CZ7398A3

CZ7398A3 - Sůl derivátu amidinu, způsob její přípravy a farmaceutický prostředek, který ji obsahuje

Info

Publication number: CZ7398A3
Application number: CZ9873A
Authority: CZ
Inventors: De Lassauniere Pierre-Etienne Chabrier; Colette Broquet
Original assignee: Societe De Conseils De Recherches Et Dápplications Scientifiques
Priority date: 1995-07-15
Filing date: 1996-07-15
Publication date: 1998-06-17
Also published as: CN1190890A; CA2227034A1; PT839041E; NO980178D0; PL185375B1; CZ293676B6; DE69632193T2; CN1187056C; EP0839041A1; ZA965969B; ES2219690T3; HUP9901331A2; JPH11509540A; US6063807A; AU704373B2; IL122737A0; DE69632193D1; NO980178L; HUP9901331A3; ATE264107T1

Description

Sůl derivátu amidinu, způsob její přípravy a farmaceutický prostředek, který j i obsahuje

Oblast techniky:

Předložený vynález se týká nových sloučenin, které vykazují dvojí biologickou aktivitu, jmenovitě současnou inhibici vzniku oxidu dusnatého (NO) a cyklooxygenázovou aktivitu, způsobu jejich přípravy, farmaceutických prostředků je obsahujících, a jejich použití hlavně jako inhibitorů syntézy NO a cyklooxygenázy.

Dosavadní stav techniky:

Inhibitory cyklooxygenázy nebo léčiva analogická s aspirinem, např. kyselina acetylsalicylová a kyselina salicylová, methylované indolové deriváty, jako je indometacin (DCI [1 -(4-chlorbenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-1H- indol-3-ylloctové kyseliny) a sulindac (DCI [5-fluor-2-methyl -1-[[4-(methylsulf inyl)fenyl1 methylen]- 1H-inden-3-yl]octové kyseliny), deriváty N-fenylanthranilových kyselin (meclofenamat, fenamaty), deriváty kyseliny propionové, jako je ibuprofen (DCI p-isobutylhydratropové kyseliny), naproxen, fenoprofen, jsou široce používané a byly vyzkoušeny jako vhodná účinná léčiva při léčení zánětů, avšak s řadou nežádoucích sekundárních účinků při zvýšených dávkách (R. Flower, S.Moncada a J.Vane, Nechánisrn of action of aspirin-like drugs - In the pharmacological basis of therapeutics Goodman and Gilman, 1985, 29, 674-715). Nicméně byly tyto sloučeniny používány současně při akutní i preventivní léčbě migrén. Hodnota těchto léčiv je nepopiratelná, ale jejich terapeutické odezvy jsou často neúplné a, u některých pacientů, není léčba těmito sloučeninami vhodná. Vzhledem k jejich protizánět1 ivým vlastnostem a vlastnostem proti shlukování destiček, jsou • · · · · · tyto sloučeniny používané na trombózy se zjevnou redukcí edému, v ischemických modelech mozku, a proto jsou navrženy pro léčení a prevenci infarktů, otřesů a cerebrovaskulárních chorob (W.Armstrong Recent trends in research and treatment of stroke, SCRIP, PJB publications, 1991).

Biologická aktivita inhibitorů NO-syntázy byla teprve objevena, a jejich potenciální terapeutická funkce je teprve ve stupni výzkumu. Tyto látky, v nichž jsou struktury reprezentovány analogy L-argininu a jsou popsány v dánském patentu 3041/90, jsou inhibitory výroby oxidu dusnatého (NO).

Naše dosavadn í znalosti o NO byly revidovány v roce 1991,

Moncadem a kol.,(S.Moncada, R.M.J. Palmer,

E. A.

Higgs= Nitric oxid:

physiology.

pathophys i o1ogy and pharmaco1ogy

Pharmacologica1 revievs 43, 2, 109-142) a nedávno Kerwinem a kol. (Kerwin J., Lancaster J., Feldman P., Nitric oxide:

a new paradigm for second messengers, J.Med.Chem. (1995), vol. 38, 22,

4343-4362). Shrnuto, zdá se , že NO slouží jako transdukčn í mechanismus pro rozpustnou guanylatcyklázu v destičkách, nervový systém, a jako efektor molekuly v imunologických reakcích v mnoha buňkách a tkáních, obsahujících makrofágy a neutrofily. NO je produkován enzymaticky z L-argininu enzymem nazývaným NO syntáza. Tento enzym existuje ve dvou formách: jedné konstitutivní (endoteliální a neuronální) a druhé indukovatelné.

V některých patologi ích může nastat nadměrná produkce NO, jak již bylo demonstrováno, že nastane v případě šoku, a jak již bylo popsáno v dříve citovaných patentech. V souvislosti s tím jsou inhibitory NO syntázy léčivy účinnými v prevenci vaskulárních následků a úmrtnosti způsobených nemocemi, zvláště když jsou spojeny s cyklooxygenázovými inhibitory, jako je aspirin, indometacin nebo meclofenamat.

Výhodné účinky kombinace dvou aktivních složek ve stejné molekule mohou působit na pacienty, nemocné jinými nemocemi, jako jsou například:

4444

4

444

44

44444

44

4

4 4 4

4

Kardiovaskulární a cerebrovaskulární nemoci zahrnující např. atherosklerózu, migrény, arteriální hypertenzi, septický šok, srdeční a mozkové infarkty ischemického a hemoragického původu, ischemie a trombus;

poruchy periferního nebo centrálního nervového systému, jako jsou například neurodegenerativní onemocnění, jako hlavně mozkové infarkty, senilní demence, včetně Alzheimerovy nemoci, Huntingtonovy chorey, Parkinsonovy nemoci, Creutzfeld Jacobovy nemoci, laterální amyotrofické sklerózy, ale také bolesti, mozkové nebo míšní trauma, návyk na opiáty, alkohol a látky vyvolávající závislost, poruchy erekce a reprodukce, kognitivní poruchy nebo ence f a1opat i e;

proliferace a zánětlivé nemoci, jako je například atheroskleróza, pulmonární hypertenze, glomerulonefritida, portální hypertenze, psoriáza, revmatická artritida a artróza, fibróza, amyloidóza, zánět gastrointestinálního systému (kolitida, Crohnova nemoc) nebo pulmonárního systému a zánět dýchacích cest (astma, sinusitida); transplantace orgánů;

autoimunní a virové nemoci, jako je například lupus, AIDS, parazitické a virové infekce, diabetes, sklerotický plát; rakovina; nebo všechny chorobné stavy charakterizované produkcí nebo disfunkcí NO a/nebo cyklooxygenázy.

Podstata vynálezu:

Předmětem předloženého vynálezu je sloučenina obecného vzorce I

A. B ( I) ve formě soli, v němž

A znamená cyklooxygenázový inhibitor představovaný karboxyfunkcí;

• · · ·

B znamená sloučeninu obecného vzorce Ib

nh₂

Ib v němž

Ri znamená H, nitroradikál nebo fenylový radikál, fenylový radikál je popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty vybranými z halogen-, kyano-, nitro-, trifluormethyl-, nižších alkyl- nebo nižších a1koxyrad i ká1ů;

Tiz znamená nižší alkylradikál; nižší alkyl thio; alkylthioalkyl; aryl popřípadě substituovaný jedním nebo více substituenty vybranými z halogen-, kyano-, nitro-, trifluormethyl-, nižších alkyl- nebo nižších alkoxyradikálů; nebo aminoskupina výhodně substituovaná radikálem vybraným z nitro-, amino-, nižších alkyl- nebo fenylradikálů, fenylradikál j e popř í pádě subst i tuován j edn í m nebo v í ce subst i tuenty vybraným i z halogen-, kyano-, nitro-, trifluormethyl - , nižších alkylnebo nižších alkoxyradikálů;

a pokud A znamená kyselina acetylsalicylová a Ri je atom vodíku, potom R2 neznamená ani arylrádikál ani fenylaminoradikál, fenylradikál je popřípadě substituován.

V definici uvedené výše znamená termín halo (halogenradikál) fluorový radikál , chlorový radikál , bromový radikál nebo jodový radikál, přednostně fluoro- a chlororadikál.

Termín nižší alkyl znamená přednostně lineární nebo větvený alkylový radikál obsahující 1 až 6 atomů uhlíku a zvláště alkylradikál obsahující od 1 do 4 atomů uhlíku , jako je methyl, ethyl, propy1, isopropyl, butyl, isobutyl, sek.butyl a terč. butylradikál . Nižší alkoxyradikály odpovídají alkylovým radikálům uvedeným výše. Přednost se dává methoxyradikálu, ethoxyradikálu nebo i sopropy1oxyrad i ká1ům.

Termín aryl znamená aromatický kondenzovaného kruhu nebo několika radikál, složený z kondenzovaných kruhů;

každý kruh může obsahovat jeden nebo více stejných nebo různých heteroatomů

Příklady arylových vybraných ze síry, dusíku nebo kyslíku.

radikálů jsou fenyl, naftyl, thienyl furyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isothiazolyl thiazolyl, isoxazolyl, oxazolyl, pyridyl, pyrazinyl pyrimidyl, benzothienyl, benzofuryl a indolylové radikály.

Zvláštním předmětem vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce I, jak je definován výše, charakterizovaný tím, že sloučenina

A je vybrána ze salicylátů, jako je kysel ina salicylová a její deriváty, indometacin, sulindac, fenamaty a deriváty kyše1 i ny prop i onové.

Mezi deriváty kyseliny salicylové lze uvést sloučeniny získané esterifikací karboxyfunkce kyseliny salicylové, jako je např. methylsalicylát, sloučeniny získané substitucí hydroxyradikálu kyseliny salicylové, jako je např. kyselina acetylsalicylová, nebo dokonce sloučeniny získané adicí substituentuísubstituentů) na volných místech fenylradikálu kyseliny salicylové, jako je např. diflunisal. Mezi fenamáty lze uvést kyselinu mefenamovou, kyselinu meclofenamovou, kyselinu flufenamovou a kyselinu tolfenamovou. Sloučeniny jako ibuprofen, naproxen, fenopren, fenbufen, flurbiprofen, indoprofen, ketoprofen nebo suprofen mohou být uvedeny jako příklady derivátů kyseliny propionové.

Ještě přesněji je předmětem vynálezu sloučenina obecného vzorce I, jak je popsána výše, charakterizovaná tím, že

- A znamená kyselina salicylová, methylsalicylát, kysel ina « · « · · · ♦ · ··♦ acetylsalicylová, indometacin, sulindac, kyselina mefenamová, meclofenamic nebo ibuprofen; a

- B je obecného vzorce (Ib>, jak je definováno výše, v němž

Ri znamená H, nitroradikál nebo fenylový radikál, fenylový radikál je popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty vybranými z chloru, fluoru, kyanoskupiny, nitroskupiny, trifluormethylu, methylu, ethylu, methoxyskupiny, ethoxyskupiny nebo isopropyloxyskupiny ;

R2 znamená radikál amino-, hydrazino-, nitroamino-, methylamino-, ethylamino-, methylu, ethylu, methylthio-, methylthiomethylu ; fenyl popřípadě substituovaný jedním nebo více substituenty vybranými z chloru, fluoru, kyano-, nitro-, trifluormethylu, methylu, ethylu, methoxy-, ethoxy- nebo isopropyloxyradikálu ; thienyl, furyl a pyrrolyl.

Nejvýhodněji jsou předmětem vynálezu sloučeniny popsané dále v příkladech a zejména sloučeniny odpovídající následujícím formulím:

am i noguan i d i n sa1 i cy1át; aminoguanidin ibuprofen;

aminoguanidin indomethacinat; methylguanidin acetylsalicylát; methylguanidin salicylat; methylguanidin ibuprofenat;

methylguanidin mefenamat.

Předmětem tohoto vynálezu je také způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I popsaného výše charakterizovaný tím, še směs vzorce A sloučenin, jak je definována výše, se ponechá reagovat ve vodě při teplotě mezi teplotou místnosti a 70 °C se sloučeninou vzorce B, jak je definována výše.

V době zahájení postupu může být sloučenina vzorce A použita jako je, nebo ve formě soli, jako je například sodná sůl. Sloučenina vzorce B může být použita jako je, nebo ve formě jako například její hydrogenuhličitan nebo její hydroch1or i d.

Sloučeniny vzorce A jsou známé, a mohou být připraveny postupy známými odborníkovi v oblasti techniky. Sloučeniny vzorce B mohou být získány použitím postupů přípravy amidinů, známých odborníkovi ze stavu techniky (Schwan T.J. a kol.,J.Pharm.Sci. (1975), 64, 337-338; Roger R. a kol., Chem. Rev. 61, 179, (1961); Tatrahedron, 29 (14), 2147-51 (1973);

Patai S., Chem. Amidines Imidates, vol. 1, 283-348 (1975);

Patai S., Chem. Amidines Imidates, vol.2, 339-366 (1960)).

Sloučeniny podle předloženého vynálezu vykazují zajímavé farmakologické vlastnosti. Mají dvojí biologickou aktivitu, zejména, že inhibují oba, L-arginin/oxid dusnatý (NO) postup a cyklooxygenázový postup současně. Sloučeniny z předloženého vynálezu tedy mohou být použity v rozdílných terapeutických aplikacích.

Pokud se vezme v úvahu potenciální role NO syntázy a cyklooxygenázy ve fyziopatologii, sloučeniny podle vynálezu mohou poskytovat výhodné a prospěšné účinky při léčení:

Kardiovaskulární a cerebrovaskulární nemoci zahrnující např. migrény, cerebrální překrvení, infarkty, ischemie, septické, endotoxické a hemorargické šoky, bolesti ;

diverzní formy zánětů, obsahující například akutní revmatické bolesti, revmatickou artritidu nebo jiné typy artritid, osteoartrididu, astma;

poruchy imunního systému, zahrnující virové a nevirové infekce, autoimunní nemoci a všechny patologie charakterizované nadbytečnou produkcí oxidu dusnatého a/nebo metabolitů kyseliny arachidové.

99	• 9	9 9
9	9	9	• ·
	9	999	• 9
•		9 9	• 9 9
9		9 9	9 ·
999	9	99	99

♦··· ·· *· * 9 9 9 9 • 9 9 9 9

9 999 · « • · · 9 9

99 99

Ilustraci těchto farmakologických vlastností sloučen i n podle vynálezu lze nalézt dále v příkladové části.

Tyto vlastnosti činí sloučeniny vzorce I vhodné pro farmaceutické použití. Předmětem tohoto vynálezu jsou také, jako léčiva, sloučeniny vzorce I, jak byly definovány výše, stejně jako farmaceutické prostředky obsahující jako účinnou látku nejméně jedno z léčiv definovaných výše.

Vynález se tedy týká farmaceutickýc přípravků obsahuj í c í ch sloučeninu podle vynálezu, ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Farmaceut i cký přípravek může být ve formě pevné, například jako prášek, granule, tablety, kapsle nebo čípky.

Vhodným pevným nosičem může například být fosforečnan vápenatý, stearát hořečnatý, talek, cukry, laktóza, dextrin, amidon, želatina, celulóza.

methylcelulóza, sodná karboxymethylcelulóza, polyvinylpyrrolidon a vosk.

Farmaceutické přípravky obsahující sloučeninu podle vynálezu mohou také být v kapalné formě, například jako roztoky, emulze, suspenze nebo sirupy. Příslušnými kapalnými nosiči mohou být například voda, organická rozpouštědla jako je glycerol nebo glykoly, stejně jako jejich směsi, v různých poměrech, ve vodě, přidané do farmaceuticky přijatelných olejů nebo tuků. Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být podávány klasickými metodami podávání, jako orálně nebo intramuskulární injekcí, intraperitoneálně, intravenozními nebo subkutánními injekcemi.

Předmětem vynálezu je také použití sloučenin vzorce

I, jak jsou definovány výše, pro přípravu léčiv týkajících se léčení kardiovaskulárních nebo cerebrovaskulárn í ch poruch, léčiv.

týkajících se léčení diverzních zánětů, léčiv, týkajících se léčení poruch imunního systému.

Následující příklady jsou uvedeny pro i lustraci výše uvedených postupů, a nejsou v žádném případě považovány jako ♦ ♦ ··»♦ omezující rozsah vynálezu.

Příklady provedení:

Příklad 1= aminoguanidin salicylat

420 mg (2,5 mmol) hydrogenuhliči tanu aminoguanidinu se rozpust í ve 25 ml vody zahřátím na °C, postupně, za m í chán í, přidá se vodný roztok 400 mg salicylátu sodného.

Směs se zahřívá po 20 minut, potom se lyofilizuje (bílý prášek; b.t.

148

Příklad 2: aminoguanidin ibuprofenat

420 mg (2,5 mmol) hydrogenuhličitanu aminoguanidinu se rozpustí ve 25 ml vody zahřátím na 70 °C. Přidá se vodný roztok 570 mg ibuprofenu sodného. Směs se zahřívá po 20 minut, potom se lyofilizuje (bílý prášek; b.t. = 134 °C).

Přík1ad 3: aminoguanidin acetylsalicylat

Probíhá jako je popsáno v příkladu 1 použitím indometacinu namísto salicylátu sodného (žlutý prášek; b.t. = 196 °C).

Příklad 4· methylguanidin acetylsalicylat

450 mg (2,5 mmol) kyseliny acetylsalicylové se rozpustí ve 20 ml vody obsahujících 2,5 ml 1N NaOH. Potom se přidá 237,8 mg methylguanidin chlorhydrátu v 10 ml vody. Směs se míchá po dobu 15 minut. Získá se čirý roztok. Lyofilizace poskytne bílý prášek (b.t. = 153 °C).

NMR-¹H (100 MHz , D2O): 7,3-6,6 (m, 4H, aromatický); 2,3 (s, 3H, NCH3); 1,8 (s, 3H, COCH3).

Příklad 5:

methylguanidin salicylat

99	··	9 9	9999	' ··	99
9 ·	•	• 9	•	9 9	9	9
•	999	• 9	9	9 9	9 9
•	• 9	• · 9	9 9	9 9 9	9	9
•	• ·	• ·	• 9	9	9	9
999 9	• 9	♦ ·	99	99	99

345 mg (2,5 mmol) kyseliny salicylové se rozpustí za horka ve 20 ml vody obsahující 2,5 ml 1N NaOH. Přidá se roztok methylguanidin chlorhydrátu (2,5 mmol) v 10 ml vody. Směs se míchá při 40 °C po dobu 10 minut. Lyofilizací se získá vysoce objemný bílý prášek (b.t. = 140 °C).

NMR-¹H (100 MHz, D₂0) = 7-6,8 (m, 4H, aromatický); 2,4 (s,

3H, NCH₃).

Přík1ad 6 ? methylguanidin ibuprofenat

Při ohřevu se 2,5 mmol ibuprofenu rozpustí ve 20 ml vody obsahující 2,5 ml 1N NaOH.Přidá se roztok methylguanidin chlorhydrátu (2,5 mmol) v 10 ml vody, následuje míchání při 60 °C po dobu 15 minut. Lyofilizací se získá bílý prášek (b.t.= 174 °C).

NMR-¹H (100 MHz, D₂0): 7,2 (s, 4H, aromatický); 3,4 (g, 1H,

CeHe-CH( Me)-CO) ; 2,6 (s, 3H, NCH₃) ; 2,25 (d, 2H, CIfeCařfe) ;

1,6 (m, 1H, CHÍCIfalz); 1,2 (d, 3H, -CH(CEb)-C0₂H) ; 0,8 (d,

6H, 2CH₃) .

Příklad 7; methylguanidin mefenamat

Probíhá jako v příkladu 6 použitím kyseliny mefenamové namísto ibuprofenu. Během ochlazování se sloučeniny vysrážejí, sraženina se filtruje a suší (b.t. = 124 °C).

NMR- *H (100 MHz, D₂0) : 8,1 (m, 1H, H v o z C0₂H) ; 7,2-6,8 (m, 6H, 2CaHa) ; 2,9 (s, 3H, NCH₃) ; 2,4 a 2,3 (d, 2CH₃CaH6) .

Použitím postupu uvedeného výše mohou být připraveny následující sloučeniny, které jsou součástí Vynálezu, a které zahrnují výhodné sloučeniny.

··	♦ ·	··	9999	99	99
♦ ♦	9	•	9	9	« 9	9	9
•	999	•	9	9	9 9	9 9
•	9 ·	• 9	9	9 9	999	9	9
•	• ·	•	9	9 9	9	9	9
··«·	··	99	99	99	99

Tabulka 1

S1ouče-	B
ni na	A	Ri	Rz
C	salicylová kyselina	nitro	hydraz i no
D	salicylová kyselina	H	methylamino
E	salicylová kyselina	2-fluorfenyl	amino
F	acetylsalicylová kyselina	4-methoxyfenyl	ethyl
G	acetylsalicylová kyselina	nitro	ethoxy
H	methylsalicylát	3-chlorfenyl	methyl
I	methylsalicylát	H	hydraz i no
J	indometacin	3,4-dichlorfenyl	propy1
K	i ndometacin	4-methylfenyl	hydraz i no
L	indometacin	H	methylamino
M	indometacin	nitro	ethylam i no
N	indometacin	nitro	3-chlorfenyl
0	sulindak	3-kyanofenyl	amino
P	sulindak	H	methylamino
Q	sulindak	H	hydraz i no
R	mefenamová kyselina	H	amino
S	mefenamová kyšelina	H	thienyl
T	mefenamová kyselina	nitro	hydraz i no
U	meclofenamová kyselina	nitro	amino
V	meclofenamová kyselina	3-tri fluorfenyl	i sopropy1oxy
W	ibuprofen	H	methylthio- methyl
X	ibuprofen	nitro	methyl
Y	ibuprofen	nitro	furyl

Farmakologické studie sloučenin podle vynálezu

Sloučeniny podle vynálezu byly podrobeny in vitro biologickým testům, aby byla vyzkoušena jejich aktivita při

··	♦ ♦	··
* ·	•	•	♦
•	··♦	•	•
•	• ·	• ·	•
•	• ·	•	•
····	·♦	··

·♦·· ·· ·· • · · *· • « · · · · · • ♦ · w · ·· ♦· «· ···· blokování indukovatelné NO syntázy a cyklooxygenázy. Byly srovnávány s referenčními látkami jako je aminoguanidin, L-nitroarginin, ibuprofen, indometacin, kyselina acetylsalicylová.

1) In vitro působení na indukovate1nou NO syntázu J774A1 myších makrofáfů:

Test sestává z měření konverze L-argininu na L-citrulin NO syntázou postupem podle Bredta a Snydera ( Sborník z National

Academy of Sciences USA 87,

682-685, 1990). Myší makrof ágy

J774A1 produkují velké množství NO po aktivaci ipopo1ysacharidy (LPS) a interferonem-τ (IFN-τ).

Buňky se kultivuj í v DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s

Medium) obohaceném % fetálního telecího séra při 37 °C v atmosféře % CO2 po aktivaci LPS a IFN-τ. Naočkují se ve 150 cm³ baňky při rychlosti

5000 buněk/cm³. Inkubace se provádí za přítomnosti LPS (1 wg/ml) a myšího IFN-τ (

U/ml) v DMEM obohaceném 10 % fetálního telecího séra.

NO syntáza se izoluje extrakčním pufrem (HEPES mM,

PH 7, 4, dithiothreitol 0,5 mM, pepstatin A lmg/ml, leupeptin 1 a PMSF 10 mg/ml). Po působení ultrazvukem v extrakčním pufru při 4 °C se homogenáty ultracentrifugují (100 000 g při 4 °C po 1 hodinu).

Dávkování se provádí ve skleněné testovací zkumavce, do níž je vneseno 100 μΐ inkubačního pufru obsahujícího 100 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM dithiothreitolu, 2,5 mM CaC12, 1O μΜ tetrahydrobiopterinu, FAD 10 μΜ, BSA 1 mg/ml, 2 mM redukované NADPH, 2 mM EDTA a 2,5 mM CaC12- Přidá se 25 pl roztoku obsahujícího 100 nM tritiovaného argininu (specifická účinnost: 56,4 Ci/mmol, Amersham) a 40 μΜ neradioaktivního argininu. Reakce se iniciuje přidáním 50 μΐ homogenátu, výsledný objem je 200 μΐ (zbývajících 25 μΐ je bud voda, nebo sloučenina, která má být testována). Po 15 minutách se reakce zastaví 2 ml zastavovacího pufru (20 mM HEPES, pH

·· ·♦	··	9999	99
13 *	• •	• •	9 9	9 9 9 ·	9
	• 9	9	9 9	99 9	9
• · ·	9	9	9 9	9	9
···· ··	99	99	99

5,5, 2 mM EDTA). Po uložení vzorků do kolony s 1 ml DOVEX pryskyřice se vypočítá radioaktivita kapalným scinti lačním spektrome trem.

Výsledky jsou vyjádřeny jako hodnota IC50 a shrnuty v tabulce skupina 2 ( první sloupec pod názvem Indukovate1ná NO syntáza, tvorba citrulinu).

2) In vitro působení na produkci dusitanů J774A1 myšími makrofágy:

Tento test se použije pro měření inhibiční aktivity sloučenin na indukovatelné NO syntáze buněčné kultury. Buňky se kultivují v DMEM prostředí (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) obohaceném 10 % fetálního telecího séra při 37 °C pod atmosférou 5 % CO2. V těchto příkladech se oddělí do 96 prohlubní destiček (50 000 buněk na prohlubeň) a inkubuje se bez fenolové červeně v 10 % fetálního telecího séra s LPS (1 jjg/ml) a myším IFN-τ (50 U/ml) za přítomnosti nebo nepřítomnosti sloučeniny, která se má testovat. Po 48 hodinách se změří kolorimetricky, postupem podle Greena a kol., Analytical Biochemístry 126, 131-138 (1982), koncentrace nitrilu v kultivačním mediu, sloučeniny degradace NO. Výsledky jsou vyjádřeny jako hodnoty ICso v tabulce v odstavci 2 (druhý odstavec výsledků pod názvem

Indukovatelná NO syntáza, vznik dusitanů.

·· ♦· • · · • ··· ♦ ·9 · • ·· ·>·♦99 ·♦··

999999

99

9 99

9999

9999 • 9 99

999

99999

99

9999

IC50 (μΜ)
Sloučeniny	Indukovatelná NO syntáza (vznik ci trulinu)	Indukovatelná NO syntáza (vznik dusitanů)
Am i noguan i d i n	20	22
L-nitroarginin	21	100
Ibuprofen	neaktivní	neakt i vn í
Indometacin	neaktivní	neaktivní
Příklad 2	11	16
Příklad 3	26	33

3) In vitro působení na produkci dusičnanu a PGE2 BikrogliálnÍBi buňkami krys:

Mikrogliové buňky se izolují z kultur gliových buněk odvozených z neonatálního kortexu krys Wistar podle protokolu zpracovaného Thery a kol. (1991). Mikrogliové buňky se naočkují do 24 prohlubní destiček rychlostí 5.10⁵ buněk na ml a 0,5 ml na prohlubeň. Mikrogliové buňky jsou inkubovány za přítomnosti LPS (10 jjg/ml) a inhibitorů po 24 hodiny při 37 °C v atmosféře 5 % COz. Po 24 hodinách se supernatanty odstraní, aby se změřila koncentrace nitrilu a PGE2. PGE2 se dávkuje pomocí běžného rádioimunologického dávkování NEN, operačním postupem popsaným výrobcem. Každý vzorek se dávkuje dvojitě. Výsledky jsou vyjádřeny jako IC50 vypočítané pomocí lineární regrese na lineární části inhibiční křivky (0brP6C softwaru). Dusičnany jsou dávkovány postupem podle Greena a kol. (Analytical Biochemistry 126, 131-138, 1982). Výsledky jsou vyjádřeny ve formě IC50 a jsou označeny v tabulce dále pro příklad 2.

• ·	··	·· ·««·	• ·	• ·
• ·	•	• · ·	* ·	•	•
•	···	• · ·	• ·	• ·
•	• ·	• · · · ·	·· ·	• ·
•	• ·	• ♦ · ·	•	e
··· ·	··	·· ··	♦ ·	··

Sloučenina	Produkce dus i čnanu IC50 (μΜ)	Produkce PGE2 IC50 (juM)
Příklad 2	97 ± 35	3, 1 ± 1,9
Aminoguanidin	109 ± 44	neakt i vn í
Ibuprof en	neaktivní	1,3 ± 0, 22

4) In vitro působení na indukovatelnou cyklooxygenázu:

Cyklooxygenáza existuje ve dvou isofornách, COX-1 (konstitutivní) a COX-2 indukované mitogenním, cytokinovým a endotoxinovým zánětlívým činidlem. Sloučeniny se testují na enzymatickou aktivitu těchto dvou sem ipurifikovaných isoforem.

Principem testu je kvantifikace konverze arachidonové kyseliny (AA) na PGEz pomocí COX-1 nebo COX-2. Postup je navršen Futaki a kol.(Prostaglandins, 47, 55-59, 1994). COX-1 ( Prostaglandin H syntéza-1, EC 1.14.9.1) se zachovává při 80 °C a jsou odvozeny ze semenných váčků berana. COX-2 (Prostaglandin H syntáza-2) se také uchovává při -80 °C a je odvozen z placenty ovce.

Zkumavky se naplní 500 jíl pufru (100 mM Tris HC1, pH 8, ljuM hematinu, 1 mM fenolu) a sloučeninami podle vynálezu nebo referenčními látkami v koncentracích v rozmezí 1 nM aš 1 mM. Kontrolní vzorek sestává z pufru bez inhibitorů. Po 2 minutách inkubace s 5 U (COX-2) nebo 10 U (COX-1) enzymu se přidá po 2 minutách 5 yM kyseliny arachidonové na 10 «Μ. Reakce se zastaví 1N 30 jíl HC1 . Extrakce se provádí na Seppack kolonách (Waters). Po odpaření do sucha se měří PGE2 radíoimunologickým dávkováním z běšného kitu. Výsledky jsou vyjádřeny jako hodnota ICso a shrnuty v tabulce dále.

IC5O (jun)
Sloučeniny	COX-1	COX-2
Acetylsalicylová kyselina	77, 8	648
Acetylsalicylová kyselina	>1000	>1000
Mefenamová kyselina	83, 9	388
Ibuprofen	>1000	>1000
Indometacin	0, 54	15, 9
Am i noguani d i n	>1000	>1000
L-n i troargi n i n	>1000	>1000
Příklad 2	459	525
Příklad 3	0, 108	29, 4
Příklad 4	243	>1000
Příklad 5	>1000	>1000
Příklad 6	>1000	>1000
Příklad 7	411	331

Claims

·«

P A TENTOVÉ NÁROKY 1 . Sloučeniny obecného vzorce I ' • A.B (I) 1 ve formě soli, v němž A znamená cyklooxygenázový inhibitor představovaný karboxyfunkcí;

B znamená sloučeninu obecného vzorce Ib

NHa v němž

Ri znamená H, nitroradikál nebo fenylradikál, fenyl radikál je popřípadě substituován jedním nebo dvěma substituenty vybranými z halogen-, kyano-, nitro-, trifluormethy1 -, nižších alkyl- nebo nižších a1koxyrad i ká1ů >

radikálem vybraným z nitro-, amino-, nižších alkyl- nebo fenylradikálů, fenylradikál j e popř í pádě subst i tuován jedním nebo více subst i tuenty vybraným i z halogen-, kyano-, nitro-, trifluormethyl-, n i žš í ho alkyl nebo nižšího alkoxyradikálů;

R2 znamená nižší alkylradikál; nižší alkylthio-;

alkylthioalkyl-; aryl popřípadě substituovaný jedním nebo více substituenty vybranými z halogen-, kyano-, nitro-, trifluormethyl-, nižších alkyl- nebo nižších alkoxyradikálů; nebo aminoskupinu výhodně substituovanou a pokud A znamená kyselina acetylsalicylová a Ri atom vodíku, potom R2 neznamená ani arylrádikál ani fenylaminoradikál, fenylradikál je popřípadě substituován.
2. Sloučeniny obecného vzorce podle nároku vyznačuj ící se tím, že sloučenina A je vybrána ze salicylátů, indometacinu, sulindacu, fenamátů a derivátů kyše1 i ny prop i onové.
3. Sloučeniny obecného vzorce I podle nároku

1 nebo 2 vyznačuj ící se tím, že

-A znamená kyselinu salicylovou, methylsalicylát, kyše1 i nu

-B acetylsalicylovou, mefenamovou.

je obecného

Ri znamená indometacin, sulindac.

kyše 1 i nu kyselinu meclofenamovou vzorce (Ib) definovaného

H, ní troradikál nebo nebo ibuprofen; a v nároku 1, v němž:

fenylradikál, fenyl radikál je popřípadě substituován jedním nebo více substituenty vybranými z ch1orfluor-, kyano-, nitro-, trifluormethyl-, methyl-, ethyl methoxy- , ethoxy- nebo isopropyloxyradikálů ;

a R2 znamená radikál amino-, hydrazino-, ni troamino-, methylamino-, ethylamino-, methyl-, ethyl-, methylthio-, methyl th i omethyl - ; fenyl popřípadě substituovaný jedním n^bo více substituenty vybranými z chlor-, fluor-, kyano-, nitro-, trifluormethyl-, methyl-, ethyl-, methoxy-, ethoxy- nebo isopropyloxyradikálů ; thienyl, f ury1 nebo pyrrolyl.
4. Sloučeniny obecného vzorce I podle nároků 1 až 3 a odpovídající následujícím formulím:

aminoguanidin salicylát; aminoguanidin ibuprofen;

4444

• · 4· 4· • 4 4 4 4 • • 14 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 • • 44« 4 * 44

·*·· ·· ·· • · · · · • · · ·· • · ··· · · • · 4 « · ·· 44 ·« am i noguan i d i n methylguanidin methylguani din methylguanidin methylguanidin i ndomethac i nat; acetylsalicylát; salicylat; ibuprofenat; mefenamat.
5. Způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1 vyznačující se tím,, že směs vzorce A sloučeniny, jak je definována v nároku 1, se ponechá reagovat ve vodě při teplotě mezi teplotou místnosti a 70 °C se sloučeninou vzorce B, jak je definována v nároku 1.
6. Sloučenina vzorce I podle nároku 1 jako léčivo.
7. Sloučenina vzorce I podle některého z nároků 2 až 4 jako 1éč i vo.
8. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou složku alespoň jedno z léčiv podle některého z nároků 6 nebo 7.
9. Použití sloučenin vzorce I podle některého z nároků 1 až 4 pro přípravu léčiv určených pro léčení kardiovaskulárních a cerebrovaskulárních nemocí, zahrnujících například migrény, cerebrální překrvení, infarkty, ischemie, septické, endotoxinové a hemoragické šoky, a bolest.

i
10. Použití sloučenin vzorce I podle některého z nároků 1 až i 4 pro přípravu léčiv určených pro léčení diverzních forem zánětů, zahrnujících akutní revmatické horečky, revmatickou artritidu nebo jiné typy artritid, osteoartritidu, astma.
11. Použití sloučenin vzorce I podle některého z nároků 1 až 4 pro přípravu léčiv uvažovaných pro léčení poruch imunního systému, zahrnujících virové a nevirové infekce, autoimunní choroby a všechny patologie charakterizované nadměrnou produkcí oxidu dusnatého a/nebo metabolitů kyseliny arachidové.