festes» kristallines DTT; man erhält eine DTT-Konzentration gleich zu 10 mMol. Um eine vollständige Lösung sicherzustellen, wird gerührt. Das Gemisch wird dann 1 h bei Zimmertemperatur stehengelassen. Danach werden 0,231 g festes Jodacetamid zugegeben und nach dem Auflösen wird das Gemisch 1 h ungestört bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das reduzierte, alkylierte Protein wird dann in ein Dialysegehäuse überführt und über Nacht gegenüber 0,15 M NaCl-Lösung, gepuffert auf 7,8 mit 0,05 M Tris, dialysiert. Man gewinnt 46 ml Lösung. Diese Lösung zeigt eine bemerkenswerte

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Anti-D-Aktivität in Salzlösung bei dem direkten Agglutinationstest.

Gemäß den oben beschriebenen Verfahren werden reduzierte und modifizierte IgG-Antikörper hergestellt, die spezifisch gegenüber Blutgruppenantigenen D, C, E, c, e, CD, DE, CDE, Kell, Fy^a und S sind. Das erfindungsgemäße Verfahren · erlaubt die leichte Herstellung von annehmbaren Antiseren, die spezifisch sind für irgendeines der Blutgruppenantigene.

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Zusammenfassung

Die Erfindung betrifft ein Blutgruppenserum, das Antikörper enthält, welche gegenüber Antigenen des menschlichen Bluts spezifisch sind und die eine erhöhte Aktivität bei der direkten Agglutination von roten Blutzellen aufweisen, onne daß die spontane Agglutination von mit Immunoglobulin beschichteten Zellen verstärkt ist. Das Serum wird hergestellt, indem man das Gesamtserum oder eine Fraktion, die IgG-Antikörper enthält, gemäß einem Verfahren behandelt, bei dem die Zwischenketten-Disulfidbindungen, die die Polypeptidketten der IgG-Moleküle verbinden, reduziert werden, das bewirkt, daß die Ketten die Fähigkeit erlangen, eine Agglutination der roten Blutzellen, die Antigene besitzen, die die Affinität aufweisen, die Stellen von IgG zu verbinden, zu bewirken. Die so gebildeten modifizierten IgG-Moleküle verhalten sich im wesentlichen in ihren Eigenschaften wie-IgM-Moleküle, die die roten Blutzellen in einem Salzmedium direkt agglutinieren. Bei dem beschriebenen Verfahren muß zu Beginn eine Trennung von IgM und IgG erfolgen, und nach der Reduktion müssen diese Antikörper wieder vereinigt werden.

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Claims

PAT E N TA NW/* L r r A. GRÜNECKER DlH-INa H. KINKELDEY or-inq W. STOCKMAIR Dft.INO, - Λ»Ε ICWTEO* K. SCHUMANN ca reu n»t. ■ an. mva P. H. JAKOB G. BEZOLD 8 MÜNCHEN 22 MAXIMILIANSTFSASS« 4» P 15 307 30. Juli 1980 GAMA BIOLOGICALS, HTC. 3700 Mangum Road Houston, Texas 77092 U. S. A. Verfahren zur Herstellung von Antikörperserum mit erhöhter Agglutinationsaktivität Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Antikörperserums mit erhöhter Agglutinationsaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) die IgM-Immunoglobulinfraktion aus einem Serum, das IgG-Immunoglobulin in Lösung enthält, entfernt;

(b) die verbleibende Lösung, die IgG enthält, milden Reduktionsbedingungen unterwirft, die ausreichen, die Disulfidbindungen, die die Polypeptidketten der IgG-MoleküTe verbinden, zu spalten, ohne daß andere Teile des Moleküls wesentlich reduziert werden;

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TELEFON (08B) >ί

TELEX 08-39 360

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(c) das so reduzierte Molekül fixiert, um im wesentlichen eine Reoxidation und Wiederbildung der Disulfidbindungen zu vermeiden;

(d) irgendwelche Reduktions- und Fixiermittel aus der Lösung entfernt; und

(e) die Lösung mit der IgM-Fraktion, die bei der Stufe (a) entfernt wurde, vereinigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktionsbedingungen erzeugt werden, indem man eine ausreichende Menge eines geeigneten Reduktionsmittels in dem Serum löst und die so gebildete Lösung bei einem geeigneten pH-Wert während einer geeigneten Zeitdauer hält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reduktionsmittel aus der Gruppe 2-Mercaptoäthanol, Cystein, Dithiothreit, Dithioerythrit und Mercaptoäthylanin ausgewählt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierstufe durchgeführt wird, indem man die Lösung nach dem Reduktionsverfahren mit einem Alkylierungsmittel behandelt, das den Wasserstoff an der SuIfhydrilgruppe durch eine niedrige Alkylgrupj ^Q ersetzen kann.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkylierungsmittel aus der Gruppe Jodessigsäure und Jodacetamid ausgewählt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Serum in der Lage ist, eine direkte Agglutination in Salzsuspension der menschlichen Erythrocyten, die ein geeignetes spezifisches Blutgruppenantigen tragen, zu bewirken, dadurch gekennzeichnet, daß

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die IgM-Fraktion aus der Serumlösung entfernt wird, indem man das Serum, das sowohl IgG- als auch IgM-Immunoglobulin-Antikörper, die für das Antigen spezifisch sind, enthält, behandelt, um die IgG- und IgM-Fraktionen zu isolieren, die IgM-Fraktion abtrennt und in einer geeignet gepufferten Salzlösung auflöst;

die die IgG-Fraktion enthaltende Lösung milden Reduktionsbedingungen auf solche Weise unterwirft, daß die zwischenschweren Kettendisulfidbindungen reduziert und gespalten v/erden, daß aber die verbleibenden Bindungen und die Eigenschaften und die Spezifizität des Antikörpers im wesentlichen unverändert bleiben;

die erhaltenen, reduzierten IgG-Moleküle durch Behandlung mit einem Mittel fixiert, wobei das Mittel die Eigenschaft aufweist, daß es im wesentlichen eine Oxidation und Wiederbildung der gespaltenen Sulfidbindungen verhindert;

irgendwelche Reduktions- und Fixiermittel aus der entstehenden Serumlösung durch Dialyse entfernt; und

anschließend das reduzierte IgG-Moleküle enthaltende Dialysat mit der zuvor gebildeten Lösung aus IgM-Antikörpera vereinigt.

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