CZ636081A3 - Process for preparing a vector for dna transfer - Google Patents

Process for preparing a vector for dna transfer Download PDF

Info

Publication number
CZ636081A3
CZ636081A3 CS816360A CS636081A CZ636081A3 CZ 636081 A3 CZ636081 A3 CZ 636081A3 CS 816360 A CS816360 A CS 816360A CS 636081 A CS636081 A CS 636081A CZ 636081 A3 CZ636081 A3 CZ 636081A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cpu
growth hormone
clu
dna
bovine growth
Prior art date
Application number
CS816360A
Other languages
English (en)
Inventor
Walter L Miller
Joseph A Martial
John D Baxter
Original Assignee
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22663908&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ636081(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ California filed Critical Univ California
Publication of CZ636081A3 publication Critical patent/CZ636081A3/cs
Publication of CZ280596B6 publication Critical patent/CZ280596B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Description

Vynález se týká způsobu výroby vektoru pro přenos DNA s obsahem sladu, mterý je rodem pro prekursor růstového hormonu shotu a růstový hormon shotu a způsobu výroby nuklsotidcvého sledu, který je hodem pro růstový hormon shotu.
Předmětem vynálezu je způsob výroby vekt/oru pro přenos DNA pro použití k udržování, replikaci a při exoresi desomynuhleotioového sledu, který je hodem pro prekursor růstového hormonu šrotu nebo pro růstový hormon shotu, vyznačující se tím, že se uvede v reakci slad nukleotidů, který je hodem pro prekursor růstového hormonu skotu nebo a o u o v j --Or.í.ou ..o u ...o 1 □ ..mo zm * A , u_ l «v ozo u stečením vektoru ero ořenos působením restrikčního
V jednom provedení způsobu podle vynálezu se vyrábí vektor pro přenos DNA s obsahem sledu pro prekursor růstového hormonu skotu tak, že ss uvede v reakci desomynuklaotidový sled, mter.v je kódem pro prekursor růstového hormonu ;a skotu ε molekulou DUA·, oři pra vanou štěpením vektoru pro přenos působením restrikčního enzy mu.
V dalším výhodném provedení sa postupuje tak, že desoxynuklaotidový sled, který je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu, obsahuje navíc řetězec s následujícím sledem :
c . z > — ATG ATG GCT GCA GGC CCC
CGG ACC TCC CTG CTC CTG GCT TTC GCC CTG CTC TGC CTG
CCC TGG ACT CAG GTG GTG GGC GCC TTC CCA GCC ATG TCC
TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG
CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT
GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGACAG AGA TAC TCC ATC
CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TČC GAA ACC ATC
CC» GČC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA
GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG
TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC
ACC AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT
GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG
ATG CGG GAG CTG GAA GAT GGC ACC CCC ČGG GCT GGG CAG
ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG
CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC
TCC TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AAG ACO GAG AC® TAG
CTG AGG GTC ATG AAG TGC CGC CGC TTC GGG GÁG GCC AGC
TGT GCC TTC TAG - 3 t
kde
A znamená deeoxyadenyl,
O znamenádesoxyguanyl,
C znamená desoxycytoxyl a
T znamená thymidyl.
Podle dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu se připravuje desoxynukleotidový sled, který je kódem pro růstový hormon skotu takr že se štěpí cSNA (desoxynukleotidový sled> který je prekursorem pro prekursor růstového hormonu skotu) působením restrikěního enzymu Hae II a rozštěpený produkt se inkubuje s enzymem, který se volí ze skupiny, obsahující Klenowův fragment DNA-polymerázy I, T4 DNA polymerázy nebo 3*,5*-exonukleázy, * «
Podle dalšího provedení způsobu podle vynálezu se připravuje sled pro růstový hormon skotu tak, že se inkubace se svrchu uvedeným KLenowovýa fragmentem provádí za přítomnosti dATP a výsledný produkt se rozkládá SI nukleázou, ěímž se získá desoxynukleotidový sled, který je kódem pro aminokyseliny,2 až 191 růstového hormonu skotu a výsledkem je desoxynukleotidkový sled, který je kódem pro růstový hormon skotu a navíc obsahuje řetězec následujícího složení:
c . * > — TTC CCA GCC ATG TCC TTG
TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG CAG
CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT GAG
CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC CAG
UC ACC CAG GffiT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC CCG
GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA GAC
TTG GAG CTG CTT CGC ATG TCA CTG CTC CTC ATČ CAG TCG
TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC ACC
UC AGO TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT G1C TAT GAG
AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG ATG
ČGG GAG CTG GÁA GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG ATC
CTC AAG CAG ACG TAT GAC AAA TTT GAC ACA IAC ATG COC
AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TÁC GGT CTG CTC TCC
TGC TTC CGG AAG GAC CTG CAT AÁG ACG GAG ACG PAC CTG
AGG GCC GTC TTC ATG TAG AAG - 3 TGC CGC CGC TTC GGG GAG, GCC AGC TGT
kde
A a
c znamená deaoxyadenyl, znamená deeoxyguanyl, znamená desoxycytosyl a znamená thymidyl.
Podle dalšího provedení způsobu podle vynálezu se získává sled pro růstový hormon skotu tak, že se inkubace se svrchu uvedeným Klenoárovým fragmentem provádí za př ítomnoati dATP, dGTP, dCTP a dTTP a výsledný produkt se inkubuje s enzymem, který se volí ze skupiny obsahující Klenowův fragment, T4 DNA polymerázu nebo 3*,5z-exonukleázu za přítomnosti dCTP a výsledný produkt se podrobí působení SI nukleézy, čímž se získá desoxynukleotidový sled, který je kódem pro aminokyselinu 1 až 191 růstového hormonu skotu za vzniku desoxynukleotidového sledu, který je kódem pro růstový hormon skotu a navíc obsahuje řetězec následujícího složení;
5 . * GCC TTC CCA GCC ATG TCC
TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTG CTC CGG GCT CAG
CAC CTG CAC CAG CTG GCT GCT GAC ACC TTC AAA GAG TTT
GAG CGT ACC TAC ATC CCG GAG GGA CAG AGA TAC TCC ATC
CAG AAC ACC CAG GTT GCC TTC TGC TTC TCC GAA ACC ATC
CCG GCC CCC ACG GGC AAG AAT GAG GCC CAG CAG AAA TCA
GAC TTG GAG CTG CTT CGC ATC TCA CTG CTC CTC ATC CAG
TCG TGG CTT GGG CCC CTG CAG TTT CTC AGC AGA GTC TTC
ACG AAC AGC TTG GTG TTT GGC ACC TCG GAC CGT GTC TAT
GAG AAG CTG AAG GAC CTG GAG GAA GGC ATC TTG GCC CTG
ATG CGG GAG CTG GAA,. GAT GGC ACC CCC CGG GCT GGG CAG
ATC CTC AAG CAG ACC TAT GAC AAA TTT GAC ACA AAC ATG
CGC AGT GAC GAC GCG CTG CTC AAG AAC TAC GGT CTG CTC
TCC TGC TTC CGG AAG GAC, CTG CAT AAG ACG GAG ACG TAC
CTG TGT AGG GCC GTC ATG TTC TAG AAG - 3 TGC CGC CGC TTC GGG GAG GCC AGG
kde
A znamená deaoxyadenyl,
G znamená desoxyguany 1, /
C znamená desoxycytosyl a
T znamená thymidyl.
Podle dalšího provedení se získá plasmid pHP348 s obsahem prekursoro růstového hormonu skotu tak, že molekulou DNA, připravenou štěpením vektoru pro přenos restrikčním enzymem je pBE322 a restrikdním enzymem je Pat I.
Podle dalšího provedení pro výrobu vektoru pro přenos DNA s obsahem sledu pro růstový hormon skotu se postupuje tak, že se uvede v reakci připravený desoxynukleotidový sled, který je kódem pro růstový hormon skotu s molekulou DNA, připravenou štěpením vektoru pro přenos působením restrikčního enzymu.
Podle dalšího provedení způsobu výroby vektoru pro přenos a expresi se postupuje tak, že se molekula DNA, připravená štěpením vektoru pro přenos působením restrikčního enzymu štěpí v místě, kde se nachází řídící oblast pro expresi.
Podle dalšího provedení se provádí postup pro výrobu# bílkoviny obsahující sled aminoXkyselin prekursoru růstového hormonu skotu nebo sled aminokyselin pro růstový hormon skotu jako koncový sled na zakončení, které obsahuje uhlíkový atom a část prokaryotické bílkoviny jako N-terminální sled tak, že se inkubuje mikroorganismus, transformovaný lektorem pro přenos a expresi, obsahující desoxynukleotidový sled, který je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu nebo pro růstový hormon skotu.
Podle dalšího provedení se způsob pro syntézu růstového hormonu skotu provádí tak, že se inkubuje mikroorganismus, transformovaný vektorem pro přenos a expresi s obsahem desoxykikleotidového sledu, který Je kódem pro růstový hormon skotu za podmínek, vhodných pro expresi tohoto Sodu pro růstový hormon skotu s následným čištěním růstového hormonu skotu po jeho izolaci z rozrušených buněk mikroorganismu nebo ze živného prostředí.
Růstový hormon je polypeptidový hormon, který je vytvářen a vylučován adenohypofýzou, to jest předním lalokem hypofýzy. Růstový hormon se vytváří nejprve jako bílkovinný prekuradr, který obsahuje N-terminální signální peptid a sled pro růstový hormon. Sled aminokyselin v růstovém hormonu skotu je známa byl popsán v publikaci Dayhoff M. D. a další, Á^las of Protein Sequenee and Structure, sv. 5, doplněk 3, str·
245 až 352, National Bioaedical Rflsearch Foundation, Washington, D. C. (1978).
Růstový hormon se za normálních podmínek produkuje celý život, i když největší množství se produkuje v období dospívání. Hormon je nutný pro růst v obdobý dospívání.
Přestože mechanismus působení hormonu není zcela znám, je známo, že je nutný hlavně pro růst kostí, udržení dusíku, výrobu bílkovin a rovněž k ovlivnění metabolismu glukózy a tukových látek. Jinakřečeno, jde o obecně anabolický hormon.
Použití růstového hormonu skotu se zakládá na jeho známé biologické účinnosti, tak jak byla svrchu popsána. Růstový hormon skotu je možno podávat mladému skotu ke zvýšení rychlosti růstu a ke zvýšení přírůstků, Čímž se zkracuje doba, která je nutná k dosažení jatečně váhy. Výsledný vzestup produkce masa může být velmi významný.Mimoto se růstový hormon skotu liší od růstového hormonu ovce pouze obsahem několika aminokyselin.
Z tohoto důvodu je možno podávat růstový hormon skotu ovcím se stejnými výsledky jako u skotu, to jest ke zvýšení rychlosti růstu a přírůstků a tím i ke zvýšení produkce masa. Růstový hormon skotu je rovněž možno podávat vepřům ke stejnému účelu a se stejným -výsledkem.
- 11 Základní postup pro klonování sledů DNA je nyní znám. Například vpublikaoi Saeburg P. H. a další, Nátuře, 270. 486 (1977) ee popisuje klonování genu pro růstový hormon krysy.
V publikaci Shine J. a další, Nátuře, 270. 494 (1977) se popisuje klonování genu pro lidský choriový somatomammotropin. V publikaci DerynckR. a další, Nátuře 285, 542 (1980) se popisuje klonování genu pro lidský interferon z fibroblastu.
Způsoby exprese heterologní DNA v mikroorganismech jsou nyní také známy. Zásadně se postupuje tak, že se sled, který je kódem pro heterologní DNA včlení do vektoru pro přenos DNA v místě, které se nachází uvnitř operonu, který je schopen exprese. Pro výrobu hybridní bílkoviny musí být včleněný sled ve správné fázi se sledem operonu a musí být orientován ve stejném směru vzhledem ke translaci. V případě dodržení těchto podmínek se při translaci operonu přenáší i včleněný sled, takže vzniklá bílkovina obsahuje N-terminální sled aminokyselin, který je kódem pro operon, schopný exprese a mimoto sled aminokyselin, který je kódem pro včleněnou část. Tyto po- 12 ')„· F ι,>Λ Γ,, I Íi,J. · ’ ι » stupy byly popsány v publikacích Polisky 3. a další, Proč. Nat. Afiad. Sci. USA, 3900 (19767, Itakura K. a další, Science, 198. 1056 (1979)·
Nyní ee užívají různé operony, schopné exprese, včetně operonu pro β-galaktosidázu, β-laktamázu a tryptofan.
Použité zkratky jsou běžně uznávané a běžně užívané v oboru. Jsou navrhovány například v J. Biol. Chem., kde jsou také užívány bez dalšího rozvětvení.
Při provádění způsobu podle vynálezu je nutno klonovat DNA, která je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu něho pro růstový hormon skotu a dosáhnout exprese klonované DNA v mikroorganismech.
mRNA, která je kódém pro prekursor růstového hormonu skotu se izoluje z hypofýzy skotu. Obrácený přepis (cDNA-kopie) této mPNA se připraví a včlení do vektorupro přenos.
Pak se připraví desoxynukleotidový sled, který je kódem pro růstový hormon skotuhydrolýzou áfedu, který je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu. Vektor pro přenos se pak užije k transformování
A.* 'ii4.il MiteMnAWMiKlÍtfiíMi/lrWVWkWWtVMUMoMO^WrifckimÍ/rtAi^W^st ÍÁí.n^».··
- 13 bakterií, v nichž dochází k expresi tímto způsobem klonované cDNA.
Sled DNA, který jekodem pro růstový hormon skotn se získá pomocí cDNA. Zásadní postup při provádění tohoto způsobu je znám a je popsán například ve svrchu uvedených publikacích Seeburga P. H a dalších a Beryncka a dalších. Použitá cDNA se získá při použití SNA, extrahované z bypofýz skotu.
SNA, izolovaná z bypofýz skotu běžným způsobem se pak izoluje jako póly» adenylovaná SNA specifickou chromatografií. Integrita této pólyadenylovaná SNA se pak prokáže translací polyadenylované SNA způsobem, popsaným v publikacích Miller W. L. a McCarthy B. J., J. Biol. Chem. 254. 742 (1979) a Martial J. A. a další, Proč. Nat. Acad. Sci., USA, 24, 1816 (1177) s následnou analýzou bílkovin, získaných elektroforézou na SDS-akrylamidovém gelu způsobem, popsaným v publikaci Laemmli U. K., Nátuře, 227. 680 (1970). Růstový hormon skotu je možno dále identifikovat imunologickou srážecí reakcí podle publi0 kece líartial J. A., a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA (viz svrchu).
- 14 Polyadenylovaná KNA, která se užije jako vzor při výrobě cDNA a dvojitým řetězcem se získá běžným způsobem· První řetězec cDNA se získá použitím reverzní transkr^ptázy, oligo-dT a polyadenylované PNA, způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Millera a McCarthyho a v publikaci Monahan J, J. a další, Biochem·, 15,
223 (1976). RNA se odstraní za alkalických podmínek a cDNA s jedním řetězcem se užije pro syntézu druhého řetězce působením reverzní traekriptázy. Klička tvaru vlásničky se odstraní působením SI nukleázy způsobem podle publikace Leong J· A. a další, J. Virol., ®9l (1972) jak bylo popsáno v publikaci Ullrich A. a další, Science, 196:1313 (1977).
Tímto způsobem se získá cDNA, kterou již je možno včlenit do vektoru pro přenos. Vhodným vektorem pro přenos může být vektor, který je schopný transformovat bakterie, například Escherichia coli a Bacillus subtilis nebo kvasinky, například Sacoharomyces cerevisiae, dále inl, csp a esp mutanty kmene Neurospora crassa a živočišné buňky ve tkáňové kultuře. Příkladem vektoru pro přenos, které je možno užít při prová- 15 dění způsobu podle vynálezu a které jsou schopny transformovat Ifccberichia coli mohou být plasmidy pSCIOl, pMB9, pBR313, pBR315, pBR316 a pBR322 a vektory, odvozené od bakteriofágů, to jest Cheron 3A, Charon 4A, Charon 161 a ‘XgtWES.XB. Publikace, které popisují výrobu a vlastnosti těchto vektorů pro přenos jsou uvedeny v následující tabulce 1
Tabulka 1
Vektor Publikace pSC|Ol Cohen a dalěí, Proč. Nati.
Acad. Sci. USA, 20, 1293 a 3240 (1977).
Boyer a dalěí, Recoabinant Molecules, Beers, a další, Bds, Raven Press, NY, str. 13 (1977).
Cohen a další, Recoabinant Molecules, str. 91.
ρΜΒ9
PBR313
PBR315 pBR316 pBR322
Rodriguez a další, Molecular Mechanisme in Control of Gene Express ion (ICN-UCLA Sjamposium on Mol. Cell. Biol. sv. 5), Nieslich, a další, Eds., Academie Press, NY, str. 471 (1976).
Bolivar a další, Gene, 2,, (1977).
Bolivar a další, viz svrchu
Rodriguez a další, viz svrchu
Rodriguez a další, viz svrchu
Bolivar a další, Gene 2, 95 (1977).
Bolivar a další, Gene £, 121 (1978).
Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol., 431 77 (1978).
Charon 3A
Blattner a další, Science 196, 161 (1977).
- 17 Charon 4A
Charon 16A ^gtWES.^B
Blattner a další, viz svrchu
Blattner a další, viz svrchu
Tremeier a další, Nátuře 263 526(1976).
Leder a další, Science 196. 175 (197&).
Dalšími vhodnými vektory pro transformaci Escherichia coli jsou vektory, popsaná v publikaci Sinsheimer R. L., Ann. Rev. Biochem. 46. 415 (1977)· Vhodné vektory pro transformaci B. subtilis byly popsény v publikacích Iordanescu S., J. Bacteriol. 124. 597 (1964) a Ehrlich S. D., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74.
1680 (1>77). Jeden z těchto vektorů byl identifikován jako plasmid pC194· Hybridní plasmidy, obsahující DNA z kvasinek, a to plasmidovou a/nebo chromozomální, jakož i bakteriální DNA, například plasmidovou je možno použít k transformaci kvasinek. Plasmidy tohoto typu byly popsány v publikacích Beggs J. D., Nátuře 275. 104 (1978), Asiav C. L. a Carbon J., Proč. Hati. Acad. Sci. USA, J6,, 3829 (1979) a Kingsman A. K. a další Gene X, 141 (1979). Vektory pro přenos, které mohou být využi- 18 ty pro tkáňové kultury živočišných buněk jsou například defektivní adenovirus, defektivní firus SV-40 a virus polyomu.
Získané cDNA se včlená do vektoru pro přenos běžným způsobem. Včlenění cDNA se obvykle provádí na jakémkoli místě působ ení restrikčního enzymu, které se ve vektoru pro přenos neopakuje. Charon 3A a 4A a XgtWES.T^B obsahují vždy větěí počet míst a v důsledku toho vzniká několik míst pro včlenění vektorů. Některé vektory obsahuje jediné místo pro působení restrikčního enzymu. Použitelná místa ve vektorech Charon 3A a U a TXgtWES.TiB jsou uvedena v následující tabulce 2.
Tabulka
Vektor pSCIOl
Místo pro působení resktrikč ního enzymu
EcoRI, Hind III, Sai I, Bam HI, Hpa I, Srna I
pMB9 BcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI
PBH313 EcoRI, Hind III, Bal I, .
Bam Hl, Hpa I, Srna I, Xma
pBR315, PBR322 EcoRI, Hind III, Sal I, Bam HI, Pat I
pBR316 Hind III, Sal I, Bam HI, Pst I
p$194 Hidn III
Cháron 164 EcoRI, Set I
Charon 34 EcoRI
Charon 44 EcoRI
>gt WES.TtB EcoRI Obvykle se cDNA včleňuje
do restrikčního místa v oblasti, která určuje ještě další vlastnost fenotypu, protože je to účelné pro selekci. Například Hind 111, Sal 1 a Bam HI v pSCIOl, pMB9, pBR313, pBR315, řBR316, a pBR322 se nachází v místě pro odolnost proti te> ' '' γ' ' · ,, ι/.ι
- 20 tracyklinu nebo v kontrolní oblasti pro tento gen. Včleněnív tomto místě způsobí ztrátu odolnosti proti tetracyklinu. cDNA je možno včlenit dovektoru pro přenos pomocí látek, usnadňujících vazbu v uvedeném místě. Lze postupovat například tak, že se na cDNA naváže syntetický nukleotid, který obsahuje místo pro štěpení určitou restrikční endonukleázou, například některou ze svrchu uvedených endonukleáz. Pak se cDNA a vektor pro přenos odděleně inkubují s restrikční endonukleázou a pak se spo£í za vzniku vektoru s obsahem cDNA.
Je také možno postupovat tak, že se na cDNA naváže desoxynukleotid a terminální transferáza, jak bylo popsáno v publikaci Roychoudhury R. a další, Nucl. Acids Res., 2., S63 (1976). Po působení restrikční enjídonukleázy je pak možno vektor pro přenos vázat na doplňkový desoxynukleotid stejným způsobem. Vektor pro přenos s navázaným desoxynukleotidem a cDNA s navázaným desoxynukleotidem se pak spojí za vzniku vektoru s obsahem cDNA.
Je například možno na cDNA navázat dC a pak otevřít vektor v místě pro působení Pst I a navázat dG.
- 21 Pak se použije vektor s obsahem cDNA pro transformacivhodného hostitele. Vhodným hostitelem pro různé vektory mohou být například E. coli, B. eubtilis,' kvasinky, N*crassa a tkáňové kultury živočišných buněk. Vektory, vhodné pro transformaci těchto hostitelů byly uvedeny svrchu. Obvykle se užívají tři mutanty Escherichia coli. Jde o chil776, RRI a HB101. Bscherichia colichil776 byl popsán v publikaci Curtis R·, Ann Rev. Microbiol. JO, 507 (1976) a v US patentu S. 4 190 495. Escherichia coli RRI byl popsán v publikaci Eugaiczyk A. a další, Molecular Mechanisme in Control of Gene Expression na str. 543. Escherichia coli HB101 byl popsán v publikaci Kedes D. H. a Thomas 0. A·, Proč. Nati. Acad. Sci. USA JJ, 1537 (1976). Vhodný hostitel se transformuje běžným způsobem. Například Escherichia coli chi 1776 se transformuje vektorem s obsahem pDNA způsobem, popsaným v publikaci Cooke N. E. a další, J. Biol. Chem., 255. 6502 (1980). Kolonie ae podrobí sělekci a/nebo výběru běžným způsobem. Je možno například postupovat podle ztráty něktéré'vlastnosti, například odolnosti proti tetrshyklinu. Selekci je možno provádět tak,
- 22 že se
1) odstraní cDNA příslušnou reektrikční endonukleázou a pakse analyzuje elektroforézou a hybridizací způsobem podle publikace, Southern E. M., J. Mol. Biol., £8, 503 (1975), nebo se
2) opakovaně pěstuje j transformovaný mikroorganismus způsobem podle publikace Grunstein M. a Hogness D. S., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 22, 3961 (1975) za současné hybridizace nebo se
3) kolonie přímo zkoumají na schopnost exprese RIA nebo jiným způsobem.
DNA, která je kódem pro růstový hormon skotu se připravuje například z části, která je kódem pro překursor růstového hormonu skotu. Z ní se DNA odstraní působením vhodné restrikční endonukleázy. Například v případě, že se cDNA včlení do místa pro působení Pst I v plasmidu pBR322 je možno tuto včleněnou část odstranit částečným /působením enzymu Pst I, protože cDNA pro růstový hormon skotu uvnitř obsahuje ještě dvě místa pro působeni tohoto enzymu. Pak se cDNA rozloží enzymem HAe II. Je také možno postupovat tak, že se rekombinantní plasmid, odvozený od pBR322 podrobí působení Hae II k odstranění části včleněné cDNA. štěpení působením Hae II odstraní DNA, která je kódem pro N-terminální signální peptid a dvě ze tří baží, které jsou kódem pro N-terminální Ala růstového hormonu, Týto baze se pak nahradí inkubaci včleněné části s Klenowovým fragmentem DNA-polymerázy las desoxynukleotidem. Rovněž je možno postupovat tak, že se baze, které jsou kódem pro Ala rozruší inkubací cDNA s Klenowovým fragmentem, T4 DNA-polymerázou nebo 3',5z-exonukleázou za přítomnosti dATP. Klenofcův fragment byl popsán v publikaci Klenow H. a Henningeen I·, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 65, 168 (1970). cDNA, která je kódem pro růstový hormon se pak včlení do vhodného vektorupro přenos svrchu uvedeným způsobem.
Klonované DNA se podrobí eaqbreai v bakteriích za vzniku bílkoviny,- která
Z obsahuje růstový hormon skotu, pro nějž je kódem '>
SJWJ’ ř'X/ včleněný sled nebo pouze růstový hormon. K dispozici je několik možných postupů, například
a) modifikace sledu, který je užit jako kód za vzniku přesného výchozího bodu pro translaci,
b) selekce nebo konstrukce optimálního vektoru pro expresi,
c) další zpracování po translaci buá in vivo s využitím aktivity hostitele nebo in vitro chemickým způsobem a
d) přímá exprese.
V případě, že dochází k expresi složené bílkoviny, je obvykle možno upustit od modifikace klonovaného sledu nukleotidů pokud výsledný sj.ed dovoluje translaci včleněné části ve správné fázi a pokud nejsou obsaženy žádné kodony, které by způsobily zastavení translace před počátečním kodonem včleněného sledu.
Je možno dosáhnout exprese prekursoru růstového hormonu nebo růstového hormonu ve foťmě složené bílkoviny tak,že se včlentfí cDNA do příslušného místa uvnitř operonu, schopného exprese, včetně například místa pro působení enzymu Pst I v genu pro β-laktamázu v plasmidu pBR322 jak bylo popsáno v publikacích Villa-Komaroff I». a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 22, 3727 (1978), Serburg P. a další, Nátuře 274:795 (1978), místa pro působení enzymu EcoRI v plasmidu pBR322, který nese lac řídící oblast a sled, který je kódem pro β-galsktosidézu, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Itakura K. nebo místo pro působení enzymu Hidd III v genu trpD v plasmidu ptrpED5O, jak bylo popsáno v publikaci Martial J. a další, Science, 205. 602 (1979)· Modifikace délky sledu o jeden nebo dva nukleotidy za účelem dosažení správného sledu při translaci je známa. Včleněním těchto nukleotidů do místa pro působení enzymu Pet I v plasmidu pBR322 svrchu popsaným způsobem vede k odečítání ve správné fázi s pravděpodobností 1/6.
h?DVN5ZV’Wa;.‘hř>v-/NN·'·;.· .·λα'-.λ.:.·.. :'.; ,/:·, '.; X.
- 26 Prekursor růstového hormonu a růstový hormon se připravuje ze složeni bílkoviny, schopné specifického Štěpení in vitro. Klonovaný sled nukleotidů se modifikuje tak, aby byl kódem pro sled aminokyselin při specificitě proteolytického enzymu. Vhodným sledem je AspAspAspAsplys, který je přednostně štěpen enaymem enterokinázou» z > ’ / ž. ' > ' ď ' /
'· ' - ... . · Z . ' , . _ . ··'. f ··., ; . .Sled nukleotidů, který je kódem pro svrchu uvedený sled aminokyselin, xe a to těsně v blízkosti nukleotidového sledu, který je kódem pro N*terminální sled prekursoru růstového hormonu.
V případě prekursoru růstového hormonu znamená toto včlenění modifikaci původně včleněné cDNA odstraněním nukleotidu v poloze 5* sledu, který je kódem pro prekursor růstového hormonu. Svrchu uvedená cDNA, která je včleněna v případě růstového hormonu nemusí být modifikována. Modifikace včleněné části pro prekursor růstového hormonu se dosahuje buá řízeným působením exonukleázy nebo T4 DNA-polymerázy na zakončení 3' nebo kombinací štěpení endo**í*«jMecfcřírř«Mai«»*At ωκω·.
- 27 nukleázou v místě, které je v žádoucí vzdálenosti od zakončení / β následnou chemickou syntézou, která obnoví tu část žádaného sledu, která byla odstraněna. ' ’ ; iíí.
·. ·»ΰ-· * ' ; Při tomto postupu se s výhodou užívá T4 DNA-polymerázy a S1 nukleázy a získá se cDNA sled, který je kódem pro prekursor růstového hormonu bez oblasti 5*. Sled nukleotidů, který je kódem pro svrchu uvedený sled aminokyselin se naváže na cDNA, která je kódem pro prekursor růstového hormonu nebo pro růstový hormon, přičemž se působí DNA-ligázou, jak bylo popsáno v publikaci Valenzuela a další, Nátuře,
280« 815 (1979). Modifikovaný sled cDNA se pak včlení do vektoru pro expresi složené bílkoviny, tak jak bylo svrchu popsáno. Hostitelské bakterie, například Escherichia coli HB101, RRI nebo chil776 nebo jiné bakterie se transformují působením vektoru, který nese kód pro prekursor růstového hormonu. Transformované kolonie se třídí na odolnost proti ampicilinu. Vybrané kolonje se pak pěstují za podmínek, vhodných pro expresi složené bílkoviny Po expresi této bílkoviny se prekursor růstového hormonu nebo růstový hormon odštěpí enzymatickou hydrolýzou působením enterokinázy.
Při použití příslušného vektoru pro přenos a expresi je možno dosáhnout přímé exprese prekursoru růstového hormonu, to jest hormonu, který není vázán na žádnou prokaríotickou bílkovinu. Základním principem pro přímou expresi je skutečnost, že včleněný segment DNA úplně nahradí segment, který je kódem a je přenášen bakteriální řídící oblastí tak, že zá__ kladní složka řídící oblasti, která má být zachována je ukončena jednotkou pro expresi, která obsahuje promotor a vazné místo ribozomu, schopné působit na organismus hostitele. Není nutné odstranit všechny nukleotidy, které jsou kódem pro hostitelskou část složené bílkoviny. Vztah . mezi ribozomálním vazným místem a kodonem AUG, od něhož začíná včleněná část je takový, že tento kodon může být uložen kdekoli mezi kodonem 3 až 11 ribozomálního vazného místa, jak bylo popsáno v publikacích Shine J. a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 21, 1342 (1974) a Steitz J., Proč.
Nat. Acad. Sci. USA, 22, 4734 (1975). V oblasti nukleotidů 3 až 11 je AUG prvním kodonem, od něhož začíná translace. V případě ptrpB3O, který je odvozen od svrchu popsaného ptrpED5O a obsa29 huje operátor, promotor, atenuátor a r£bozomální vazné sledy tryptofsnového operonu spolu se sledem nukleotidů, který je kódem pro sedm aminokyselin bílkoviny trp E s následným místem pro působeníenzymu Hind IIÍ je odstranění minimálního množství 23 až 29 nukleotidů z místa pro působení Hind III zapotřebí pro vznik místa pro včlenění cDNA při řízení operonem tryptofanu.
Pro přímou expresi prekux soru růstového hormonu se původní včleněná cDNA modifikuje svrchu popsaným způsobem k odstranění 5'-nepřenesené oblasti· Vektor pro přímou expresi je možno získat modifikací ptrpE3O, při níž se odstraní nukleotidy 23 až 29 při použití T4 DNA polymerázy a SI nukleázy svrchu uvedeným způsobem. Vazný sled nukleotidů, který obsahuje restrikční sled pro Bam HI endonukleázu se naváže na modifikovanou cDNA a současně na modifikovaný ptrpE3O způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Valenzuela a další. Tímto způsobem se usnadní včlenění, které se pak provádí v podstatě způsobem, popsaným v publikaci Ullrich A. a další, Science, 126, 1313 (1977). Vhodný hostitel, na...
- 30 příklad Escherichia coli HB101, RRI nebo chil776 nebo jiná bakterie se transformují rekombinantním vektorem, který nese včleněnou část, které je kódem pro prekursor růstového hormonu. Transformované kolonie se podrobí výběru na odolnost proti ampicilinu a pak se pěstují za podmínek, vhodných pro expresi prekursoru růstového hormonu.
Přímé exprese růstového hormonu je možno dosáhnout způsobem, popsaným v publikaci Goeddel D. V. a další, Nátuře, 281. 544 (1979)· J© tsžé možno postupovat tak, že se naváže sled nukleotidů s obsaiem místa pro působení Bam HI a výchozí kodon AUG ma cDNA, která je kódem pro růstový hormon. Takto modifikovaná cDNA se pak včlení do modifikovaného ptrpE30 svrchu uvedeným způsobem.
Prekursor růstového hormonu je možno převést na růstový hormon odstraněním N-terminálního sledu hydrofóbních aminokyselin, které obsahují signální peptidy. In vitro je možno provést odstraněním signálního peptidu tak, že se na bílkovinu, extrahovanou z £ransformovanýchbuněk působí přípravkem s obsahem surových mikro- 31 somů způsobem popsaným v publikaci Jackson,R. C. a Blobel G., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 74. 5598 (1977). In vivo je možno odstranění signálního peptidu provés t při přímé bakteriální expresi sledu, který je kódem pro prekursor růstového hormonu. Bakteriální signální peptidy a signální peptidy savců mají podobné sledy. Bílkoviny s obsahem signálních peptidů savců je možno získat pomocí bakteriálních buněk a tak získat růstový hormon bu3 v periplasmatickém prostoru nebo v prostředí.
Takto získaný prekursor růstového hormonu a růstový hormon je možno čistit známým způsobem, například gelovoufiltrací, chromatografií na iontoměnič.i a způsoby, které využívají různé rozpustnosti.
Podrobnosti způsobu podle vynálezu budou déle popsány v průběhu příkladů.
V průběhu těchto příkladů bylo působení resktrikčních endonukleáz prováděno za podmínek, optimálních pro každý jednotlivý enzym. Restrikční endonukleézy, jejich názvosloví a místa, specifická pro jejich působení jsou podrobně uvedeny v publikaclmli
- 32 Roberta R., Crit. Rev. Biochem., <£, 123 (1976).
lýto enzymy jsou nyní také běžně dodávány Néw ,
England Biolabs, Cambridge, Massachusetts) a současně jsou uvedeny dodavatelem i optimální podmínky pro působení tědhto enzymů. Reverzní transkriptázu je možno získat od Dr. J. Běard,
Life Sciences, lne., St. Peteřsburg, Florida.
<— · · Použití reíerzní transkriptázy a vhodné reakční podmínky pro její působení byly již dříve popsány v publikacích Seeburg P. H.a další, Nátuře 276. 795 (1978), a ve svrchu uvedených publikacích geeburga P. H. a dalších a Shinea J. a dalších. T4 DNA polymerázy je možno získat od New England Biolabs. Použití T4 DNA polymerázy a vhodné reakční podmínky jsou ζπΡιπϋγ. '
SI nukleáza z mikrokoků je dodávána z Miles Laboratories, Elkhart, Indiana. Použití SI nukleázy a vhodné reakční podmínky nyly popsány ve svrchu uvedené publikaci Ullricha A. a dalších. Terminální desoxynukleotidová transferáza byla získána od Enzo Biochemicals,
New York, New York. Použití tohoto enzymu a vhodné redcční podmínky byly popsány ve svrchu uvedené publikaci Roychoudhury a dalších. Klene- 33 wův fragment DNA polymerázy I je možno získat od Boehringer Biochemicals, Indianapolis, Indiana.
Příklad 1
Způsob výroby cDNA prekursoru růstového hormonu skotu
Hypofýzy krav se odeberou krátce po porážce a ihned se zmrazí v kapalném dusíku. RNA se připraví homogenizací těchtožláz v roztoku guanidinthiokyanátu podle publikace
Chirginwin J. M. a další, Biochem. 18, 5294 (1979).
c
RNA se odstředí v roztoku 7,5 M CsCl způsobem podle svrchu uvedené publikace Ullricha a dalších.
Pak se RNA extrahuje fenolem a sráží ethanolem. Polyadenylovená RNA se čistí při použití chromatofcrafie na oligo-dT-celulóze způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Millema a McCarthyho a v publikaci Aviv H. a Leder P., Proč. Nat. Acad·
Sci. USA, 6&, 1408 (1972).
Polyadenylovaná RNAše přenese do bezbuněčného systému při použití retikulocytů králíka způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Millera a McCarthyho a v publikaci Martial J. A., a další (1977). Prekursor růstového hormonu skotu, syntetizovaný v tomuto syitému se vysráží imunologickým způsobem při použití heterologního antiséra proti růstového hormonu ovce a získá se adsorpcí na Staphylococcue aureus Cowan I, fixovaný na formaldehyd podle svrchu uvedené publikace Martial J. A. a dalších (1977). 35S-bílkoviny se podrobíelektroforéze na 12,5 % SES polyakrylamidovém gelupodle svrda uvedené publikace Laemmliho. Analýza ukazuje, že polyadenylovaná SNA, která je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu tvoří přibližně 12,6 % celkové polyadeny1ováné RNA hypofýzy.
Polyadenylovaná RNA se podrobí reverzní trsskripci do cDNA s jedním řetězcem při použití reverznítranskriptázy podle svrchu uvedených publikací Millera a McCarthyho a Monahana a dalších. RNA se odstraní hydrolýzou za alkalických podmínek. Pak se cDNA s jedním řetězcem extrahuje fenolem, chromatografuje na Sephadexu G-50 (Pharmacia, lne. Uppsala, Švédsko)a
- 35 vysráží se ethanolem. Pak se cDNA s jedním řetězcem užije k syntéze druhého řetězce cDNA při použití reverzní tršnskriptázy svrchu popsaným způsobem. Vzniklá vlásnička na zakončění 3* prvního řetězce cDNA se odstraní působením SI nukleézy, tak jak bylo uvedeno ve svrchu uvedených publikacích Leonga a další, a Ullricha A. a dalších.
Tato cDNA a dvojitým řetězcem se čistí extrakcí fenolem, chromatografií na Sephadexu G-5O e .«rážením ethanolem. Pak se naváže na zakončení 3'*ještě dCMP při použití dCTP a terminální transferézy, tak jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Eoychoudhury a další.
Plasmid pBR322 se rozštěpí Pst I endonukleázou a naváže se d(atP svrchu uvedeným způsobem a tím rozdílem, že se užije dGTP místo dCTP. 50 ng plasmidu pBR322 s dB po štěpení Pst I a 20 ng cDNA s dvojitým řetězcem po navázání dC se naváže v 50 ^ul reakční směsi způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Cooka a dalších
Transformace Escherichia coli chi 1776 působením plasmidu se provádí následujícím způsobem. Escherichia coli chi 1776 se
- 36 k získání propustnosti pro DNA inkubuje v 75 mffl chloridu vápenatého, 5 mM chloridu hořečnatďho, mM tris-pufru o pH 7,5 po dobu 20 minut při teplotě 4 °C. Plasmid a bakterie se inkubují 60 minut při teplotě 4 °C a pak 2 minuty při teplotě 41 °C. Transformované kolonie se podrobí výběru na odolnost proti tetracyklinu. Přítomnost klonované DNA se stanoví hybridizací kolonií na čerstvě připravené cDNA značené P z hypofýz skotu, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Grunsteina a Hognesse. Plasmidová DNA se připraví z vybraných kolonií, rozštěpí se enzymem Pst I, podrobí se elektroforéze na 1% agaróze, barví ethidiumbromidem a pak se přenese na nitrocelulózové filtry, způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Southernově. Přítomnost sledu pro růstový hormon v přenesené DNA se stanoví hybridizací na klonovaný růstový hormon krysy s plnou délkou cDNA tak, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci (Seeburga Ρ. H. a dalších) a podrobí se značení (Maniatis, R. a flalší^, Proč. Nat. Acad. Sci. USA J2, 1184 (1975). Jeden z kloů nů, který byl takto získán byl označen pBP348. Včleněná Část obsahuje 831 párů baží.
- 37 Příklad 2
Ana lýzasledu, cDNA
Plasmid pBP348 se rozštěpí enzymem Pst I a fosfát na zakončení 4 5” fragmentů
DNA se odstraní alkalickou fosfatážou a nahradí se 32 značením J P-fosfátem při použití polynukleotidkinázy· Následujícím štěpením celouřadou dalších restrikčních?endonukleáz, elektroforézou na polyakrylamidovám gelu, barvení a autoradiografií svazků DNA se získá mapa restrikčních míst klonované DNA. Pakse získá větší množství pBP348 a opět se provádí štěpení Pst I, Pvu II nebo Sau 3A, ke značení ae užije ÍV^^PjATP a polynukleotidkjnázy a pak se získaný materiál štěpí dalšími enzymy, čímž se získají fragmenty DNA, značené pouze na jednom konci. Tyto fragmenty ae získají elucí z polyakrylamidovéhogelu a pak se sledují způsobem, popsaným ve svrohu uvedené publikaci·Cook a další a v publikaci Maxam A. M. a Gilbert W. Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 24, 1560 (1977). Sled, který má být včleněn je znázorněn na obr. 1 spolu s odpovídajícím sledem aminokyselin, pro něž je kódem
- 38 uvedený řetězec, to jest řetězec, který svým sledem odpovídá sledu odpovídající mRNA.
Směr odečítání je možno rozeznat tak, že ve včleněné části chybí kodony prózastavení činnosti. Polohy aminokyselin jsou Číslovány od aminokyseliny, která má volnou aminoskupinu v růstovém hormonu skotu, načež se postupuje v kladném směru až do terminální karboxylové skupiny a v negativním směru k prvnímu kodonu AUG, o němž se předpokládá, že je signálem pro počátek translace. Stejně jako je tomu v případě dalších hormonů, je po translaci zapotřebí růstovýhormon dále zpracovat. Translací mENA pro růstový# hormon se získá prekursor růstového hormonu s obsahem signálního, peptidu, který může být uvolněn při přechodu_do endoplasmatického prostoru.
Příklad 3 (A) Opakuje se postup, uvedený v příkladu 1 při použití plasmidu pBR315 místo plasmidu pBR322. Všechny podmínky zůstávají stejné včetně výběru rekombinantníchklonů. Včleně
- 39 ná část se odstraní a analyzuje stejným způsobem jako v příkladu 2, čímž se získá DNA o 831 pérech baží se sledem, uvedeným na obr. 1.
(B) Opakuje se postup podle příkladu 1, avšak užije se plasmidu pBR316 místo plasmidu pBR322. Všechny podmínky jsou jinak stejné jako v příkladu 1. Odstranění a analýza včleněná části se provádí způsobem podle příkladu 2, čímž se získá DNA se sledem, znázorněným na obr. 1·
Příklad 4
Pro postup podle tohoto příkladu se připraví cDNA, která je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu způsobem podle příkladu 1. Všechny řetězce, navázané na volná zakončenív průběhu tohoto postupu se připravují způsobem, popsaným v publikaci Scheller R. H. a další Science 196. 177 (1977). Restrikční endonukleázy, použité při provádění tohoto postupu jsou běžně dodávány od New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, přičemž bylo užito optimálních podmínek,
- 40 doporučených dodavatelem. Transformace Escherichia coli chil77č se provádí způsobem, uvedeným v příkladu 1.
(ΑΪ Na cDNA se po její výrobě podle příkladu 1 naváží v místě působení enzymu Hind III sledy 5* - CCAAGCTTGC -3* při použití T4 DNA ligázy způsobem, popsanýav publikaci Valenzuela P. a další, Nátuře /280, 815 (1979).
Po navázání se produkt podrobí působení enzymu Hind III nebo Hsu I a pak se postupuje způsobem, uvedeným v publikaci Ullrich A. a další, Science 196. 1313 (1977). Plasmid pBR322 ae rozštěpí v místě pro působení enzymu Hind III působením enzymu Hind III nebo Hsu I, načež se zpracuje působením alkalické fosfatázy, tak jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Ullricha A. a dalších. Po vysrážení ethanolem se rozštěpený plasmid pBR322 naváže na cDNA s obsahem zakončení po působení enzymu Hind III, tak jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Ullricha A. a dalších. Při použití této směsi se transformuje Escherichia coli chil776 a transformované kolonie se podrobí výběru na citlivost na tetracyklin. Přítomnost klono
- 41 vsné DNA se prokazuje způsobem podle příkladu 1. Kolonie s obsahem včleněné části se zpracovávají tak, že se tato část odstraní působením enzymu Hind III a Hsu I a provádí se analýza stejným způsobem jako v příkladu 2. Včleněná část obsahuje přibližně 830 párů baží a má sled, uvedený na obr. 1.
(3) Opakuje ae způsob podle příkladu 4(A), avšak užije se několika vektorů místo plasmidu pBR322. Užije se například plasmidů pSIOl, pMB9, PBR313, pBR315 a pBR316 místo plasmidu pBR322. Všechny podmínky včetně volby rekombinantních klonů jsou jinak stejné jako v odstavci A. Pro všechny plasmidy byly získány stejné výsledky, to znamená, že v každém případě byl získán rekombinantní plasmid, obsahující v/členěnou část se sledem, uvedeným na obr. 1.
(C) Opakuje se postup podle příkladu 4(A), avšak užije se několik dalších restrikčních endonukleáz a jinýchvazných řetězců. Užijí se například vazné řetězce, v místech Sal I a Bam HI místo Hind III. Sled těchto řetězců je 5* - GGTCQACC - 3* a 5* - CCGGATCCGG - 3*. V pří- 42 pádě, že se užije první z řetězců, provádí se Štěpení endonukleázou Sal I a v případě, že se užije druhého řetězce, užije se endonukleázy Bam HI. Další podmínky včetně výběru rekombinantních klonů jsou jinak totožné jakov odstavci 4(A). V případě obou řetězců a obou restrikčních endonukleáz bylo dosaženo týchž výsledků.
(D) Opakuje se způsob podle odstavce 4(G), přičemž se užije plasmidů pSCIOl, pMB9, pBR313, pBR315 a pBR316 místo plasmidu pBR322. Všechny podmínky jsou jinak stejné jako v odstavci 4(0 a byly také získány stejné výsledky, to znamená, že v každém případě byl včleněn sled, který je znázorněn na obr. 1.
(E) Opakuje se postup podle odstavce 4(A) s tím rozdílem, že se v místě působení Eco RI užije vazný řetězec se sledem
5* - CCGAATTCGG -3' místo vazného řetězce v místě působení Hind III (HsuI)t Všechny podmínkyjsou jinak stejné s tím rozdílem, že transformované kolonie nejsou podrobeny výběru podle citlivosti na tetracyklin. Přítomnost klonované DNA se zjiš•'‘'^^«.«ωίΜΚΛί^ίνϋν^ΚίΓΛ.ν.^ν.'ΛΛβν^Μ'.'.Λ/ίΖίίίίΊΛ/.Λ:....*».* huiz.d,. uU,i,
- 43 íuje stejným způsobem jako v příkladu 1· Získá se rekombinantní klon, který obsahuje včleněnou část, znázorněnou na obr. 1.
(F) Opakuje se poátup podle odstavce 4(E) s tím rozdílem, že se užijí plapmidy pSCIOl, pMB9, pBR 313 a pBR315 místo plasmidu pBR322. Jinak se užije stejných podmínek jako v odstavci 4(E) a pro každý plasmid se také dosáhne stejných výsledků.
(G) Opakuje se způsob podle příkladu 4(A), avšak užije se vazného řetězce
5* - GCTGCAGC - 3' v míetě pro působení reektričního enzymu Pst I., který se užije místo vazného řetězce v místě Hind III (Hsu I). Jinak se užije stejných podmínek s tím rozdílem, že výběr rekombinantních klonů se provádí způsobem podle příkladu 1. Tímto způsobem se získá rekombinanžní klon, jehož sled odpovídá sledu, znázorněnému na obr. 1.
- 44 (H) Opakuje se postup podle příkladu 4(G), s tímrozdílem, že se užijí plasmidy pBR315 a pBR316 místo plasmidu pBR322. Jinakse užijístejné podmínky jako v příkladu 4(G) a dosáhne se týchž výsledků.
i (I) Opakují se příklady 1, 3(A), 3(B) a 4(A) až (H) s tím rozdílem, že se užije Escherichia coli RRI nebo Escherichia coli HB1O1 místo Escherichia coli chi!776. Všechny podmínky jsou jinak stejné abylo také dosaženo stejných výsledků.
Příklad 5
V tomto případě byla cDNA, která je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu připravena stejným způsobem jakfc v příkladu 1.
Do místa pro působení enzymu Eco RI byly navázány řetězce způsobem, který b.yl popsán ve svrchu uvedené publikaci Valenzuela P. a další a tytořetězc.e byly navázány také na xj cDNA, načež bylo provedeno štěpení enzymem EcoRI, tak jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Ullricha A. a dalších
- 45 (A) Jako vektor pro prenoa byl užit Charon 16A DNA, připravený podle svrchu uvedené publikace. Blattnera a dalších. Kohezivní zakončení byla spojena inkubací po dobu 60 minut při teplotě 42 °C v 0,1 M tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,0 za přítomnosti 10 mM chloridu hořečnatého. Vektor byl rozštěpen já v místě působení Eco RU endonukleázou Bco SI a získaná směs byla podrobena působení alkalické fosfatázy podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Po srážení ethanolem byl vektor, zpracovaný působením fosfatázy přidán k cDNA s obsahem zakončení pro působení enzymu EcoRI v molérním poměru 2 moly vektoruna 1 mol cDNA. Směs se navážej působením T4 DNA ligázy podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Výsledná směs se přímo přidá k suspenzi buněk Escherichia coli chi!776, připravené způsobem podle příkladu 1 a transformace se rovněž provádí způsobem, popsaným podle příkladu 1. Rekombinantní fágy se izolují a pěstují na Lac“ bakteriích na plotnách s obsahem 5-ohlor-4-brom-3-indolyl-p-D-galaktoeidu (X6) v koncentraci 80 /Ug/ml a rekombinantní fágy β obsahem cDNA, včleněné do místa pro působení Eco RI
- 46 v plasmidu Charon 16A se podrobí výběru podle produkce bezbarvých plaků. Zvolený rekombinantní plasmid se izoluje a podrobí působení přebytku nedonukleázy EcoRI a výsledné směs se analyzuje způsobem podle příkladu 2. Získá se DNA o přibližně 830 párech baží se sledem, uvedeným na obr. 1. Je také možno postupovat tak, že se získaná směs přímo užije in vitro k získání rekombinantních fágů způsobem, popsaným v publikaci Sternberg N. a další, Gene 1, 255 (1977)· Rekombinantní fágy je také možno sledovat podle hybridizace plaků in šitu způsobem, popsaným v publikaci Benton W. D. a Davis R. W., Science 196. 180 (1977).
(B) Charon 3A nebo 4A DNA, připravený podle svrchu uvedené publikace Blattnera a dalších se užije jako vektor pro přenos místo Charonu 16A DNA. Všechny podmínky jsou jinak stejné jako pro Charon 16A DNA. Výběr rekom— binantních fágů se provádí «Φ» (a) pěstováním na Lac bakteriích naplotnách s obsahem X6 s následnou
- 47 izolací bezbarvých plaků a hybridizací nebo netrávení restrikční endonukleázou podle svrchu uvedené Blattnerovy publikace. Včleněné část se odstraní svrchu uvedeným způsobem, čímž se získá DNA o přibližně 830 párech baží se sledem, znázorněným na obr. 1.
(C) Xgt WES.7<B DNA, podle publikace Tiemier a dalších, takjč jak byla svrchu uvedena se užije jako vektor pro přenos místo Charonu 16A. Všechny podmínky jsou jinak totožné jako pro Charon 16A. Selekce rekombinantních fágů se provál hybridizací podle svrchu uvedené publikace Benttona a Devise. Včleněná Část se odstraní svrchu uvedeným způsobem, čímž se získá DNA o přibližně 830 párech baží se sledem, znázorněným na obr. 1.
(D) Opakují se příklady 5(A) až (C), avšak užije se Escherichia coli RPI, Escherichia coli HB101, Escherichia coli DP50 nebo Escherichia coli DP50SupE místo Escherichia coli chil776. Všechny podmínky jsou jinak totožné a byly získány také totožné výsledky.
- 48 Příklad 6
V tomto příkladě byla cDNA,
Z která je kódem pro prekursor růstového hormonu skotupřipravena rovněž způsobem podle příkladu 1. Byly užity vazné řetězce v místě Hind III a cDNA byla štěpena enzymy Hind III nebo Hsu I podle příkladu 4(A).
Plasmid pC194, izolovaný z Staphylococcus aureus způsobem podle svrchu uvedené publikace Ehrlicha S. D. se užije jako vektor pro přenos. Plasmfid pC194 se rozštěpí v místě působení Hind III enzymem Hind III nebo Hsu I a pak se zpracovává působením alkalické fosfatázy podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších.
Pak se cDNA se zakončeními v místě působení Hind III naváže na rozštěpený pC194 podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Indukce B. subtilis RUB331 se provádí způsobem podle publikací Sgaramella V. a další J. Mol. BiBl. .105« 58? (1976) a Borenstein S. a Ephrati-Elizue E.,
J. Mol. Biol., 137 (1969). Transformace B. subtilis RUB331 se provádí směsí, popsanou ve svrchu uvedené publikaci Sgaramella a další a Bořen- 49 steina a dalších· Buněčná suspenze se nanáší přímo na L plotny s obsahám 3 yUg chloramfenikolu. Po selekci se izolují rekombinanty a podrobí se působení enzymu Hind III a získaný materiál se analyzuje jako v příkladu 2· Tímto způsobem se získá DNA o přibližně 830 párech baží se sledem, znázorněným na obr. 1.
Příklad 7
Syntéza cDNA, která je kódem pro růstový hormon skotu (A) Plasmid pBR348 se podrobí působení endonukleázy Hae II, čímž se získá fragment o 1600 párech baží. Jedno místo pro působení Hae II se nachází uvnitř včleněné cDNA, která je kódem pro prekursor růstového hormonu a druhé místo se nachází v místě pER322 plasmidu. Netrávením se získá následující materiál:
+1/ +2 ' - C TTC .... 3' ' - G CGG AAG .... 5 '
- 50 Růstový hormon skotu může začínat bu3 ala v poloze +1 nebo phe v poloze +2 při zakončení NHg (Dayhoff a další, viz svrchu), takže je možno se pokusit o dolnění kodonu ala nebo o jeho úplné odstranění. Úplné odstranění je možno dosáhnout inkubací DNA s dATP a Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I, protože první baží kodonu phe v poloze +2 (v řetězci 3? -> 5*) je A. Touto reakcí se získá následující materiál;
+1 +2
5Z - C TTC .... 3'
3' - AAG .... 5l
DNA se extrahuje fenolem a vysráží. Přebytek dATP a rozložených baží se odstraní chromatografií na Sephadexu G-50. Zbývající uhlíkový atom na zakončení 5' v původní poloze +1 v místě kodonu pro ala se pak odstraní působením SI nukleézy způsobem, popsaným v publikaci Shine a další, Nátuře 285» 456 (1980). Tímto způsobem se získá následující materiál:
- 51+2
5* - TTC .... 3* 3Z - AAG .... 5* (B) Opakuje se postup podle příkladu 7(A) tak, že se sled desoxynukleotidů, který je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu odstraní z vektorů pro přenos, získaných podle příkladů 3, 4, 5 a 6 při použití příslušných restrikčních enzymů před působením Hee II. Použité vektory a restrikční enzymy jsou uvedeny v následující tabulce 3.
Tabulka 3
Restrikční enzym Vektor pro přenos (příklad)
Pst I 3 A, 3B, 4G, 4H
Hind III 4A, 4B, 6
Sal I 4C, 4D
Bam HI 40, 4D
Eco RI 4E, 4E, 5A, 5B,
VMM:
- 52 Po netrávení příslušným restrikčním enzymem se sled pro prekursor růstového hormonu izoluje elektroforézou na gelu a psk se zpracovává způsobem pčdle příkladu 7(A), získají se tytéž výsláky.
(C) Opakuje se postup podle příkladu 7(A) a 7(B) při použití T4 DNA polymerázy nebo 3z-5Zexonukleázy místo Klenowova fragmentu DNA polymerázy I. Všechny ostatní podmínky jsou tytéž a v každém případě se také získá identický sled, který je fragmentem růstového hormonu skotu.
Příklad 8 (A) Působení enzymu Haě II podle příkladu 7(A) nebo 7(B) se získá fragment růstového hormonuskotu +1+2 * - C TTC .... 3 '
3* - G CGG AAG .... f
- 53 Tento fragment je možno doplnit tak, že se inkubuje s dATP, dGTP, dCTP, dTTP a Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I. Touto reakcí ae získá následující materiál:
+1+2
5* - G GCC TTC .... 3* * - G CGG AAG .... 5 *
DNA se extrahuje fenolem a vysráží. Získaný sled se pak inkubuje s Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I za přítomnosti dCTP. Sled se pak podrobí působení SI nukleázy podle publikace Shine a dalších, Nátuře 285. 456 (1980), čímž se získá následující materiál:
5Z - GCC TTC .... 3Z
3* - CGG AAG .... 5z.
(B) Opakuje se postup podle příkladu 8(A) s tím rozdílem, že se užije T4 DNA polymeráza nebo 3'-$' exonukleáza místo Klenowova fragmentu v druhém inkubačním stupni, to jest za přítomnosti dCTP. Všechny ostatní podmínky jsou
- 54 totožné a v každém případě se také získá stejný sled proř růstový hormon skotu.
Příklad 9
Desoxynukleotidový sled, který je kódem pro růstový hormon skotu se včlení do vektorupro přenos svrchu popsaným způsobem pro sled, který je kódem pro prekursory růstového hormonu.
(A) Opakují se příklady 1, 3(A), 3(B), 4(A$ až (I), 5(A) až (D) a 6, přičemž se užije DNA, připravená podle příkladů 7(A), 7(B) nebo 7(0 místo DNA, která je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu. Všechny další podmínky jsou totožné. DNA se odstraní netrávením příslušným restrikčním enzymem, například jako v tabulce 3 a analyzuje se podle příkladu 2. DNA, jejíž sled začíná kodonem Phe v poloze 2 a končí sledem, znázorněným na obr. 1 je výsledným produktem ve všech případech.
- 55 (B) Opakuje se způsob podle příkladu 1, 3(A), 3(B), 4(A) až (I), 5(A) až 5(B) a 6, přičemž se užije DNA, připravená podle příkladů 8(A) nebo 8(B) místo DNA, která je kódem pro prekurosr růstového hormonu skotu. Všechny ostatní podmínky jsou totožné. DNA se odstraní působením příslušného restrikčního enzymu, tak jak jsou uvedeny například v tabulce 3 a analyzuje se způsobem pádle příkladu 2. Ve všech případech se získá DNA, jejíž sled začíná kodonem pro Ala v poloze 1 a pokračuje sledem, znázorněným na obr. 1.
Příklad 10
Exprese růstového hormonu skotu
Růstovýhormon skotu může být doveden k expresi jakýmkoli ze svrchu popsaných způsobů.
(A) Exprese růstového hormonu skotu ve formě prekursoru jako složené bil
- 56 koviny byla provedena radioimunologicky a při použití ainibuněk. Při radioimunologickém pokusu » byla Escherichia coli chil776 s obsahem pBU348 nebo Escherichia coli s obsahem pBP322 jako kontrola pěstována v živném prostředí a oddělena odstředěním. Buňky byly znovu uvedeny v suspenzi a rozrušeny růstovým hormonem ovce s radioaktivním značením s následným přidáním protilátky proti růstovému hormonu ovce nebo skotu. Imunologický komplex byl vysrážen a jeho přítomnost byla měřena radioaktivním způsobem. Tento pokus prokázal, že si složená bílkovina uchovává aspoň ' z určité částiimunologickou účinnost růstového hormonu skotu. Aby bylo možno dále zkoumat vlastnosti složené bílkoviny, byl proveden pokus na minibuňkách způsobem, popsaným v publikaci Meagher R. B. a další, Cell, 10 521 (1977). Na obr. 2 jsou znázorněný pásy, získané při elektroforéze na gelu při použití materiálu z minibuněk Escherichia coli chi!776. Pás (a) byl získán z buněk, transformovaných pBP348. Pás (b) byl získánz buněk, transformovaných pBR322. Pás (c) je užit pro označení molekulové hmotnosti. (A) označuje složenou bílkovinupři použití β-laktamázy a
- 57 prekursoru růstového hormonu skotu. (B) označuje prekursor laktamázy a (C) označuje β-íaktamázu.
Tento pokus prokazuje, že pBP348 vytváří složenou bílkovinu, která obsahuje 183 aminokyselin β-lak- * tamázy, 217 aminokyselin prekursoru růstového hormonu skotu a malý počet spojujících aminokyselin, které jsou kódem pro oblast 5*^jejíž translaci za běžných podmínek nedochází. Celková molekulová hmotnost je přibližně 45 000 a je v souhlasu a předpokládanou molekulovou hmotností hybridní bílkoviny.
(B) Pro přímou expresi prekursoru růstového hormonu skotu se včleněná DNA nejprve oddělí z pBP348 částečným působením endonukleázy Pst I a čistí preparativní elektroforézou na gelu. 15 ^ug takto čištěné DNA se pak modifikuje tak, že se tato DNA uvede v suspenzi ve vodě, k níž se přidá koncentrovaný roztok solí, takže výsledná směa obsahuje 70 mM tris-pufru o pH 8,8, 70 mM chloridu hořečnatého, 10 mM dithiothreitolu a 13,75 jednotek 74 DNA polymerázy v celkovém ofijemu 250/»1. Reakční směs se inkubuje několik minut při teplotě 37 °C a pak se přidá dATP do konv.%?SžfiíSííí ι ;ΐϊΙί'ί Mž 3.: κ >^44ίΐ44^ζΧ!ί>,
Λ centrace 50 mM k ukončení endonukleolytického netrávení následujícího adeninového zbytku. Po 30 sekundách další inkubace se enzym inaktivuje teplem při teplotě 65 °C na 5 minut. Postup se ještě dvakrát opakuje, v prvním případě se užije dCTP místo dATP a v dalším případě se užije dTTP. Získaná DNA se izoluje vysrážením ethanolem. Působením SI nukleázy se získají požadované zakončení podle svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších. Tímto způsobem se získá molekula DNA, která je ukončena v poloze -26. U těchto molekul dojde k translaci v případě, že se včlení do vektoru pro expresi s místem včlenění 3 sž 11 nukleotidů od místa pro Vazbu ribosomálního sledu v jednotce, určené k expresi.
Vektor pro přímou expresi se získá modifikací plasmidu ptrpE30 tak, že se odstraní nukleotidy 23 až 29 při použití T4 DNA polymerázy a SI nukleázy svrchu uvedeným způsobem.
Modifikovaná cDNA a modifikovaný vektor pro expresi se opatří specifickým vazným řetězcem, který na jednom svém zakončení obsahuje sled 5Z - CCGGATCCGG - 3'a na druhém za- 59 končení obsahuje komplementární sled při použití DNA ligázy podle svrchu uvedené publikace Valenzuelý,
V důsledku toho vznikají restrikční místa, citlivá na endonukíeázu Bam HI, tato místa jsou zavede- * na k usnadnění inzerce. Včlenění se provádí podle . . ; . ,ý;. ; <
svrchu uvedené publikace Ullricha A. a dalších.
Hostitelstá bakterie Escherichia coli HB1O1, RRI
..... . t........ - .
nebo chil776 se transformuje rekombinantním vekto• rem, který nese včleněnou modifikovanou oblast, která je kódam pro prekursor růstového hormonu a transformované kolonie se podrobí výBěru na odolnost k ampicilinu. Pro další analýzu se vybere transformovaná kolonie, která se označí ptrpE30/ /bGH.
Bakteriální buňky, transformované ptrpE30/b(3í se pěstují ve standardním minimálním prostředí M9, které se doplní Leu, Pro, vitamínem B1 a ampicilinem při teplotě 37 °C. *
V časné fázi log se trp operon indukuje přidáním
B kyseliny β-indoly lakrylové v množství 30 ^ug/mi.
U kontrolních kultur se indukce neprovádí. Po dalších 3 hodinách růstují se 1,5 ml buněk radioaktivně značí přidáním 20 ^uGi ^^g-L-Met a buňky se inkubují ještě 10 minut,načež se oddělí odstředě- 60 ním a promyjí, načež se uvedou v suspenzi ve 250 /ul pufru, který obsahuje 10 objemových % glykolu, objemových % β-merkaptoethanolu a 2,3 % (hmotostni/objeové %) SDS v 0,0625 M tris-pufru o pH 6,8. Suspenze se 5 minut vaří a pak se nanese na SDS pčlyakrylamidový gel o koncentraci 10 % (hmotnostní/objemová %) a podrobíse frakcionaci elektroforézouZ. Pásy bílkovin se označí autoradiograficky. Tímto způsobem je možno prokázat páa nové bílkoviny o přibližně 24 000 daltonů, který není možno pozorovat u kultur bez indukce nebo bez transformace.
Prekursor růstového hormonu skotu se čistí běžným způsobem, například filtrací nagelu, chromatografií na iontoměniči, afinitní chromatografií nebo technikami, které využívají, různé rozpustnosti. Prekursor růstového hormonu jemožno převést na růstový hormon následujícím způsobem, který byl popsán ve svrchu uvedené publikaci Jacksona a dalších.
(C) Specifický vazný řetězec ae sledem 5* - CCGGATGCGGATG - 3 na jednom řetězci a s doplňkovým sledem na druhém konci se
61naváže na DNA, která je kódem pro růstový hormon skotu, připravený podle příkladu 7(A) až (C) a 8(A) až (B). Tato modifikovaná DNA se pak včlen#í do modifikovaného plasmidu jtířXS ptrpE3O způsobem, popsaným v příkladu 1O(B). Hostitelská bakterie se transformuje a pěstuje a výsledný růstový hormon ekotu se čistí způsobem, popsaným v příkladu 1O(B).
Vynález byl popsán ve spojení se specifickým provedením, je však zřejmé, že jsou možné další modifikace. Je zřejmé, že do oboru vynálezu spadají také jakékoli variace nebo adaptace uvedeného způsobu v případě, že bude zadhován princip způsobu pddle vynálezu a variace se budou týkat pouze známých nebo běžných reakcí.
Předmět vynálezu:
jíío-Sl f r — - ..
- ť i T
- / ΛΟ T >
* I . í
- I - ' .E /’ · ' ' i ·'» '? I «s ; Ξ ! '
PAT-ENTOVÉ

Claims (1)

  1. NÁROKY
    1. Způsob výroby vektoru pro přenos, obsahujícího kódovou DNA pro aminokyseliny 2-191 růstového hormonu skotu, vyznačující se tím, že se první DNA, obsahující kódový řetězec pro aminokyseliny 2-191 růstového hormonu skotu uvede do styku s druhou DNA, obsahující linearizovaný plasmid hostitele za podmínek, vhodných pro vazbu první DNA na druhou DNA za vzniku vektoru pro přenos, který se pak izoluje.
    2. Prostředek s, obsahem molekul DNA,, obsahujících.kódové řetězce pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu.
    3. Prostředek podle nároku 2, obsahující kódovou DNA pro prekursor růstového hormonu skotu.
    4. Rekombinantní systém pro expresi pro ovlivnění exprese kódové DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu v hostitelské buňce, vyznačující se tím, že obsahuje kódovou DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, operativně vázanou na řídící řetězce, kompatibilní s hostitelskou buňkou.
    5. Rekombinantní systém pto expresi podle nároku 4, vyznačující se tím, že je uložen v plasmidu.
    6Ů Rekombinantní systém pro expresi podle nároku 4, vyznačující se tím, že kódová DNA pro aminokyseliny 2 'až 191 růstového hormonu skotu obsahuje kódové řetězce pro další aminokyseliny, takže je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu.
    II
    7. Rekombinantní systém pro expresi podle nároku 5, vyznačující se tím, že je uložen v plasmidu.
    8. Způsob výroby bílkoviny, obsahující aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, vyznačuj íc í se t í m, že se pěstují buňky, obsahující systém, který v hostitelské buňce ovlivňuje expresi kódové DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, přičemž tento systém je tvořen kódovou DNA pro aminokyseliny 2 až 191 růstového hormonu skotu, operativně vázanou na řídící řetězce, kompatibilní s buňkou hostitele za podmínek, při nichž dochází k expresi kódové DNA za vzniku bílkoviny, která se z kultury izoluje.
    9. Způsob podle nároku 8, vyznačuj íc í se t í m, že kódová DNA pro aminokyselina 2 až 191 růstového hormonu skotu obsahuje kódové řetězce pro další aminokyseliny, takže je kódem pro prekursor růstového hormonu skotu.
    Zastupuje x
    . - .....
    /· ΓΊ i í
    -26 -20 met met ala ala gly pro arg thr ser leu leu leu ala phe ala leu ACGGCTCAGGGTCCGTGACGCTCACCAGCT ATG ATG GCT GCA GGC CCC CGG ACC TCC CTG CTC CTG GCT TTC GCC CTG
    A H 0 U u 0 CLU O P £4 fl Η c u CPU -4 u Cl U x; u Cl O r4 >, < r-4 U tn < P u <3 (0 o CLU M < P £4 r4 P £4 fl u fl *( (0 0 O <* c o Φ U O U Cl U r4 U CPU ta U 01 U tn < r4 £4 U U Φ U fl £4 P u so 0 (0 < •rl < CLU tn £4 > u fl u rP < U £4 u a u P U O 03 U . . c u Cp£4 O u 3 U 0 tn U U P u >-, \X3 rH U r-4 P u P u 0) £4 co >-,< U (0 o P £4 H3 U cpu fl U CL U P U r-( r-l u 0) E-> P U 0 u Φ u CLU P u ' 3 U P u u -C X J-ι (J P £4 tn < X u Q) £4 0) £4 E-i 0, E4 P <5 CLU •rl < « U +> < rp U ε < <j 3 o CP £4 <u cj 3 U P U 0 AU fl u P u U 0) E-I Ci U <U £4 a> u fl p O r4 U fl £4 P U 3 U Ή < P u tn £4 ,—4 σ>υ fl u > u O >U M U 3 U P u CL £4 CLU tj>u U P U P < jC U Φ H X u tn < tn < p 0 u cpu CPU X» < <—( u P < fl u fl U fl < O p U Φ £4 d *ú 0 3 U >iU CLU 3 U U Φ u x Η 00 Φ £4 r-4 U r-p tn < d) £4 u ω H Cl £4 CpU r-l U CPU CPU fl U P O u CJ «MB 3 O 3 U M U P < dl £4 3 U P Η P u u a) Η r-4 < <y CJ 0) U X £4 OJ £4 d) u X H P E-l CPU « Ε-» tn £4 CL £4 _r-p U w < P £4 U U p u 0 ω < Φ U <t> u r-4 U 3 U O CPU P 0 U aj u m X5 £“· *-4 £4 fl £4 r-4 tn p u X u U tn E-i 1-4 r=C CLEh Ή < > U CPU rp fl U P < O &-< P O Φ U w u CPU 3 U CPU P u 3 U E^ Q) ř-i X £4 P 0 d) £4 P 0 QJ Ě4 P < E-< 6 < CL £4 a fl u r4 £4 fl u ε < CpU U E-< n> u P U OJ u 3 £4 OPU P u c u P u E-* r-4 P U X u Λ H φ £4 O d) U 0) £4 tn < X u U <a o 44 < ChH r-4 U r-4 tn < ε < fl < P < E·* O >1 o < CLU Π3 u 3 U c u 3 U P < tn u E-< r—I >4 U tn < rd U aj £4 in < Φ £4 x u >-,< 0 CLU 3 U (0 u -4 u fl < rp O p < P < U CJ CL 0) u 3 £4 O ř-H H 3 u P u fl U CLU 0 tn £4 u U E-, 1-4 U u*i ifl H r*4 r=C x u *P U tn < Γ' P < u CL £4 fl U > U cpu P < fl u fl u P X U u u u E-í fl U fl £4 C U 3 u 0) u 3 U d) £4 3 U 0 < P U P U cd tu £4 X £4 d) Η X £4 ω £4 &-» u 3 O fl U cpu r-4 £4 CL £4 ,Ρ £4 CL £4 P u E-i u Eh >,U 3 U μι q CLU r4 U O d) U tn < CLU O Eh r-ι o <u £4 i u tn < fl £4 (N rp £4 tn < 2J < cp o -4 U 4J < fl u > U ,—l -Ip Ffl P <c fl U < E-· 2 P U c u cj Cl < CP< >,u CLU tn U r-| Φ U u fl H 1—1 f£ Λ <2 0) U p U rP U tn < cn x: E-i u > O CPU . 03 2 tn £4 fl < CPU fl u p 2 r-l CL E· U P U tn u C u 0 tn f£ P u 3 5 P £4 CpU O 03 u fl £4 -4 FÍ r-í rij Γ' >-,i=5 d) u X P U Ch rd CJ > U X u CPU tn < CPU P £4 fl O rd 03 U 5 c 0 3 U Φ U c 0 3 u 3 O P u Φ O W E-* 2 P < GJ £4 r—1 £-4 r-4 < oj £4 r—1 X u x £4 >nU CnU P U H *í CPU c-4 U CPU P < a, £4 U Ε-» £4 H 0 tn u J-J CJ c 0 Q) £4 3 U c u tn u U £4 x; u (N —1 < <D U r-i < X £4 OJ £4 P AU Φ U u 4-> < x u W Ε-» cnu CL £4 r4 CJ CPU U £4 tn < u E-* CLU c o μ, CJ OJ U C U CLU tn O P U 03 U E-* S4 U P *=£ •v. t£ r-l U rp <C tn < >1 < Φ U r-l CJ e~i 4-1 £4 cpu **s P £4 oj U CPU fl u P 3 tn £4 03 U u CJ 0 u a £4 3 U O 3 U tn u 3 U 3 U 3 U E-· >4 U r-4 U μ, •M < CP OJ £4 >,< 0) £4 Φ £4 u au fl u fl < CPU rP U rP < P U p u CPU E-« CJ □ u cpu c* ř 0 £ E-t 0 u 3 U 0) U 3 U >.U < 0) E-i Cl U Ml r—J <C Ul < P u d) £4 r—1 Φ £4 r-4 CJ u H.U fl U- cpu OJ < ClU 1—1 u •r-l p u CP u u 0 tn u 3U *V. itf V) U AU w u O c u 0 >,£4 QJ U AO Φ £4 r-l O .P U 'V' r-l < to t—1 U x: e-« u U E-I P U CpU r-l <C CPU r-l < r-l σ>υ P CPU Ch H < CJ 3 U r-4 U f n >u 3 £4 3 U >u P u CPU u Oj £4 fl £4 P-f 1—1 *C r-l O d> £4 «—1 r-| O X >-» u u r-l U > u CPU CPU rP U CJ>U CPU P £4 03 U E-<
    ία] (b) (c)
    MKfl* (A)
    AilíeáS»
    T^RWJF (Β) (Ο
CS816360A 1980-08-26 1981-08-26 Způsob výroby vektoru pro přenos DNA CZ280596B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18134880A 1980-08-26 1980-08-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ636081A3 true CZ636081A3 (en) 1995-02-15
CZ280596B6 CZ280596B6 (cs) 1996-03-13

Family

ID=22663908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS816360A CZ280596B6 (cs) 1980-08-26 1981-08-26 Způsob výroby vektoru pro přenos DNA

Country Status (24)

Country Link
EP (1) EP0047600B1 (cs)
JP (2) JP2534221B2 (cs)
KR (1) KR830007822A (cs)
AT (1) ATE72833T1 (cs)
AU (1) AU544453B2 (cs)
CA (1) CA1225948A (cs)
CZ (1) CZ280596B6 (cs)
DD (4) DD212267A5 (cs)
DE (1) DE3177273D1 (cs)
DK (1) DK372881A (cs)
ES (2) ES504968A0 (cs)
FI (1) FI812614L (cs)
GR (1) GR74350B (cs)
HU (1) HU195535B (cs)
IE (1) IE52755B1 (cs)
IL (1) IL63628A (cs)
NZ (1) NZ198050A (cs)
PH (2) PH21216A (cs)
PL (1) PL232797A1 (cs)
PT (1) PT73569B (cs)
RO (1) RO105533B1 (cs)
SU (1) SU1471949A3 (cs)
YU (1) YU44962B (cs)
ZA (1) ZA815696B (cs)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4443539A (en) * 1980-02-05 1984-04-17 The Upjohn Company Process for preparing bovine growth hormone
JPS58996A (ja) * 1981-06-01 1983-01-06 ザ・ボ−ド・オブ・トラステイ−ズ・ミシガンステ−トユニバ−シテイ− 細菌中での牛成長ホルモン遺伝子のクロ−ン化
US5254463A (en) * 1981-09-18 1993-10-19 Genentech, Inc. Method for expression of bovine growth hormone
ATE83799T1 (de) * 1981-09-18 1993-01-15 Genentech Inc Verfahren und produkte zur leichten mikrobiologischen expression von dns-sequenzen.
NZ201918A (en) * 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
IE55244B1 (en) * 1982-05-25 1990-07-18 Lilly Co Eli Cloning vectors for expression of exogenous protein
EP0103395A3 (en) * 1982-08-17 1985-05-22 Biogen N.V. Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield
JPS59501852A (ja) * 1982-09-16 1984-11-08 アムジエン 鳥類の成長ホルモン
CA1341012C (en) * 1982-09-27 2000-06-06 Biogen, Inc. Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing swine growth hormone-like polypeptides
AU2092983A (en) * 1982-11-08 1984-05-17 Genentech Inc. Porcine growth hormone produced by recombinant dna technology
ZA837173B (en) * 1982-11-08 1984-05-30 Univ Case Western Reserve Genomic bovine growth hormone
EP0111814A3 (en) * 1982-12-16 1985-08-14 Mgi Pharma, Inc. The cloning and expression of nucleotide sequences encoding bovine growth hormone
DE3247922A1 (de) * 1982-12-24 1984-06-28 Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim Dna-sequenzen, deren herstellung, diese sequenzen enthaltende plasmide und deren verwendung zur synthese eukaryotischer genprodukte in prokaryoten
JPS6011557A (ja) * 1983-04-19 1985-01-21 ジエネツクス・コ−ポレイシヨン クロ−ンヒツジ成長ホルモン遺伝子
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US5198361A (en) * 1983-07-15 1993-03-30 Bio-Technology General Corp. Plasmids for production of met-asp-gln bovine growth hormone, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods
BG49718A3 (en) * 1983-07-15 1992-01-15 Bio Technology General Corp Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty
US4521409A (en) * 1983-10-03 1985-06-04 Cornell Research Foundation, Inc. Use of growth hormone to enhance ruminant mammary development
US4935370A (en) * 1983-12-23 1990-06-19 Pfizer Inc. Expression plasmids for improved production of heterologous protein in bacteria
DE3484926D1 (de) * 1983-12-23 1991-09-19 Pfizer Expressionsplasmide fuer die herstellung eines heterologen proteins in bakterien.
US5489529A (en) * 1984-07-19 1996-02-06 De Boer; Herman A. DNA for expression of bovine growth hormone
US5037806A (en) * 1985-02-22 1991-08-06 Monsanto Company Biologically active method using somatotropins
US4861868A (en) * 1985-02-22 1989-08-29 Monsanto Company Production of proteins in procaryotes
EP0229110B1 (en) 1985-06-26 1992-05-20 The Upjohn Company Solubilization and oxidation of somatotropin from transformed microorganisms
US4786501A (en) * 1985-07-15 1988-11-22 International Minerals & Chemical Corp. Cylindrical implants for the controlled release of growth hormones
US5631227A (en) * 1985-09-18 1997-05-20 The Upjohn Company Somatotropin analogs
JPS63500941A (ja) * 1985-09-18 1988-04-07 ジ・アップジョン・カンパニ− 選択的脱アミノ化による哺乳動物ソマトトロピンの生物学的活性の増強
ES2019874B3 (es) * 1986-10-08 1991-07-16 Upjohn Co Bioactividad mejorada de somatotropina de mamiferos mediante desamidacion selectiva.
US5215896A (en) * 1987-03-20 1993-06-01 Creative Biomolecules, Inc. Leader sequences for the production of recombinant proteins
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5268284A (en) * 1988-03-11 1993-12-07 The Upjohn Company Ribosome binding site
JP2787729B2 (ja) * 1990-08-02 1998-08-20 株式会社ニッポンジーン 組換え型ミンク成長ホルモン遺伝子、組換え型ミンクプレ成長ホルモン遺伝子、ミンク成長ホルモン又はミンクプレ成長ホルモン形質転換プラスミド、及び、ミンク成長ホルモン又はミンクプレ成長ホルモン形質転換大腸菌
AT500850B1 (de) 2000-12-26 2007-10-15 Monsanto Technology Llc Rekombinante dna-vektoren zur expression von somatotropinen

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT373279B (de) * 1977-11-08 1984-01-10 Genentech Inc Verfahren zur herstellung eines rekombinationsclonbildungstraegers
IE48385B1 (en) * 1978-08-11 1984-12-26 Univ California Synthesis of a eucaryotic protein by a microorganism
GR68404B (cs) * 1979-06-01 1981-12-29 Univ California
IL59690A (en) * 1980-03-24 1983-11-30 Yeda Res & Dev Production of bovine growth hormone by microorganisms and modified microorganisms adapted to produce it

Also Published As

Publication number Publication date
ES514526A0 (es) 1983-04-16
JP2763024B2 (ja) 1998-06-11
DD212403A5 (de) 1984-08-15
ATE72833T1 (de) 1992-03-15
IL63628A0 (en) 1981-11-30
AU7449681A (en) 1982-03-04
DD211581A5 (de) 1984-07-18
PH22847A (en) 1989-01-19
NZ198050A (en) 1984-12-14
RO105533B1 (ro) 1995-10-01
ES8305828A1 (es) 1983-04-16
PT73569B (en) 1982-11-09
DD204711A5 (de) 1983-12-07
EP0047600B1 (en) 1992-02-26
IE52755B1 (en) 1988-02-17
YU206281A (en) 1984-08-31
JP2534221B2 (ja) 1996-09-11
ES8405072A1 (es) 1984-05-16
GR74350B (cs) 1984-06-26
ZA815696B (en) 1982-08-25
SU1471949A3 (ru) 1989-04-07
PH21216A (en) 1987-08-21
CA1225948A (en) 1987-08-25
JPS57171999A (en) 1982-10-22
FI812614L (fi) 1982-02-27
PT73569A (en) 1981-09-01
ES504968A0 (es) 1984-05-16
EP0047600A2 (en) 1982-03-17
CZ280596B6 (cs) 1996-03-13
IL63628A (en) 1991-06-10
HU195535B (en) 1988-05-30
EP0047600A3 (en) 1982-10-20
JPH09135691A (ja) 1997-05-27
DK372881A (da) 1982-02-27
DD212267A5 (de) 1984-08-08
DE3177273D1 (de) 1992-04-02
YU44962B (en) 1991-06-30
AU544453B2 (en) 1985-05-30
IE811822L (en) 1982-02-26
KR830007822A (ko) 1983-11-07
PL232797A1 (en) 1983-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ636081A3 (en) Process for preparing a vector for dna transfer
Derynck et al. Human transforming growth factor-α: precursor structure and expression in E. coli
AU620673B2 (en) Somatotropin analogs
EP0020147B2 (en) A dna transfer vector for human pre-growth hormone, a microorganism transformed thereby, and a method of cloning therefor
US4693973A (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield
JP2863113B2 (ja) 豚ソマトトロピンを含有する家畜の成長制御用組成物
KR920005918B1 (ko) 인간 푸리푸로 인슐린-양성장 인자 i
JPS63251095A (ja) 新規融合蛋白質およびその精製方法
EP0111389A2 (en) Substantially pure porcine growth hormone, DNA sequences therefor, and expression vehicles and transfected microorganisms for the production of porcine growth hormone
KR870000501B1 (ko) 사람의 프로인슐린의 아미노산 배열을 함유하는 단백질의 제조방법
US4675297A (en) Genes encoding bovine prolactin
EP0046669B1 (en) Somatostatin or somatostatin precursors
JP2612264B2 (ja) Ｄｎａ配列体
US6054291A (en) Expression vectors for enhanced production of polypeptides, plasmids containing the vectors, hosts containing the plasmids, products manufactured thereby and related methods
US6194200B1 (en) Expression systems for preparation of polypeptides in prokaryotic cells
US6692941B1 (en) Bovine growth hormone
JPS61149089A (ja) Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物
US5332664A (en) Human calcitonin precursor polyprotein structural gene
WO1986005805A1 (en) A dna sequence
KR860001922B1 (ko) 소의 성장 호르몬을 유전 암호화하는 데옥시뉴클레오티드 배열을 발현시키는데 사용하기 위한 발현 전달 벡터의 제조 방법
US5268284A (en) Ribosome binding site
US7101981B1 (en) Bovine growth hormone recombinantly produced in E. coli
JPS63313586A (ja) ＴＧＦ−α

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20010826