DD152578A5

DD152578A5 - Verfahren zur abtrennung von gibberellinen

Info

Publication number: DD152578A5
Application number: DD22335480A
Authority: DD
Inventors: Ryszard Heropolitanski; Andrzej Kazmierczak; Ireneusz Gajewski; Halina Wosko
Original assignee: Inst Chemii Przemyslowej; Kutnowskie Zakl Farma
Priority date: 1980-08-15
Filing date: 1980-08-15
Publication date: 1981-12-02

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung von Gibberellinen, insbesondere von Gibberellinsaeure, aus der Bruehe, welche in einem fermentativen Verfahren erhalten wurde. Gibberelline werden auf Grund ihrer wachstumsbeschleunigenden Wirkung auf Pflanzen in der Landwirtschaft angewandt. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens, mit dem Gibberelline in guter Ausgabe hergestellt werden koennen. Erfindungsgemaess erfolgt die Abtrennung von Gibberellinen, insbesondere von Gibberellinsaeure, aus der Bruehe nach der Biosynthese durch Sorption und Desorption mit Loesungsmitteln in der Weise, dass die Bruehe durch ein Bett aus hochporoesen, nichtionischen, unpolaren oder mittelpolaren Harzen durchgeleitet wird. Die adsorbierten Gibberelline werden mit einer waessrigen Loesung von Aceton, Methanol oder Ethanol desorbiert und das Sorptionsmittel wird der Regenerierung mit Loesungen von denselben Verbindungen, aber mit einer anderen Konzentration unterworfen.

Description

Berlin, den 29. 12. 1980

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Verfahren zur Trennung von Gibberellinen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung von Gibberellinen, insbesondere von Gibberellinsäure, aus der Brühe nach dem fermentativen Verfahren zur Erzeugung dieser Produkte.

Gibberellinsäure, auch Gibberellin A_ genannt, gehört zu öer Gruppe von Verbindungen, die unter dem Sammelnamen Gibberelline bekannt sind.

Ein gemeinsames Merkmal dieser Verbindungen ist die wachstumsbeschleunigende Wirkung auf höhere Pflanzen und, unter geeigneten agrotechnischen Bedingungen, auch die Beschleunigung der Entwicklungsprozesse dieser Pflanzen. Einer weiten Anwendung von Gibberellinen für die Ertragssteigerung von landwirtschaftlichen Nutzpf3anzen ist hauptsächlich aer hohe Preis von diesen Präparaten hinderlich.

Cha r a kt er j,s j i k^ dl_er b e k a η η t e η t ec h η i s c h e η Lösungen

Gibberellinen, darunter vor allem Gibberellinsäure, werden im großtechnischen Maßstab nach einem fermentativen Verfahren (Biosynthese) als flüssige Kultur des Pilzes Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi) hergestellt. Die Ausbeute der Biosynthese von Gibberellinen hängt vonvielen Parametern des fermentativen Verfahrens ab, darunter von der biologischen Aktivität des Bakterienstammes, der Zusammensetzung der Nährstofflösung, der Tempera-

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tür, der Zeit u. dgl. Nadh Beendigung der Fermentation wird das Myzelium von der erzeugten Menge Gibberelline abfiltriert und das transparente Kulturfiltrat, auch Brühe genannt, einer Reihe von Operationen unterworfen, die zum, Zweck haben, die sichin dem Filtrat befindenden Aktivsubstanzen abzutrennen.

Eine der Haupt-ursachen des hohen Preises von Gibberellinen ist eine niedrige A_usbeute des Abtrennungsverfahrens. Die gegenwärtig angewendeten Abtrennungsverfahren ermöglichen eine Abtrennung von Gibberellinen mit Ausbeuten, die in der Regel nicht höher sind als 40 % der in der Brühe vorkommenden Menge. Zur Abtrennung von Gibberellinen sind mehrere Verfahren bekannt. Das Verfahren, welches im großtechnischen Maßstab vorzugsweise angewendet wird, besteht in der Adsorption dieser Substanzen mit Aktivkohle und der folgenden Desorption mit Methylalkohol oder Aceton« Oer Nachteil dieses Verfahrens ist die Unmöglichkeit einer vollständigen Rückgewinnung der auf der Aktivkohle adsorbierten Gibberelline. Weiterhin ist es mit den bekannten Verfahren nicht möglich, mehrere Verunreinigungen und Nebenprodukte aus der Biosynthese gleichzeitig zu adsorbieren und danach zu desorbieren, welche in den weiteren Schritten des Verfahrens eine Abtrennung eines reinen Präparates erschweren und dadurch die Ausbeute des ganzen Abtrennungsverfahrens erniedrigen. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist die Möglichkeit einer nur einmaligen Anwendung der Aktivkohle, was zusätzlich die Produktionskosten erhöht.

Ein anderes Verfahren zur Abtrennung von Gibberellinsäure beruht auf Anwendung von Anionenaustauschern. Gibberel-

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linsäure wird dabei durch die funktioneilen Gruppen der Austauscher gebunden. Auf diese Weise werden Gibberelline aus der Brühe quantitativ aufgefangen. Dieses Verfahren weist jedoch auch mehrere wesentliche Nachteile auf. Gibberellinsäure besitzt im Molekül einen Lactonring, welcher' sowohl im sauren wie auch im alkalischen Medium sehr instabil ist» Die öffnung des Lactonringes ist mit einem kompletten Verlust der biologischen Aktivität verbunden« Diese öffnung findet in bedeutendem Maße auf funktioneilen Gruppen der Anionenaustauscher statt sowie während der Desorption, welche unter Anwendung von wäßrigen oder alkoholischen Lösungen von Basen durchgeführt wird.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens, mit dem Gibberelline, insbesondere Gibberellinsäure, auf einfache und wirtschaftliche Weise in guter Ausbeute und hoher Reinheit hergestellt werden können«,

Darlegung des WesenS₁ der Erfindung

DerEcfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Abtrennung von Gibberellinen, insbesondere.von Gibberellinsäure, aus dem Kulturfiltrat nach der Fermentation zu verbessern/

Erfindungsgemäß erfolgt die Abtrennung von Gibberellinen, insbesondere von Gibberellinsäure, aus der Brühe nach der Biosynthese durch Sorption und Desorption mit Lösungs-

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mitteln in der Weise, daß die Brühe durch ein Bett aus hochporösem, nichtionischem, unpolarem oder mittelpolarem Harz durchgeleitet wird und die adsorbierten Gibberelline und Verunreinigungen der R_eihe nach aus dem Harze durch zweimaliges Durchleiten einer wäßrigen Lösung von Methanol, Aceton oder Ethanol desorbiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt teilweise die Nachteile der bisher bekannten Verfahren und ermöglicht vor allem, die Ausbeute bei der Abtrennung auf über 70 % der in der Brühe befindlichen Menge zu steigern. Das Verfahren beruht auf der Anwendung von synthetischen Sorptionsharzen zur Adsorption von Gibberellinen mit nichtionischem Charakter und mit unpolarer oder mittelpolarer Oberfläche vom Typ Amberlite XAD-4, XAD-2 und XÄD-7. Die auf dem Harz adsorbierten Gibberelline werden danach einer selektiven Desorption mittels wäßriger Lösungen von Aceton, Methanol oder Ethanol von geeigneter Konzentration unterworfen. Zum gründlichen Auswaschen der Verunreinigungen, was zur Regenrierung des Bettes des Sorptionsmittels unentbehrlich ist, wird dieses Bett im nächsten Schritt mit einer wäßrigen Lösung desselben Lösungsmittels, aber von einer anderen Konzentration ausgewaschen.

Im Falle der Desorption von Gibberellinen mittels Aceton wird eine wäßrige Lösung mit einer Acetonkonzentration von über 70 % oder unter 45 % angewendet und die Regenerierung des Sorptionsmittels mit einer Lösung mit einer Acetonkonzentration von 45 bis 70 % durchgeführt. Im Falle der Anwendung von Methanol wird die Desorption mittels einer 80 bis 35%igen wäßrigen Lösung und die

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Regenerierung des Sorptionsmittels mit einer wäßrigen

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Losung mit einer Methanolkonzentration von 80 bis 95 % durchgeführt·

Öle Desorption von Gibberellinen mit Ethanol wird mit einer wäßrigen Lösung mit einer Ethanolkonzentration von 40 bis 96 % durchgeführt, danach werden die Verunreinigungen mit einer Ethanollösung mit einer Konzentration von 20 bis 40 % zwecks Regenerierung des Sorptions-Bitteis desorbiert.

Die Anwendung von synthetischen Sorptionsharzen zur Sorption von Gibberellinen aus der Brühe ergab überraschenderweise gute Ergebnisse, Es erwies sich, daß Harze von diesem Typ Gibberelline qu ntitativ und die Verunreinigungen und Nebenprodukte nur in unbedeutendem Maße auffangen. Darüber hinaus ermöglichte die Anwendung von entsprechend angepaßten Konzentrationen der wäßrigen Lösungen von Aceton, Methanol oder Ethanol eine selektive Desorption und damit eine zusätzliche Abtrennung der Verunreinigungen von dem Hauptprodukt.

Das Diagramm 1 zeigt die Desorption der Gibberellineäure und der Verunreinigungen mit einer wäßrigen Methanollösung, dabei entspricht Achse Y d-er Desorption (in %) und Achse X der Methanolkonzentration (in Vol„~%). Die gebrochene Linie bezeichnet die Desorption von Gihberellinsäure und die kontinuierliche die Desorption von Verunreinigungen. Das Diagramm 2 zeigt die Desorption der Gibberellinsäure und der Verunreinigungen mit einer wäßrigen Acetonlösung. Auf der Achse X wird die Acetonkonzentration in Vol.~% angegeben, die übrigen Werte

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haben dieselben Bezeichnungen wie auf dem Diagramm 1.

Die Absonderung von Gibberellinsäure nach dem erfindungsgemäßen Verfahren macht es möglich, das Endprodukt mit einer Ausbeute von über 70 % zu erhalten.

Ausf ühruncjsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Durch eine Austauschersäule von bekannter Konstruktion oder durch zwei reihenweise geschalteten Säulen, welche mit Amberlitö XAD-4 gefüllt ist (sind), wird von oben die Brühe nach der Biosynthese der Gibberellinsäure mit einem Gehalt an Gibberellinsäure von 350 Einh./cm mit einer Geschwindigkeit von 4 Volumina auf 1 Volumen des Bettes des Sorptionsmittel auf 1 Stunde (4 Vol./Vol./Std.) bis zum Augenblick des Erscheinens von Spurmengen von diesem Produkt im Eluat durchgeleitet. Danach wird von oben durch die Säule eine wäßrige Acetonlösung mit einer Konzentration an Aceton von 90 %-mit einer Geschwindigkeit von 2 Vol./Vol./Std. durchgeleitet. Nach Erreichen einer leichten Farbänderung des Eluates wird die Fraktion, welche die Hauptmenge der Gibberellinsäure enthält, aufgefangen. Nach Entnahme der Hauptfraktion in einer Menge von 2 Volumina des Bettes wird eine wäßrige Acetonlösung mit einer Konzentration von 50 % Aceton dosiert. Nach Entnahme einer weiteren Hälfte des Volumens wird die nächste Fraktion aufgefangen, bis zum Erreichen eines

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fast farblosen Eluates. Danach wird das Bett in der Säule mit Wasser zur Entfernung vom Aceton durchgewaschen. Aus der Hauptfraktion der Gibberelline wird Aceton unter, vermindertem Druck unter Zugabe von kleinen Mengen Wasser abdestilliert. Aus dem wäßrigen Destillationsrückstand wird kristalline Gibberellinsäure nach bekannten Verfahren abgeschieden. Die Ausbeute beträgt 80 % vom Rohprodukt.

Beispiel 2

Die Abtrennung der Gibberellinsäure aus der Brühe nach der Biosynthese wird auf dieselbe Weise, wie im Beispiel 1 angegeben, durchgeführt, mit dem Unterschied, daß zur Desorption von Gibberellinen wäßrige Acetonlösung mit einer Konzentration von 35 % und zur Regenerierung des Sorptionsmittel eine wäßrige Acetonlösung mit einer Konzentration von 65 % angewendet wird.

Beispiel 3

Die Abtrennung der Gibberellinsäure ajs der Brühe nach der Biosynthese wird auf dieselbe W_eise, wie in den Beispielen 1 und 2 angegeben, durchgeführt, mit dem Unterschied, daß zur Desorption von Gibberellinen wäßrige Methanollösung mit einer Konzentration von 70 % Methanol und zur Regenerierung des Sorptionsmittels nach Entnahme der Hauptfraktion der Gibberelline wäßrige Methanollösung mit einer Konzentration von 90 % Methanol angewendet wird.

Beispiel 4

Die Abtrennung von Gibberellinsäure aus der Brühe nach

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der Biosynthese wird auf dieselbe Weise, wie im Beispiel 1 angegeben, durchgeführt» mit dem Unterschied, daß zur Desorption von Gibberellinen wäßrige Ethanollösung mit einer Konzentration von 85 % Ethanol und zur Regenerierung des Sorptionsmittels wäßrige Ethanollösung mit einer Konzentration von 25 % Ethanol angewendet wird. Nach endgültiger Absonderung von Gibberellinsäure nach bekannten Verfahren wird eine Ausbeute von 75 % im Verhältnis zu ihrer Menge in der Brühe erhalten.

Beispiel 5

Die Abtrennung von Gibberellinsäure aus der Brühe nach der Biosynthese wird auf/dieselbe Weise, wie im Beispiel 1 angegeben, durchgeführt, mit dem Unterschied, daß zur Füllung der Säule ein hochporöses, nichtionisches, mittelpolares Sorptionsharz vom Typ Amberlite XAB-7 angewendet wird.

Claims

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1, Verfahren zur Abtrennung von Gibberellinen, insbesondere von Gibberellinsäure, aus der Brühe nach der Biosynthese durch Sorption und Desorption mit Lösungsmitteln, gekennzeichnet dadurch, daß die Brühe durch ein Bett aus hochporösem, nichtionischem, unpolarem oder mittelpolarem Harz durchgeleitet wird und die adsorbierten Gibberelline und Verunreinigungen der Reihe nach aus dem Harz durch zweimaliges Durchleiten einer wäßrigen Lösung von Methanol, Aceton oder Ethanol desorbiert werden.

2, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die adsorbierten Gibberelline aus dem Harz durch Durchleiten einer wäßrigen Methanollösung mit einer Konzentration von 80 bis 35 % Methanol desorbiert werden und danach auch die Verunreinigungen mit einer wäßrigen Methanollösung mit einer Konzentration von 95 bis 80 % M_ethanol desorbiert werden.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die adsorbierten Gibberelline aus dem Harz durch Durchleiten einer wäßrigen Acetonlösung mit einer Konzentration von Aceton über 70 % oder unter 45 % desorbierf werden und danach auch die Verunreinigungen mit einer wäßrigen Acetonlösung mit einer Konzentration von 45 bis 70 % Aceton desorbiert werden.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die adsorbierten Gibberelline aus dem Harz durch

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Durchleiten einer wäßrigen Ethanollösung mit einer Konzentration von 40 bis 96 % Ethanol desorbiert werden und danach auch die Verunreinigungen mit einer wäßrigen Ethanollösung mit einer Konzentration yon 20 bis 40 % Ethanol desorbiert werden«

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