DE3442858C2 - Verfahren zur bestimmung eines menschlichen immunglobulins, das spezifisch ist fuer menschliche karzinome - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung eines menschlichen Immunglobulins, das spezifisch für menschliche Karzinome ist.

Bis jetzt existieren keine Verfahren oder Versuchsergebnisse, die in der Lage sind, die Anwesenheit von freiem tumorspezifischen Immunglobulinen in den Seren von krebskranken Patienten zu zeigen (s. z. B. K. Kapsopoulou-Dominos und F.A. Anderer "An approach to the routine estimation of circulating carcinoembryonic antigen immunocomplexes in patients with carcinomata of the gastrointestinal tract", Clin. Exp. Immunol. (1979), 37, 25-32).

Tatsächlich war es bekannt, daß das zum ersten Mal von P. Gold und S.O. Freedman ("Demonstration of tumor specific antigen in human carcinomata by tolerance and absorption technique", J. Exp. Med. 121, 439-462, 1965) beschriebene carcino-embryonale Antigen (CEA) als ein funktioneller Indikator zur Überwachung der postoperativen Behandlung von Patienten mit Magendarmkrebs verwendet wurde, während seine Verwendung sich als wenig nützlich in der frühen Diagnose und im allgemeinen in der Diagnose von einfachen Krebstumoren in Abwesenheit von Metastasen erwies. Nachfolgend bildete das Problem der Induktion der Immunglobulinbildung (Antikörper, spezifischer Proteine), die spezifisch für einen bestimmten Tumor bezüglich CEA bei Patienten mit CEA-absondernden Karzinomen sind, den Gegenstand langwierigen Experimentierens, obgleich dessen Ergebnisse nicht ausreichend waren, eine zufriedenstellende Antwort zu diesem Problem zu geben. Insbesondere sind verschiedene Versuche bekannt (Lo Gerfo P., Herter F.P. und Bennett S.J. (1972): "Absence of circulating antibodies to carciembryonic antigen in patients with gastrointestinal malignancies", Int. J. Cancer 9, 344-348; E. Collatz, S. von Kleist und P. Burtin (1971): "Further investigations of circulating antibodies in colon cancer patients: on the autoantigenicity of the carinoembryonic antigen", Int. J. Cancer 8, 298-303), die die Anwesenheit von spezifischen Anti-CEA-Antikörpern im Serum von Patienten mit Karzinomen zeigen sollten, jedoch waren solche Versuche völlig erfolglos.

Im Jahre 1972 (J.M. Gold, S.O. Freedman und P. Gold (1972): "Human AntiCEA antibodies detected by radioimmunoassay", Nature, New Biology 239, 60-62) wurde die Anwesenheit von Immunglobulinen der Klasse IgM durch Radioimmunelektrophorese in Seren einiger Patienten gezeigt, die fähig waren zur Bindung mit CEA. Jedoch wurde dieses Ergebnis von vielen anderen Autoren wiederlegt (s. insbesondere K. Kapsopoulou-Dominos, F.A. Anderer: Circulating carcinoembryonic antigen immunocomplexes in sera of patients with carcinomata of the gastointestinal tract", Clin. Exp. Immunol. (1978) 35, 190-195).

Die Veröffentlichung "Isolation of Tumor-Associated Immunoglobulins from Ascitic Fluid", R. Hill et al, British J. Cancer (1978) 38, 154-157, betrifft ein Verfahren zum Isolieren von Immunglobulin aus aszitischen Flüssigkeiten, um Tumorantigene im Patientenserum zu bestimmen.

In der Veröffentlichung "Measurement of Carcinoembryonic Antigen", M. Fleisher et al, Clinical Chemistry, Vol. 19, No. 10, 1973, S. 1214-1220, werden verschiedene Verfahren zur Aufbereitung von CEA-Antigen und von Antiserum beschrieben.

Die Existenz einer schwachen und nicht spezifischen Bindung zwischen den IgMs in den Seren einiger Patienten und den radioaktiv markierten CEA (¹²⁵J-CEA) wurde auch nachgewiesen (J.M. MacSween: "The antigenicity of circulating antibodies to carcinoembryonic antigen with gastrointestinal malignancies", Int. J. Cancer 1975, 15, 246-252).

Aus der US 43 48 376 ist ein Verfahren zum Lokalisieren und Diagnostizieren von CEA enthaltenden Tumoren durch photoelektrische Abtastung bekannt, bei dem radioaktiv markierte Antikörper zu dem CEA verwendet werden. Weiterhin wird ein Verfahren zur Tumortherapie unter Verwendung von radioaktiv markierten anti-CEA Antikörpern vorgeschlagen. Auch sind einige Publikationen bekannt (Gloria M. Mavligit und Sarah Stuckey: "Colorectal carcinoma, Evidence for circulating CEA-Anti-CEA complexes", Cancer 52, 146-149, 1983), die die Anwesenheit von CEA-Anti-CEA zirkulierenden Immunkomplexen anzeigen, in welchen die Immunglobuline als sowohl vom IgM-Typ als auch vom IgG-Typ angesehen werden.

Dieses Verfahren erlaubt die Bestimmung eines tumorspezifischen Immunglobulins, das bisher nicht bekannt war und im folgenden als Immunglobulin K bezeichnet wird, in menschlichen Seren von CEA-absondernden Karzinomträgern.

Zusätzlich kann die vorteilhafte Verwendung des Immunglobulins K als Indikator aus dem durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Ergebnis abgeleitet werden, wobei dieser Indikator von den Risiken anaphylaktischer Schocks frei ist und sowohl als Suchträger für Medikamente wie für die Lokalisierung des Tumorsitzes dienen kann.

Zum Erreichen dieser Ergebnisse wird ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen, welches von überraschender Art ist, da es wirksam auf der einleitenden Bemerkung basiert, daß, wenn ein für Tumore spezifisches Immunglobulin tatsächlich existiert, es im freien Zustand in den Seren von krebskranken Patienten in der Anfangsphase der Krankheit vorhanden sein muß. In dieser, wie bekannt, sind solche Seren negativ bei den üblichen Methoden der Bestimmung von CEA, wenn die Bindung der geringen Menge des Antigens, welches noch mit den spezifischen Immunglobulinen in der Form von Immunkomplexen vorhanden ist, der hohen Antikörper-Reaktion entspricht. Auf der Grundlage des bereits vorhandenen Wissens (GB-Patentanmeldung 8317022 des vorliegenden Anmelders) über die Anwesenheit von neuen antigenischen Determinaten bei Adenokarzinomen wurde beobachtet, daß das Immunglobulin K durch die üblichen immunchemischen Verfahren (Immunelektrophorese, Agar- Doppeldiffusion, Doppel-Antikörper-Radioimmunprüfung) unter Verwendung von menschlichen Anti-IgM-, Anti-IgG- und Anti-IgA-Seren (Behring Werke) nicht festgestellt werden konnte.

Wie bekannt ist, sind Ziegen-Antiseren (z. B. in Kaninchen usw. erzeugte Ziegen-Anti-Gammaglobulin-Seren) und zu einem geringeren Grad Meerschweinchen-Antiseren in der Lage, mit menschlichen Immunglobulinen zu reagieren (Zwischenarten-Kreuzreaktion), so daß, wenn Ziegen-Antiseren von einer Kreuzreaktivität für menschliches IgA, IgM und IgG durch Bioabsorption befreit sind, sie notwendigerweise die Fähigkeit zum Niederschlagen von Immunglobulin K behalten müssen, welches sich zuletzt im Ergebnis als menschlicher Antikörper zeigt, der nicht zu den bereits bekannten Klassen gehört und nur in Karzinomträger-Seren vorhanden ist. In diesem Zusammenhang wird erfindungsgemäß angenommen, daß der Niederschlag Immunglobulin K enthält.

Insbesondere wurde als Bestätigung des spezifischen Charakters von Immunglobulin K beobachtet, daß, wenn das Serum eines Patienten, welches positiv in bezug auf dieses Immunglobulin ist, mit dem Serum eines Patienten, welches positiv in bezug auf das zirkulierende CEA ist, inkubiert wird, das Serum des ersten Patienten jegliche Fähigkeit zum Binden von radioaktiv markiertem CEA verliert, und das gleiche geschieht ebenfalls, wenn das Serum des ersten Patienten mit aus Karzinomen extrahierten CEA inkubiert wird.

Demgemäß ist das Immunglobulin K in den Seren von Patienten im Anfangszustand der tumorigen Erkrankung vorhanden, wie bei an kontrollierbaren Brustkarzinomen durchgeführten Untersuchungen und nach einem chirurgischen Eingriff in vollständiger Abwesenheit tumoriger Zellen, die dasselbe erzeugt hatten mit einer Immunisierung des Organismus, festgestellt wurde, so daß offensichtlich ist, daß Immunglobulin K von außerordentlichem Nutzen sein kann als Indikator eines sehr frühen Tumors, unabhängig von der tumorigen Masse. Tatsächlich ist, wie bekannt ist, eine sehr niedrige Antigenkonzentration ausreichend, um eine sehr gute Antikörperreaktion zu ergeben, wohingegen, wie vorstehend erläutert ist, das Antigen als Indikator verwendet werden kann, gerade wenn seine Blutkonzentration sehr hoch ist (<9,5×10⁹ g/ml), d. h., wenn die tumorige Masse sehr groß ist. Darüber hinaus kann gemäß der vorliegenden Erfindung die Zugabe von Kaninchen-Antiserum-Antihuman- Immunglobulin K als Alternative erfolgen.

In jedem Fall, wenn der Niederschlag erfolgt ist und mit dem im Überschuß radioaktiv markierten zugefügten CEA verknüpftes Immunglobulin K zentrifugal getrennt wurde, bestätigt eine einfache Gammazählung die Isolierung sowie die Menge der neuen Antikörper, die in den Seren der Patienten vorhanden sind.

Daher ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung eines menschlichen Immunglobulins (K-Immunglobulin), das spezifisch für menschliche Karzonom-Antigene ist, zu entwickeln.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, das gekennzeichnet ist durch die folgenden Schritte:

• - die Inkubation des Serums eines krebskranken Patienten mit im Überschuß (50 000 cpm, 80 µCi/µg spezifischer Aktivität) radioaktiv markiertem CEA (¹²⁵J-CEA) für wenigstens 16 Stunden bei Raumtemperatur (erste Inkubation);
• - Zugabe von Ziegen-Anti-Gammaglobulin Antiserum, das befreit wurde von der Keuzreaktivität für menschliches IgA, IgG und IgM, und Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur (zweite Inkubation);
• - Zentrifugieren und Abgießen des Überstandes und Zählen des Niederschlages mit einem Gammazähler.

Vorzugsweise wird erfindungsgemäß ein Kaninchen-Antiserum verwendet. Wie bereits erwähnt wurde, können Immunglobulin von Kaninchen, Eseln, Pferden usw. gegen menschliche Immunglobuline spezifisch für das Karzinom ebenfalls als Alternative verwendet werden.

Beispielsweise wird Immunglobulin K aus den Seren zahlreicher Patienten herausgezogen, die positiv auf den radioimmunologischen Test reagierten, dieses Immunglobulin K ebenfalls weiterhin von anderen menschlichen Immunglobulinen durch verschiedene Verfahren wie Ionenaustausch, Molekularsiebtechniken oder durch Affinität und Bioabsorption gereinigt, und das so erhaltene Immunglobulin K für die Immunisierung von Kaninchen gemäß dem vorstehend erläuterten Verfahren verwendet (Antiziege).

Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert:

Reagenzien und ihre Zubereitung a) Kaninchen-Immunglobulin gegen Ziegen-Immunglobuline (Ziegenserum).

Ziegen-Immunglobuline werden dem allgemeinen Ziegenserum nach den üblichen Verfahren entzogen (Polyethylenglykol, Kaprylsäure usw.). 1 ml (2 mg/ml) dieses Extrakts wird mit Freunds-chem. Adjuvans (1 ml) alle zwei Wochen für die Dauer von zwei Monaten in ein Kaninchen injiziert. Immunglobuline werden dem Kaninchenserum entzogen (Polyethylenglykol), der Antiziegentiter wird durch die Radioimmunprüfung entsprechend den üblichen doppelten Antikörper-Verfahren, die seit zehn Jahren labortechnisch durchgeführt werden, geprüft.

b) Anti-Ziegen-Kreuzreaktion mit normalen menschlichen Immunglobulinen, Prüfung und Eliminierung der Kreuzreaktivität.

Mit den Techniken der Immunelektrophorese und der Agar- Doppeldiffusion zeigt das Ziegen-Antiserum seine Kreuzreaktion mit menschlichem IgA und IgG (es kann mit der IgM-Reaktion nicht erkannt werden). Das Ziegen-Antiserum fließt viele Male durch eine Bioabsorptionssäule (Affinitäts-Chromatographie-Verfahren) mit an Sepharose gebundenen IgA-, IgG-Immunglobulinen und, aus Gründen der Sicherheit, auch menschlichen IgM-Immunglobulinen. Nach diesem Reinigungsvorgang wird die Abwesenheit der Kreuzreaktion nach den vorstehend geschilderten Methoden geprüft. Die Kreuzreaktion ist auf diese Weise um durchschnittlich 30% zurückgegangen. Das so verarmte Serum behält seine Fähigkeit zur Reaktion mit den Ziegen- Immunglobulinen.

c) Kaninchenserum gegen Human-Immunglobuline. Anti- IgM Anti-IgA Anti-IgG-Serum.

Aus Gründen der Genauigkeit werden Seren der Behring- Werke verwendet, da sie als allgemein anerkannt für Prüfzwecke gelten.

d) Reines CEA-radioaktiv markiertes CEA. e) Bestimmung von menschlichen tumorspezifischen Immunglobulinen in den Seren von Karzinom-Patienten (der radioimmunologische Test).

Menschliches Serum in einer Menge von 0,1 bis 0,5 ml wird mit 0,1 ml ¹²⁵J-CEA (entsprechend 50 000 cpm) in einer 0,05 m phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) und 0,1% Rinderalbumin bei einem pH-Wert von 7,4 für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der ersten Inkubation (zwischen dem nachzuweisenden Immunglobulin K und dem radioaktiv markierten Tumor-Antigen) werden 0,1 ml von 1/10 Antiziegen-Serum oder Anti- Immunglobulin hinzugefügt (dies bewirkt den Niederschlag der Immunkomplexe, die zwischen dem Immunglobulin K und dem ¹²⁵J-CEA gebildet werden); dann wird die Masse für 15 Minuten bei 4000×g zentrifugiert. Der Überstand wird abgegossen. Der so isolierte Niederschlag wird mit einem Gammazähler gezählt. Der mit negativen Seren gebildete Niederschlag war niemals höher als 1000 cpm, während positive Seren Radioaktivitätswerte von 1500 bis zu 32 000 cpm ergaben. Wenn der Niederschlag sehr hohe derartige Werte zeigt, kann das Patientenserum verdünnt werden.

f) Immunglobulin K wird dahingehend geprüft, daß es nicht IgA-, IgM- oder IgG-Immunglobulin ist.

Wenn das Antiziegen-Serum durch ein Antiziegen-Serum ersetzt wird, das gemäß dem vorbeschriebenen Verfahren verarmt wurde, sind die mit positiven Seren erhaltenen Ergebnisse die gleichen.

Wenn das Antiziegen-Serum ersetzt wird durch menschliches Anti-IgA, Anti-IgM oder Anti-IgG, d. h. durch gegen menschliches IgA-, IgM- und IgG-Immunglobuline erhaltene Antiseren (im Kaninchen, Esel usw.), wird kein Niederschlag erhalten.

g) Immunglobulin vom K-Typ wird als spezifisch nachgewiesen.

Wenn ein Immunglobulin K-Positivserum mit den Seren von gesunden Spendern inkubiert wird, bleibt Immunglobulin K nachweisbar.

Wenn das Serum eines gesunden Spenders ersetzt wird durch das Serum eines CEA-positiv-Patienten, ist Immunglobulin K nicht mehr nachweisbar, genauer gesagt, die CEA "blockieren" die aktiven Positionen des Immunglobulins vom K-Typ, so daß die ¹²⁵J-CEA nicht mehr gebunden werden können.

K-Immunglobulin zeigt immunhistochemische Reaktionen nur mit karzinogenen Zellen und nciht mit anderen Zellen.

Zum besseren Verständnis des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Bezug genommen auf die Fig. 1, 2 und 3, in welchen die Bildung von Antikörpern dargestellt ist nach der Injektion von menschlichem Serum eines gesunden Spenders (Fig. 1) und eines krebskranken Patienten (Fig. 2) in eine Ziege und einen Menschen.

Das Diagramm in Fig. 3 zeigt die Konzentration von freien Antikörpern und spezifischen freien Antigenen auf der Ordinate in Abhängigkeit von der Krankheitszeit, die auf der Abszisse dargestellt ist.

Als abschließende Bemerkung ist festzustellen, daß zu beobachten ist, daß in den Seren von krebskranken Patienten sowohl CEA als auch das spezifische K-Immunglobulin vorhanden ist. Ein solches K-Immunglobulin zeigt keine Reaktionen mit den menschlichen Antiseren (IgA, IgM und IgG), wohingegen es Kreuzreaktionen mit Antiziegenseren zeigt, welche, wie bekannt ist, nicht mit allgemeinen menschlichen Immunglobulinen reagieren, wenn sie verarmt wurden. Ein solches K-Immunoglobulin stellt somit eine neue Klasse von menschlichen Immunglobulinen dar. Es wurde festgestellt, daß die bis jetzt erhaltenen Ergebnisse bei den mit 30 Patienten (240 Gesundheitsprüfungen) durchgeführten Experimenten mit (einfachen, postoperativen oder metastasierten) Karzinomen die vernünftige Annahme gestatten, daß der immunologische Mechanismus in der folgenden Weise abläuft:

Stufe I - Ein Tumor in der Vorläuferphase oder in der Immunisierungsphase.

Wenige tumorige Zellen bringen geringe Konzentrationen des Antigens (CEA) in Zirkulation, welche den Organismus immunisieren, der zuletzt mit der Produktion einer hohen Konzentration von K-Immunglobulin antwortet; in dieser Phase wird K-Immunglobulin im Serum gefunden, jedoch keine freien Antigene beobachtet, da sie vollständig an das Immunglobulin gebunden sind (s. Fig. 3).

Stufe II - Die Tumormasse nimmt in der Größe zu und die Antigenkonzentration nimmt ebenfalls zu, während die Konzentration von K-Immunglobulin langsamer wächst (Immundepression); von nun an wird eine stets abnehmende Konzentration von freien K-Immunglobulin im Umlauf beobachtet; dieses Immunglobulin ist an das Antigen gebunden:
die Phase der Immunkomplexformen.

Stufe III - Die Tumormasse nimmt an Größe zu, so daß eine Antigenkonzentration produziert wird, die höher ist als die Antikörperkonzentration; die Menge des freien Antigens kann bestimmt werden: die Phase der CEA-positiv-Bestimmungen, während Immunglobulin nicht bestimmt werden kann.

Stufe IV - Der Eingriff. Die Antigen-Konzentration nimmt auf sehr niedrige Werte ab, während der Antikörpertiter konstant bleibt: K-Immunglobulin ist vorhanden, da, wie bekannt ist (z. B. bei der Impfung), der Organismus die Erzeugung eines Antikörpers lernt und diese Aktivität selbst in Abwesenheit vom Antigen nicht beendet wird.

Stufe V - Metastasen: das Antigen ist wieder vorhanden, mit der Induktion zur Bildung neuer spezifischer Antikörper.

Claims (7)

1. Verfahren zur Bestimmung eines menschlichen Immunglobulins (K-Immunglobulin), das spezifisch ist für menschliche Karzinome, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

• - Inkubation des Serums eines krebskranken Patienten mit CEA, das im Überschuß radioaktiv markiert wurde (¹²⁵J-CEA, 50 000 cpm, 80 µCi/µg spezifischer Aktivität) für wenigstens 16 Stunden bei Raumtemperatur (erste Inkubation);
• - Zugabe von Ziegen-Antigammaglobulin Antiserum, das befreit wurde von der Kreuzreaktivität mit Humanglobulin vom Typ IgA, IgG und IgM, und Inkubation für eine Stunde bei Raumtemperatur (zweite Inkubation); und
• - Zentrifugieren und Abgießen des Überstandes und Zählen des Niederschlags mit einem Gammazähler.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Antiserum Kaninchen-Antiserum verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß menschliches Serum in einer Menge von 0,1 bis 0,5 ml mit 0,1 ml ¹²⁵J-CEA (50 000 cpm in 0,05 m phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS+0,1‰ Rinderalbumin, bei pH=7,4) in der ersten Inkubation inkubiert wird und in der zweiten Inkubation 0,1 ml des Antiziegenserums hinzugefügt wird, und daß auf diese Zugabe 15 Minuten Zentrifugieren mit 4000×g Abgießen des Überstandes und Zählen des Niederschlags mit einem Gammazähler folgen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiziegenserum von der Kreuzreaktivität für die IgA-, IgG- und IgM- Immunglobuline durch einen Bioabsorptionsvorgang befreit wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Bioabsorptionsvorgang durchgeführt wird durch Durchfließen von Sepharose, an die IgA-, IgG- und IgM-Immunglobuline gebunden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe (zweite Inkubation) von Kaninchen-, Esel-, Pferd-Immunglobulinen gegen ein menschliches Immunglobulin erfolgt, welches spezifisch für Karzinome ist (K-Immunglobulin).

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß solche Immunglobuline gegen das K-Immunglobulin verwendet werden, die dadurch gewonnen werden, daß aus den Seren von Patienten, die sich bei der Bestimmung des Vorhandenseins des K-Immunglobulins nach einem der Ansprüche 1 bis 6 als positiv gezeigt haben, das K-Immunglobulin extrahiert und nachfolgend von den anderen menschlichen Immunglobulinen gereinigt und dann in Kaninchen, Esel, Pferde injiziert wird.