CZ304966B6 - Syntetický způsob výroby ecteinascidinových sloučenin - Google Patents

Abstract

Způsoby výroby ecteinascidinové sloučeniny, kdy se při jednom kroku způsobu odchrání sloučenina vzorce A, kde Prot.sup.NH.n. je amin chránicí skupina a Prot.sup.OH.n. je hydroxy chránicí skupina odstraněním obou chránicích skupin v jediném kroku, za vzniku .alfa.-aminolaktonu vzorce 35.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká syntetických způsobů zvláště syntetických způsobů výroby ecteinascidinových sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Evropský patent 309 477 se týká ecteinascidinů 729, 743, 745, 759A, 759B a 770. Bylo popsáno, že ecteinascidinové sloučeniny vykazují antibakteriální a jiné užitečné vlastnosti. S ecteinascidinem 743 jako protinádorovým činidlem se nyní provádějí klinické testy.

Ecteinascidin 743 je tvořen komplexní tris(tetrahydroisochinolinfenolovou) strukturou a má vzorec I.

V současné době se získává izolací z extraktů mořského pláštěnce Ecteinascidin turbinata. Výtěžek je nízký a hledají se alternativní způsoby přípravy.

Syntetický způsob výroby ecteinascidinových sloučenin jsou popsány v Patentu US 5 721 362, viz také WO 9 812 198, který je uveden v odkazech. Tento způsob je dlouhý a komplikovaný aje tam uvedeno 38 příkladů, kde každý popisuje jeden nebo více kroků syntézy ecteinascidinů 743.

V tomto známém syntetickém způsobu se 1,4 můstek vytvoří použitím kondenzované 1—labilní, 10-hydroxy, 18-chráněná hydroxy, di-6,8-en-5-on sloučeniny. Jak je ukázáno v příkladu 33, přemění se sloučenina 13 na sloučeninu 14.

-1 CZ 304966 B6

V tomto známém syntetickém způsobu se dále na 1,4 můstku vytvoří spirochinolin pomocí kroků uvedených v příkladech 34 až 36, čímž dojde k odstranění 18-MOM chránící skupiny, což vede ke vzniku ecteinascidinu 770, který lze poté přeměnit na ecteinascidin 743.

V nároku 25 patent US 5 721 362 je jako meziprodukt popsána fenolová sloučenina, která je označována také jako meziprodukt 11 nebo Int-11. Tato sloučenina je tvořena bis(tetrahydroisochinolinfenolovou) strukturou a má vzorec II,

kde MOM je methoxymethyl a TBDPS je terc.butyldifenylsilyl.

Z meziproduktu 11 lze syntetizovat další protinádorové činidlo fthalascidin, viz Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 96, 3496-3501, 1999. Fthalascidin je derivát bis(tetrahydroisochinolinfenolu) a má vzorec III.

(III),

V ecteinascidinech 743 a 770 má 1,4 můstek strukturní vzorec IV.

-2CZ 304966 B6

Mezi další známé ecteinascidiny patří sloučeniny s odlišným systémem přemostění, například v ecteinascidinu 722 a 736, kde má můstek strukturní vzorec V,

(V), dále v ecteinascidinu 583 a 597, kde má můstek strukturní vzorec VI, (VI),

Π YnYlHj a dále v ecteinascidinu 594 a 596, kde má můstek strukturní vzorec VII.

Kompletní struktura těchto a odvozených sloučenin je uvedena vJ. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 9017-9023. Tento článek je uveden v odkazech.

Mezi další literaturu týkající se ecteinascidinových sloučenin patří Corey, E. J., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, pp. 9202-9203, dále Rinehart et al., Journal ofNatural Products, 1990, „Bioactive Compounds from Aquatic and Terrestrial Source“, vol. 53, pp. 771-792, dále Rinehart et al., Pure and Appl. Chem., 1990, „Biologically active natural products“, vol. 62, pp. 1277-1280, dále Rinehart et al., J. Org. Chem. 1990, „Ecteinascidiny 729, 743, 745, 759A, 759B, and 770, potent Antitumour Agents from the Caribeean Tunicate Ecteinascidia turbinata“, vol. 55, pp. 4512-4515; dále Wright et al., J. Org. Chem., 1990, „Antitumour Tetrahydroisoquinoline Alkaloids from the Colonial Ascidian Ecteinascidia turbinata“, vol. 55, pp. 4508^4512, dále Sakai et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1992, „Additional antitumur acteinascidins from Carbbean tunicate: Crystal structurs and activities in vivo“, vol. 89, pp. 11 456-11 460, dále Science, 1994, „Chemical Prospectors Scour the Seas for Promising Drugs“, vol. 266, pp. 1324, dále Koenig, K. E., „Asymmetric Synthesis, ed. Morrison, Academie Press, Inc., Orlando, FL, vol. 5, 1985, pp. 71, dále Bartoň et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1, 1982, „Synthesis and Properties of Series of Sterically Hindered Guanidine bases“, pp. 2085, dále Fukuyama et al., J. Am. Chem. Soc., 1982,

-3 CZ 304966 B6 „Stereocontrolled Total Synthesis of (+)-Saframycin B“, vol. 104, pp. 4957, dále Fukuyama et al., J. Am. Chem. Soc., 1990, „Total Synthesis of (+)-Saframycin A“, vol. 112, p. 3712, dále Saito et al., J. Org. Chem., 1989, „Synthesis of Saframycins. Preparation of a Key tricyclic Lactam Intermediate to Saframycin A“, vol. 54, 5391, dále Still et al., J. Org. Chem.,. 1978, „Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resoluion“, vol. 43, p. 2923, dále Kofron, W. G., Baclawski, L. M., J. Org. Chem., 1976, vol. 41, 1879, dále Guan et al., J. Biomolec. Struc. & Dynam., 1993, vol. 10, pp. 793-817, dále Shamma et al., „Carbon-13 NMR Shift Assignments of Amines and Alkaloids“, 1979, p. 206, dále Lown et al., Biochemistry, 1982, 21, 419-428, dále Zmijewski et al., Ceem. Biol. Interactions, 1985, 52, 361-375, dále CRC Crit. Rev. Anal. Chem., 1986, 17, 65-143, dále Rinehart et al., „ Topics in Pharmaceutical Sciences 1989“, 1989, pp. 613-626, Breimer, D. D., Cromwelin, D. J. A., Midha K., eds. Amsterdam Medical Press Β. V., Noordwijk, The Netherlands, dále Rinehart et al., „Biological Mass Spectrometry“, 1990, pp. 233-258, eds. Burlingame et al., Elsevier Amsterdam, dále Guan et al., Jour. Biomolec. Struc. & Dynam., 1993, vol. 10, pp. 793-817, dále Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, pp. 2721-2722, dále Lichter et al., „Food and Drugs from the Sea Proceedings“, 1972, Marině Technology Society, Washington, D.C. 1973, pp. 117-127, dále Sakai et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, p. 9017, dále Garcia-Rocha et al., Brit. J. Cancer, 1996, 73, pp. 875-883, a dále Pommier et al., Biochemistry, 1996, 35, pp. 13 303-13 309.

Dále jsou známé sloučeniny, které systém přemostění postrádají. Patří mezi ně například bis(tetrahydroisochinolinchinonová) protinádorová antimikrobiální antibiotika, to jest safraciny a saframyciny, a mořské přírodní látky, to jest renieramiciny a xestomycin, které byly izolovány z kultivovaných mikroorganismů nebo hub. Všechny tyto sloučeniny mají dimemí tetrahydroisochinolinovou uhlíkovou strukturu. Tyto sloučeniny lze klasifikovat do čtyř typů, typy I až IV, podle typu oxidace aromatických kruhů.

Do třídy typ I, dimerické isochinolinchinony, patří sloučeniny obecného vzorce VIII,

(Vlil), viz následující tabulka I.

-4CZ 304966 B6

Tabulka I. Saframycinová antibiotika typu I

Sloučenina	R14a	R14b	Substituenty p21 p25a p25b	R25c
saframycin A	H	H	CN	0	0	ch3
saframycin B	H	H	H	0	0	ch3
saframycin C	H	och3	H	0	0	ch3
saframycin G	H	OH	CN	0	0	ch3
saframycin H	H	H	CN	OH	CH2COCH3	ch3
saframycin S	H	H	OH	0	0	ch3
saframycin Y3	H	H	CN	nh2	H	ch3
saframycin Yd!	H	H	CN	nh2	H	c2h5
saframycin Adi	H	H	CN	0	0	c2h5
saframycin Yd2	H	H	CN	nh2	H	Η
saframycin Y2b	H	Qb	CN	nh2	H	ch3
saframycin Y2M	H	Qb	CN	nh2	H	c2h5
saframycin AH2	H	H	CN	Ha	OHa	ch3
saframycin AH2Ac	H	H	CN	H	OAc	ch3
saframycin AHí	H	H	CN	OHa	Ha	ch3
saframycin AH,Ac	H	H	CN	OAc	H	ch3
saframycin AR3	H	H	H	H	OH	ch3

^a substituenty lze zaměnit ^b kde má skupina Q vzorec IX ch₃.

cb,O'

(IX),

Aromatické kruhy typu I se nacházejí v saframycinech A, B a C, dále G a H, a dále S, které se jako vedlejší složky izolují ze Streptomyces lavendulae. Kyano derivát saframycinu A, který je označován jak okyanochinonamin, je známý z Japanese Kokai JP-A2 59/225 189 a 60/084 288. Saframyciny Y₃, Yd], Adi a Yd₂ byly připraveny ze S. lavendulae řízenou biosyntézou ve vhodně složeném kultivačním médiu. Dimery saframycinů Y₂b a Y₂b-d, připravené spojením dusíku na C10 25 jedné jednotky s C-14 druhé jednotky, byly také připraveny ve vhodně složeném kultivačním médiu A lavendulae. Saframycin AR] (= AH₂), produkt mikrobiální redukce saframycinu A na

-5CZ 304966 B6

C-25, který je produkován Rhodococcus amidophilus, lze také připravit nestereoselektivní chemickou redukcí saframycinu A pomocí tetrahydroboritanu sodného za vzniku 1:1 směsi epimerů s následnou chromatografickou separací (druhý izomer AH] je méně polární). Další produkt redukce saframycin AR₃, 21-dekyano-25-dihydrosaframycin A (25-dihydrosaframycin B), byl připraven stejnou mikrobiologickou přeměnou. V jiném typu mikrobiologické přeměny saframycinu A vzniká za přítomnosti druhů Nocardia saframycin B a redukcí za přítomnosti druhů Mycobacterium dále vzniká saframycin AH]Ac. 25-O-acetáty saframycinu AH₂ a AH] lze pro biologické studie připravit také chemicky.

ío Sloučeniny typu I obecného vzorce X lze také izolovat z mořských hub,

O^R viz tabulka II.

Tabulka II. Sloučeniny typu I z mořských hub

Sloučenina	R14a	R14b	Substituenty R21	R
renieramycin A	OH	H	H	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycin B	OC2H5	H	H	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycin C	OH	0	0	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycin D	OC2H5	0	0	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycin E	H	H	OH	-C(CH3)=CH-CH3
renieramycin F	och3	H	OH	-C(CH3)=CH-CH3
xestomycin	OCH3	H	Η	-ch3

Reniermyciny A až D spolu s biogeneticky příbuznými monomemími isochinoliny (renieron) a příbuznými sloučeninami byly izolovány z antimikrobiálního extraktu hub, z druhů Reniera sesbíraných v Mexiku. Struktura reniermycinu A byla původně určena s inverzní stereochemií na uhlících C-3, C-ll a C—13. Důkladným zkoumáním ’HNMR dat příbuzných sloučenin (renie25 ramycinů E a F) izolovaných ze stejných hub sesbíraných v Palu bylo zjištěno, že kruhové spojení je u renieramycinů stejné jako u saframycinů. Tento výsledek vedl k závěru, že kdysi určená stereochemie renieramycinů A až D je stejná jako u saframycinů.

Xestomycin byl nalezen v houbě, druhy Xestospongia, odebrané z vod Sri Lancan.

Mezi sloučeniny typu II s redukovaným hydrochinonovým kruhem patří saframyciny D a F, izolované z S. lavendulae, a saframyciny Mx-1 a Mx-2, izolované z Myxococcus xanthus obecného vzorce XI,

viz tabulka III.

Tabulka III. Sloučeniny typu II

Sloučenina	R14a	R14b	Substituenty	R25c
R2’	R25a	R25b
saframycin D	0	0	H	0	0	CH3
saframycin F	0	0	CN	0	0	ch3
saframycin Mx-1	H	och3	OH	H	ch3	nh2
saframycin Mx-2	H	och3	H	H	ch3	nh2

Struktur typu III byla nalezena v antibiotikách safracinu A a B izolovaných z kultivované Pseu15 domonas fluorescens. Tato antibiotika jsou tvořena tetrahydroisochinolinchinonovou a tetrahydroisochinolinfenolovou jednotkou a mají obecný vzorec XII,

₀Á/CH, ňh₂ kde R²¹ je -H v safracinu A aje -OH v safracinu B.

Saframycin R, jediná sloučenina klasifikovaná se strukturou typu IV, byl také izolován zS. lavendulae. Tato sloučenina je tvořena hydrochinonovým kruhem s esterem kyseliny glyko-7CZ 304966 B6 love jako postranním řetězcem na jednom z kyslíku fenolu, je považována za prekurzor saframycinu A pro její mírnou toxicitu a má vzorec XIII.

(XIII),

Všechny tyto známé sloučeniny mají systém kondenzovaných pěti kruhů A až E jak je patrné z následujícího obecného vzorce XIV.

(XIV)

V ecteinascidinech a některých dalších sloučeninách jsou kruhy A a E fenolické, v jiných sloučeninách, jmenovitě v saframycinech, jsou kruhy A a E chinolické. Ve známých sloučeninách jsou kruhy B a D tetrahydro, zatímco kruh C je perhydro.

Podstata vynálezu

Stále existuje potřeba hledat alternativní syntetické způsoby vedoucí k přípravě ecteinascidinových a jim příbuzných sloučenin. Takovéto syntetické způsoby případně znamenají ekonomičtější cesty k přípravě známých protinádorových činidel stejné jako k přípravě nových účinných sloučenin.

Tento vynález se týká syntetických způsobů přípravy meziproduktů, derivátů a sloučenin se strukturou příbuznou ecteinascidinům nebo jiných tetrahydroisochinolinfenolových sloučenin.

Tento vynález se týká způsobu přípravy ecteinascidinové sloučeniny se spiroamin-l,4-můstkem. Při této přípravě dochází k vytvoření 1,4 můstku pomocí kondenzované 1—labilní, 10-hydroxy, 18-chráněná hydroxy, di-6,8-en-5-on sloučeniny, přičemž kondenzovaný kruh má obecný vzorec XIV. V tomto vynálezu dochází k odstranění C-l 8 chránící skupiny před vnesením spiroaminu.

Mezi výhodné výchozí látky pro nové syntetické způsoby patří sloučeniny příbuzné přírodním bis(tetrahydroisochinolinovým) alkaloidům. Takovéto výchozí látky lze připravit buď z různých tříd saframycinových a safřacinových antibiotik dostupných z různých kultivačních půd jak je detailně uvedeno ve WO 0 069 862, který je uveden v odkazech, nebo jinými syntetickými nebo biochemickými postupy. Tato PCT přihláška nárokuje prioritu z přihlášky PCT/GB 00/01 582

-8CZ 304966 B6 publikované jako WO 0 069 862. Tento text je v plném rozsahu uveden v odkazech a není uveden v popisu vynálezu.

Výhodná provedení tohoto vynálezu

Tento vynález se týká použití meziproduktu 21 v řadě nových syntetických způsobů přípravy ecteinascidinu 743 a příbuzných sloučenin a má vzorec XV.

Meziprodukt 21 má 5-allyloxy skupinu, kde allylová skupina slouží k ochraně 5-hydroxylové skupiny. Tento vynález se týká i použití jiných skupin chránících 5-hydroxylovou skupinu. Příprava ecteinascidinu 743 a příbuzných sloučenin.

Přeměna meziproduktu 21 nebo příbuzné látky na ecteinascidinovou sloučeninu obvykle obsahuje následující klíčové přeměny

a) přeměna NH₂ na OH reakcí například s dusitanem sodným v kyselině octové,

b) £-kruhová fenolová ochrana,

c) esterifikace pomocí chránění primární 1-hydroxylové funkční skupiny chráněným cysteinovým postranním řetězcem,

d) sejmutí skupiny chránící allylovou skupinu a oxidace,

e) vytvoření přemostění cyklizační reakcí,

f) sejmutí chránících skupin z £-kruhového fenolu a cysteinového zbytku,

g) vnesení chinolinu trans-aminační reakcí a Pictet-Spenglerovou reakcí.

Vysoká funkčnost meziproduktů vyžaduje pro £-kruhový fenol a pro cysteinový postranní řetězec použití chránících skupin, aby se zabránilo nežádoucím vedlejším reakcím.

V závislosti na výběru chránících skupin lze vytvořit množství alternativních meziproduktů.

Tyto přeměny lze navzájem jakkoliv kombinovat v závislosti na chránících skupinách vybraných pro fenolový kruh a pro amin na cysteinovém postranním řetězci.

Celkový počet syntetických přeměn je také funkcí vybraných chránících skupin.

Pro ilustraci je níže popsáno použití různých kombinací chránících skupin v šesti typických cestách přípravy ET-743 z meziproduktu 21, který je zde označen také jako SF21.

-9CZ 304966 B6

cesta	fenolová ochrana	cysteinová ochrana	počet kroků
1	MOM	Boc	12
2	MEM	Boc	10
3	MEM	Cbz	11
4	MOM	Alloc	13
5	MEM	Alloc	13
6	MOM	Cbz	15

MEM je methoxyethoxymethyl, Boc je terc.butyloxykarbonyl, Cbz je benzyloxykarbonyl a Alloc je allyloxykarbonyl.

Reakční schémata popsaná níže lze modifikovat a/nebo různými způsoby kombinovat a tento vynález se také týká i těchto alternativních způsobů a sloučenin při nich vzniklých.

Tento vynález se týká také použití jiných chránících skupin.

Detailní popis šesti typických syntetických cest

Celá reakční schémata pro každou cestu jsou uvedena na následujících schématech 1 až 6.

-10CZ 304966 B6

Schéma 1 - ET-743. Semisyntetická alternativní cesta 1.

(02Z-J3)

Schéma 2 - ET-743. Semisyntetická alternativní cesta 2.

<5* %

i·

s

fe.

£ í

12CZ 304966 B6

Schéma 3 - ET-743. Semisyntetická alternativní cesta 3.

- 13 CZ 304966 B6

Schéma 4 - ET-743. Semisyntetická alternativní cesta 4.

n

14CZ 304966 B6

Schéma 5 - ET-743. Semisyntetická alternativní cesta 5.

Schéma 6 - ET-743. Semisyntetická alternativní cesta 6.

(168) (36) (36) (Et-770)

- 16CZ 304966 B6

Chránění £-kruhového fenolu je v cestě 1 dosaženo třemi kroky, které obsahují navázání/sejmutí chránicí skupiny Troc (2,2,2-trichlorethyloxykarbonyl) z aminu SF21.

Chránění cysteinového postranního řetězce pomocí Boc v cestě 1 a 2 vede k tomu, že u fenolové a cysteinové skupiny dojde k sejmutí chránicí skupiny v jednom kroku namísto dvou oddělených kroků. U ostatních cest je k sejmutí chránicí skupiny nutný jeden krok navíc.

V cestě 2 nevzniká meziprodukt 25, protože se použije přímá esterifikační metoda následovaná chráněním fenolu MEM skupinou.

V cestě 2 a 3 dochází k chránění £-kruhového fenolu až po proběhnutí diazotačních a esterifikačních kroků, což vede k navázání skupiny chránicí fenol v jednom kroku namísto tří kroků uvedených v cestě 1.

V cestě 1, 2 a 3 eliminuje přímá esterifikace primárního alkoholu cysteinových derivátem neproduktivní navázání/sejmutí silylové skupiny (cesty 4 a 5) chránicí primární alkohol, čímž se cesty zkrátí o dva kroky.

Cesta 6 pouze popisuje poslední kroky přeměny meziproduktu 161, který lze snadno získat z meziproduktu 21.

V cestě 4 a 5 se primární alkohol připravený v počátečním kroku diazotace chrání pomocí křemíku, což vede k selektivnímu chránění £-kruhového fenolu a nedochází ke vzniku meziproduktu 25. Následující modifikací Λ-kruhu (sejmutí chránicí skupiny/oxidace) dojde k odstranění křemíkové skupiny, což vede k esterifikaci primárního alkoholu cysteinovým derivátem.

Tyto změny jsou přímým důsledkem problémů, které byly nalezeny u cesty uvedené v WO 0 069 862. Jako výsledek těchto změn je celá cesta 2 kratší o tři kroky, a proto je tedy potenciálně výhodnější a/nebo levnější pro běžnou výrobu.

Přehled způsobů

Z pohledu cesty 1 až 6 se tento vynález týká způsobu přípravy ecteinascidinové sloučeniny se spiroamin-l,4-můstkem, při kterém dochází k vytvoření 1,4 můstku u kondenzované 1—labilní, 10-hydroxy, 18-chráněná hydroxy, di-6,8-en-5-on sloučeniny sejmutím C-18 chránicí skupiny a vnesením spiroaminu.

V jednom provedení má ecteinascidinová sloučenina 21-hydroxylovou skupinu a tento způsob obsahuje přeměnu 21-kyano skupiny na 21-hydroxylovou skupinu.

Spiroamin je typicky spirochinolin, zvláště spirochinolin ecteinascidinu 743

Ve výhodném provedení je 18-chráněná skupina kondenzované 1—labilní, 10-hydroxy, 18-chráněná hydroxy, di-6,8-en-5-on sloučeniny chráněna MOM (methoxymethyl) nebo MEM (methoxyethoxymethyl) skupinou.

Výhodná 1—labilní skupina je N-chráněná cysteinyloxymethylenová skupina vzorce -CH₂-OCO-CNHProť-CH₂-S-H.

V tomto vzorci je Prot¹ typicky Boc (terc.butyloxykarbonyl), Troc (2,2,2-trichlorethyloxykarbonyl), Cbz (benzyloxykarbonyl) nebo Alloc (allyloxykarbonyl).

V některých provedeních dojde k sejmutí Prot¹ ve stejném kroku jako k sejmutí C-18 chránicí skupiny.

- 17CZ 304966 B6

Tuto 1—labilní skupinu lze připravit z 1-substituentu vzorce -CH₂-0-CO-CNHProť-CH₂-SProt².

V tomto vzorci je Prot² typicky Fm (9-fluorenylmethyl).

1-substituent vzorce -CH₂-O-CO-CNHProť-CH₂-S-Prot² lze připravit esterifikací -CH₂-O-H substituentu.

Esterifikaci lze uskutečnit před nebo po vytvoření 10-hydroxy, di-6,8-en-5-on struktury.

V jednom provedení vychází nárokovaný způsob z kondenzované 1-aminomethylen, 5-chráněná hydroxy, 7,8-dioxymethylen, 18-hydroxy, 21-kyano sloučeniny.

1-aminomethylenovou skupinu lze dočasně chránit, což vede ke chránění 18-hydroxylové skupiny, a chránící skupinu poté odstranit.

C-18 hydroxylovou skupinu lze také chránit po vytvoření 1-esterové funkční skupiny.

V jiných provedeních se 1-aminomethylenová skupina převede na 1-hydroxymethylenovou skupinu, která se dočasně chrání, což vede ke chránění 18-hydroxylové skupiny, a chránící skupina se poté sejme.

Kondenzovaná struktura má výhodný obecný vzorec XVI,

kde R¹⁵ je výhodně H. Jeden, více nebo všechny zbývající substituenty jsou stejné jako v případě ecteinascidinu 743.

Semisyntéza

Tento vynález se týká použití známé sloučeniny, safracínu B, také označovaného jako chinonamin, v semisyntéze.

Tento vynález se týká semisyntetického způsobu přípravy meziproduktů, derivátů a sloučenin se strukturou příbuznou ecteinascidinu nebo jiných tetrahydroisochinolinfenolových sloučenin původem z přírodních bis(tetrahydroisochinolinových) alkaloidů. Mezi výhodné výchozí látky pro semisyntetický způsob patří třídy saframycinových a safracinových antibiotik dostupných z různých kultivačních půd a také třídy reineramicinových a xestomycinových sloučenin dostupných z mořských hub.

Výchozí látky mají obecný vzorec XVII,

-18CZ 304966 B6 (XVII),

kde R¹ je amidomethylenová skupina jako je -CH2-NH-CO-CR^25aR^25bR^25c, kde R^25a a R^25b tvoří keto skupinu nebo kde jedno je -ΌΗ, -NH2 nebo -OCOCH₃ a druhé je -CH₂COCH₃, -H, -OH nebo -OCOCH₃ za předpokladu, že když R^25a je -OH nebo -NH2 potom R^25b není -OH a R^25c je -H, -CH3 nebo -CH₂CH₃ neboje R¹ acyloxymethylenová skupina jako je -CH2-O-CO-R, kde R je -C(CH3)=CH-CH3 nebo -CH3, dále R⁵ a R⁸ jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující -H, -OH nebo -OCOCH2OH nebo jsou R⁵ a R⁸ keto skupiny a kruh A je //-benzochinonový kruh, dále R^14a a R^14b jsou obě -H nebo jedno je -H a další je -OH, -OCH₃ nebo -OCH₂CH₃ nebo R^14a a R^14b tvoří keto skupinu, dále R¹⁵ a R¹⁸ jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující -H nebo -OH nebo R¹⁵ a R¹⁸ jsou obě keto skupiny a kruh A je />-benzochinonový kruh, a dále R²¹ je -OH nebo -CN.

Tato třída sloučenin má obecný vzorec XVIII,

kde substituenty definované pomocí R|, R₂, R₃, R4, R₅, R₆, R₇, Rg, R₉, R₁₀ jsou nezávisle vybrané ze skupiny obsahující H, OH, OCH₃, CN, =0, CH₃, dále kde X jsou různé amidy nebo esterové funkční skupiny obsažené ve zmíněných přírodních látkách, dále kde každý tečkovaný kruh představuje jednu, dvě nebo tři dvojné vazby.

Tento vynález se týká semisyntetických cest přípravy meziproduktů včetně meziproduktu 11 nebo 21, a tudíž přípravy ecteinascidinových sloučenin jako je fthalascidin a další sloučeniny.

Každá semisyntetická cesta tohoto vynálezu obsahuje několik kroků, které vedou k požadované sloučenině. Každý krok sám o sobě je způsobem podle tohoto vynálezu. Tento vynález není uvedenými cestami limitován a lze použít i alternativní cesty, které vzniknou vhodnou změnou pořadí kroků nebo výměnou používaných chráničích skupin.

Tento vynález vyžaduje především přípravu 21-kyano výchozí látky obecného vzorce XIX,

-19CZ 304966 B6

kde R¹ R⁵, R⁸, R^14a, R^14b, R¹⁵ a R¹⁸ již byly definovány.

Výhodnými výchozími látkami jsou také sloučeniny obecného vzorce XIX s odlišnými substituenty na 21-pozici. Jakýkoliv derivát, který vzniká nukleofilním nahrazením 21-hydroxylové skupiny sloučenin obecného vzorce XVII, kde R²¹ je hydroxylová skupina, je vhodný. Mezi příklady vhodných 21-substituentů patří například merkapto skupina, dále alkylthio skupina (alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku), dále arylthio skupina (arylová skupina s 6 až 10 atomy uhlíku a substituovaná nebo nesubstituovaná 1 až 5 substituenty vybranými ze skupiny obsahující například alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxy skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, atomy halogenů, merkapto skupiny a nitro skupiny), dále amino skupina, dále mono- nebo dialkylamino skupina (každá alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku), dále mono- nebo diarylamino skupina (každá arylová skupina jak bylo definováno výše v popisu arylthio skupiny), dále a-karbonylalkylová skupina obecného vzorce -C(R^a)(R^b)-C(=O)R^c, kde R^a a R^b jsou vybrány ze skupiny obsahující atomy vodíku, alkylové skupiny s 1 až 20 atomy uhlíku, arylové skupiny (jak bylo definováno výše v popisu arylthio skupiny) a aralkylové skupiny (ve kterých alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku je substituována arylovou skupinou jak bylo definováno výše v popisu arylthio skupiny) za předpokladu, že jeden z R^a a R^b je atom vodíku a kde R^c se vybere ze skupiny obsahující atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 20 atomy uhlíku, arylovou skupinu (jak bylo definováno výše v popisu arylthio skupiny), aralkylovou skupinu (ve kterých alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku je substituována arylovou skupinou jak bylo definováno výše v popisu arylthio skupiny), alkoxy skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, amino skupinu nebo mono- nebo dialkylamino skupinu jak bylo definována výše.

Tento vynález se týká způsobů, ve kterých v prvním kroku dochází použitím nukleofilního činidla ke vzniku 21-derivátu. Tyto sloučeniny se označují jako 21-Nuc sloučeniny.

Pro získání některých konečných sloučenin, jmenovitě ecteinascidinů 770 a fthalascidinu, je nutná přítomnost 21-kyano skupiny, zatímco u jiných konečných sloučenin tato skupina vystupuje jako chránící skupina, kterou lze snadno přeměnit na jiný substituent jako je například 21hydroxylová skupina v ecteinascidinů 743 nebo 21-hydroxylová skupina v fthalascidinu. Použití 21-kyano sloučeniny jako výchozí látky účinně stabilizuje molekulu během následných syntetických kroků, dokud není odstraněna. Jiné 21-Nuc sloučeniny nabízejí tyto ajiné výhody.

Tento vynález se týká použití 21-kyano sloučeniny obecného vzorce XIX pro přípravu bis- nebo tris(tetrahydroisochinolinfenolových) sloučenin. Mezi sloučeniny, které lze připravit, patří například meziprodukt 11 nebo 21 a ecteinascidiny stejně jako nové a známé sloučeniny příbuzné struktury.

Mezi výhodné výchozí látky patří sloučeniny obecného vzorce XVII nebo XIX, kde R^14a a R^14b jsou vodík. Mezi výhodné výchozí látky také patří sloučeniny obecného vzorce XVII nebo XIX, kde R¹⁵ je vodík. Mezi výhodné výchozí látky dále také patří sloučeniny obecného vzorce XVII nebo XIX, kde kruh £ je fenolový kruh. Mezi výhodné výchozí látky dále patří sloučeniny obecného vzorce XVII nebo XIX, kde minimálně jeden, lépe minimálně dva nebo tři z R⁵, R⁸, R¹⁵ a R¹⁸ nejsou vodík.

-20CZ 304966 B6

Mezi příklady výhodných výchozích látek pro tento vynález patří saframycin A, saframycin B, saframycin C, saframycin G, saframycin H, saframycin S, saframycin Y₃, saframycin Ad,, saframycin Yd₂, saframycin AH₂, saframycin AH₂Ac, saframycin AH_b saframycin AHiAc, saframycin AR₃, renieramycin A, renieramycin B, renieramycin C, renieramycin D, renieramycin E, renieramycin F, xestomycin, saframycin F, saframycin Mx-1, saframycin Mx-2, safracin A, safracin B a saframycin R. Výhodné výchozí látky mají v 21-pozici kyano skupinu jako skupinu R²¹.

Tento vynález se týká semisyntetického způsobu, kde se jako výchozí látka použije safracin B, který má vzorec XX.

OMe

Me

Safracin B je tvořen systémem kruhů, který je úzce příbuzný k ecteinascidinům. Tato sloučenina má stejnou pentacyklickou strukturu a stejný význam substituentů v pravotočivém aromatickém kruhu E. Safracin B je také velmi podobný některým syntetickým meziproduktům v celé syntéze ET-743, především meziproduktu 11 nebo 21. Takovýto meziprodukt lze přeměnit na ET-743 pomocí dobře známého způsobu. Syntetická přeměna safracinu B na meziprodukt 11 nebo 21 vede ke vzniku ET-743 semisyntetickým způsobem.

Tento vynález se týká meziproduktu 11 nebo 21 připraveného ze safracinu B a sloučenin odvozených z meziproduktu 11 nebo 21, především ecteinascidinové sloučeniny. Dále se vynález týká fthalascidinu připraveného ze safracinu B. Tento vynález se také týká použití safracinu B při přípravě meziproduktu 11 nebo 21, ecteinascidinových sloučenin a dalších meziproduktů. Tento vynález se dále týká sloučenin odvozených z dalších navrhovaných výchozích látek a použití výchozích látek při přípravě takovýchto sloučenin.

Výhodnější výchozí látky tohoto vynálezu mají 21-kyano skupinu. V současné době nejvýhodnější sloučenina 2 tohoto vynálezu. Tato sloučenina se získá přímo ze safracinu B, je považována za klíčový meziprodukt v semisyntetickém způsobu a má vzorec XXI.

Tento vynález se týká kyanosafracinu B připraveného fermentací safracin B produkujícího kmenu Pseudomonas fluorescens a úpravou kultivační půdy použitím kyanidového iontu. Mezi výhodný kmen Pseudomonas fluorescens patří kmen A2-2, FERM BP-14, který se používá

-21 CZ 304966 B6 v postupu uvedeném v EP 055 299. Výhodným zdrojem kyanidového iontu je kyanid draselný. Při typické úpravě se kultivační půda přefiltruje a přidá se nadbytek kyanidového iontu. Po důkladném promíchání, například po jedné hodině, poté se pH upraví na 9,5 a organickou extrakcí vzniká surový extrakt, který lze dále čistit za vzniku kyanosafracinu B.

Stereochemické označení použité v tomto vynálezu, které vykazuje chyby, je třeba opravit. A protože lze syntézy modifikovat, týká se tento vynález také stereoizomerů.

Vynález se týká sloučenin obecného vzorce XXII,

(XXII), kde R¹ a R⁴ tvoří skupinu vzorce IV, V, VI nebo VII,

(IV)

(V) (VI),

-22CZ 304966 B6

O

O (VII), dále kde R⁵ je -H nebo -OH, dále R⁷ a R⁸ tvoří skupinu -O-CH2-O-, dále R^14a a R^14b jsou -H nebo jedna je -H a druhá je -OH, -OCH3 nebo -OCH₂CH₃ nebo R^14a a R^14b tvoří keto skupinu, dále R¹⁵ je -H nebo -OH, dále R²¹ je -H, -OH nebo -CN, a dále jejich derivátů jako jsou acyl deriváty, především ty, kde R⁵ je acetyloxy nebo jiná acyloxy skupina s maximálně 4 atomy uhlíku.

V obecném vzorci XXII R¹ a R⁴ obvykle tvoří skupinu vzorce IV nebo V. Skupina R¹⁸ je obvykle chráněná. R²¹ je obvykle kyano skupina.

Výhodně je R^14a a R^14b vodík. Výhodně je R¹⁵ vodík. Mezi výhodné O-acyl deriváty patří alifatické O-acylové deriváty, především ty, které mají 1 až 4 atomy uhlíku a typicky O-acetylová skupina umístěná na 5-pozici.

Mezi výhodné chránící skupiny pro fenoly a hydroxylové skupiny patří ethery a estery jako je alkylová skupina, alkoxyalkylová skupina, aryloxyalkylová skupina, alkoxyalkoxyalkylová skupina, alkylsilylalkoxyalkylová skupina, alkylthioalkylová skupina, arylthioalkylová skupina, azidoalkylová skupina, kyanoalkylová skupina, chloralkylová skupina, heterocyklická skupina, arylacylová skupina, haloarylacylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkenylová skupina, cykloalkylová skupina, alkylarylalkylová skupina, alkoxyarylalkylová skupina, nitroarylalkylová skupina, haloarylalkylová skupina, alkylaminokarbonylarylalkylová skupina, alkylsulfinylarylalkylová skupina, alkylsilylová skupina a další ethery, a dále arylacylová skupina, arylalkylkarbonát, alifatický karbonát, alkylsulfinylarylalkylkarbonát, alkylkarbonát, arylhaloalkylkarbonát, arylalkenylkarbonát, arylkarbamát, alkylfosfinylová skupina, alkylfosfinothioylová skupina, arylfosfinothioylová skupina, arylalkylsulfonát a další estery. Tyto skupiny lze případně nahradit substituenty uvedenými u R¹.

Mezi vhodné chránící skupiny pro aminy patří karbamáty, amidy a jiné chránící skupiny jako je alkylová skupina, arylalkylová skupina, sulfo- nebo haloarylalkylová skupina, haloalkylová skupina, alkylsilylalkylová skupina, arylalkylová skupina, cykloalkylalkylová skupina, alkylarylalkylová skupina, heterocyklylalkylová skupina, nitroarylalkylová skupina, acylaminoalkylová skupina, nitroaryldithioarylalkylová skupina, dicykloalkylkarboxamidoalkylová skupina, cykloalkylová skupina, alkenylová skupina, arylalkenylová skupina, nitroarylalkenylová skupina, heterocyklylalkenylová skupina, heterocyklylová skupina, hydroxyheterocyklylová skupina, alkyldithio skupina, alkoxy- nebo halo- nebo alkylsulfinylarylalkylová skupina, heterocyklylalkylová skupina a jiné karbamáty, a dále alkanoylová skupina, haloalkanoylová skupina, arylalkanoylová skupina, alkenylová skupina, heterocyklylalkylová skupina, aroylová skupina, arylaroylová skupina, haloaroylová skupina, nitroaroylová skupina, a dále další amidy jako je alkylová skupina, alkenylová skupina, alkylsilylalkoxyalkylová skupina, alkoxyalkylová skupina, kyanoalkylová skupina, heterocyklylová skupina, alkoxyarylalkylová skupina, cykloalkylová skupina, nitroarylová skupina, arylalkylová skupina, alkoxy- nebo hydroxyarylalkylová skupina a mnoho dalších skupin. Tyto skupiny lze případně nahradit substituenty uvedenými u R¹.

Příklady těchto chránících skupin jsou uvedeny v následující tabulce.

-23 CZ 304966 B6

chránící skupiny pro -OH skupinu
ethery methyl	zkratka
methoxymethyl	MOM
benzyloxymethyl	BOM
methoxyethoxymethyl	MEM
2-(trimethylsilyl)ethoxymethyl	SEM
methylthiomethyl	MTM
fenylthiomethyl azidomethyl kyanomethyl 2,2-dichlor-1,1 -difluorethyl 2-chlorethyl 2-bromethyl	PTM
tetrahydropyranyl	THP
1-ethoxyethyl fenacyl 4-bromfenacyl cyklopropylmethyl allyl propargyl isopropyl cyklohexyl terc.butyl benzyl 2,6-dimethylbenzyl	EE
4-methoxybenzyl o-nitrobenzyl 2,6-dichlorbenzyl 3,4-dichlorbenzyl 4-(dimethylamino)karbonylbenzyl	MPM nebo PMB
4-methylsulfinylbenzyl 9-anthrylmethyl 4-pikolyl heptafluor-p-tolyl tetrafluor-4-pyridyl	Msib

-24CZ 304966 B6

chránící skupiny pro -OH skupinu
ethery	zkratka
trimethylsilyl	TMS
terč. butyldi methylsi tyl	TBDMS
forc. butyldifenylsilyl	TBDPS
triisopropylsilyl	TIPS
estery
arylformiát arylacetát aryllevulinát arylpivaloát arylbenzoát aryl-9-fluorkarboxylát	ArIPv
arylmethylkarbonát 1 -adamantylkarbonát terc.butylkarbonát	BOC-OAr
4-methylslfinylbenzylkarbonát	Msz-Oar
2,4-dimethylpent-3-ylkarbonát aryl-2,2,2-trichlorethylkarbonát arylvinylkarbonát arylbenzylkarbonát arylkarbamát	Doc-Oar
dimethylfosfinyl	Dmp-OAr
dimethylfosfinothioyl	Mpt-OAr
difenylfosfinothioyl	Dpt-Oar
arylmethansulfonát aryltoluensulfonát aryl-2-formylbenzensulfonát

-25 CZ 304966 B6

chránící skupiny pro -NH2 skupinu
karbamáty	zkratka
methyl ethyl 9-fluorenylmethyl 9-(2-sulfo)fluorenylmethyl 9-(2,7-dibrom)fluorenylmethyl	Fmoc
17-tetrabenzo[a, c, g, íjfluorenylmethyl	Tbfmoc
2-chlor-3-indenylmethyl	Climoc
benz[f]inden-3-ylmethyl	Bimoc
2,7-di-terc. buty I [9-( 10,10-d ioxo- -10,10,10,10-tetrahydrothioxanthyl)]methyl	DBD-Tmoc
2,2,2-trichlorethyl	Troc
2-trimethylsilylethyl	Teoc
2-fenylethyl	hZ
1 -(1 -adamantyl)-1 -methylethyl 2-chlorethyl 1,1 -dimethyl-2-chlorethyl 1,1 -dimethyl-2-bromethyl	Adpoc
1,1 -dimethyl-2,2-dibromethyl	DB-t-BOC
1,1 -dimethyl-2,2,2-trichlorethyl	TCBOC
1 -methyi-1 -(4-bifenyl)ethyl	Bpoc
1 -(3,5-di-terc. butylfenyl)-1 -methylethyl	t-Burmeoc
2-(2'- a 4'-pyridyl )ethyl	Pyoc
2,2-bis(4'-nitrofenyI)ethyl	Bnpeoc
n-(2-pivaloylamino)-1,1 -dimethylethyl 2-[(2-nitrofenyl)dithio]-1-fenylethyl	NpSSPeoc
2-(n,n-dicyklohexylkarboxamido)ethyl-terc.butyl	BOC
1 -adamantyl	1 -Adoc
2-adamantyl	2- Adoc
vinyl	Voc

-26CZ 304966 B6

chránící skupiny pro -NH2 skupinu
karbamáty	zkratka
aliyl	Aloe nebo Alloc
1-isopropylallyl	Ipaoc
cinnamyl-(3-fenyl-2-propen-1-yl)	Coc
4-nitrocinnamyl	Noc
3-(3 '-pyridyl)prop-2-enyl 8-chinolyl n-hydroxypiperidinyl alkyldithio	Paloc
benzyl	Cbz nebo Z
p-methoxybenzyl	Moz
p-nitrobenzyl p-brombenzyl p-chlorbenzyl 2,4-dichlorbenzyl	PNZ
4-methylsulfinylbenzyl 9-anthrylmethyl difenylmethyl fenothiazinyl-( 10)-karbonyl n '-p-toluensulfonylaminokarbonyl n '-fenylaminothiokarbonyl	Msz
amidy
formamid acetamid chloracetamid trifluoracetamid fenylacetamid 3-fenylpropanamid pent-4-enamid pikolinamid	TFA

-27CZ 304966 B6

chránící skupiny pro -NHŽ skupinu
amidy	zkratka
3-pyridylkarboxamid
benzamid
p-fenylbenzamid
n-ftalimid
n-tetrachlorftalimid	TCP
4-nitro-n-ftalimid
n-dithiasukcinimid	Dts
n-2,3-difenylmaleimid n-2,5-dimethylpyrrol n-2,5-bis(triisopropylsiloxyl)pyrrol	BIPSOP
n-1,1,4,4-tetramethyldisiliazacyklopentanový adukt	STABASE
1,1,3,3-tetramethyl-1,3-disilaisoindol in	BSB
specifické chránící skupiny pro	-NH skupiny
n-methylamin n-terc.butylamin n-allylamin n-[(2-trimethylsilyl)ethoxy]methylamin	SEM
n-3-acetoxypropylamin n-kyanomethylamin n-(1-isopropyl-4-nitro-2-oxo-3-pyrrolin-3-yl)amin n-2,4-dimethoxybenzylamin 2-azanorborneny (2-azabicyklo[2,2,1 ]hept-5-eny) n-2(4-dinitrofenylamin	Dmb
n-benzylamin	Bn
n-4-methoxybenzylamin	MPM
n-2,4-dimethoxy benzylamin	DMPM
n-2-hydroxybenzylamin	Hbn
n-(difenylmethyl)amin n-bis(4-methoxyfenyl)methylamin	DPM

-28CZ 304966 B6

specifické chránící skupiny pro -NH skupiny
n-5-dibenzosuberylamin	DBS
n-trifenylmethylamin	Tr
n-[(4-methoxyfenyl)difenylmethyl]amin	MMTr
n-9-fenylfluorenylamin	Pf
n-ferrocenylmethylamin n-2-pikolylamin-n '-oxid n-1,1 -dimethylthiomethylenamin n-benzylidenamin n-p-methoxybenzylidenamin n-difenyimethylenamin n-(5,5-dimethyl-3-oxo-1-cyklohexenyl)amin n-nitroamin n-nitrosoamin	Fcm
difenylfosfinamid	Dpp
dimethylthiofosfinamid	Mpt
difenylthiofosfinamid dibenzylfosforamidát	Ppt
2-nitrobenzensulfenamid	Nps
n-1 -(2,2,2-trif I uor-1,1 -difenyl)ethylsulfenamid	TDE
3-nitro-2-pyridinsulfenamid	Npys
p-toluensulfonamid benzensulfonamid	Ts

Vynález se týká ecteinascidinových sloučenin obecného vzorce XXIII,

-29CZ 304966 B6 (IV)

(V) (VI) (VII),

O především skupinu IV nebo V, dále kde R²¹ je -H, -OH nebo -CN, především -OH nebo -CN, i dále jejich acylových derivátů, především 5-acyl derivátů včetně 5-acetyl derivátu.

Přeměna 21-kyano výchozí látky na ecteinascidinovou sloučeninu obecného vzorce XXII probí há obvykle v následujících krocích,

a) pokud je to nutné, přeměnu chinonového systému kruhu E na fenolový systém,

b) pokud je to nutné, přeměnu chinonového systému kruhu A na fenolový systém,

c) přeměnu fenolového systému kruhu A na methylendioxyfenolový kruh,

d) vytvoření přemostěného spiro kruhového systému vzorce IV, VI nebo VII na 1-pozici a 4pozici kruhu B,

e) vytvoření vhodného derivátu například acylací.

-30CZ 304966 B6

Krok (a), případnou přeměnu chinonového systému kruhu E na fenolový systém, lze provést konvenčními redukčními postupy. Vhodným reakčním prostředím je vodík s katalyzátorem palladium-uhlík, avšak lze použít i další redukční postupy.

Krok (b), případnou přeměnu chinonového systému kruhu A na fenolový systém, je analogický kroku (a).

Krok (c), přeměnu fenolového systému kruhu A na methylendioxyfenolový kruh, lze provést několika způsoby, případně spolu s krokem (b). Chinonový kruh A lze například demethylovat odstraněním methoxy substituentu na 7-pozici, redukovat na dihydrochinon a zachytit vhodným elektrofílním činidlem jako je například CH₂Br₂, BrCH₂Cl nebo podobným divalentním činidlem což vede přímo ke vzniku methylendioxy kruhového systému, nebo divalentním činidlem jako je například thiocarbonyldiimidazol, což vede ke vzniku substituovaného methylendioxy kruhového systému, který lze přeměnit na požadovaný kruh.

Krok (d) se obvykle provádí vhodnou substitucí na 1-pozici přemosťujícím činidlem, které napomáhá vytvoření požadovaného můstku, což vede k vytvoření chinonmethidové skupiny na 4pozici a vede k tomu, že methidová skupina reaguje s 1-substituentem za vzniku přemostěné struktury. Výhodná přemosťující činidla mají obecný vzorec XXIV,

Prot³^

(XXIV), kde Fu označuje chráněnou funkční skupinu jako je skupina -NHProť¹³, dále Prot³ je chránicí skupina a dále tečkovaná čára představuje případnou dvojnou vazbu.

Methiová skupina se výhodně vytvoří vnesením hydroxylové skupiny na 10-pozici v místě spojení kruhu A a B, což vede ke vzniku struktury obecného vzorce XXV,

(XXV),

(XXVI), kde se skupina R zvolí podle požadované skupiny vzorců IV, V, VI nebo VII. U prvních dvou těchto skupin má skupina R obvykle vzorec -CHFu-CH₂-SProt³. Chránicí skupiny lze poté odstranit a vhodně upravit, což vede ke vzniku požadované sloučeniny.

-31 CZ 304966 B6

Obvyklý postup kroku (d) je popsán v patentu US 5 721 362, kterýje uveden v odkazech. Konkrétně je odkazována část ve sloupci 8, kroku (1) a příkladu 33 tohoto US patentu a příbuzné části.

Vytvoření derivátu v kroku (e) případně probíhá acylací například skupinou R^a-CO-, kde R^a se případně vybere ze skupiny obsahující například alkylovou skupinu, alkoxy skupinu, alkylenovou skupinu, arylalkylovou skupinu, arylalkylenovou skupinu, acylaminokyselinu nebo heterocyklylovou skupinu, přičemž každá je případně substituována halogenem, kyano skupinou, nitro skupinou, karboxyalkylovou skupinou, alkoxy skupinou, arylovou skupinou, aryloxy skupinou, heterocyklylovou skupinou, heterocyklyloxy skupinou, alkylovou skupinou, amino skupinou nebo substituovanou amino skupinou. Mezi další acylační činidla patří isothiokyanáty jako je arylisothiokyanát, jmenovitě fenylisokyanát. Tato alkylová, alkoxy nebo alkylenová skupina R^a výhodně obsahuje 1 až 6 nebo 12 atomů uhlíku aje případně lineární, rozvětvená nebo cyklická. Mezi arylové skupiny patří fenyl, bifenyl nebo naftyl. Heterocyklylové skupiny jsou případně aromatické nebo částečně nebo úplně nenasycené a výhodně mají 4 až 8 atomů v kruhu, výhodněji 5 nebo 6 atomů v kruhu sjedním nebo více heteroatomy vybranými ze skupiny obsahující dusík, síru a kyslík.

Mezi příklady R^a skupiny patří alkylová skupina, haloalkylová skupina, alkoxyalkylová skupina, haloalkoxyalkylová skupina, arylalkylenová skupina, haloalkylarylalkylenová skupina, acylová skupina, haloacylová skupina, arylalkylová skupina, alkenylová skupina a aminokyselina. Skupina R^a-CO- je například acetyl, trifluoracetyl, 2,2,2-trichlorethoxykarbonyl, isovalerylkarbonyl, /ran.v-3-(trifluormethyl)cinnamoylkarbonyl, heptafluorbutyrylkarbonyl, dekanoylkarbonyl, //•čm-cinnamoylkarbonyl, butyrylkarbonyl, 3-chlorpropionylkarbonyl, cinnamoylkarbonyl, 4methylcinnamoylkarbonyl, hydrocinnamoylkarbonyl nebo Zran.s-hexenoylkarbonyl, nebo dále alanyl, arginyl, aspartyl, cystyl, glutamyl, glutaminyl, glycyl, histidyl, hydroxyprolyl, isoleucyl, leucyl, lysyl, methionyl, fenylalanyl, prolyl, seryl, threonyl, thyronyl, tryptofyl, tyrosyl, valyl, stejně jako další méně obvyklé acylové skupiny aminokyselin, stejně jako ftalimido a další cyklické amidy. Další příklady lze nalézt mezi zmíněnými chránícími skupinami. Sloučeniny, kde je R^a-CO- odvozena z aminokyseliny a obsahuje amino skupinu, případně sami tvoří acyl deriváty. Mezi výhodné N-acyl skupiny patří dipeptidy, které případně střídavě tvoří N-acyl deriváty.

Ve srovnání s dříve popsanými postupy lze nyní uskutečnit přeměnu sloučeniny 2 (kyanosafracin B) na ET-743 kratší a přímější cestou.

Retrosyntéza ET-743 použitím sloučeniny 29 je znázorněna na schématu 7.

-32CZ 304966 B6

Schéma 7

(1NT-2Z)

Postupem znázorněným na schématu 7 lze připravit ET-743 v 21 lineárních krocích. V této syntéze dochází k přeměně kyanosafracinu B na meziprodukt 25 sledem reakcí, z nichž mezi základní patří (1) odstranění methoxy skupiny umístěné na kruhu A, (2) redukce kruhu A a vytvoření methylendioxy skupiny, (3) hydrolýza funkčního amidu umístěného přes uhlík 1, (4) přeměna vzniklé amino skupiny na hydroxylovou skupinu. V této syntéze kromě toho nedochází k chránění a sejmutí chrániči skupiny funkčního primárního alkoholu na 1-pozici v kruhu B sloučeniny 25 a meziprodukt 27 vzniká přímo z cysteinového zbytku 29. Aminoskupina cysteinového derivátu 29 je chráněna β-β-β-trichlorethoxykarbonylovou chránící skupinou, aby se dosáhlo kompatibility s existující allylovou skupinou a MOM skupinou. Meziprodukt 27 je přímo oxidován a cyklován. Tyto okolnosti společně s odlišnými strategiemi sejmutí chránící skupiny v koncových stupních syntézy jsou příčinou novosti této syntézy a její lepší přizpůsobitelnosti průmyslovému vývoji než způsob uvedený v patentu US 5 721 362.

Přeměna 2-kyano sloučeniny na meziprodukt 25 probíhá obvykle v následujících krocích (viz schéma 8)

a) vznik chráněné sloučeniny 14 reakcí sloučeniny 2 s anhydridem terc.butoxykarbonylu,

b) přeměna sloučeniny 14 na di-chráněnou sloučeninu 15 reakcí s brommethylmethyletherem a diisopropylethylaminem v acetonitrilu,

c) selektivní odstranění methoxy skupiny chinonového systému ve sloučenině 15 za vzniku sloučeniny 16 reakcí s methanolickým roztokem hydroxidu sodného,

d) přeměna sloučeniny 16 na methylendioxy sloučeninu 18 provedením následující výhodné sekvence kroků (1) chinonová skupina sloučeniny 16 se redukuje 10% Pd/C ve vodíkové atmosféře, (2) hydrochinonový meziprodukt se přemění na methylendioxy sloučeninu 17 reakcí s bromchlormethanem a uhličitanem česným ve vodíkové atmosféře, (3) sloučenina 17 se přemění na sloučeninu 18 chráněním volné hydroxylové skupiny jako je OCH₂R skupina. Tato reakce se provádí s BrCH₂R a uhličitanem česným, kde R je případně aryl, CH=CH₂, OR' apod.,

-33CZ 304966 B6

e) odstranění terc.butoxykarbonylové a methyloxymethylové chránící skupiny ve sloučenině 18 za vzniku sloučeniny 19 reakcí s roztokem HCI v dioxanu. Této reakce se také dosáhne smísením sloučeniny 18 s roztokem kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu,

f) vytvoření thiomočovinové sloučeniny 20 reakcí sloučeniny 19 s fenylisothiokyanátem,

g) přeměna sloučeniny 20 na amino sloučeninu 21 reakcí s roztokem HCI v dioxanu,

h) přeměna sloučeniny 21 na N-Troc derivát 22 reakcí s trichlorethylchlorformiátem a pyridinem,

i) přeměna chráněné hydroxylové sloučeniny 23 reakcí sloučeniny 22 s brommethylmethyletherem a diisopropylethylaminem, io j) přeměna sloučeniny 23 na N-H derivát sloučeniny 24 reakcí s kyselinou octovou a zinkem,

k) přeměna sloučeniny 24 na hydroxylovou sloučeninu 25 reakcí s dusitanem sodným v kyselině octové. Alternativně lze použít oxid dusičitý ve směsi kyseliny octové a acetonitrilu s následnou úpravou hydroxidem sodným. Lze také použít dusitan sodný ve směsi kyseliny octové a acetanhydridu s následnou úpravou hydroxidem sodným.

-34CZ 304966 B6 •no

-35CZ 304966 B6

Schéma 8 - pokračování

-36CZ 304966 B6

Přeměna meziproduktu 25 na ET-743 použitím cysteinového derivátu 29 probíhá obvykle v následujících krocích (viz schéma 9)

Schéma 9

a) přeměna sloučeniny 24 na derivát 30 chráněním funkčního primárního hydroxylu sloučeninou i o 29, (S)-N-2,2,2-trichlorethoxykarbonyl-S-(fluoren-9-ylmethyl)cystein,

-37CZ 304966 B6

b) přeměna chráněné sloučeniny 30 na fenolový derivát 31 štěpením allylové skupiny tributylstanniumhydridem a dichlorbis(trifenylfosfmem) palladnatým,

c) přeměna fenolové sloučeniny 31 na sloučeninu 32 oxidací anhydridem kyseliny benzenselenové při nízké teplotě,

d) přeměna hydroxylové sloučeniny 32 na laktonovou sloučeninu 33 provedením následující sekvence kroků (1) reakce sloučeniny 32 se 0,22 mmol (2 ekvivalenty) anhydridu kyseliny trifluormethansulfonové a 0,55 mmol (5 ekvivalentů) DMSO (dimethylsulfoxid), (2) reakce s 0,88 mmol (8 ekvivalenty) diisopropylethylaminu, (3) reakce se 0,44 mmol (4 ekvivalenty) terc.butylalkoholu, (4) reakce se 0,77 mmol (7 ekvivalenty) 2-terc.butyl-l,l,3,3-tetramethylguanidinu, (5) reakce s 1,10 mmol (10 ekvivalenty) acetanhydridu,

e) přeměna laktonové sloučeniny 33 na hydroxylovou sloučeninu 34 odstraněním MOM chránící skupiny pomocí TMSI (trimethylsulfoxonium jodid),

f) štěpení N-trichlorethoxykarbonylové skupiny sloučeniny 34 na sloučeninu 35 reakcí se Zn/AcOH (Zn/kyselina octová),

g) přeměna amino sloučeniny 35 na odpovídající α-ketolaktonovou sloučeninu 36 reakcí sNmethylpyridiniumkarboxaldehydchlorid následované DBU (l,8-diazabicyklo[5,4,0]undek-7-en),

h) vznik ET-770 reakcí sloučeniny 36 s 3-hydroxy-4-methoxyfenylethylaminem,

i) přeměna ET-770 na ET-743 reakcí s dusičnanem stříbrným ve směsi AcN/H₂O (acetonitril/voda).

Vznik meziproduktu 11a příbuzných meziproduktů

Retrosyntéza je popsána následující rovnicí (viz schéma 10).

Mezi klíčovou třídu meziproduktů tohoto vynálezu patří meziprodukt 11 obecného vzorce XXVII,

(XXVII), kde Proť a Prot² jsou výhodně různé hydroxy chránící skupiny. Pro meziprodukt lije Prot¹ methoxymethyl skupina a Prot² terc.butyldifenylsilylová skupina.

- 38 CZ 304966 B6

Přeměna 21-kyano sloučeniny na meziprodukt 11 nebo příbuzný meziprodukt obecného vzorce XXVII probíhá obvykle v následujících krocích

a) pokud je to nutné, přeměnu chinonového systému kruhu E na fenolový systém,

b) vznik -OProt¹ skupiny na 18-pozici kruhu E,

c) vznik -CH₂-OProt² skupiny na 1-pozici kruhu B,

d) pokud je to nutné, přeměnu chinonového systému kruhu A na fenolový systém,

e) přeměnu fenolového systému kruhu A na methylendioxyfenolový kruh.

Krok (b), vznik -OProt¹ skupiny na 18-pozici kruhu E, je typická reakce vedoucí k chránění fenolové skupiny a není potřeba to více komentovat. V závislosti na povaze chránicí skupiny se vyberou odpovídající podmínky. Další kroky jsou podobné jako u ostatních reakcí.

Krok (b), vznik -CH₂Prot² skupiny na 1-pozici kruhu B, obvykle probíhá tak, že se vytvoří skupina -CH2NH2 na 1-pozici a poté se funkční amin přemění na funkční hydroxylovou skupinu a chrání se. Má-li výchozí látka skupinu R¹ se strukturou -CH2-NH-CO-GR^25aR^25bR^25c, dochází k odstranění N-acyl skupiny. Má-li výchozí látka skupinu R¹ se strukturou -CH₂-O-CO-R, nedochází k žádné změně, protože ecteinascidinová sloučenina má stejný substituent R¹. Pro jiné sloučeniny dochází k odstranění O-acyl skupiny. Deacylace probíhají nejrůznějšími způsoby.

V jednom z nich probíhá deacylace a přeměna na funkční hydroxylovou skupinu v jednom kroku. Hydroxylovou skupinu lze poté acylovat nebo jinak přeměnit na odpovídající R¹ skupinu.

V patentu US 5 721 362 jsou popsány syntetické způsoby přípravy ET-743 prostřednictvím dlouhé mnohostupňové syntézy. Jedním z meziproduktů této syntézy je meziprodukt 11. Použitím kyanosafracinu B jako výchozí látky lze připravit meziprodukt 11 mnohem kratší cestou, což je zlepšení způsobu přípravy ET-743.

Kyanosafracin B lze přeměnit na meziprodukt 25 výše popsanými způsoby. Z meziproduktu 25 lze získat meziprodukt 11 následujícími kroky (viz schéma 11).

a) vytvoření chráněné hydroxylové sloučeniny 26 reakcí sloučeniny 25 s terc.butyldifenylsilylchloridem v přítomnosti zásady,

b) rozštěpení allylové skupiny tributylstanniumhydridem a dichlorbis(trifenylfosfinem)palladnatým ve sloučenině 26, což vede ke vzniku meziproduktu 11.

Schéma 11

39CZ 304966 B6

Jedním provedením syntetického způsobu tohoto vynálezu, to jest přeměny safracinu B na meziprodukt 11, je modifikace a rozšíření způsobu uvedeného na schématu 12 a obsahuje následující kroky.

a) stereospecifickou přeměnu safracinu B na sloučeninu 2 selektivním nahrazením skupiny OH skupinou CN reakcí s KCN v kyselém médiu,

b) vytvoření thiomočovinové sloučeniny 3 reakcí sloučeniny 2 s fenylisothiokyanátem,

c) přeměnu thiomočovinové sloučeniny 3 na acetamid 5 hydrolýzou v kyselém médiu následovanou adicí acetanhydridu. Aminovou sloučeninu 4 lze jako meziprodukt izolovat rychlým ochlazením hydrolýzy v kyselém médiu hydrogenuhliěitanem sodným, ale tento meziprodukt je velmi nestabilní a rychle dochází kjeho přeměně na pětičlenný cyklický imin 6,

d) vytvoření chráněné sloučeniny 8 reakcí s brommethylmethyletherem a diisopropylethylaminem v dichlormethanu,

e) selektivní demethylaci methoxy skupiny chinonového systému sloučeniny 7 za vzniku sloučeniny 8 reakcí s methanolickým roztokem hydroxidu sodného,

f) přeměnu sloučeniny 8 na methylendioxy sloučeninu 9 provedením následující výhodně sekvence kroků (1) chinonová skupina sloučeniny 8 se redukuje 10% Pd/C ve vodíkové atmosféře, (2) hydrochinonový meziprodukt se přemění na methylendioxy sloučeninu 9 reakci s bromchlormethanem a uhličitanem česným ve vodíkové atmosféře, (3) sloučenina 9 se přemění na sloučeninu 10 chráněním volné hydroxylové skupiny jako je OCH₂R skupina reakcí s BrCH₂R a uhličitanem česným, kde Rje případně aryl, CH=CH₂, OR' apod.,

g) přeměnu acetamidové skupiny sloučeniny 10 na odpovídající hydroxylovou skupinu sloučeniny 25 reakcí s oxidem dusičitým ve směsi kyseliny octové a acetacetátu s následnou úpravou hydroxidem sodným, dále lze alternativně použít dusitan sodný ve směsi kyseliny octové a acetanhydridu s následnou úpravou hydroxidem sodným, dále lze alternativně acetamidovou skupinu sloučeniny 10 přeměnit na primární aminovou skupinu reakcí s hydrazinem nebo reakcí s Boc₂O, DMAP (dimethylaminopyridin) s následnou úpravou hydrazinem, dále lze takovýto primární amin přeměnit na odpovídající hydroxylovou skupinu (sloučenina 25) oxidační přeměnou primárního aminu na odpovídající aldehyd použitím 4-formyl-l-methylpyridiniumbenzensulfonátu nebo jiného pyridiniového iontu s následnou úpravou DBU nebo jinou zásadou a dále hydrolýzou následovanou redukcí aldehydu na odpovídající hydroxylovou skupinu tetrahydridohlinitanem lithným nebo jiným redukčním činidlem,

h) vytvoření chráněné sloučeniny 26 reakcí s terč.buty ldifenylsilylchloridem a dimethylaminopyridinem v dichlormethanu (schéma 11),

i) přeměnu silylované sloučeniny 26 na meziprodukt 11 sejmutím OCH₂R chrániči skupiny prostřednictvím reakce za redukčních podmínek nebo kyselých podmínek. Mezi typické způsoby patří reakce s palladiovou černí ve vodíkové atmosféře nebo s vodným roztokem TFA nebo s tributylstanniumhydridem a dichlorbis(trifenylfosfinem) palladnatým.

-40CZ 304966 Β6

0Μ· QM· ΟΜ·

V jiné výhodné modifikaci lze kyano sloučeninu 2 převést na meziprodukt 11 prostřednictvím rozšíření způsobu uvedeného na schématu 8 pomocí těchto kroků,

a) vytvoření chráněné hydroxylové sloučeniny 26 reakcí sloučeniny 25 s terc.butyldifenylsilylchloridem v přítomnosti zásady,

b) rozštěpení allylové skupiny tributylstanniumhydridem a dichlorbis(trifenylfosfinem) palladnatým ve sloučenině 26, což vede ke vzniku meziproduktu 11.

Těmito a dalšími cestami lze tedy přeměnit kyanosafřacin B na množství meziproduktů a derivátů s potenciálním protinádorovým léčebným účinkem. Tyto meziprodukty lze připravit z již popsaných sloučenin nebo použitím alternativních cest.

Nové meziprodukty

Tento vynález se týká nových meziproduktů. V závislosti na kruhu A mají meziprodukty obecný vzorec XXVIII

(XXVIII), nebo obecný vzorec XXIX,

(XXIX), kde R¹ je -CH2NH2 nebo -CH₂OH nebo chráněná nebo derivatizovaná verze této skupiny a R⁴ je -H, nebo R¹ a R⁴ tvoří skupinu vzorce IV, V, VI nebo VII,

-4? CZ 304966 B6

dále R⁵ je -OH nebo chráněná nebo derivatizovaná verze této skupiny, dále R^14a a R^14b jsou -H nebo je jedna —H a druhá je —OH nebo chráněná nebo derivatizovaná verze této skupiny, —OCH3 nebo -OCH2CH3, nebo R^14a a R^14b tvoří keto skupinu, dále R¹² je -H, -CH3 nebo -CH₂CH₃-, dále R¹⁵ je -H, -OH nebo chráněná nebo derivatizovaná verze této skupiny, a dále R¹⁸ je -OH nebo chráněná nebo derivatizovaná verze této skupiny.

Ve výhodném provedení je alespoň jeden substituent z R¹, R⁵, R^14a, R^14b, R¹⁵ nebo R¹⁸ chráněná nebo derivatizovaná skupina.

V jiném provedení tohoto vynálezu není skupina R¹ terc.butyldifenylsilylový substituent a/nebo skupina R¹⁸ není methoxymethylová skupina.

R¹ je výhodně -CH₂NH₂ nebo CH₂OH nebo chráněná nebo derivatizovaná verze této skupiny a R⁴ je -H, nebo dále R¹ a R⁴ tvoří skupinu vzorce IV,

-43 CZ 304966 B6 (iv),

kde R^14a a R^14b jsou výhodně -H.

Do jedné výhodné třídy meziproduktů patří sloučenina, která se označuje jako sloučenina 25 a má vzorec XXX.

(XXX), io Výhodná třída má tedy obecný vzorec, kde je skupina MOM nahrazena jinou chránící skupinou.

Mezi další výhodné meziprodukty patří sloučeniny, které se označují jako sloučenina 45 a 43 (viz schéma 13).

-44CZ 304966 B6

Schéma 13

Další N-acetyl deriváty lze snadno připravit ze sloučeniny 45 a jsou důležitou součástí tohoto vynálezu. Mezi výhodné acylové skupiny patří ty, které jsou zmíněny výše. Odpovídající 215 hydroxylové sloučeniny jsou také výhodné a patří mezi nalezené účinné sloučeniny.

Nové účinné sloučeniny

Bylo zjištěno, že určité sloučeniny tohoto vynálezu, které byly původně připraveny jako mezilo produkty, mají značný účinek při léčbě karcinomů jako je leukémie, rakovina plic, rakovina tlustého střeva, rakovina ledvin a melanom.

-45CZ 304966 B6

Tento vynález se týká způsobu léčení všech savců, zvláště lidí, trpících rakovinou, který zahrnuje podání účinného množství sloučeniny tohoto vynálezu nebo farmaceutického prostředku obsahujícího sloučeninu tohoto vynálezu zmíněnému jedinci.

Tento vynález se také týká farmaceutických prostředků, které obsahují jako účinnou složku sloučeninu nebo sloučeniny tohoto vynálezu a dále způsobů jejich přípravy.

Mezi příklady farmaceutických prostředků patří pevné (například tablety, pilulky, kapsle, granule atd.) nebo kapalné prostředky (roztoky, suspenze nebo emulze) s vhodným složením pro orální, místní nebo parenterální podání a případně obsahují čistou sloučeninu nebo čistou sloučeninu v kombinaci s nosičem nebo s jinými farmakologicky účinnými sloučeninami. Pro účely parenterálního podávání je nutné tyto prostředky sterilizovat.

Podání sloučenin nebo prostředků tohoto vynálezu lze provést jakýmikoliv vhodnými metodami jako je intravenózní infuze, orální podání, intraperitoneální a intravenózní podání. Výhodné jsou doby infuze do 24 hodin, výhodnější 2 až 12 hodin, nejvýhodnější 2 až 6 hodin. Žádoucí jsou především krátké doby infuze, což umožňuje provádět léčbu bez toho, aby pacient zůstával přes noc v nemocnici. Jestliže je to nutné, lze infuzi zavést na dobu 12 až 24 hodin nebo dokonce na dobu delší. Infuzi lze provádět ve vhodných intervalech, například 2 až 4 týdny. Farmaceutické prostředky obsahující sloučeninu tohoto vynálezu lze podávat prostřednictvím liposomální nebo nanosférická enkapsulace v prostředku s trvalým uvolňováním nebo pomocí jiných standardních možností podání.

Optimální dávka sloučeniny se mění v závislosti na druhu prostředku, způsobu podání a jednotlivých situs, hostitele a nádoru, které jsou léčeny. V úvahu je nutno vzít i další faktory jako je věk, tělesná hmotnost, pohlaví, strava, doba podávání, rychlost exkrece, stav hostitele, kombinace léků, citlivost reakce a vážnost onemocnění. Podávání lze provádět kontinuálně nebo periodicky až do maximální přípustné dávky.

Sloučeniny a prostředky tohoto vynálezu lze při léčbě použít v kombinaci s jinými léky. Tyto jiné léky tvoří buď část stejného prostředku, nebo jsou ve formě odděleného prostředku podávaného ve stejnou nebo různou dobu. Mezi příklady těchto jiných léků patří například

a) léky s antimitotickými účinky, zvláště ty, které se zaměřují na cytoskeletální prvky včetně modulátorů mikrotubulu jako jsou taxanové léky (jako je taxol, paclitaxel, taxoter, docetaxel), podoíylotoxiny nebo vinca alkaloidy (získané z rostliny Vinca roseá) (vincristin, vinblastin),

b) antimetabolické léky jako je 5-fluorouracil, cytarabin, gemcitabin, analogy purinu (jako je pentostatin, methotrexát),

c) alkylační léky jako je hořčičný dusík (jako je cyklofosfamid nebo ifosfamid),

d) léky, které se zaměřují na DNA jako jsou antracyklinové léky, adriamycin, doxorubicin, pharmorubicin nebo epirubicin,

e) léky, které se zaměřují na topoizomerázy, jako je etoposid,

f) hormony a hormonální agonisté nebo antagonisté jako jsou estrogeny, antiestrogeny (tamoxifen a příbuzné sloučeniny) a androgeny, flutamid, leuprorelin, goserelin, cyprotron nebo octreotid,

g) léky, které se zaměřují na přenos signálu v nádorových buňkách včetně derivátů protilátek jako je herceptin,

h) alkylační léky jako jsou platinové léky (cz.s—platin, carboplatin, oxaliplatin, paraplatin) nebo nitrosomočoviny,

i) léky potenciálně ovlivňující metastázy nádorů jako jsou matrix metaloproteinázové inhibitory,

j) genová terapie a antisense (komplementární sekvence genu) činidla,

k) protilátky,

-46CZ 304966 B6

l) další biologicky účinné sloučeniny mořského původu, hlavně didemniny (skupina látek původem z moře), jako je aplidin,

m) analogy steroidů zvláště dexamethason,

n) protizánětlivé léky zvláště dexamethason,

o) léky proti dávení zvláště dexamethason.

Tento vynález se také týká sloučenin používaných ve způsobu léčby a použití těchto sloučenin při přípravě prostředku pro léčbu rakoviny.

Cytotoxický účinek

Buněčné kultury. Buňky byly udržovány v logaritmické fázi růstu v Eagle's Minimum Essential Mediu (EMEM), s Earle's Balanced Salts, s 2,0 mmol/1 (2,0 mM) L-glutaminem, s neesenciálními aminokyselinami (neaa), bez hydrogenuhličitanu sodného (EMEM/neaa), doplněný 10% fetálním telecím sérem (Fetal Calf Sérum, FCS), 10“^{2 *} mol/1 (10^-2 M) hydrogenuhličitan sodným a 0,1 g/1 penicilinem G + streptomycinsulfátem.

Použitím jednoduchého testovacího způsobu byly stanoveny a porovnány protinádorové účinky těchto sloučenin, přičemž byla použita přizpůsobená forma způsobu uvedeného v Bergeron et al., 1984. Použitými liniemi nádorových buněk byly P-388 (suspenzní kultura lymfoidního novotvaru z myši DBA/2), A-549 (jednovrstvá kultura rakovinového nádoru plic člověka), HT-29 (jednovrstvá kultura rakovinného nádoru tlustého střeva člověka) a MEL-28 (jednovrstvá kultura melanomu člověka).

Buňky P-388 byly naočkovány do důlků o velikostí 16 mm v množství 1 x 10⁴ buněk na důlek v 1 ml MEM 5FCS obsahující danou koncentraci léku. Aby se zajistilo, že buňky zůstanou v exponenciální fázi růstu, byly pro kontrolu naočkovány buňky do média neobsahující lék. Všechna stanovení byla provedena duplicitně. Po třech dnech inkubace při teplotě 37 °C, 10% CO₂ v 98% atmosférické vlhkosti byly důlky obarveny roztokem krystalové violeti o koncentraci 0,1 %. Porovnáním růstu v důlcích obsahujících lék s kontrolními důlky byla stanovena hodnota IC₅₀.

Buňky A-549, HT-29 a MEL-28 byly naočkovány do důlků o velikosti 16 mm v množství 2 x 10⁴ buněk na důlek v 1 ml MEM 10FCS obsahující danou koncentraci léku. Aby se zajistilo, že buňky zůstanou v exponenciální fázi růstu, byly pro kontrolu naočkovány buňky do média neobsahující lék. Všechna stanovení byla provedena duplicitně. Po třech dnech inkubace při teplotě 37 °C, 10% CO₂ v 98% atmosférické vlhkosti byly důlky obarveny roztokem krystalové violeti o koncentraci 0,1 %. Porovnáním růstu v důlcích obsahujících lék s kontrolními důlky byla stanovena hodnota IC₅₀.

1. Raymond J. Bergeron, Paul F. Cavanaugh, jr., Steven J. Kline, Robert G. Hughes, Jr., Gary T. Elliot and Carl W. Porter. Antineoplastic and antiherpetic activity if spermidine catecholamide iron chelators. Biochem. Bioph. Res. Comm. 1984, 121(3), pp.848-854.

2. Alan C. Schroeder, Robert G. Hughes, Jr. and Alexander Bloch. Effects of Acyclic Pyrimidine

Nucleoside Analoges. J. Med. Chem. 1981, 24, pp. 1078-1083.

-47CZ 304966 B6

Cytotoxický účinek

Sloučenina	lCso(pmol/l)(pM)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
OMc Ol CM NK HiHyk,, 2	0,009	0,018	0,018	0,018	0,023
OMc M»o'YlK: 14	0,15	>0,15	0,15	>0,15
1 ΟΜ» •fr 15	1,44	1,44	1,44	1,44
1 OM· O^.OyL,M. ^Yf^y '‘j** 0*%·* A ' 16	>1,5	>1,5	>1,5	>1,5
L°JC* on Τ j Vo-Ú 1 17	1,4	1,4	1,4	1,4
V 1 ?*· Lo O^O^L,». L-ο K ČN O / jn XO_L <Α< ' ' 18	0,01	0,01	0,01	0,01

- 48 CZ 304966 B6

Sloučenina	IC50 (μΓηοΙ/Ι) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
\	OM· H0.Á>
	’''Υ’''^Ν-J-M·		0,08	0,16	0,01	0,16
V©
	o^~>	19
	CM· HP^ Á. ,M> S^V^W-J-Me					0,01
			0,01	0,01	0,01
V-o	l č* M· $^ΝΗ«ΜΛι	20
\	OM· «řX,1*
Μ._±			0,019	0,019	0,019	0,019
ú-o	^*4*	21
\	OM* MO^JL,M*
	Sz^^Y^WJMM X.		0,014	0,014	0,014	0,014	0,014	0,014
V-c	L In
	0Λ0.θΜβ»
		22
\	OM· ,βχ.ζΟχ-^γ“·
			0,13	0,13	0,13	0,13	0,13	0,13
\-o	<Λ0'°^	23
\	OM· χΟνχΟγ/γ“·
Μβ-xL	< X		0,18	- 1,8	1,8	1,8	1,8	1,8
Vo	KN»{*	24
	| OM· Ο^,Ο^Χχ*·
M*.JL	''j M**		0,2	0,2	0,2	0,2		0,2
«Ty		25

-49CZ 304966 B6

Sloučenina	ICso (μΐΊΠθΙ/Ι) (μΜ)
Ρ-388	Α-549	ΗΤ-29	MEL-28	CV-1	DU-145
\ ΟΜ» A«o\ « ΊΓ | vY*^’*^“***		0,008	0,008	0,008	0,008
k-O ĚM	35
O 1 °** **°\ A 17 V μ. ΛαΛ Υπ Yf Μ J-«k		0,01	0,01	0,01	0,01
'-Ο ΪΜ	36
OMc ΗίΚ^γ.»* OH JTJ Ο\-Ο J CM κ	28	0,001	0,001	0,001	0,001	0,001	0,001
| ΟΜ· Οχ^Ο^^Λγ'**·
’UX > 0 <Λγ·« '	42	0,13	0,13	0,13	0,13		0,13
ΟΜ· c* Ji i	43	0,008	0,016	0,008	0,008		0,016
©Μ» We **· 'γ'·^γ'*''γζ^Ητ«· ut> {>Λγ“«ωΜ	44	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
ΟΜ· ο** 77 Τ ***		0,01	0,01	0,01	0,01		0,01
Ον-° Μ	45

- 50 CZ 304966 B6

Sloučenina	ICso (μτηοΙ/Ι) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
OMi o Γ 6*	3	0,015	0,015	0,015	0,015	0,018
OMC • aC γχχ-		2,171	2,171	2,171	2,171	2,171
CH	6
ou« * Μ·σ'γχγΜ><^ 0 A	5	0,005	0,005	0,005	0,005
I QM. OvAAy-* *YVyv* íljn A-	7	0,22	0,22	0,22	0,22	0,22
' ‘ Γ* o^OyAy* wyVv^**· *O I ČN MM A	8	>9	>18,1	>18,1	>18,1	>18,1
i ?* OH j7 j 0\~l L žm ^MM	9	>1,77	>1,77	>1,77	>1,77		>1,77
> 1 í* % ^“A“· A	10	>1,65	>1,65	>1,65	>1,65		>1,65

- 51 CZ 304966 B6

Sloučenina	ICso (μίποΙ/Ι) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
1 OM· u« OAC J7 J A 46	0,016	0,016	0,016	0,016		0,016
OM· ΟΑβ T_ 1 Wl(j. A 47	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
HA-X-W °** JLJ οΛΛ 48	0,0008	0,001	0,0008	0,0008		0,001
OMe MO^Jx^Me OAC jT jf V- O X CN NM 2 O^tCMjJ, 49	0,007	0,007	0,007	0,007		0,007
OMt MO^Js^N· oa« f Yjj rj1*· V 50	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001
OM« HOsJs^Me OAc X | Me^ JL ,^<^r VílT M47*·· Atyif \-O \ ČN W ofy“ οΛΑ 51	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001

-52CZ 304966 B6

Sloučenina	IC50 (pmol/l) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
OM* OAe Jl l O \ ČN NH o^S··* NH U 52	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
OMe ho^JR»* oa6 77 T Μ* X λ- ytt n4** AAX»' V_O X ČN NH q^Sj*NH^,CFj Ma 0 53	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001
~ OMe L πΜγ* OVA/ \_O \ ČN NH Me 0 54	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
OMe OH ΊΓΤ “yÝVSX A\V V-0 \ CN NH θΑ*|**·**γ^> Μ» 0 55	0,01	0,01	0,01	0,01		0,01
ΟΜ» OH J2 j ·*♦. Á >^τ ίγίγ 7J~H OHCj» „A-.». ' 56	0,18	0,9	0,18	0,8		0,9

-53CZ 304966 B6

Sloučenina	IC50 (pmol/l) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
OMe *** Zf~	57	0,14	0,14	0,14	0,14		0,14
OMe K\J. lít o*c JH Ϋ zCjC^ív'*1* 0 L ŽH MM	58	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
QM* ΜΟ^Χ,Μ» °*® X j “yVpF ÁjJLí^X '-o I CM M· °	60	0,001	0,001	0,0005	0,001		0,0005
OMe OAc JT T v-o * ČN NH cÁcz,	61	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
OMe HO^Jsy.·*· o* XT ví I ŽH NM H M. 0	62	0,001	0,001	0,0005	0,0005		0,001
OMe HOs^syM· OAe jrjT \—O \ ČN NM ZO	63	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001

- 54 CL 304966 B6

Sloučenina	ICso (μπιοΙ/Ι) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
OMe OAC TJ NH M „ <ΑΛ~° í. 0 64	0,001	0,001	0,001	0,001		0,001
HoJ^Me OAc TJ **’>»^syz*>srz^ N-^Me V-O \ ČN NH 65	0,0001	0,0005	0,0001	0,0001		0,0005
OMe HO^k^-Me au ΊΓ T xxX55“ *—O ( ON ° 66	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001
OMe HO^J^Me OAe Τ ΊΓ V-0 V δΗ NH ,/γΝΗ CF, Me o 67	0,0001	0,0001	0,0001	0,0001		0,0001
OMe MOMaJxyMe OAJ0 Li «/00ύ Λ—O \ CM «Λ Y+TV “““ <□ 142		>1	>1
OMe MOMO^JyM· o on TJ Χζγ \~O \ CN χ—Λ. NHBoe Abf 144		>1	>1

-55CZ 304966 B6

Sloučenina	ICso (pmol/l) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
OMe OAJM jT I XXJL·' Λ-O \ CN OH 146	0,19	0,19	0,19	0,19
OM· ΗΟ^ΤγΜ. CMM fl aJLM* Lo ( ŠH _ V»tV NHBoe Λ*( 147		0,0055	0,0055
OMe MEMO^Js^Me OAN T jf Μ» J- ν^Ίττ N- Me V-O \ ÉM °γ^··^τνζ ~0 148		>1	>1
OM· ΜΕ*«\Λ.Μ« OH JlT Ίφοζκ X-O \ CM «λ VsMy ~0 149		0,01	0,01
OMe KMO^jk-Me O OH T J mV '-O \ CM —v Υ*Ύν 150		0,051	0,051

- Sfi CZ 304966 B6

Sloučenina	ICso (gmol/l) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
OMe 5 OM. o=yS oCXm. *=o\ ,s IJ v-o CH 151		0,012	0,012
Ob ΗΟυΧ,Μ» pup Jl f '-O 1 CH v-^p ΝΗΟ» 153		0,11	0,11
OMe (uCMCkJ^Me OANyt T. Γ ^ÝYYVu. Xm> v^xP NHCte Awf 154		>1	>1
OMe MEMCt^J^Me 0 0« JsLÍ XlP NHCte A%/ 156		>1	>1
^OM· CtaHV 5 OMe 0=/*···. οίΧ,Μ. «0 \ i LJ *4e UL. θν-Χ Υί\ι X'1* 157		0,59	0,59

-57CZ 304966 B6

Sloučenina	ICso (μΓηοΙ/Ι) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
CbzKN om, HO-i-Me toO\ S Γ) °Cj \	158		0,0013	0,0013
r**“ °* 0=/*'l HO-^Á-Me KO\ ? IC í ÁÁr '-o á«	164		0,00015	0,00015
OMe xxx> <U Λ ÉN OTBOMS	165		>1	>1
OMe °**»* T j Ύο ( ČM OTBOMS	166		>1	>1
OMe MEMO^J-^-Me OH JTJ AJLÍ^· °V-0 \ CN OTBOMS	167		>1	>1
OMe MEMO^JL^M· 9oh LJ Me Aí.^ y\ ΤΓ Ί6ΤΊΓ *jMe AJL-V* %-O CM OTBOMS	168		>1	>1
OMe MCMC\Jx.Me 2 OH JL T 0 í i B N-ο \ CM OH	169		>1	>1

-58CZ 304966 B6

Sloučenina	IC50 (pmol/l) (μΜ)
P-388	A-549	HT-29	MEL-28	CV-1	DU-145
ΟΜ» O OH jT I 170		>1	>1
AcO \ s jH f ftte JL 0» JL °'_o έπ 171		0,012	0,012
OMe '-O i « —< °ύ^ύΡ NHCfat 172		>1	>1
MeO “Π < OM* AcO\ S Γ J Μ« -A. Q. X *** '-o Ín 173		0,062	0,062

Mezi účinné sloučeniny tohoto vynálezu patří sloučeniny s 10-hydroxy a 1-labilní skupinou. 5 Ve výhodném provedení tohoto vynálezu dochází k následující reakci.

V dalším výhodném provedení tohoto vynálezu dochází k následující reakci.

-59CZ 304966 B6

Dalším výhodným provedením tohoto vynálezu je reakce, kde se R¹, což je aminomethylenová skupina, přemění na hydroxymethylenovou skupinu.

Dalším výhodným provedením tohoto vynálezu je reakce, kde sloučenina se substituentem R¹, což je hydroxymethylenová skupina, reaguje s činidlem obecného vzorce XXIV,

Prot

3/'

(XXIV) kde Fu označuje chráněnou funkční skupinu, Prot³ je chránící skupina a tečkovaná čára představuje případnou dvojnou vazbu.

Dalším výhodným provedením tohoto vynálezu je příprava 21-kyano sloučeniny obecného vzorce XIX reakcí sloučeniny obecného vzorce XVII,

kde R¹, R⁵, R⁸, R^14a, R^14b, R¹⁵ a R¹⁸ jsou definovány výše a R²¹ je hydroxylová skupina, se zdrojem kyanidového iontu, což vede k požadované 21-kyano sloučenině.

Vynález se také týká způsobů, ve kterých se používají i jiné sloučeniny obsahující nukleofil, což vede ke vzniku sloučenin obecného vzorce XIX, kde 21-pozice je chráněná nukleofilní skupinou, 21-Nuc skupinou. 21-Nuc sloučeninu obecného vzorce XIX s alkylamino substituentem na 21pozici lze připravit reakcí sloučeniny obecného vzorce XVII, kde R²¹ je hydroxylová skupina, s vhodným alkylaminem. 21-Nuc sloučeninu obecného vzorce XIX s alkylthio substituentem na 21-pozici lze také připravit reakcí sloučeniny obecného vzorce XVII, kde R²¹ je hydroxylová skupina, s vhodným alkanthiolem. 21-Nuc sloučeninu obecného vzorce XIX s a-karbonylalkylovým substituentem na 21-pozici lze připravit reakcí sloučeniny vzorce XVII, kde R²¹ je hydroxylová skupina, s vhodnou karbonylovou sloučeninou obvykle v přítomnosti zásady. Pro jiné 21-Nuc sloučeniny existují jiné syntetické cesty.

Dalším výhodným provedením tohoto vynálezu je reakce 21-kyano sloučeniny tohoto vynálezu za vzniku 21-hydroxylové sloučeniny. Takovéto sloučeniny mají zajímavé in vivo vlastnosti.

-60CZ 304966 B6

Příklady uskutečnění vynálezu

Tento vynález je popsán následujícími příklady

Me (2) (Boc); O EtOH, 7 h, 23 °C

04)

K. roztoku sloučeniny 2 (21,53 g, 39,17 mmol) v ethanolu (EtOH) (200 ml) se přidá anhydrid terc-butoxykarbonylu ((Boc)₂O) (7,7 g, 35,25 mmol) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu io 7 hodin. Poté se reakční směs zakoncentruje ve vakuu a zbytek se čistí rychlou (flash) sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:ethylacetát (EtOAc) 6:4), což vede ke vzniku sloučeniny 14 (20,6 g, 81 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,52 (ethylacetát:CHCl₃ 5:2).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,49 (s, 1H), 6,32 (bs, 1H), 5,26 (bs, 1H), 4,60 (bs, 1H), 4,14 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,05 (d, J = 2,4 Ηζ,ΙΗ), 3,94 (s, 3H), 3,81 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 3,7 (s, 3H), 3,34 (brd, J = 7,2 Hz, 1H), 3,18 až 3,00 (m, 5H), 2,44 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 1,82 (s, 3H), 1,80 až 1,65 (m, 1H), 1,48 (s, 9H), 0,85 (d, J = 5,7 Hz, 3H).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 185,5, 180,8, 172,7, 155,9, 154,5, 147,3, 143,3, 141,5, 135,3, 130,4, 129,2, 127,5, 120,2, 117,4, 116,9, 80,2, 60,7, 60,3, 58,5, 55,9, 55,8, 54,9, 54,4, 50,0, 41,6, 40,3, 28,0, 25,3, 24,0, 18,1, 15,6, 8,5.

ESI-MS m/z: vypočítaná C34H43N5O8: 649,7, naměřená (M+H)⁺: 650,3.

Příklad 2

(14) (15)

-61 CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 14 (20,6 g, 31,75 mmol) v CH₃CN (159 ml) se při teplotě 0 °C za stálého míchání přidá diisopropylethylamin (DIPEA) (82,96 ml, 476,2 mmol), methoxymethylenbromid (MOMBr) (25,9 ml, 317,5 mmol) a dimethylaminopyridin (155 mg, 1,27 mmol). Směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 24 hodin. Reakční směs se rychle ochladí na teplotu 0 °C vodným roztokem HCI (750 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N) (pH - 5) a extrahuje se CH2CI2 (2 x 400 ml). Organická fáze se vysuší síranem sodným a zakoncentruje se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:ethylacetát s gradientem 4:1 až 3:2), což vede ke vzniku sloučeniny 15 (17,6 g, 83 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,38 (hexan:ethylacetát 3:7).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,73 (s, 1H), 5,35 (bs, 1H), 5,13 (s, 2H), 4,50 (bs, 1H), 4,25 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,03 (d, J = 2,7 Ηζ,ΙΗ), 3,97 (s, 3H), 3,84 (bs, 1H), 3,82 až 3,65 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 3,56 (s, 3H), 3,39 až 3,37 (m, 1H), 3,20 až 3,00 (m, 5H), 2,46 (d, J = 18 Hz, 1H), 2,33 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 1,85 (s, 3H), 1,73 až 1,63 (m, 1H), 1,29 (s, 9H), 0,93 (d, J = 5,1 Hz, 3H).

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 185,4, 180,9, 172,4, 155,9, 154,5, 149,0, 148,4, 141,6, 135,1, 131,0, 129,9, 127,6, 124,4, 123,7, 117,3, 99,1, 79,3, 60,7, 59,7, 58,4, 57,5, 56,2, 55,9, 55,0, 54,2, 50,0, 41,4, 39,9, 28,0, 25,2, 24,0, 18,1, 15,6, 8,5.

ESI-MS m/z: vypočítaná C^ELpNsO?: 693,8, naměřená (M+H) : 694,3.

Příklad 3

Do baňky obsahující sloučeninu 15 (8 g, 1,5 ml) v methanolu (MeOH) (1,6 1) se při teplotě 0 °C přidá vodný roztok hydroxidu sodného (3,2 1) o koncentraci 1 mol/1 (1 M). Reakční směs se při této teplotě míchá po dobu 2 hodin a poté se přidá roztok HCI o koncentraci 6 mol/1 (6 M) na pH = 5. Směs se extrahuje ethylacetátem (3 x 1 1) a organické vrstvy se vysuší síranem sodným a zakoncentrují se ve vakuu. Zbytek se čistí lychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, s gradientem CHC1₃ až CHCl₃:ethylacetát 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 16 (5,3 mg, 68 %).

Rf: 0,48 (CH₃CN:H₂O 7:3, RP-C18).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,73 (s, 1H), 5,43 (bs, 1H), 5,16 (s, 2H), 4,54 (bs, 1H), 4,26 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 4,04 (d, J = 2,7 Ηζ,ΙΗ), 3,84 (bs, 1H), 3,80 až 3,64 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 3,41 až 3,39 (m, 1H), 3,22 až 3,06 (m, 5H), 2,49 (d, J = 18,6 Hz, 1H), 2,35 (s, 3H), 2,30 až 2,25 (m, 1H), 2,24 (s, 3H), 1,87 (s, 3H), 1,45 až 1,33 (m, 1H), 1,19 (s, 9H), 1,00 (brd, J = 6,6 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 184,9, 180,9, 172,6, 154,7, 151,3, 149,1, 148,6, 144,7, 132,9,

131,3, 129,8, 124,5, 123,7, 117,3, 116,8, 99,1, 79,4, 59,8, 58,6, 57,7, 56,2, 55,6, 54,9, 54,5, 41,6, 40,1, 28,0, 25,3, 24,4, 18,1, 15,7, 8,0

-62 CZ 304966 B6

ESI-MS m/z: vypočítaná C35H45N5O9: 679,7, naměřená (M+H)⁺: 680,3.

Příklad 4

(«) (17)

K odplyněnému roztoku sloučeniny 16 (1,8 g, 2,64 mmol) v DMF (dimethylformamid) (221 ml) se přidá 10% Pd/C (360 mg) a směs se míchá po dobu 45 min ve vodíkové atmosféře (atmosférický tlak). Reakční směs se přefiltruje v argonové atmosféře přes celit do baňky obsahující bezvodý Cs₂CO₃ (2,58 g, 7,92 mmol). Poté se ke směsi přidá bromchlormethan (3,40 ml, 52,8 mmol), baňka se uzavře a směs se při teplotě 100 °C míchá po dobu 2 hodin. Reakční směs se ochladí, přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se CH₂C1₂. Organická vrstva se zakoncentruje a vysuší síranem sodným, což vede ke vzniku sloučeniny 17 ve formě hnědého oleje, který se bez dalšího čištění použije v následujícím kroku.

Rf: 0,36 (SiO₂, hexan.ethylacetát 1:5).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,68 (s, 1H), 6,05 (bs, 1H), 5,90 (s, 1H), 5,79 (s, 1H), 5,40 (bs, 1H), 5,31 až 5,24 (m, 2H), 4,67 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,19 (d, J = 2,7 Ηζ,ΙΗ), 4,07 (bs, 1H), 4,01 (bs, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,67 (s, 3H), 3,64 až 2,96 (m, 5H), 2,65 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,33 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,01 až 1,95 (m, 1H), 1,28 (s, 9H), 0,87 (d, J = 6,3 Hz, 3H).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 172,1, 162,6, 154,9, 149,1, 145,7, 135,9, 130,8, 130,7, 125,1, 123,1, 117,8, 100,8, 99,8, 76,6, 59,8, 59,2, 57,7, 57,0, 56,7, 55,8, 55,2, 49,5, 41,6, 40,1, 36,5, 31,9,31,6, 29,7, 28,2, 26,3,25,0, 22,6,18,2, 15,8, 14,1,8,8.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃6H47N₅O₉: 693,34, naměřená (M+H)⁺: 694,3.

Příklad 5

-63 CZ 304966 B6

Do baňky obsahující roztok sloučeniny 17 (1,83 g, 2,65 mmol) v DMF (13 ml) se při teplotě 0 °C přidá Cs₂CO₃ (2,6 g, 7,97 mmol) a allylbromid (AllylBr) (1,15 ml, 13,28 mmol). Výsledná směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 1 hodiny. Reakční směs se přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se CH2CI2. Organická vrstva se vysuší síranem sodným a zakoncentruje se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, CHCl₃:ethylacetát 1:4), což vede ke vzniku sloučeniny 18 (1,08 mg, 56 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,36 (CHCl₃:ethylacetát 1:3).

'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,70 (s, 1H), 6,27 až 6,02 (m, 1H), 5,94 (s, 1H), 5,83 (s, 1H), 5,37 (dd, Jj = 1,01 Hz, J₂ = 16,8 Hz, 1H), 5,40 (bs, 1H), 5,25 (dd, J, = 1,0 Hz, J₂ = 10,5 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 4,91 (bs, 1H), 4,25 až 4,22 (m, 1H), 4,21 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,14 až 4,10 (m, 1H), 4,08 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,00 (bs, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,59 (s, 3H), 3,56 až 3,35 (m, 2H), 3,26 až 3,20 (m, 2H), 3,05 až 2,96 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18 Hz, 1H), 2,63 (d, J = 18 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 1,91 až 1,80 (m, 1H), 1,24 (s, 9H), 0,94 (d, J = 6,6 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 172,0, 154,8, 148,8, 148,6, 148,4, 144,4, 138,8, 133,7, 130,9,

130,3, 125,1, 124,0, 120,9, 117,8, 117,4, 112,8, 112,8, 112,6, 101,1,99,2, 73,9, 59,7, 59,3,57,7, 56,9, 56,8, 56,2, 55,2, 40,1,34,6, 31,5, 28,1, 26,4, 25,1, 22,6, 18,5, 15,7, 14,0, 9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C^H^NsO^ 733,4, naměřená M+H): 734,4.

Příklad 6

(18)

HCI/dioxan 1,2 h, 23 °C

Me (19)

K roztoku sloučeniny 18 (0,1 g, 0,137 mmol) v dioxanu (2 ml) se přidá směs HCl/dioxan (1,46 ml) o koncentraci HCI 4,2 mmol/1 (4,2 M) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 1,2 hodiny. Reakční směs se rychle ochladí na teplotu 0 °C nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (60 ml) a extrahuje se ethylacetátem (2 x 70 ml). Organické vrstvy se vysuší síranem sodným a zakoncentrují se ve vakuu, což vede ke vzniku sloučeniny 19 (267 mg, 95 %) ve formě bílé pevné látky, která se bez dalšího čištění použije v následujících reakcích.

Rf: 0,17 (SiO₂, ethylacetát:methanol 10:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,49 (s, 1H), 6,12 až 6,00 (m, 1H), 5,94 (s, 1H), 5,86 (s, 1H), 5,34 (dd, J, = 1,0 Hz, J₂ = 17,4 Hz, 1H), 5,25 (dd, J = 1,0 Hz, J = 10,2 Hz, 1H), 4,18 až 3,76 (m, 5H), 3,74 (s, 3H), 3,71 až 3,59 (m, 1H), 3,36 až 3,20 (m, 4H), 3,01 až 2,90 (m, 1H), 2,60 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,97 až 1,86 (m, 1H), 0,93 (d, J = 8,7 Hz, 3H).

-64CZ 304966 B6

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 175,5, 148,4, 146,7, 144,4, 142,4, 138,9, 133,7, 131,3, 128,3, 120,8, 117,9, 117,4, 113,8, 112,4, 101,1, 74,2, 60,5, 59,1, 56,5, 56,1, 56,3, 56,0, 55,0, 50,5, 41,6,

39,5, 29,5, 26,4, 24,9, 21,1, 15,5, 9,33.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₂H₃₉N5O₆: 589, naměřená (M+H)⁺: 590.

Me (19) fenylisokyanát >

h, 23 °C

K roztoku sloučeniny 19 (250 mg, 0,42 mmol) v CH₂C1₂ (1,5 mmol) se přidá fenylisothiokyanát (0,3 ml, 2,51 mmol) a směs se pri teplotě 23 °C míchá po dobu 1 hodiny. Reakční směs se zakoncentruje ve vakuu a zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, s gradientem hexan až hexan:ethylacetát 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 20 (270 mg, 87 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,56 (CHCly.ethylacetát 1:4).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 8,00 (bs, 1H), 7,45 až 6,97 (m, 4H), 6,10 (s, 1H), 6,08 až 6,00 (m, 1H), 5,92 (s, 1H), 5,89 (s, 1H), 5,82 (s, 1H), 5,40 (dd, J = 1,5 Hz, J = 17,1 Hz, 1H), 3,38 (bs, 1H), 5,23 (dd, J = 1,5 Hz, J = 10,5 Hz, 1H), 4,42 až 4,36 (m, 1H), 4,19 až 4,03 (m, 5H), 3,71 (s, 3H), 3,68 až 3,17 (m, 4H), 2,90 (dd, J = 7,8 Hz, J = 18,3 Hz, 1H), 2,57 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,25 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,90 (dd, J = 12,3 Hz, J = 16,5 Hz, 1H), 0,81 (d, J = 6,9 Hz, 3H).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 178,4, 171,6, 148,6, 146,8, 144,3, 142,7, 138,7, 136,2, 133,6,

130,7, 129,8, 126,6, 124,2, 124,1, 120,9, 120,5, 117,7, 117,4, 116,7, 112,6, 112,5, 101,0, 74,0, 69,9, 59,0, 57,0, 56,2, 56,1, 55,0, 53,3, 41,4, 39,7, 26,3, 24,8, 18,3, 15,5, 9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₉H44N₆O₆S: 724,8, naměřená (M+H)⁺: 725,3.

Me (20)

HCl v dioxanu ->

minut, 23 °C

(21)

-65CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 20 (270 mg, 0,37 mmol) v dioxanu (1 ml) se přidá směs HCl/dioxan (3,5 ml) o koncentraci HCI 4,2 mol/1 (4,2 N) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 30 minut. Poté se ke směsi přidá ethylacetát (20 ml) a H₂O (20 ml) a organická vrstva se oddělí dekantací. Vodná fáze se při teplotě 0 °C zalkalizuje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (60 ml) (pH = 8) a extrahuje se CH₂C1₂ (2 x 50 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným a zakoncentrují se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografíí (SiO₂, ethylacetát:methanol 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 21 (158 mg, 82 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,3 (ethylacetát:methanol 1:1).

'HNMR(300 MHz, CDC1₃): δ 6,45 (s, 1H), 6,12 až6,03 (m, 1H), 5,91 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 5,38 (dd, Ji = 1,2 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,24 (dd, Ji = 1,2 Hz, J₂ = 10,5 Hz, 1H), 4,23 až 4,09 (m, 4H), 3,98 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 3,90 (bs, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,36 až 3,02 (m, 5H), 2,72 až 2,71 (m, 2H), 2,48 (d, J= 18,0 Hz, 1H), 2,33 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,85 (dd, J, = 11,7 Hz, J₂= 15,6

Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 148,4, 146,7, 144,4, 142,8, 138,8, 133,8, 130,5, 128,8, 121,5,

ESI-MS m/z: vypočítaná C^H^N^: 518,3, naměřená (M+H)⁺: 519,2.

Příklad 9

Me

Me

TrocCI, py, CH₂CI_{2 >}

Me

1h, -10 °C

NH₂ (21)

CN

NHTroc (22)

K roztoku sloučeniny 21 (0,64 g, 1,22 mmol) v CH₂C1₂ (6,13 ml) se při teplotě -10 °C přidá pyridin (py) (0,104 ml, 1,28 mmol) a 2,2,2-trichlorethylchlorformiát (TrocCI) (0,177 ml, 1,28 mmol). Směs se při této teplotě míchá po dobu 1 hodiny, poté se reakční směs rychle ochladí přídavkem HCI (10 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N) a extrahuje se CH₂C1₂ (2x10 ml). Organická vrstva se vysuší síranem sodným a zakoncentruje se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:ethylacetát 1:2), což vede ke vzniku sloučeniny 22 (0,84 g, 98 %) ve formě bílé porézní pevné látky.

Rf: 0,57 (ethylacetát:methanol 5:1).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,50 (s, 1H), 6,10 až 6,00 (m, 1H), 6,94 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,87 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,73 (bs, 1H), 5,37 (dq, Ji = 1,5 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,26 (dq, Ji = 1,8 Hz, J₂ = 10,2 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,22 až 4,10 (m, 4H), 4,19 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,02 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,37 až 3,18 (m, 5H), 3,04 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18 Hz, 1H), 2,63 (d, J = 18 Hz, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,85 (dd, Ji = 12,3 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H).

-66CZ 304966 B6 ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 154,3, 148,5, 146,7, 144,5, 142,8, 139,0, 133,8, 130,7, 128,7,

121,3, 120,8, 117,8, 117,7, 116,8, 112,7, 101,2, 77,2, 74,3, 60,7, 59,9, 57,0, 56,4, 55,3, 43,3,

41,7, 31,6, 26,4, 25,3, 22,6, 15,9, 14,1, 9,4.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₂H₃5C1₃N₄O₇: 694,17, naměřená (M+H)⁺: 695,2.

Příklad 10

MOMBr, CH₃CN, DIPEA -: i—:->

DMAP, 10 h, 30 °C

K roztoku sloučeniny 22 (0,32 g, 0,46 mmol) v CH₃CN (2,33 ml) se při teplotě 0 °C přidá diisopropylethylamin (1,62 ml, 9,34 mmol), brommethylmethylether (0,57 ml, 7,0 mmol) a dimethylaminopyridin (6 mg, 0,046 mmol). Směs se udržuje při teplotě 30 °C po dobu 10 hodin. Reakční směs se poté naředí dichlormethanem (30 ml) a převede se do vodného roztoku HCI (10 ml) pH = 5. Organická vrstva se vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexamethylacetát 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 23 (0,304 g, 88 %) ve formě bílé porézní pevné látky.

Rf: 0,62 (hexamethylacetát 1:3) 'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,73 (s, 1H), 6,10 (m, 1H), 5,94 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,88 (d, J =

I, 5 Hz, 1H), 5,39 (dq, Ji = 1,5 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,26 (dq, Ji = 1,8 Hz, J₂ = 10,2 Hz, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,61 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,55 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,25 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,22 až 4,11 (m, 4H), 4,03 (m, 2H), 3,72 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 3,38 až 3,21 (m, 5H), 3,05 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18 Hz, 1H), 2,65 (d, J = 18 Hz, 1H), 2,32 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 1,79 (dd,

J, = 12,3 Hz, J₂=15,9Hz, 1H).

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 154,3, 148,6, 148,4, 144,5, 139,0, 133,6, 130,6, 130,1, 125,07,

124,7, 124,0, 121,1, 117,7, 112,6, 101,2, 99,2, 77,2, 74,4, 74,1, 59,8, 59,8, 57,7, 57,0, 56,8, 56,68, 55,3, 43,2, 41,5, 26,4, 25,2, 15,9, 9,3.

ESI-MS m/z: vypočítaná C^H^Cl^Os: 738,20, naměřená (M+H)⁺: 739,0.

vodný AcOH, Zn >

h, 23 °C

-67CZ 304966 B6

K suspenzi sloučeniny 23 (0,304 mg, 0,41 mmol) v 90% vodném roztoku kyseliny octové (4 ml) se přidá práškový zinek (0,2 g, 6,17 mmol) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 7 hodin. Směs se přefiltruje přes podložku z celitu, která se promyje CH₂C1₂. Organická vrstva se promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (15 ml) (pH = 9) a vysuší se síranem sodným. Rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku, což vede ke vzniku sloučeniny 24 (0,191 g, 83 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,3 (ethylacetát:methanol 5:1).

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,68 (s, 1H), 6,09 (m, 1H), 5,90 (d, J= 1,5 Hz, 1H), 5,83 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,39 (dq, J, = 1,5 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,25 (dq, J, = 1,5 Hz, J₂ = 10,2 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 4,22 až 4,09 (m, 3H), 3,98 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,89 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 3,37 až 3,17 (m, 3H), 3,07 (dd, J, = 8,1 Hz, J₂ = 18 Hz, 1H), 2,71 (m, 2H), 2,48 (d, J = 18 Hz, 1H), 2,33 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 1,80 (dd, Ji = 12,3 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 148,5, 148,2, 144,3, 138,7, 133,7, 130,7, 129,9, 125,0, 123,9,

121,3, 117,9, 117,5, 113,6, 112,0, 101,0, 99,2, 74,0, 59,8, 59,7, 58,8, 57,6, 57,0, 56,2, 55,2, 44,2,

41,5, 31,5, 26,4, 25,6, 22,5, 16,7, 14,0, 9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C_3]H₃₈N₄O6: 562,66, naměřená (M+H)⁺: 563,1.

Příklad 12

K roztoku sloučeniny 24 (20 mg, 0,035 mmol) ve H₂O (0,7 mmol) a THF (tetrahydrofuranu) (0,7 mmol) se při teplotě 0 °C přidá NaNO₂ (12 mg, 0,17 mmol) a 90% vodný roztok AcOH (0,06 ml) a směs se při teplotě 0 °C míchá po dobu 3 hodin. Poté se směs naředí CH₂C1₂ (5 ml), organická vrstva se promyje vodou (1 ml), vysuší se síranem sodným a zakoncentruje se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupovou chromatografií (SiO₂, hexan.ethylacetát 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 25 (9,8 mg, 50 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,34 (hexamethylacetát 1:1).

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,71 (s, 1H), 6,11 (m, 1H), 5,92 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,87 (d, J = 1,5 Hz, 1), 5,42 (dq, J, = 1,5 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,28 (dq, J, = 1,5 Hz, J₂ = 10,2 Hz, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,26 až 4,09 (m, 3H), 4,05 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 3,0 Hz, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,67 až 3,32 (m, 4H), 3,58 (s, 3H), 3,24 (dd, J, = 2,7 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H), 3,12 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18,0 Hz, 1H), 2,51 (d, J = 18 Hz, 1H), 2,36 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 1,83 (dd, J, = 12,3 Hz, J₂= 15,9 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 148,7, 148,4, 138,9, 133,7, 131,1, 129,4, 125,1, 123,9, 120,7,

117.6, 117,5, 113,2, 112,3, 101,1, 99,2, 74,0, 63,2, 59,8, 59,7, 57,9, 57,7, 57,0, 56,5, 55,2, 41,6,

29.6, 26,1,25,6, 22,6, 15,7, 9,2.

-68CZ 304966 B6

ESI-MS m/z: vypočítaná C31H37N3O7: 563,64, naměřená (M+H)⁺: 564,1.

Příklad 13

2,2,2,-trichlorethylchlorformiát >

NaH, THF, zpětný chladič

K suspenzi hydridu sodného (354 mg, 8,86 mmol) v THF (40 ml) se při teplotě 23 °C přidá výchozí látka (2,0 g, 5,90 mmol). K této suspenzi se při teplotě 23 °C přidá allylchlorformiátem (1,135 ml, 8,25 mmol) a suspenze se poté pod zpětným chladičem vaří po dobu 3 hodin. Suspenze se ochladí, přefiltruje, pevný zbytek se promyje ethylacetátem (100 ml) a filtrát se zakoncentruje. Olejovitý zbytek se naředí hexanem (100 ml) a při teplotě 4 °C se nechá stát přes noc. Rozpouštědlo se oddělí dekantaci a ke světle žluté kaši se přidá CH₂C1₂ (20 ml) a vysráží se hexanem (100 ml). Po uplynutí 10 minut se rozpouštědlo opět oddělí dekantaci. Postup se opakuje dokud nevznikne bílá pevná látka. Bílá pevná látka se přefiltruje a vysuší, což vede ke vzniku sloučeniny 29 (1,80 g, 65 %) ve formě bílé pevné látky.

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,74 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,62 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 7,33 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,30 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 5,71 (d, J = 7,8 Hz, IH), 4,73 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 4,59 (m, IH), 4,11 (t, J = 6,0 Hz, IH), 3,17 (dd, J = 6,0 Hz, J = 2,7 Hz, 2H), 3,20 (dd, J = 5,4 Hz, J = 2,1 Hz, 2H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 173,6, 152,7, 144,0, 139,7, 137,8, 126,0, 125,6, 123,4, 118,3, 73,4, 52,4, 45,5, 35,8, 33,7.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₂oHigCl₃N04S: 474,8, naměřená (M+Na)⁺: 497,8.

Příklad 14

Směs sloučeniny 25 (585 mg, 1,03 mmol) a sloučeniny 29 (1,47 mg, 3,11 mmol) se azeotropicky destiluje s bezvodým toluenem (3x10 ml). K roztoku sloučeniny 25 a sloučeniny 29 v bezvodém CH₂C1₂ (40 ml) se při teplotě 23 °C přidá DMAP (633 mg, 5,18 mmol) a EDC-HC1 (1,3dimethylaminopropyl-3-ethylkarbodiimidhydrochlorid) (994 mg, 5,18 mmol). Reakční směs se

-69CZ 304966 B6 při teplotě 23 °C míchá po dobu 3 hodin. Směs se rozdělí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (50 ml) a vrstvy se oddělí. Vodná vrstva se promyje CH₂C1₂ (50 ml). Organické vrstvy se vysuší síranem sodným, přefiltrují a zakoncentrují se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (ethylacetát:hexan 1:3), což vede ke vzniku sloučeniny 30 (1,00 g, 95 %) ve formě světle krémově žluté pevné látky.

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,72 (m, 2H), 7,52 (m, 2H), 7,38 (m, 2H), 7,28 (m, 2H), 6,65 (s, 1H), 6,03 (m, 1H), 5,92 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,79 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,39 (m, 1H), 5,29 (dq, J = 10,3 Hz, J = 1,5 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 4,73 (d, J= 11,9 Hz, 1H), 4,66 (d, J= 11,9 Hz, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,36 až 3,96 (m, 9H), 3,89 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,55 (s, 3H), 3,33 (m, 1H),

3,20 (m, 2H), 2,94 (m, 3H), 2,59 (m, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,83 (dd, J= 16,0 Hz, J= 11,9 Hz, 1H).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 169,7, 154,0, 148,8, 148,4, 145,7, 144,5, 140,9, 139,0, 133,7,

130.9, 130,6, 127,6, 127,0, 124,8, 124,6, 124,1, 120,8, 119,9, 118,2, 117,7, 117,3, 112,7, 112,1,

101,3, 99,2, 74,7, 73,9, 64,4, 59,8, 57,7, 57,0, 56,8, 55,4, 53,3, 46,7, 41,4, 36,5, 34,7, 31,5, 26,4,

24.9, 22,6, 15,7, 14,0, 9,1.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₅iH₅₃C1₃N₄OioS: 1020,4, naměřená (M+H)⁺: 1021,2.

Příklad 15

K roztoku sloučeniny 30 (845 mg, 0,82 mmol), kyseliny octové (500 mg, 8,28 mmol) a dichlorbis(trifenylfosfín) palladnatý ((PPh₃)₂PdCl₂) (29 mg, 0,04 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (20 ml) se při teplotě 23 °C po kapkách přidá tributylstanniumhydrid (Bu₃sNh) (650 mg, 2,23 mmol). Reakční směs se při této teplotě probubláváním míchá po dobu 15 min. Zbytek se rychle ochladí vodou (50 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (3 x 50 ml). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a zakoncentruje se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (ethylacetát:hexan s gradientem 1:5 až 1:3), což vede ke vzniku sloučeniny 31 (730 mg, 90 %) ve formě světle krémově žluté pevné látky.

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,72 (m, 2H), 7,56 (m, 2H), 7,37 (m, 2H), 7,30 (m, 2H), 6,65 (s, 1H), 5,89 (s, 1H), 5,77 (s, 1H), 5,74 (s, 1H), 5,36 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,32 (d, J = 5,9 Hz, 1H),

5,20 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,75 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,73 (m, 1H), 4,48 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,08 (m, 4H), 3,89 (m, 1H), 3,86 (t, J = 6,2 Hz, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,69 (s, 3H), 3,38 (m, 1H), 3,25 (m, 1H), 3,02 až 2,89 (m, 4H), 2,67 (s, 1H), 2,61 (s, 1H), 2,51 (dd, J = 14,3 Hz, J = 4,5 Hz, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 1,95 (s, 3H), 1,83 (m, 1H).

-70CZ 304966 B6 ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 168,2, 152,5, 148,1, 146,2, 144,4, 144,3, 143,3, 139,6, 134,6,

129,7, 129,6, 126,2, 125,6, 123,4, 123,3, 121,6, 118,5, 116,3, 110,7, 110,2, 105,1, 99,4, 98,5, 75,2, 73,3, 61,7, 58,4, 57,9, 56,3, 56,1, 55,1, 54,7, 53,9, 51,9, 45,2, 40,1, 35,6, 33,3, 24,8, 23,3, 14,5, 7,3.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₄8H49C1₃N40ioS: 980,3, naměřená (M+H)⁺: 981,2.

Příklad 16

K roztoku sloučeniny 31 (310 mg, 0,32 mmol) v bezvodém CH2CI2 (15 ml) se při teplotě -10 °C pomocí kanyly přidá 70% roztok anhydridu kyseliny benzenselenové ((PhSeO)₂O) (165 mg, 0,32 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (7 ml), přičemž tato teplota se udržuje. Reakční směs se při teplotě -10 °C míchá po dobu 5 minut. Při této teplotě se ke směsi přidá nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (30 ml). Vodná vrstva se promyje CH₂C1₂ (40 ml). Organické vrstvy se vysuší síranem sodným, přefiltrují a zakoncentrují. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (ethylacetát:hexan s gradientem 1:5 až 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 32 (287 mg, 91 %, HPLC 91,3 %) ve formě světle krémově žluté pevné látky tvořené dvěma izomery (65:35), které se použijí v následujícím kroku.

'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ (směs izomerů) 7,76 (m, 4H), 7,65 (m, 4H), 7,39 (m, 4H), 7,29 (m, 4H), 6,62 (s, 1H), 6,55 (s, 1H), 5,79 až 5,63 (m, 6H), 5,09 (s, 1H), 5,02 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,99 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,80 až 4,63 (m, 6H), 4,60 (m, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,38 (d, J = 12,8 Hz, J = 7,5 Hz, 1H), 4,27 (dd, J = 12,8 Hz, J = 7,5 Hz, 1H), 4,16 až 3,90 (m, 10H), 3,84 (s, 3H), 3,62 (s, 3H), 3,50 (s, 3H), 3,49 (s, 3H), 3,33 až 2,83 (m, 14H), 2,45 až 2,18 (m, 2H), 2,21 (s, 6H), 2,17 (s, 6H), 1,77 (s, 6H), 1,67 (m, 2H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ (směs izomerů) 168,6, 168,4, 158,6, 154,8, 152,8, 152,5, 147,3, 147,2, 146,8, 144,1, 144,0, 140,8, 139,7, 137,1, 129,8, 129,3, 128,4, 128,7, 126,5, 125,5, 123,7,

123,6, 123,5, 123,4, 122,2, 121,3, 118,3, 115,8, 115,5, 110,2, 106,9, 103,5, 103,2, 100,1, 99,6,

97.9, 97,7, 93,8, 73,4, 70,9, 69,2, 64,9, 62,5, 59,3, 58,9, 58,4, 56,7, 56,3, 56,2, 55,4, 55,2, 55,1,

54.9, 54,7, 54,3, 54,1, 53,8, 52,8, 45,5, 40,5, 40,0, 39,8, 35,8, 35,5, 33,9, 33,7, 30,1, 28,8, 24,2, 24,1, 21,2, 14,5, 14,4, 12,7, 6,0, 5,7.

ESI-MS m/z: vypočítaná C48H49CI3N4O11S: 996,3, naměřená (M+H)⁺: 997,2.

-71 CZ 304966 B6

Příklad 17

(32)

1) DMSO, Tf₂O

2) DIPEA

3) tercBuOH —--j

N*Bu

4) Λ Me₂N NMe₂

5) Ac₂O, CH₂CI₂

Me (33)

Reakční baňka se dvakrát vyžíhá, několikrát se promyje argonem a udržuje se v argonové atmosféře. K roztoku DMSO (39,1 ml, 0,55 mmol, 5 ekvivalentů) v bezvodém CH2CI2 (4,5 ml) se při teplotě -78 °C po kapkách přidá anhydrid kyseliny trifluormethansulfonové (Tf₂O) (37,3 ml, 0,22 mmol, 2 ekvivalenty). Reakční směs se při teplotě -78 °C míchá po dobu 20 minut, poté se pomocí kanyly při teplotě -78 °C přidá roztok sloučeniny 32 (110 mg, 0,11 mmol, HPLC 91,3 %) vbezvodém CH₂C1₂ (1 ml jako hlavní přídavek a 0,5 ml na promytí). Během přidávání se v baňkách udržuje teplota -78 °C a barva se změní ze žluté na hnědou. Reakční směs se při teplotě -40 °C míchá po dobu 35 minut. Během tohoto časového intervalu se roztok změní ze žluté na tmavě zelenou. Po uplynutí této doby se po kapkách přidá ‘Pr₂NEt (diisopropylethylamin) (153 ml, 0,88 mmol, 8 ekvivalentů), reakční směs se při teplotě 0 °C nechá reagovat po dobu 45 minut a během této doby se barva roztoku změní na hnědou. Poté se k reakční směsi po kapkách přidá terc.butanol (terc.BuOH) (41,6 ml, 0,44 mmol, 4 ekvivalenty) a 2-terc.butyl-l, 1,3,3— tetramethylguanidin (132,8 ml, 0,77 mmol, 7 ekvivalentů) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 40 minut. Po uplynutí této doby se k reakční směsi po kapkách přidá acetanhydrid (104,3 ml, 1,10 mmol, 10 ekvivalentů) a směs se nechá reagovat při teplotě 23 °C po více než 1 hodiny. Poté se reakční směs naředí CH₂C1₂ (20 ml) a promyje se nasyceným vodným roztokem NH4CI (50 ml), hydrogenuhliěitanu sodného (50 ml) a chloridu sodného (50 ml). Organické vrstvy se vysuší síranem sodným, přefiltrují a zakoncentrují se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (eluent ethylacetát:hexan s gradientem 1:3 až 1:2), což vede ke vzniku sloučeniny 33 (54 mg, 58 %) ve formě světle žluté pevné látky.

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,85 (s, 1H), 6,09 (s, 1H), 5,99 (s, 1H), 5,20 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 5,03 (m, 1H), 4,82 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,35 až 4,17 (m, 4H), 3,76 (s, 3H), 3,56 (s, 3H), 3,45 (m, 2H), 2,91 (m, 2H), 2,32 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,12 (m, 2H), 2,03 (s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 168,5, 167,2, 152,7, 148,1, 147,1, 144,5, 139,6, 139,1, 130,5, 129,0, 123,7, 123,5, 123,3, 118,8, 116,5, 112,1, 100,6, 97,8, 73,3, 60,5, 59,4, 59,2, 58,3, 57,6, 57,4, 56,1, 53,3, 53,1, 40,6, 40,0, 31,0, 22,2, 18,9, 14,4, 8,1.

ESI-MS m/z: vypočítaná C36H39CI3N4O11S: 842,1, naměřená (M+H)⁺: 843,1.

-72CZ 304966 B6

Příklad 18

(33) (34)

K roztoku sloučeniny 33 (12 mg, 0,014 mmol) v suchém dichlormethanu (1,2 ml) a pro HPLC použitelném acetonitrilu (1,2 ml) se při teplotě 23 °C přidá jodid sodný (21 mg, 0,14 mmol) a čerstvě předestilovaný (použitím hydridu vápenatého za atmosférického tlaku) trimethylsilylchlorid (TMSC1) (15,4 mg, 0,14 mmol). Reakční směs změní barvu na oranžovou. Po uplynutí 15 minut se roztok naředí dichlormethanem (10 ml) a promyje se čerstvým nasyceným vodným rozio tokem Na₂S₂O₄ (3x10 ml). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a zakoncentruje se, což vede ke vzniku sloučeniny 34 (13 mg, kvantitativní) ve formě světle žluté pevné látky, která se použije bez dalšího čištění.

’H NMR (300 MHz, CDCfi): δ 6,85 (s, 1H), 6,09 (s, 1H), 5,99 (s, 1H), 5,27 (d, J = 5,8 Hz, 1H),

5,14 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 5,03 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 4,82 (d, J = 12,2 Hz, 1H), 4,63 (d, J = 13,0

Hz, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,34 (m, 1H), 4,27 (bs, 1H), 4,18 (m, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,56 (s, 3H), 3,44 (m, 1H), 3,42 (m, 1H), 2,91 (m, 2H), 2,32 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,03 (s, 3H). ESI-MS m/z: vypočítaná C34H35N4O10S: 798,1, naměřená (M+H)⁺: 799,1.

Příklad 19

K roztoku sloučeniny 34 (13 mg, 0,016 mmol) ve směsi kyselina octová/voda (90:10, 1 ml) se při teplotě 23 °C přidá práškový zinek (5,3 mg, 0,081 mmol). Reakční směs se udržuje při teplotě 70 °C po dobu 6 hodin. Po uplynutí této doby se směs ochladí na teplotu 23 °C, naředí se CH₂C1₂ (20 ml) a promyje se nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (15 ml) a vodným roztokem Et₃N (triethylamin) (15 ml). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a zakoncentruje se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (oxid křemičitýNH₂, eluent ethylacetát:hexan s gradientem 0:100 až 50:50), což vede ke vzniku sloučeniny 35 (6,8 mg, 77 % pro dva kroky) ve formě světle žluté pevné látky.

-73CZ 304966 B6 *H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,51 (s, 1H), 6,03 (dd, J = 1,3 Hz, J = 26,5 Hz, 2H), 5,75 (bs, 1H), 5,02 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,52 (m, 1H), 4,25 (m, 2H), 4,18 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 4,12 (dd, J = 1,9 Hz, J = 11,5 Hz, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,40 (m, 2H), 3,26 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 2,88 (m, 2H), 2,30 až 2,10 (m, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 2,02 (s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 174,1, 168,4, 147,8, 145,4, 142,9, 140,8, 140,1, 131,7, 130,2, 129,1, 128,3, 120,4, 118,3, 117,9, 113,8, 111,7, 101,7, 61,2, 59,8, 59,2, 58,9, 54,4, 53,8, 54,4,

41,3, 41,5, 34,1, 23,6, 20,3, 15,5, 9,4.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃iH₃₄N₄O₈S: 622,7, naměřená (M+H)⁺: 623,2.

Příklad 20

K roztoku N-methylpyridin-4-karboxaldehydjodidu (378 mg, 1,5 mmol) v bezvodém DMF (5,8 ml) se přidá bezvodý toluen (2x10 ml), aby se pomocí azeotropické destilace toluenu eliminoval obsah vody. Poté se k tomuto oranžovému roztoku pomocí kanyly při teplotě 23 °C přidá roztok sloučeniny 35 (134 mg, 0,21 mmol), předem upravený bezvodým toluenem (2x10 ml), v bezvodém CH2CI2 (destilovaný s CaH₂, 7,2 ml). Reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 4 hodin. Po uplynutí této doby se při teplotě 23 °C po kapkách přidá DBU (32,2 μΐ, 0,21 mmol) a při teplotě 23 °C se míchá po dobu 15 minut. K reakční směsi se přidá čerstvý nasycený vodný roztok kyseliny šťavelové (5,8 ml) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 30 minut. Poté se reakční směs ochladí na teplotu 0 °C a po částech se přidá NaHCO₃ a následně se přidá nasycený vodný roztok NaHCO₃. Směs se extrahuje Et₂O (diethylether). K vodné vrstvě se přidá K₂CO₃ a směs se extrahuje Et₂O. Organické vrstvy se vysuší MgSO₄ a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (EtOAc:hexan 1:3 až 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 36 (77 mg, 57 %) ve formě světle žluté pevné látky.

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,48 (s, 1H), 6,11 (d, J= 1,3 Hz, 1H), 6,02 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 5,70 (bs, 1H), 5,09 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 4,66 (bs, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,27 (d, J = 5,6 Hz, 1H),

4,21 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 4,16 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 3,42 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 2,88 až 2,54 (m, 3H), 2,32 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,04 (s, 3H).

’³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 186,7, 168,5, 160,5, 147,1, 146,4, 142,9, 141,6, 140,7, 130,4,

129,8, 121,7 (2C), 120,0, 117,8, 117,1, 113,5, 102,2,61,7,61,4, 60,3,59,8,58,9, 54,6,41,6,36,9,

29,7, 24,1,20,3, 15,8, 14,1,9,6.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃iH₃₁N₃O9S: 621,7, naměřená (M+H)⁺: 622,2.

-74CZ 304966 B6

Příklad 21

K roztoku sloučeniny 36 (49 mg, 0,08 mmol) a 2-[3-hydroxy-4-methoxyfenyl]ethylaminu (46,2 mg, 0,27 mmol) v ethanolu (2,5 ml) se při teplotě 23 °C přidá silikagel (105 mg). Reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 14 hodin. Směs se naředí hexanem a prolije se kolonou na sloupcovou chromatografii (ethylacetát:hexan 1:3 až 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny ET770 (55 mg, 90 %) ve formě světle žluté pevné látky.

¹II NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,60 (s, 1H), 6,47 (s, 1H), 6,45 (s, 1H), 6,05 (s, 1H), 5,98 (s, 1H), 5,02 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 4,57 (bs, 1H), 4,32 (bs, 1H), 4,28 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,18 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 4,12 (dd, J = 2,1 Hz, J = 11,5 Hz, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,62 (s, 3H), 3,50 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 3,42 (m, 1H), 3,10 (ddd, Ji = 4,0 Hz, J₂ = 10,0 Hz, J₃ = 11,0 Hz, 1H), 2,94 (m, 2H), 2,79 (m, 1H), 2,61 (m, 1H), 2,47 (m, 1H), 2,35 (m, 1H), 2,32 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,09 (m, 1H), 2,04 (s, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C40H42N4O10S: 770,7, naměřená (M+H)⁺: 771,2.

Příklad 22

K roztoku sloučeniny 21 (22 mg, 0,042 mmol) v CH₂C1₂ (0,8 ml) se přidá ftalanhydrid (6,44 mg, 0,042 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 2 hodin. Poté se přidá karbonyldiimidazol (CDI) (1 mg, 0,006 mmol) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 7 hodin. Poté se opět přidá karbonyldiimidazol (5,86 mg, 0,035 ml) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 17 hodin. Roztok se naředí CH₂C1₂ (15 ml) a promyje se HC1 (15 ml) o koncentraci 0,1 mmol/1 (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan: ethylacetát 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 27 (26,4 mg, 96 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,58 (ethylacetát).

-75CZ 304966 B6 'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,73 až 7,64 (m, 4H), 6,40 (s, IH), 6,12 až 6,01 (m, IH), 5,63 (s, IH) 5,58 (d, J = 1,5 Hz, IH), 5,37 (dd, J, = 1,8 Hz, J₂ = 17,4 Hz, IH), 5,23 (dd, J, = 1,8 Hz, J₂ = 10,5 Hz, IH), 5,12 (d, J= 1,5 Hz, IH), 4,22 až 4,15 (m, 3H), 4,08 (d, J= 1,8 Hz, IH), 3,68 (s, 3H), 3,59 až 3,55 (m, 2H), 3,35 (d, J = 8,1 Hz, IH), 3,27 až 3,16 (m, 2H), 3,05 (dd, J, = 8,1 Hz, J₂ = 18,3 Hz, IH), 2,64 (d, J = 18,0 Hz, IH), 2,30 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 1,80 (dd, J, = 11,4 Hz, J₂ = 15Hz, IH).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 167,7, 148,9, 146,4, 144,2, 142,6, 139,5, 134,0, 133,5, 132,0, 131,0, 128,3, 123,0, 121,3, 120,9, 118,1, 117,5, 116,8, 113,6, 112,4, 100,8, 74,5,60,6, 60,5,57,7, 56,6, 55,6, 55,5, 42,3, 41,7, 26,6, 25,5, 15,9, 9,46.

ESI-MS m/z: vypočítaná C^H^N^: 648,79, naměřená (M+H)⁺: 649,3.

Příklad 23

K roztoku sloučeniny 27 (26 mg, 0,041 mmol) v CH₂C1₂ (11 ml) se při teplotě 23 °C přidá kyselina octová (11 ml), (PPh₃)₂PdCl₂ (2,36 mg) a Bu₃SnH (28 ml, 0,10 mmol). Směs se při této teplotě míchá po dobu 2 hodin a poté se prolije kolonou na sloupcovou chromatografii (SiO₂, s gradientem hexan až hexan:ethylacetát 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 28 (24,7 mg, 99 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,33 (hexan:ethylacetát 2:1).

'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,75 až 7,70 (m, 2H), 7,69 až 7,65 (m, 2H), 6,39 (s, IH), 5,82 (bs, IH) 5,50 (d, J = 1,5 Hz, IH), 5,0 (d, J = 1,5 Hz, IH), 4,45 (bs, IH), 4,23 až 4,19 (m, 2H), 4,10 až 4,09 (m, IH), 3,73 (s, 3H), 3,60 až 3,48 (m, 2H), 3,36 až 3,33 (m, IH), 3,26 až 3,20 (m, IH), 3,14 až 3,08 (m, IH), 3,98 (d, J = 14,4 Hz, IH), 2,61 (d, J = 18,3 Hz, IH), 2,30 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 1,85 (dd, Ji = 12 Hz, J₂ = 15,3 Hz, IH).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 167,8, 146,4, 145,1, 143,9, 142,7, 137,1, 133,5, 131,9, 130,8, 128,4, 122,9, 120,8, 118,0, 116,8, 114,0, 113,4, 106,4, 100,4, 60,6, 60,5, 57,8, 56,6, 55,5, 55,2, 42,6,41,5,25,6, 25,5, 15,8, 8,9.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₄H₃₂N₄O₇: 608,6, naměřená (M+H)⁺: 609,2.

-76CZ 304966 B6

Příklad 24

AcCl, py, CHgClg 1 h, 0 °C

K roztoku sloučeniny 28 (357 mg, 0,058 mmol) v CH2CI2 (3 ml) se při teplotě 0 °C přidá acetylchlorid (41,58 ml, 0,58 mmol) a pyridin (47,3 ml, 0,58 ml). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (15 ml) a promyje se HCI (15 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (RP-18,

CH₃CN:H₂O 60:40), což vede ke vzniku fthalascidinu (354 mg, 94 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,37 (CH₃CN:H₂O 7:3, RP-18).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,72 až 7,68 (m, 2H), 7,67 až 7,63 (m, 2H), 6,38 (s, IH), 5,69 (d, 15 J = 1,2 Hz, IH), 5,64 (d, J = 1,2 Hz, IH), 5,30 (bs, IH), 4,25 až 4,21 (m, 2H), 4,02 (d, J = 2,1 Hz,

IH), 3,64 až 3,62 (m, 5H), 3,33 (d, J = 8,4 Hz, IH), 3,21 až 3,16 (m, IH), 3,02 (dd, J, = 8,1 Hz, J₂ = 18 Hz, IH), 2,76 (dd, J, = 1,8 Hz, J₂ = 15,6 Hz, IH), 2,63 (d, J = 17,7 Hz, IH), 2,29 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,0 (s, 3H), 1,73 (dd, J, = 12,0 Hz, J₂ = 15,3 Hz, IH).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 168,5, 167,6, 146,2, 144,2, 142,5, 141,0, 140,5, 133,4, 131,8,

130,7, 128,2, 120,9, 120,8, 117,9, 116,4, 113,6, 101,1, 60,4, 60,0, 57,0, 56,3, 55,6, 55,4, 41,6,

41,5,26,5,25,2, 20,2, 15,7, 9,4.

ESI-MS m/z: vypočítaná C36H34N4O8: 650, naměřená (M+H)⁺: 651,2. 25

Příklad 25

-77CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 17 (300 mg, 0,432 mmol) v CH₂C1₂ (2 ml) se při teplotě 0 °C přidá acetylchlorid (AcCl) (30,7 ml, 0,432 mmol) a pyridin (34,9 ml, 0,432 mmol). Reakční směs se při této teplotě míchá po dobu 2 hodin, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (15 ml) a promyje se HCl (15 ml) o koncentraci 0,1 mol/l (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku, což vede ke vzniku sloučeniny 42 (318 mg, 100 %) ve formě bílé pevné látky, která se bez dalšího čištění použije v následujících reakcích.

Rf: 0,5 (ethylacetát:methanol 5:1).

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,66 (s, IH), 5,93 (d, J = 1,2 Hz, IH), 5,83 (d, J= 1,2 Hz, IH), 5,42 (t, J = 6,6 Hz, IH), 5,07 (d, J = 5,7 Hz, IH), 4,98 (d, J = 5,7 Hz, IH), 4,16 (d, J = 1,8 Hz, IH), 4,11 (d, J = 2,7 Hz, IH), 3,98 (bs, IH), 3,73 až 3,61 (m, 2H), 3,64 (s, 3H), 3,52 až 3,48 (m, IH), 3,50 (s, 3H), 3,33 (d, J = 9,6 Hz, IH), 3,17 až 3,14 (m, IH), 2,97 až 2,87 (m, IH), 2,75 až 2,70 (d, J = 16,8 Hz, IH), 2,26 (s, 6H), 2,16 (s, 3H), 1,96 (s, 3H), 1,70 (dd, J, = 11,7 Hz, J₂ = 15,6 Hz, IH), 1,33 (s, 9H), 0,59 (d, J = 6,0 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 172,0, 168,3, 162,3, 148,2, 144,4, 140,4, 140,2, 130,9, 130,5,

125,3, 123,4, 120,8, 117,6, 112,7, 111,7, 101,4, 99,1, 79,2, 59,5, 58,8, 57,5, 57,4, 56,4, 55,5, 55,0, 41,3, 39,0, 28,2, 26,4, 24,6, 19,9, 18,4, 15,4, 9,1.

ESI-MS m/z: vypočítaná C38H49N5O10: 735,82, naměřená (M+H)⁺: 736,3.

Příklad 26

(42)

TFA, CH₂CI, -£—£—>

3,5 h, 23 °C

Me (43)

K roztoku sloučeniny 42 (318 mg, 0,432 mmol) v CH₂C1₂ (2,16 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (TFA) (1,33 ml, 17,30 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 3,5 hodiny. Reakční směs se rychle ochladí na teplotu 0 °C nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (60 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (2 x 70 ml). Organické vrstvy se vysuší síranem sodným a zakoncentrují se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, ethylacetát: methanol 20:1), což vede ke vzniku sloučeniny 43 (154 mg, 60 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,22 (ethylacetát:methanol 5:1).

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,47 (s, IH), 6,22 (bs, IH), 5,95 (d, J = 1,2 Hz, IH), 5,88 (d, J = 1,2 Hz, IH), 4,08 až 4,06 (m, 2H), 4,01 (bs, IH), 3,69 (s, 3H), 3,49 (d, J = 3,6 Hz, IH), 3,33 (d, J = 8,1 Hz, IH), 3,26 až 3,22 (m, IH), 2,95 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18 Hz, IH), 2,80 až 2,76 (m, 2H), 2,58 (d, J = 18 Hz, IH), 2,29 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,96 (s, 3H), 1,77 (dd, J, = 12,3 Hz, J₂ = 15,6 Hz, IH), 0,90 (d, J = 6,9 Hz, 3H).

- 78 CZ 304966 B6 ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 174,8, 169,0, 146,8, 144,4, 142,8, 140,5, 140,2, 131,1, 128,8,

120,8, 120,5, 117,1, 112,9, 111,6, 101,5, 60,3,59,0, 56,5, 56,3,55,6,55,1,50,2,41,6, 39,5,26,8, 26,3,24,9, 20,2, 15,4, 9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃iH₃₇N₅O7: 591,65, naměřená (M+H)⁺: 592,3.

Příklad 27

Me (43)

PhNCS, CH₂CI₂ 2 h, 23 °C

Me (44)

K roztoku sloučeniny 43 (154 mg, 0,26 mmol) v CH₂C1₂ (1,3 ml) se přidá fenylizothiokyanát (PhNCS) (186 ml, 1,56 mmol) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 2 hodin. Reakční směs se zakoncentruje ve vakuu a zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, s gradientem hexan až hexan:ethylacetát 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 44 (120 mg, 63 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,41 (ethylacetát:methanol 5:1).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 8,17 (s, 1H), 7,49 až 7,44 (m, 3H), 7,31 až 7,24 (m, 3H), 7,05 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,87 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,52 (bs, 1H), 4,54 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,15 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,03 (d, J = 2,7 Hz, 2H), 3,80 (bs, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,40 (bs, 1H), 3,32 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,16 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 2,82 až 2,61 (m, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,80 (dd, J, = 12,0 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H), 0,62 (d, J = 6,0 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 178,5, 171,9, 168,7, 146,7, 144,5, 142,6, 140,6, 140,3, 136,3, 131,0, 129,9, 128,9, 126,7, 124,4, 120,9, 120,6, 117,7, 116,6, 112,7, 111,9, 101,4, 60,4, 58,7,

57,5, 56,1, 55,7, 55,1, 53,3, 41,4, 38,8, 26,3, 24,4, 20,2, 18,1, 15,3, 9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₈H₄₂N₆O7S: 726,3, naměřená (M+H)⁺: 727,3.

(45)

-79CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 44 (120 mg, 0,165 mmol) v dioxanu (0,9 ml) se přidá směs HCl/dioxan (1,8 ml) o koncentraci HCI 5,3 mol/1 (5,3 N) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 2,5 hodiny. Ke směsi se poté přidá CH2CI2 (10 ml) a H₂O (5 ml) a organická vrstva se oddělí dekantaci. Vodná fáze se při teplotě 0 °C zalkalizuje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (20 ml) (pH = 8) a poté se extrahuje CH₂C1₂ (2x15 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným a zakoncentrují se ve vakuu, což vede ke vzniku sloučeniny 45 (75 mg, 87 %) ve formě bílé pevné látky, která se bez dalšího čištění použije v následujících reakcích.

Rf: 0,23 (ethylacetát:methanol 5:1).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,43 (s, 1H), 5,94 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,87 (d, J= 1,2 Hz, 1H), 4,10 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 3,98 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,91 (bs, 1H), 3,69 (s, 3H), 3,34 až 3,25 (m, 2H), 3,05 (dd, J, = 1,8 Hz, J₂ = 8,1 Hz, 1H), 2,80 až 2,73 (m, 3H), 2,46 (d, J = 18 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 1,79 (dd, J, = 12,6 Hz, J₂ = 16,2 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 168,7, 146,7, 144,4, 142,9, 140,4, 130,4, 128,9, 121,1, 120,8,

117,8, 116,8, 113,6, 111,5, 101,4, 67,6, 60,5, 59,8, 58,4, 56,6, 55,8, 55,3, 43,6, 41,8, 31,3, 25,6,

20,2, 15,6, 9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₂8H₃₂N₄O₆: 520,58, naměřená (M+H)⁺: 521,3.

Příklad 29

K roztoku sloučeniny 45 (10 mg, 0,02 mmol) v CH₂C1₂ (0,4 ml) se přidá ftalanhydrid (2,84 mg, 0,02 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 2 hodin. Poté se přidá karbonyldiimidazol (0,5 mg, 0,003 mmol) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 7 hodin. Poté se opět přidá karbonyldiimidazol (2,61 mg, 0,016 mmol) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu dalších 17 hodin. Roztok se naředí CH2CI2 (10 ml) a promyje se HCI (5 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (RP-18, CH₃CN:H₂O 60:40), což vede ke vzniku fthalascidinu (11,7 mg, 93 %) jako bílé pevné látky.

Rf: 0,37 (CH₃CN:H₂O 7:3, RP-18).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,72 až 7,68 (m, 2H), 7,67 až 7,63 (m, 2H), 6,38 (s, 1H), 5,69 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,64 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,30 (bs, 1H), 4,25 až 4,21 (m, 2H), 4,02 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 3,64 až 3,62 (m, 5H), 3,33 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 3,21 až 3,16 (m, 1H), 3,02 (dd, Jj = 8,1 Hz, J₂ = 18 Hz, 1H), 2,76 (dd, J_t = 1,8 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 2,63 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,0 (s, 3H), 1,73 (dd, Ji = 12,0 Hz, J₂ = 15,3 Hz, 1H).

-80CZ 304966 B6 ¹³ NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 168,5, 167,6, 146,2, 144,2, 142,5, 141,0, 140,5, 133,4, 131,8, 130,7,

128,2, 120,9, 120,8, 117,9, 116,4, 113,6, 101,1, 60,4, 60,0, 57,0, 56,3, 55,6, 55,4, 41,6, 41,5,

26,5, 25,2, 20,2, 15,7, 9,4.

ESI-MS m/z: vypočítaná C^H^N^g: 650, naměřená (M+H)⁺: 651,2.

TBDPS, irod, DMAP DMF, 6 h, 23 °C

K roztoku sloučeniny 25 (18 mg, 0,032 mmol) v DMF (0,05 ml) se při teplotě 0 °C přidá katalyzátor DMAP (0,5 mg, 0,004 mmol), imidazol (Imd) (5 mg, 0,08 mmol) a terc.butyldifenylsilylchlorid (12,5 ml, 0,048 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 6 hodin. Ke směsi se při teplotě 0 °C přidá voda (10 ml) a vodná fáze se extrahuje směsí hexan:ethylacetát 1:10 (2 x 10 ml). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:ethylacetát 3:1), což vede ke vzniku sloučeniny 26 (27 mg, 88 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,29 (hexan:ethylacetát3:l).

'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,61 až 7,58 (m, 2H), 7,42 až 7,28 (m, 8H), 6,71 (s, 1H), 6,19 až 6,02 (m, 1H), 5,78 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,64 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,40 (dd, Ji = 1,2 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,27 (dd, Ji = 1,2 Hz, J₂ = 10,2 Hz, 1H), 5,13 (s, 2H), 4,45 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,24 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,17 až 4,06 (m, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,64 (dd, Ji = 2,4 Hz, J₂ = 9,9 Hz, 1H), 3,59 (s, 3H), 3,42 až 3,21 (m, 4H), 3,10 (dd, J, = 8,1 Hz, J₂ = 17,7 Hz, 1H), 2,70 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 2,33 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,08 až 1,89 (m, 1H), 0,87 (s, 9H).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 148,5, 148,3, 148,1, 144,0, 139,0, 135,6, 135,4, 133,8, 133,1,

132,6, 130,5, 130,3, 129,6, 129,4, 127,5, 127,4, 125,1, 124,3, 121,6, 118,5, 117,5, 112,9, 111,7,

100,8, 99,2, 74,0, 67,7, 61,5, 59,6, 59,0, 57,7, 57,1, 55,4, 41,6, 29,6, 26,6, 25,5, 18,8, 15,8, 9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C^HssN^Si: 801,3, naměřená (M+H)⁺: 802,3.

Příklad 31

-81 CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 26 (7 mg, 0,0087 mmol) v CH₂C1₂ (0,15 ml) se při teplotě 23 °C přidá kyselina octová (2,5 ml, 0,044 mmol), (PPh₃)₂PdCl2 (0,5 mg, 6,96 x 10^ mmol) a Bu3SnH (3,5 ml, 0,013 mmol). Reakční směs se při této teplotě míchá po dobu 1 hodiny. Roztok se naředí směsí hexan:ethylacetát 5:1 (0,5 ml) a prolije se kolonou na rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:ethylacetát s gradientem 5:1 až 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny ET-11 (5 mg, 75 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,36 (hexan:ethylacetát 5:1, oxid křemičitý).

*H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,56 (m, 2H), 7,41 až 7,25 (m, 8H), 6,67 (s, 1H), 5,72 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 5,58 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 5,51 (s, 1H), 5,38 (d, J = 5,75 Hz, 1H), 5,16 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,57 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 4,21 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 3,68 (dd, Ji = 2,1 Hz, J₂ = 10,4 Hz, 1H), 3,38 až 3,26 (m, 3H), 3,11 (dd, Ji = 2,5 Hz, J₂ = 15,7 Hz, 1H), 3,01 (dd, J, = 8,9 Hz, J₂ = 17,9 Hz, 1H), 2,70 (d, J = 17,9 Hz, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 1,89 (dd, Ji = 12,1 Hz, J₂ = 15,7 Hz, 1H), 0,9 (s, 9H).

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 149,0, 147,4, 145,3, 144,3, 136,3, 135,7, 135,4, 133,2, 130,9,

130,5, 129,6, 129,5, 127,5, 125,0, 118,6, 112,5, 112,1, 105,7, 100,5, 99,8, 68,5, 61,5, 59,7, 58,8, 57,7, 56,9, 56,5, 55,4, 41,7, 26,6, 26,2, 25,5, 18,9, 15,8, 14,2, 8,7.

ESI-MS m/z: vypočítaná C44H51N3O7SÍ: 761, naměřená (M+H)⁺: 762.

Příklad 32

PhNCS, CH₂CI₂ 1,3 h, 23 °C

PbHNSCHN

Roztok sloučeniny 2 (3,0 g, 5,46 mmol) a fenylisothiokyanátu (3,92 ml, 32,76 mmol) v CH₂C1₂ (27 ml) se při teplotě 23 °C míchá po dobu 1,5 hodiny. Reakční směs se rozdělí mezi CH₂C1₂ (10 ml) a H₂O (5 ml). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a zakoncentruje se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, s gradientem hexan až hexan:ethylacetát 2:3), což vede ke vzniku sloučeniny 3 (3,29 g, 88 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,27 (ACN:H₂O 3:2, RP-C18).

'HNMR (300 MHz, CDCI3): δ 7,77 (bs, 1H), 7,42 až 7,11 (m, 5H), 6,65 (d, 1H), 6,29 (s, 1H), 5,6 až 5,5 (m, 1H), 4,19 až 4,14 (m, 2H), 4,08 (d, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,87 až 3,65 (m, 6H), 3,77 (s, 3H), 3,37 až 2,98 (m, 8H), 2,50 (d, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 1,96 (d, 1H), 1,87 (s, 3H), 1,81 až 1,75 (m, 1H), 0,96 (d, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 185,7, 180,9, 178,9, 172,0, 155,7, 147,1, 143,2, 142,4, 136,0, 135,1, 130,5, 129,9, 129,3, 128,5, 126,9, 124,4, 120,2, 117,4, 116,3, 77,1, 60,9, 58,6, 56,2, 55,8, 55,0, 54,6, 53,5, 41,7, 40,3, 25,1, 24,5, 18,4, 15,8, 8,7.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₆H4₀N₆O₆S: 684,8, naměřená (M+H)⁺: 685,2.

- 82 CZ 304966 B6

Příklad 33

1) HCI v dioxanu

2) NaHCO₃

PhHNSCHN

h₂n (4)

Roztok sloučeniny 3 (0,143 g, 0,208 mmol) ve směsi HCl/dioxan (150 ml) o koncentraci HCI 6,5 mmol/1 (6,5 M) se při teplotě 23 °C míchá po dobu 6 hodin. K reakční směsi se poté přidá toluen (3 ml) a organická vrstva se oddělí dekantaci. Zbytek se rozdělí mezi nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (3 ml) a CHCI3 (3x3 ml). Organické vrstvy se vysuší a zakoncentrují se, což vede ke vzniku směsi sloučeniny 4 a 6 (4:6 90:10), která při stání pomalu cyklizuje na sloučeninu 6.

Rf: 0,4 (ethylacetát:methanol 5:1, oxid křemičitý).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,45 (s, 1H), 4,16 (m, 1H), 4,02 (d, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,79 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,35 (m, 1H), 3,20 až 3,00 (m, 3H), 2,87 (d, 1H), 2,75 (d, 1H), 2,43 (d, 1H), 2,34 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 1,93 (s, 3H), 1,72 až 1,5 (m, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C26H30N4O5: 478,5, naměřená (M+H)⁺: 479,2.

Příklad 34

PhHNSCHN

HCI v dioxanu -->

minut, 23 °C

Roztok sloučeniny 3 (0,143 g, 0,208 mmol) ve směsi HCl/dioxan (150 ml) o koncentraci HCI 6,5 mmol/1 (6,5 M) se při teplotě 23 °C míchá po dobu 1 hodiny. Rozpouštědlo se odpaří a zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, ethylacetát:methanol:triethylamin 100:25:0,1), což vede ke vzniku směsi sloučeniny 6 (83 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,26 (ACN:H₂O 3:2, RP-C18).

’H NMR (500 MHz, CDC1₃): δ 6,46 (s, 1H), 5,9 (bs, 1H), 4,67 (dd, J = 18,3 Hz, J = 7,8 Hz, 1H), 4,24 (d, 1H), 4,16 (s, 3H), 3,93 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 3,8 (m, 2H), 3,77 (s, 3H), 3,45 (m, 2H), 3,08 (dd, J = 17,9 Hz, J = 3,6 Hz, 1H), 2,78 (m, 1H), 2,55 (d, 1H), 2,3 (m, 1H), 2,3 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 1,90 (s, 3H).

-83 CZ 304966 B6

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 186,2, 162,1, 154,9, 146,9, 145,3, 143,0, 130,1, 129,4, 128,1, 125,0, 121,4, 116,4, 116,2, 66,6, 60,7, 60,7, 60,1, 59,6, 58,8, 55,6, 54,9, 41,9, 25,3, 24,7, 15,7,

8,9.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₂6H₂₈N₄O₄: 460,5, naměřená (M+H)⁺: 461,1.

Příklad 35

HCI v dioxanu Ac₂O, 4 h, 23 °C

ίο K roztoku sloučeniny 3 (2,38 g, 3,47 mmol) v dioxanu (5 ml) se přidá HCI o koncentraci 5,3 mol/l (5,3 M) v dioxanu (34 ml) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 45 minut. Poté se ke směsi přidá Ac₂O (51 ml, 539,5 mmol) a míchá se po dobu 4 hodin. Reakční směs se ochladí na teplotu 0 °C a při této teplotě se rozdělí mezi nasycený vodný roztok Na₂CO₃ (300 ml) a ethylacetát (300 ml). Organická fáze se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a zakoncentruje se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, s gradientem CH₂C1₂ až CH₂C1₂:ethylacetát 1:2), což vede ke vzniku sloučeniny 5 (1,75 g, 97 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,53 (ACN:H₂O 3:2, RP-C18).

'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,51 (s, 1H), 5,98 (bs, 1H), 4,84 (dd, 1H), 4,17 (d, 1H), 4,00 (d, 1H), 3,99 (s, 3H), 3,85 (bs, 1H), 3,81 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 3,70 (d, 1H), 3,23 (m, 1H), 3,11 (dd, 1H), 3,09 (m, 1H), 2,93 (m, 2H), 2,44 (d, 1H), 3,67 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,70 (s, 3H), 1,60 až 1,50 (m, 2H), 1,29 (s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 185,9, 180,8, 169,9, 160,2, 156,2, 147,0, 143,1, 140,4, 136,1,

130,6, 129,6, 127,9, 120,4, 117,2, 61,0, 60,7, 58,6, 56,1, 55,7, 55,1, 54,3, 41,8, 41,1, 25,7, 23,9,

22,2, 15,7, 8,7.

ESI—MS m/z: vypočítaná C28H₃₂N₄O₆: 520,6, naměřená (M+H)⁺: 521,1. 30

Příklad 36

- 84CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 5 (1,75 g, 3,36 mmol) v CH₂C1₂ (17 ml) se při teplotě 0 °C přidá diisopropylethylamin (11,71 ml, 67,23 mmol), DMAP (20 mg, 0,17 mmol) a brommethylmethylether (4,11 ml, 50,42 mmol). Po uplynutí 6 hodin se při teplotě 23 °C reakční směs rozdělí mezi CH₂C1₂ (50 ml) a nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (25 ml). Organická vrstva se vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (RP-18, CH₃CN:H₂O 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 7 (1,32 g, 70 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,34 (ACN:H₂O 3:2, RP-C18).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,74 (s, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,82 (m, 1H), 4,22 (d, 1H), 4,00 (s,

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 185,9, 180,7, 169,6, 156,2, 148,9, 148,5, 140,3, 136,2, 131,3,

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₀H₃₆N4O₇: 564,6, naměřená (M+H)⁺: 565,3.

Příklad 37

OMe

Me

NH '0

MeOH, NaOH minut, 0 °C »

OMe

Me

HO

Me (7)

NH

K roztoku sloučeniny 7 (0,37 g, 0,65 mmol) v methanolu (74 ml) se při teplotě 0 °C přidá hydroxid sodný (130 ml) o koncentraci 1 mol/l (1 M). Reakční směs se míchá po dobu 15 minut a poté se rychle ochladí na teplotu 0 °C HC1 o koncentraci 6 mol/l (6 M) na pH = 5. Reakční směs se extrahuje ethylacetátem (3 x 50 ml), organické vrstvy se vysuší síranem sodným a zakoncentrují se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (RP-18, CH₃CN:H₂O 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 8 (232 mg, 65 %) ve formě žlutého oleje.

Rf: 0,5 (ACN:H₂O 3:2, RP-C18).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,75 (s, 1H), 5,15 (s, 2H), 4,86 (m, 1H), 4,26 (d, 1H), 4,01 (d, 1H), 3,88 až 3,81 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 3,39 (m, 1H), 3,27 až 3,21 (m, 1H), 3,18 až 3,08 (m, 2H), 3,03 až 2,97 (m, 1H), 2,47 (d, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 1,90 (s, 3H), 1,57 až 1,46 (m, 2H), 1,33 (s, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C₂9H₃₄N₄O₇: 550,6, naměřená (M+H)⁺: 551,2.

-85CZ 304966 B6

Příklad 38

CICH₂Br, Cs₂CO₃ DMF, 90 °C

A

A <«) (9)

K odplyněnému roztoku sloučeniny 8 (240 mg, 0,435 mmol) v DMF (30 ml) se přidá 10% Pd/C (48 mg) a reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny ve vodíkové atmosféře (atmosférický tlak). Reakční směs se přefiltruje, jako bezbarvý roztok, v argonové atmosféře přes podložku z celitu do baňky obsahující bezvodý Cs₂CO₃ (240 mg, 0,739 mmol). Poté se ke směsi přidá bromchlormethan (0,566 ml, 8,71 mmol). Baňka se uzavře a směs se při teplotě 90 °C míchá po dobu 3 hodin. Reakční směs se ochladí, přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se CH₂C1₂. Organická vrstva se zakoncentruje a vysuší síranem sodným, což vede ke vzniku sloučeniny 9 ve formě hnědého oleje, který se bez dalšího čištění použije v následujícím kroku.

Rf: 0,36 (SiO₂, hexamethylacetát 1:5).

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,71 (s, IH), 5,89 (d, IH), 5,81 (d, IH), 5,63 (bs, IH), 5,33 (d, IH), 5,17 (d, IH), 4,97 (m, IH), 4,20 (d, IH), 4,09 (m, IH), 3,99 (m, IH), 3,68 (m, IH), 3,65 (s, 6H), 3,59 až 3,47 (m, 4H), 3,37 až 3,27 (m, 2H), 3,14 až 2,97 (m, 2H), 2,62 (d, IH), 2,32 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 1,72 (m, IH), 1,36 (s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 169,8, 149,1, 147,4, 145,5, 136,2, 130,9, 130,8, 125,0, 122,9,

117,7, 112,6, 111,8, 106,4, 100,8, 99,8, 59,8, 58,9, 57,7, 56,6, 56,4, 55,5, 55,2, 41,6, 40,1, 29,6,

25,9, 25,0, 22,6, 15,6, 8,8.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃oH₃₆SiN₄07: 564,6, naměřená (M+H)⁺: 565,3.

Příklad 39

(⁹) 00)

Do baňky obsahující sloučeninu 9 (245 mg, 0,435 mmol) v DMF (4 ml) se při teplotě 0 °C přidá uhličitan česný (425 mg, 1,30 mmol) a allybromid (376 ml, 4,35 mmol) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 1 hodiny. Reakční směs se přefiltruje přes podložku z celitu a rozdělí se mezi CH₂C1₂ (25 ml) a H₂O (10 ml). Organická fáze se vysuší síranem sodným, zakoncentruje se

-86CZ 304966 B6 destilací za sníženého tlaku a zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, CHCf :ethylacetát 1:2), což vede ke vzniku sloučeniny 10 (113 mg, 43 %) ve formě žlutého oleje.

Rf: 0,36 (hexamethylacetát 1:5).

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,74 (s, 1H), 6,3 až 6,0 (m, 1H), 5,94 (d, 1H), 5,87 (d, 1H), 5,43 až 5,36 (m, 2H), 5,22 (s, 2H), 5,00 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 4,17 až 4,01 (m, 1H), 3,98 (m, 2H), 3,71 až 3,67 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 3,62 až 3,51 (m, 3H), 3,58 (s, 3H), 3,39 až 3,37 (m, 1H), 3,31 až 3,26 (m, 3H), 3,09 (dd, 1H), 2,56 (d, 1H), 2,36 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,24 až 2,10 (m, 1H), 1,82 až 1,73 (m, 1H), 1,24 (bs, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 169,4, 148,8, 148,3, 139,1, 133,7, 130,9, 130,3, 125,2, 120,2,

117.7, 113,1, 112,6, 101,3, 99,3, 74,1, 59,7, 59,3, 57,8, 57,0, 56,1, 56,1, 55,2, 41,6, 41,0, 40,9,

29.7, 26,3,22,5, 15,6, 9,3.

ESI-MS m/z: vypočítaná C33H40N4O7: 604,7, naměřená (M+H)⁺: 605,3.

Příklad 40

K roztoku sloučeniny 9 (22 mg, 0,039 mmol) v CH₂C1₂ (0,2 ml) se při teplotě 0 °C přidá acetylchlorid (2,79 ml, 0,039 mmol) a pyridin (3,2 ml, 0,039 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (10 ml) a promyje HC1 (5 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N).Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku, což vede ke vzniku sloučeniny 46 (22 mg, 93 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,4 (hexamethylacetát 1:5).

*H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,74 (s, 1H), 5,97 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 5,91 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 5,7 Hz, 2H), 5,04 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,90 (t, J = 6 Hz, 1H), 4,17 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,05 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,01 (bs, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 3,50 až 3,44 (m, 2H), 3,38 až 3,36 (m, 1H), 3,30 až 3,26 (m, 1H), 3,00 (dd, J, = 7,8 Hz, J₂ = 18,0 Hz, 1H), 2,79 (d, J = 12,9 Hz, 1H), 2,60 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 2,35 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,68 (dd, J₃ = 11,7 Hz, J₂= 15,6 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₂H_3Í!N4O₈: 606,67, naměřená (M+H)⁺: 607,3.

-87CZ 304966 B6

Příklad 41

oA

HCI v dioxanu -_> h, 23 °C

(46) £7)

K roztoku sloučeniny 46 (8 mg, 0,013 mmol) v dioxanu (0,1 ml) se při směs HCl/dioxan (0,5 ml) o koncentraci HCI 5,3 mol/1 (5,3 N) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 1 hodiny. Poté se roztok naředí CH₂C1₂ (5 ml) a promyje se HCI (3 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N).Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku, což vede ke vzniku sloučeniny 47 (5 mg, 70 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,4 (hexamethylacetát 1:5).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,51 (s, 1H), 5,97 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,91 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 4,97 (bs, 1H), 4,11 (bs, 1H), 4,04 až 4,02 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,65 (d, J = 2,1 Hz, 2H), 3,56 až 3,30 (m, 2H), 3,04 (dd, Ji = 7,5 Hz, J₂ = 18 Hz, 1H), 2,80 (d, J= 14,4 Hz, 1H), 2,59 (d, J =

18,3 Hz, 1H), 2,33 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,76 (dd, Jj = 12,0 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H), 1,33 (s, 3H), 1,25 (s, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C30H34N4O7: 562,61, naměřená (M+H)⁺: 563,3.

K roztoku sloučeniny 45 (10 mg, 0,0192 mmol) v CH₂C1₂ (0,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá isovalerylchlorid (2,34 ml, 0,0192 mmol) a pyridin (1,55 ml, 0,0192 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (5 ml) a promyje HCI (3 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N).Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexamethylacetát 1:2), což vede ke vzniku sloučeniny 48 (11 mg, 95 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,12 (hexan:ethylacetát 1:2).

-88CZ 304966 B6 ’Η NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,50 (s, IH), 5,98 (d, J = 1,5 Hz, IH), 5,91 (d, J = 1,5 Hz, IH), 5m75 (s, IH), 5,02 (t, J = 5,4 Hz, IH), 4,10 (d, J = 1,5 Hz, IH), 4,06 (d, J = 2,7 Hz, IH), 4,02 (d, J = 2,7 Hz, IH), 3,77 (s, 3H), 3,76 až 3,71 (m, IH), 3,86 až 3,28 (m, 3H), 3,04 (dd, J, = 8,1 Hz, J₂ = 18,3 Hz, IH), 2,78 (d, J = 15,9 Hz, IH), 2,55 (d, J = 18 Hz, IH), 2,32 (s, 6H), 2,26 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 1,84 až 1,68 (m, 2H), 1,36 (d, J = 7,2 Hz, IH), 2,32 (s, 6H), 2,26 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 1,84 až 1,68 (m, 2H), 1,36 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 0,69 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,62 (d, J = 6,6 Hz, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₃HtoN407: 604,69, naměřená (M+H) : 605,3.

Příklad 43

(45) dekanoylchlorid, py >

CH₂CI₂,1 h, 0 °C

Λ

O^(CH₂)₈

I

Ř9)

K roztoku sloučeniny 45 (10 mg, 0,0192 mmol) v CH₂C1₂ (0,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá isovalerylchlorid (3,98 ml, 0,0192 mmol) a pyridin (1,55 ml, 0,0192 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (5 ml) a promyje HCl (3 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N).Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:ethylacetát 1:2), což vede ke vzniku sloučeniny 49 (12,4 mg, 96 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,7 (ethylacetát:methanol 10:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,50 (s, IH), 5,98 (d, J = 1,5 Hz, IH), 5,91 (d, J = 1,5 Hz, IH), 5,73 (s, IH), 5,08 (t, J = 5,4 Hz, IH), 4,10 (d, J = 1,5 Hz, IH), 4,05 (m, IH), 4,01 (m, IH), 3,76 (s, 3H), 3,65 až 3,61 (m, IH), 3,40 až 3,27 (m, 3H), 3,03 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18,6 Hz, IH), 2,78 (d, J = 13,2 Hz, IH), 2,57 (d, J = 18,3 Hz, IH), 2,32 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,79 (dd, Jj = 12,0 Hz, J₂ = 16,5 Hz, IH), 1,73 až 1,42 (m, 4H), 1,33 až 1,18 (m, 10H), 1,03 (m, 2H), 0,87 (t, J = 6,6 Hz, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná Q8H50N4O7: 674,83, naměřená (M+H)⁺: 675,5.

Příklad 44

-89CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 45 (14,5 mg, 0,0278 mmol) v CH₂C1₂ (0,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá Zra«s-3-trifluormethylcinnamoylchlorid (4,76 ml, 0,0278 mmol) a pyridin (2,55 ml, 0,0278 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (5 ml) a promyje HCl (3 ml) o koncentraci 0,1 mol/l (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexamethylacetát 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 50 (18,7 mg, 94 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,64 (ethylacetát:methanol 5:1).

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,74 až 7,55 (m, 4H), 7,23 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 6,34 (s, 1H), 6,12 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 6,07 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 5,96 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,07 až 4,05 (m, 1H), 3,81 (bs, 1H), 3,46 až 3,51 (m, 3H), 3,42 (s, 3H), 3,09 (brd, J = 12,0 Hz, 1H), 2,94 až 2,85 (m, 2H), 2,74 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,80 (s,3H), 1,84 až 1,75 (m, 1H).

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 168,7, 165,3, 146,5, 144,7, 142,6, 140,6, 138,0, 135,9, 131,0,

130,9, 129,1, 128,6, 125,8, 125,7, 124,5, 124,4, 122,7, 121,2, 117,8, 116,5, 113,0, 112,0, 101,7,

60,4, 59,1, 56,5, 56,4, 55,6, 55,3, 41,8, 40,3, 26,6, 25,1, 20,3, 15,4, 9,3.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃8H₃₇F₃N₄O₇: 718,72, naměřená (M+H)⁺: 719,3.

Příklad 45

K roztoku sloučeniny 43 (33 mg, 0,0557 mmol) v CH₂C1₂ (0,4 ml) se pri teplotě 0 °C přidá isovaletylchlorid (6,79 ml, 0,0557 mmol) a pyridin (4,5 ml, 0,0557 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (5 ml) a promyje se HCl (3 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan .-ethylacetát 1:2), což vede ke vzniku sloučeniny 51 (34 mg, 91 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,09 (hexamethylacetát 1:2).

*H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,46 (s, 1H), 6,10 (bs, 1H), 5,99 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 5,30 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,10 až 4,05 (m, 3H), 3,81 (bs, 1H), 3,74 (s, 3H), 3,54 (bs, 1H), 3,38 až 3,36 (m, 1H), 3,29 až 3,21 (m, 1H), 3,00 (dd, Jj = 8,0 Hz, J₂ = 18,0 Hz, 1H), 2,25 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,95 až 1,90 (m, 3H), 0,87 (d, J = 6,6 Hz, 6H), 0,76 (d, J = 6,0 Hz, 3H).

-90CZ 304966 B6

ESI-MS m/z: vypočítaná C36H45N5O8: 675,77, naměřená (M+H)⁺: 676,3.

Příklad 46

NH₂ (43)

NH

O

CF₃

K roztoku sloučeniny 43 (33 mg, 0,0557 mmol) v CH₂C1₂ (0,4 ml) se při teplotě 0 °C přidá trans5 3-trifluormethylcinnamoylchlorid (9,52 ml, 0,0557 mmol) a pyridin (4,5 ml, 0,0557 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (5 ml) a promyje se HCl (3 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexamethylacetát 1:2), což vede ke vzniku sloučeniny 52 (40 mg, 92 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,21 (hexan:ethylacetát 1:2).

'H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 7,74 až 7,47 (m, 4H), 6,49 (s, 1H), 6,40 (d, J= 15,6 Hz, 1H), 15 6,00 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,47 (t, J = 6 Hz, 1H), 4,12 až 4,09 (m, 3H),

3,93 (bs, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,59 až 3,58 (m, 1H), 3,38 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,29 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 3,00 (dd, Jj = 8,1 Hz, J₂ = 18,3 Hz, 1H), 2,79 až 2,78 (m, 1H), 2,65 (d, J= 18,3 Hz, 1H), 2,29 (s, 6H), 2,28 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 1,84 až 1,80 (m, 1H), 0,85 až 0,84 (m, 3H).

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 171,9, 168,8, 164,4, 146,9, 144,6, 143,0, 140,5, 140,5, 139,3,

135.7, 131,1, 131,0, 129,4, 129,1, 126,0, 124,1, 124,0, 122,4, 121,1, 120,7, 120,6, 117,7, 116,9,

112.8, 112,0, 101,6, 60,6, 59,3, 57,1, 56,3, 55,9, 55,2, 49,0, 41,7, 49,9, 26,5, 25,1, 20,2, 18,4, 15,7, 9,3.

ESI-MS m/z: vypočítaná C41EI42F3N5O8: 789,8, naměřená (M+H)⁺: 790,3.

Me O (⁴³) (53)

-91 CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 43 (10 mg, 0,0169 mmol) v CH₂C1₂ (0,2 ml) se při teplotě 23 °C přidá anhydrid kyseliny trifluoroctové (2,38 μΐ, 0,0169 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 5 hodin, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (5 ml) a promyje se HCl (3 ml) o koncentraci 0,1 mol/l (0,1 N).Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:ethylacetát 3:2), což vede ke vzniku sloučeniny 53 (10,7 mg, 93 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,57 (ethylacetát:methanol 5:1).

*H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 6,45 (s, IH), 6,00 (d, J = 1,2 Hz, IH), 5,90 (d, J = 1,2 Hz, IH). 5,87 (bs, IH), 5,32 (bs, IH), 4,12 (d, J = 2,1 Hz, IH), 4,08 (d, J = 1,8 Hz, IH), 3,78 až 3,56 (m. 3H), 3,72 (s, 3H), 3,40 (d, J = 8,1 Hz, IH), 3,25 (d, J = 9,3 Hz, IH), 3,00 (dd, J, = 8,4 Hz, J₂ 18,0 Hz, IH), 2,77 (dd, J, = 2,1 Hz, J₂ = 15,9 Hz, IH), 2,68 (d, J = 18,6 Hz, IH), 2,30 (s, 3H). 2,28 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,75 (dd, J, = 11,4 Hz, J₂ = 15,9 Hz, IH), 0,69 (d, J

6,3 Hz, 3H)

13.

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,1, 168,6, 147,0, 144,6, 143,0, 140,6, 140,4, 131,0, 129,4,

120,9, 120,7, 117,6, 116,8, 112,4, 112,1, 101,6, 60,5, 59,0, 57,1, 56,3, 55,6, 55,2, 48,7, 41,6,

39,4, 26,5, 24,9, 20,2, 17,8, 15,4, 9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₃H₃₆F₃N₅O₈: 687,63, naměřená (M+H)⁺: 688,66.

Příklad 48

Me Me O (19) (54)

K roztoku sloučeniny 19 (11 mg, 0,0169 mmol) v CH₂C1₂ (0,2 ml) se při teplotě 23 °C přidá anhydrid kyseliny trifluoroctové (2,38 ml, 0,0169 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 5 hodin, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (5 ml) a promyje se HCl (3 ml) o koncentraci 0,1 mol/l (0,1 N).Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:ethylacetát 3:2), což vede ke vzniku sloučeniny 54 (10,7 mg, 93 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,6 (ethylacetát:methanol 5:1).

*HNMR (300 MHz, CD₃OD): δ 7,33 (d, J = 6,3 Hz, IH), 6,45 (s, IH), 6,04 (m, IH), 5,95 (d, J = 1,5 Hz, IH), 5,84 (d, J= 1,5 Hz, IH), 5,32 (m, 2H), 5,21 (m, IH), 4,11 (m, 4H), 3,73 (s, 3H), 3,64 (m, 2H), 3,51 (m, IH), 3,37 (d, J = 7,8 Hz, IH), 3,22 (m, 2H), 3,03 (dd, IH, fr = 8,1 Hz, J₂ =

18,3 Hz, IH), 2,60 (d, J = 18,3 Hz, IH), 2,29 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 1,86 (dd, J, = 12 Hz, J₂ = 16,2 Hz, IH), 0,82 (d, J = 7,2 Hz, 3H).

-92CZ 304966 B6 ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,0, 156,0, 148,4, 147,1, 144,3, 143,0, 138,7, 133,8, 130,5,

129,4, 120,6, 120,4, 117,6, 117,5, 117,0, 113,5, 112,5, 112,4, 101,1, 74,1, 66,8, 60,4, 59,3, 56,9,

56,6, 56,3, 55,4, 48,7, 41,6, 40,1, 26,2, 25,0, 17,6, 15,4, 9,1.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃5H3₉F₃N₅O7: 685,69, naměřená (M+H) : 686,3.

(54)

Me o (PPh₃)₂PdCI₂,Bu₃SnH

AcOH, CH₂CI₂,2h

Me O (55)

K roztoku sloučeniny 54 (100 mg, 0,415 mmol) v CH₂C1₂ (4 ml) se při teplotě 23 °C přidá kyselina octová (40 ml), (PPh₃)₂PdCl₂ (8,4 mg, 0,012 mmol) a B^SnH (157 ml, 0,56 mmol). Reakční ío směs se při dané teplotě míchá po dobu 2 hodin a poté se prolije kolonou na rychlou sloupcovou chromatografu (SiO₂, s gradientem hexan až hexan:ethylacetát 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 55 (90 mg, 96 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,6 (hexan:ethylacetát 1:2).

*H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 7,55 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,45 (s, 1H), 5,90 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,82 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,37 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,15 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,04 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,66 až 3,53 (m, 2H), 3,37 až 3,31 (m, 2H), 3,19 až 3,15 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 3,08 až 3,00 (m, 2H), 2,56 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 1,91 (dd,

Ji = 12,0 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 0,84 (d, J = 6,9 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,1, 156,3, 147,3, 144,9, 144,4, 143,3, 136,7, 130,7, 129,3,

120.6, 117,6, 117,4, 114,4, 112,1, 107,7, 101,0, 85,8, 60,5, 59,3, 56,5, 56,4, 56,2, 55,2, 48,9,

41.6, 40,9, 25,7, 25,3, 18,0, 15,6, 8,7.

ESI-MS m/z: vypočítaná C^H^F^O?: 645,63, naměřená (M+H)⁺: 646,2.

Příklad 50

(17)

TFA, CH₂CI₂ h, 23 °C

Me (56)

-93CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 17 (200 mg, 0,288 mmol) v CH2CI2 (1,44 ml) se přidá kyselina trifluoroctová (888 ml, 11,53 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 4 hodin. Reakční směs se rychle ochladí na teplotu 0 °C nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (60 ml) a extrahuje se ethylacetátem (2 x 70 ml). Organické vrstvy se vysuší síranem sodným a zakoncentrují se ve vakuu, což vede ke vzniku sloučeniny 56 (147 mg, 93 %) ve formě bílé pevné látky, která se bez dalšího čištění použije v následujících reakcích.

Rf: 0,6 (ethylacetát:methanol 5:1).

’H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 6,48 (s, 1H), 5,88 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 5,81 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 4,35 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,15 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 3,99 až 3,98 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,52 až 2,96 (m, 7H), 2,68 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,24 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 1,85 (dd, J, = 11,7 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 0,91 (d, J = 6,6 Hz, 3H).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 173,2, 149,1, 145,6, 144,9, 138,0, 132,2, 130,6, 121,4, 119,6,

117,4, 114,3, 109,2, 102,5, 82,3, 60,4, 58,4, 58,3, 57,8, 56,6, 50,1, 42,3, 41,6, 27,8, 26,2, 19,5, 15,5,9,8.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₂9H₃5N₅O₆: 549,62, naměřená (M+H)⁺: 550,3.

Me (56)

PhNCS, CH₂CI₂

1,5 h, 23 °C

Me (57)

K roztoku sloučeniny 56 (10 mg, 0,018 mmol) vCH₂C1₂ (0,4 ml) se přidá fenylisothiokyanát (13 ml, 0,109 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 1,5 hodiny. Směs se zakoncentruje ve vakuu a zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, s gradientem hexan až hexan:ethylacetát 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 57 (8 mg, 65 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,57 (ethylacetát:methanol 10:1).

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,88 (bs, 1H), 7,41 až 7,36 (m, 2H), 7,27 až 7,22 (m, 1H), 7,02 až 7,00 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 6,71 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 6,17 (bs, 1H), 5,93 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,83 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,55 (bs, 1H), 5,20 až 5,17 (m, 1H), 4,16 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 4,05 (bs, 1H), 4,02 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,79 (s, 3H), 3,75 až 3,71 (m, 1H), 3,35 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 3,28 až 3,19 (m, 2H), 3,12 až 2,97 (m, 2H), 2,50 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,32 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,15 až 2,09 (dd, Ji = 11,4 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H), 1,95 (s, 3H), 0,88 (d, J = 6,9 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 178,5, 171,7, 147,2, 145,0, 144,3, 143,3, 137,0, 135,7, 130,6,

130,4, 129,6, 127,5, 124,3, 120,6, 117,7, 117,2, 115,3, 112,1, 108,3, 100,9, 60,9, 59,5, 56,7, 56,5, 56,2, 55,2, 54,1, 41,7, 41,1, 26,3, 25,4, 18,5, 15,8, 9,0.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₆H4oN₆0₆S: 684,81, naměřená (M+H)⁺: 685,3.

- Q4 CZ 304966 B6

Příklad 52

K roztoku sloučeniny 57 (45 mg, 0,065 mmol) v CH2CI2 (0,5 ml) se při teplotě 0 °C přidá acetylchlorid (4,67 ml, 0,065 mmol) a pyridin (5,3 ml, 0,065 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 3 hodin, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (10 ml) a promyje HCI (5 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (RP-18, CH₃CN:H₂O

40:60), což vede ke vzniku sloučeniny 58 (14 mg, 28 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,34 (CH₃CN:H₂O 7:15).

'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 11,90 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 7,45 až 7,40 (m, 3H), 7,18 až 7,15 (m, 2H), 6,58 (s, 1H), 6,00 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,89 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,70 (s, 1H), 5,37 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,48 (m, 1H), 4,23 (bs, 1H), 4,07 (bs, 2H), 3,85 až 3,75 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,46 až 3,41 (m, 2H), 3,24 až 3,20 (m, 1H), 3,00 až 2,95 (m, 1H), 2,87 až 2,75 (m, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,85 (dd, Ji = 11,4 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 1,66 (s, 3H), 0,82 (d, J = 6,0 Hz, 3H).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 182,6, 174,3, 171,0, 146,6, 144,6, 142,7, 142,3, 140,7, 140,2, 131,3, 129,8, 129,3, 128,9, 128,8, 121,5, 120,4, 117,3, 116,6, 112,8, 112,0, 111,3, 101,5, 60,5, 59,0, 57,6, 56,2, 55,9, 55,3, 55,1, 41,6, 39,4, 27,8, 26,5, 24,8, 20,2, 17,1, 15,5, 9,3.

ESI-MS m/z: vypočítaná C^HwNéOgS: 768,88, naměřená (M+H)⁺: 769,2.

Příklad 53

Me (57)

HCI v dioxanu

->

h, 23 °C

(59)

-95CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 57 (130 mg, 0,189 mmol) v dioxanu (1 ml) se přidá směs HCl/dioxan (1,87 ml) o koncentraci HCI 5,3 mol/l (5,3 N) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 4 hodin. Poté se k této reakční směsi přidá CH₂C1₂ (15 ml) a H₂O (10 ml) a organická vrstva se oddělí dekantací. Vodná fáze se při teplotě 0 °C zalkalizuje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (60 ml) (pH = 8) a poté se extrahuje ethylacetátem (2 x 50 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným a zakoncentrují se ve vakuu, což vede ke vzniku sloučeniny 59 (63 mg, 70 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,15 (ethylacetát:methanol 5:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,67 (s, 1H), 5,99 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 5,91 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,10 (bs, 1H), 4,32 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,25 (dd, J, = 3,6 Hz, J₂ = 9,3 Hz, 1H), 3,7 (s, 3H), 3,71 až 3,64 (m, 2H), 3,50 (dd, Ji = 2,4 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H), 3,42 až 3,37 (m, 2H), 3,16 (dd, Jj = 3,6 Hz, J₂ = 12,9 Hz, 1H), 2,57 (dd, J, = 9,3 Hz, J₂ = 12,9 Hz, 1H), 2,27 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,91 (dd, Jj = 12,0 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C₂₆H₃₀N4O₅: 478,5, naměřená (M+H)⁺: 479,3.

Příklad 54

Me (43) trans-C₉H₆CIO, py >

CH₂CI₂,1 h, 0 °C

K roztoku sloučeniny 43 (20 mg, 0,0338 mmol) v CH₂C1₂ (0,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá cinnamoylchlorid (5,63 mg, 0,0338 mmol) a pyridin (2,73 ml, 0,0338 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (10 ml) a promyje se HCI (5 ml) o koncentraci 0,1 mol/l (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 20:1), což vede ke vzniku sloučeniny 60 (22 mg, 90 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,56 (EtOAc:MeOH 5:1).

*H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,51 (s, 1H), 7,50 až 7,47 (m, 2H), 7,36 až 7,35 (m, 2H), 6,43 (s, 1H), 6,36 (brd, J = 15,9 Hz, 2H), 6,01 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,90 (brd, J = 1,5 Hz, 2H), 5,42 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,12 až 4,07 (m, 3H), 3,96 až 3,95 (m, 1H), 3,73 (bs, 3H), 3,58 (bs, 2H), 3,39 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,25 (d, J = 11,7 Hz, 1H), 3,0 (dd, Ji = 7,5 Hz, J₂ = 17,7 Hz, 1H), 2,78 (d, J = 15,9 Hz, 1H), 2,67 (d, J = 16,5 Hz, 1H), 2,29 (s, 6H), 2,23 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,82 (dd, J, = 11,4 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 0,83 (d, J = 6,0 Hz, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 172,0, 165,0, 146,9, 144,6, 143,1, 141,0, 140,5, 134,8, 131,0, 129,7, 129,1, 128,8, 127,8, 125,5, 123,8, 123,0, 121,1, 120,5, 117,7, 116,9, 112,8, 112,0, 101,9,

60,6, 59,2, 57,1, 56,4, 55,9, 55,3, 48,8, 41,7, 40,0, 26,5, 25,1, 20,3, 18,5, 15,7, 9,3.

-96CZ 304966 B6

ESI-MS m/z: vypočítává C^HoNsO»: 721,8, naměřená (M+H)⁺: 722,3.

Příklad 55

(45) (61)

K roztoku sloučeniny 45 (19 mg, 0,0364 mmol) v CH₂C1₂ (0,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá heptafluorbutyrylchlorid (5,44 mg, 0,0364 mmol) a pyridin (2,95 ml, 0,0364 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (10 ml) a promyje se HC1 (5 ml) o koncentraci 0,1 mol/l (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 20:1), což vede ke vzniku sloučeniny 61 (11,7 mg, 45 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,76 (EtOAc:MeOH 5:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,46 (s, 1H), 6,12 (s, 1H), 5,98 (d, J= 1,2 Hz, 1H), 5,93 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,72 (bs, 1H), 4,13 až 4,11 (m, 2H), 4,0 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,98 až 3,96 (m, 1H), 3,73 (s, 3H), 3,39 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 3,39 až 3,28 (m, 2H), 3,09 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18,0 Hz, 1H), 2,80 (d, J = 16,2 Hz, 1H), 2,46 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,32 (s, 6H), 2,21 (s, 3H), 1,99 (s,

3H), 1,80 (dd, Ji = 12,0 Hz, J₂ = 16,2 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C3₂H₃iF₇N₄O₇: 716,6, vypočítaná (M+H)⁺: 717,2.

Příklad 56

Me (43)

C₄F₇OC( py _}

CH₂CI₂,1 h, 0 °C

K roztoku sloučeniny 43 (24 mg, 0,004 mmol) v CH₂C1₂ (0,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá butyrylchlorid (4,15 ml, 0,04 mmol) a pyridin (3,28 ml, 0,04 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (10 ml) a promyje se HC1 (5 ml) o koncentraci 0,1 mol/l (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 20:1), což vede ke vzniku sloučeniny 62 (24 mg, 90 %) ve formě bílé pevné látky.

-97CZ 304966 B6

Rf: 0,35 (EtOAc:MeOH 5:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,47 (s, 1H), 6,10 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 6,0 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,91 (d, J= 1,5 Hz, 1H), 5,86 (bs, 1H), 5,31 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 4,11 až 4,06 (m, 3H), 3,85 až

3,81 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,59 až 3,53 (m, 2H), 3,38 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 3,27 až 3,22 (m, 1H),

3,0 (dd, Ji = 7,8 Hz, J₂ = 17,4 Hz, 1H), 2,79 (d, J = 15,3 Hz, 1H), 2,63 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,0 (s, 3H), 1,80 (dd, J, = 12,0 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H), 1,58 (q, J = 7,2 Hz, 2H), 0,89 (t, J = 7,2 Hz, 3H), 0,76 (d, J = 6,6 Hz, 3H).

ío ESI-MS m/z: vypočítaná C₃5H₄₃N₅O₈: 661,64, naměřená (M+H)⁺: 662,30.

Příklad 57

(45)

C9H7CIO, py *

CH₂CI₂,1 h, 0 °C

K roztoku sloučeniny 45 (19 mg, 0,0364 mmol) v CH₂C1₂ (0,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá cinnamoylchlorid (6,06 mg, 0,0364 mmol) a pyridin (2,95 ml, 0,0364 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (10 ml) a promyje se HCI (5 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 20:1), což vede ke vzniku sloučeniny 63 (20,1 mg, 85 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,65 (EtOAc:MeOH 5:1).

'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,39 až 7,29 (s, 5H), 6,42 (s, 1H), 6,01 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,92 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,73 (bs, 1H), 5,24 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 4,12 až 4,08 (m, 3H), 3,66 až 3,64 (m, 2H), 3,58 (bs, 3H), 3,36 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,29 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 2,98 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18 Hz, 1H), 2,33 (s, 6H), 2,29 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 1,84 (dd, J_t = 12,0 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₇H₃₈N₄O₇: 650,72, naměřená (M+H)⁺: 651,2.

Me (43)

3-chlorpropionylchlorid py, CH₂CI₂,1 h, 0 °C

(64)

-98CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 43 (20 mg, 0,0338 mmol) v CH2CI2 (0,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá 3chlorpropionylchlorid (3,22 ml, 0,0338 mmol) a pyridin (2,73 ml, 0,0338 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH2CI2 (10 ml) a promyje HCI (5 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 20:1), což vede ke vzniku sloučeniny 64 (20,5 mg, 89 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,32 (EtOAc:hexan 5:1).

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,48 (s, 3H), 6,28 (m, IH), 5,99 (d, J = 1,2 Hz, IH), 5,91 (d, J = 1,2 Hz, IH), 5,86 (bs, IH), 5,31 (m, IH), 4,08 až 4,07 (m, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,72 až 3,53 (m, 5H), 3,39 (d, J = 8,1 Ηζ,ΙΗ), 3,24 (d, J = 12,0 Hz, IH), 3,00 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18,0 Hz, IH), 2,79 (d, J = 13,5 Hz, IH), 2,50 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,32 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 2,0 (s, 3H), 1,79 (dd, J, = 12,3 Hz, J₂ = 14,8 Hz, IH), 0,81 (d, J = 6,3 Hz, 3H).

Příklad 59

(45) (65)

K roztoku sloučeniny 45 (19 mg, 0,0364 mmol) v CH₂C1₂ (0,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá butyrylchlorid (3,78 mg, 0,0364 mmol) a pyridin (2,95 ml, 0,0364 mmol). Reakční směs se míchá po dobu 1 hodiny, poté se roztok naředí CH₂C1₂ (10 ml) a promyje HCI (5 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Organická vrstva se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 20:1), což vede ke vzniku sloučeniny 65 (19 mg, 87 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,60 (EtOAc:MeOH 5:1).

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,50 (s, IH), 5,98 (d, J = 1,5 Hz, IH), 5,91 (d, J = 1,5 Hz, IH), 5,75 (s, IH), 5,01 (t, J = 6,4 Hz, IH), 4,10 až 4,09 (m, IH), 4,06 (d, J = 2,1 Hz, IH), 4,03 až 4,02 (m, IH), 3,76 (s, 3H), 3,67 až 3,60 (m, IH), 3,42 až 3,35 (m, 2H), 3,29 (d, J = 12,0 Hz, IH), 3,02 (dd, Ji = 7,8 Hz, J₂ = 17,7 Hz, IH), 2,79 (d, J = 14,1 Hz, IH), 2,56 (d, J = 18,3 Hz, IH), 2,32 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 1,78 (dd, J, = 12,0 Hz, J₂ = 15,9 Hz, IH), 1,63 (s, 3H), 1,53 až 1,46 (m, 2H), 1,28 až 1,16 (m, 2H), 0,68 (t, J = 7,2 Hz, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₂H₃₈N4O₇: 590,67, naměřená (M+H)⁺: 591,2.

-99CZ 304966 B6

Příklad 60

K roztoku sloučeniny 50 (31,7 mg, 0,044 mmol) ve směsi CH₂CN/H₂0 (1,5 ml/0,5 ml) se přidá AgNO₃ (225 mg, 1,32 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 17 hodin. Poté se ke směsi při teplotě 0 °C přidá roztok solanky (10 ml) a nasycený vodný roztok NaHCO₃ (10 ml) a směs se míchá po dobu 15 minut, poté se přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se CH₂C1₂ (20 ml). Roztok se dekantuje a organická vrstva se vysuší a zakoncentruje ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 66 (16 mg, 51 %) ve formě bílé pevné látky.

io

Rf: 0,26 (EtOAc:MeOH 5:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,66 až 7,42 (m, 4H), 7,20 (s, 1H), 6,44 (s, 1H), 5,97 (b, J = 1,2 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,76 (bs, 1H), 5,28 (bs, 1H), 4,54 (bs, 1H), 4,42 (bs, 1H), 4,00 (bs, 1H), 3,68 až 3,57 (m, 4H), 3,47 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 2,74 (d, J = 17,1 Hz, 1H), 2,48 (d, J =

18,6 Hz, 1H), 2,32 (s, 6H), 2,28 (s, 3H), 1,99 (s, 3H), 1,76 (dd, Jj = 12,0 Hz J₂ = 16,2 Hz, 1H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃7H₃8F₃N₃O_g: 709, naměřená (M -17): 692,3.

Me O (53)

AgNO₃,CH₃CN/H₂O 24 h, 23 °C

Me O (67)

K roztoku sloučeniny 53 (57 mg, 0,0828 mmol) ve směsi CH₂CN/H₂0 (1,5 ml/0,5 ml) se přidá AgNO₃ (650 mg, 3,81 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 24 hodin. Poté se ke směsi při teplotě 0 °C přidá roztok solanky (10 ml) a nasycený vodný roztok NaHCO₃ (10 ml) a směs se míchá po dobu 15 minut, poté se přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se CH₂C1₂ (20 ml). Roztok se dekantuje a organická vrstva se vysuší a zakoncentruje ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc.MeOH 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 67 (28 mg, 50 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,28 (EtOAc:MeOH 10:1).

.1(1(1.

’Η NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,47 (s, 1H), 5,97 (s, 1H), 5,88 (s, 1H), 5,35 (bs, 1H), 4,51 (bs, 1H), 4,41 (bs, 1H), 4,12 až 4,05 (m, 1H), 4,00 (d, J= 2,7 Hz, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,64 (bs, 1H), 3,46 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 3,34 (d, J = 11,4 Hz, 1H), 3,18 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 2,95 (dd, Ji = 8,4 Hz, J₂ = 18,3 Hz, 1H), 2,70 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 2,48 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 2,28 (s, 3H), 2,27 (s, 3H),

2,26 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 1,68 (dd, Ji = 12 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 0,86 (d, J = 6,3 Hz, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C^H^F^Og: 678,66, naměřená (M⁺-17): 661,2.

AgNO₃, CH₃CN/H₂O _v h, 23 °C

(88) (48) ίο K roztoku sloučeniny 48 (32 mg, 0,0529 mmol) ve směsi CH₃CN/H₂0 (1,5 ml/0,5 ml) se přidá AgNO₃ (270 mg, 1,58 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 24 hodin. Poté se ke směsi při teplotě 0 °C přidá roztok solanky (10 ml) a nasycený vodný roztok NaHCO₃ (10 ml) a směs se míchá po dobu 15 minut, poté se přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se CH₂C1₂ (20 ml). Roztok se dekantuje a organická vrstva se vysuší a zakoncentruje ve vakuu. Roz15 tok se dekantuje a organická vrstva se vysuší a zakoncentruje ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 68 (18 mg, 56 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,40 (EtOAc:MeOH 5:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,50 (s, 1H), 5,95 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,88 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 4,38 (s, 1H), 4,01 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,78 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,41 až 3,37 (m, 1H), 3,17 až 3,15 (m, 1H), 2,96 (dd, Ji = 7,8 Hz, J₂ = 18,0 Hz, 1H), 2,70 (d, J = 15,3 Hz, 1H), 2,40 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 2,30 (s, 6H), 2,27 (s, 3H), 1,76 až 1,65 (m, 1H), 1,35 až 1,25 (m, 2H), 0,89 až 0,82 (m, 1H), 0,69 (d, J = 6,6 Hz, 3H), 0,58 (d, J = 6,6 Hz,

3H).

Příklad 63

AgNO₃, CH₃CN/H₂O 24 h, 23 °C

-101 CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 51 (27 mg, 0,04 mmol) ve směsi CH₃CN/H₂0 (1,5 ml/0,5 ml) se přidá AgNO₃ (204 mg, 1,19 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 24 hodin. Poté se ke směsi při teplotě 0 °C přidá roztok solanky (10 ml) a nasycený vodný roztok NaHCO₃ (10 ml) a směs se míchá po dobu 15 minut, poté se přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se CH₂C1₂ (20 ml). Roztok se dekantuje a organická vrstva se vysuší a zakoncentruje ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 69 (10 mg, 38 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,38 (EtOAc:MeOH 5:1).

*H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,48 (s, 1H), 6,16 (bs, 1H), 5,98 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,89 (d, J =

1,5 Hz, 1H), 5,33 (t, J = 6,0 Hz, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,11 až 4,09 (m, 1H), 4,00 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 3,78 (s, 3H), 3,41 až 3,32 (m, 3H), 3,18 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 2,94 (dd, Ji = 8,4 Hz, J₂ = 18,3 Hz, 1H), 2,70 (d, J = 14,4 Hz, 1H), 4,45 (d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,00 až 1,85 (m, 3H), 1,73 (m, 1H), 0,87 (d, J = 6,3 Hz, 6H).

Příklad 64

K roztoku sloučeniny 63 (15 mg, 0,023 mmol) ve směsi CH₃CN/H₂0 (1,5 ml/0,5 ml) se přidá AgNO₃ (118 mg, 0,691 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 24 hodin. Poté se ke směsi při teplotě 0 °C přidá roztok solanky (10 ml) a nasycený vodný roztok NaHCO₃ (10 ml) a směs se míchá po dobu 15 minut, poté se přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se CH₂C1₂ (20 ml). Roztok se dekantuje a organická vrstva se vysuší a zakoncentruje ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 70 (20,1 mg, 85 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,43 (EtOAc:MeOH 5:1).

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,38 až 7,28 (m, 5H), 6,48 (s, 1H), 5,98 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,91 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,75 (bs, 1H), 5,38 (brd, 1H), 5,30 (bs, 1H), 4,53 (m, 1H), 4,42 (m, 1H), 4,02 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 3,78 až 3,65 (m, 5H), 3,46 až 3,40 (m, 2H), 3,17 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 2,94 (dd, Ji = 7,8 Hz, J₂ = 17,7 Hz, 1H), 2,73 (d, J = 16,8 Hz, 1H), 2,45 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 2,31 (s, 6H), 2,28 (s, 3H), 1,97 (s, 3H), 1,77 (dd, J, = 12,0 Hz, J₂ = 15,3 Hz, 1H).

- 102CZ 304966 B6

Příklad 65

OMe

Me

O

AgNO₃,CH₃CN/H₂O

NH

(65) h, 23 °C

OMe

NH

K roztoku sloučeniny 65 (25 mg, 0,042 mmol) ve směsi CH₃CN/H₂0 (1,5 ml/0,5 ml) se přidá AgNO₃ (215,56 mg, 1,269 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 24 hodin. Poté se ke směsi při teplotě 0 °C přidá roztok solanky (10 ml) a nasycený vodný roztok NaHCO₃ (10 ml) a směs se míchá po dobu 15 minut, poté se přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se CH₂C1₂ (20 ml). Roztok se dekantuje a organická vrstva se vysuší a zakoncentruje ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:MeOH 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 71 (16 mg, 65 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,05 (EtOAc:MeOH 5:2).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,50 (s, 1H), 5,95 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,78 (s, 1H), 5,19 (bs, 1H),

4,45 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 4,37 (bs, 1H), 4,11 (brd, J = 4,8 Hz, 1H), 4,01 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 3,76 (s, 1H), 3,71 až 3,69 (m, 1H), 3,49 až 3,35 (m, 1H), 3,24 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 3,15 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 2,95 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 17,7 Hz, 1H), 2,70 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 2,40 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 1,96 (s, 3H), 1,75 až 1,66 (m, 1H), 1,52 až 1,17 (m, 2H), 0,66 (t, J = 7,2 Hz, 3H).

Fermentační postupy

Příklad A

Inokulační médium YMP3 obsahující 1 % glukózu, 0,25 % hovězí extrakt, 0,5 % becto-pepton, 0,25 % NaCl, 0,8 % CaCO₃ se inokuluje 0,1% zmraženým vegetativním kmenem mikroorganismů, kmen A2-2 Pseudomonas fluorescens, a inkubuje se při teplotě 27 °C v rotační třepačce (250 otáček za minutu). Po uplynutí 30 hodin inkubace se inokulační kultura přidá do míchaného fermentoru s médiem obsahujícím 2% dextrózu, 4% mannitol, 2% vysušené pivovarské droždí (kvasinky) (Vitalevor® Biolux, Belgium), 1% (NH^SCU, 0,04% KH₂PO₄, 0,8% KC1, 0,001% FeCl₃, 0,1% L-Tyr (tyrozin), 0,8% CaCO₃, 0,05% PPG-2000, 0,2% silikon proti pěnění (ASSAF-100, RHODIA UK). Sterilizace se provádí při teplotě 122 °C po dobu 30 minut. Objemový poměr mezi inokulem a médiem je 2 % objemová. Od 0 hodiny do 16 hodiny se udržuje teplota 27 °C a od 16 hodiny do konce přípravy (41 hodin) se udržuje teplota 24 °C. Tlak rozpuštěného kyslíku se udržuje maximálně na hodnotě 25 %. Hodnota pH se udržuje na 6,0 pomocí zředěné kyseliny sírové od 28 hodiny až do konce přípravy. Přetlak se udržuje na hodnotě 50 kPa (0,5 bar). Od 16 hodiny do konce přípravy (běží po dobu 2 dní) se přidává 1% mannitol nebo sorbitol a 2% mannitol nebo sorbitol v případě, že fermentační příprava probíhá po dobu 3 dní.

Po uplynutí 41 hodin nebo 64 hodin se fermentační kultivační půda buď extrahuje, což vede k získání safracinu B nebo upraví KCN, což vede k získání kyanosafracinu B.

- 103 CZ 304966 B6

Příklad B

Získání kyanosafracinu B ze surového extraktu.

Čištěním nebo filtrací při pH 6 se z fermentační kultivační půdy odstraní pevné látky. Takto vyčištěná kultivační půda se upraví na pH 9,5 zředěným hydroxidem sodným a dvakrát se extrahuje ethylacetátem, methylenchloridem nebo butylacetátem v objemovém poměru 2:1. Extrakce se provádí v míchané nádobě po dobu 20 minut, teplota směsi se udržuje na 8 až 10 °C. Vzniklé fáze se oddělí na kapalina-kapalina odstředivce. Organická fáze se vysuší bezvodým nebo zmrazeným síranem sodným a poté se přefiltruje, aby se odstranil led. Tato organická fáze (ethylacetátová vrstva) se odpařuje dokud nevznikne olejovitý surový extrakt.

Příklad C

Získání kyanosafracinu B z vyčištěné kultivační půdy.

Čištěním nebo filtrací při pH 6 se z fermentační kultivační půdy odstraní pevné látky. Takto vyčištěná kultivační půda se upraví na pH 3,9 koncentrovanou kyselinou octovou. K vyčištěné kultivační půdě se přidá 0,5 gramu KCN v litru a za míchání se při teplotě 20 °C inkubuje po dobu 1 hodiny. Poté se teplota sníží na 15 °C a pH se upraví na 9,5 zředěným hydroxidem sodným a dvakrát se extrahuje ethylacetátem v objemovém poměru 2:1,5. Extrakce se provádí vmíchané nádobě po dobu 20 minut, teplota směsi se udržuje na 8 až 10 °C. Vzniklé fáze se oddělí na kapalina-kapalina odstředivce. Organická fáze se vysuší bezvodým nebo zmrazeným síranem sodným. Tato organická fáze (ethylacetátová vrstva) se odpařuje, dokud nevznikne olejovitý surový extrakt. Tento extrakt se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, ethylacetát:methanol s gradientem 20:1 až 10:1 až 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 2 ve formě světle žluté pevné látky.

Rf: 0,55 (ethylacetát:methanol 5:1), dále t_R = 19,9 MIN [HPLC, Delta Pack C4, 5 pm, 300 A, 150 x 3 mm, λ = 215 nm, průtok = 0,7 ml/min, teplota = 50 °C, s gradientem CH3CN: vodný NaOAc (10 mmol/1 (10 mM)) 85 až 70 % (20 minut)].

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,54 (dd, J, = 4,4 Hz, J₂ = 8,4 Hz, 1H), 6,44 (s, 1H), 4,12 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,04 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,00 (s, 3H), 3,87 (bs, 1H), 3,65 (ddd, Ji = 1,5 Hz, J₂ = 8,7 Hz, J₃ = 9,9 Hz, 1H), 3,35 (brd, J = 8,4 Hz, 1H), 3,15 až 2,96 (m, 4H), 2,92 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 2,47 (d, J= 18,3 Hz, 1H), 2,29 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 1,83 (s, 3H), 1,64 (ddd, Ji = 2,7 Hz, J₂ = 11,1 Hz, J₃ = 14,1 Hz, 1H), 0,79 (d, J = 7,2 Hz, 3H).

^,3C NMR (75 MHz, CDCI3): δ 186,0 (q), 175,9 (q), 156,2 (q), 146,8 (q), 142,8 (q), 140,7 (q),

136,6 (q), 130,5 (q), 128,8 (q), 127,0 (q), 120,5 (s), 117,4 (q), 116,5 (q), 60,8 (t), 60,4 (s), 58,7 (t), 56,2 (s), 55,7 (s), 54,8 (s), 54,8 (s), 54,4 (s), 50,0 (s), 41,6 (t), 39,8 (d), 25,2 (d), 24,4 (d), 21,2 (t), 15,5 (t), 8,4 (t).

ESI-MS m/z: vypočítaná C29H35N5O6: 549,6, naměřená (M+Na)⁺: 572,3.

Příklad D

Médium (50 1) obsahující dextrózu (2 %), mannitol (4 %), vysušené pivovarské droždí (kvasinky) (2 %), síran amonný (1 %), hydrogenfosforečnan draselný (0,04 %), chlorid draselný (0,8 %), hexahydrát chloridu železitého (0,001 %), L-tyrosin (0,1 %), uhličitan vápenatý (0,8 %), polypropylenglykol 2000 (0,05 %) a ASSAF 1000 (0,2 %) proti pěnění se nalije do sterilizovaného fermentoru s celkovou kapacitou 75 1, inokuluje se inokulační kulturou (2 %) kmenu A2—2 (FERM BP-14) a za stálého míchání se při teplotě 27 °C až 24 °C po dobu 64 hodin provádí

- 104CZ 304966 B6 provzdušňovaná kultivace (provzdušňování 75 1/min a míchání 350 otáček za minutu (350 rpm) až 500 otáček za minutu (500 rpm). Hodnota pH se udržuje automatickým dávkováním zředěné kyseliny sírové od 27 hodiny do konce přípravy. Od 16 hodiny do konce přípravy se přidává 2% mannitol. V kultivačním médiu (45 1), po odstranění buněk odstředěním, se pH upraví na hodnotu

9,5 zředěným hydroxidem sodným a médium se dvakrát extrahuje 25 litry ethylacetátu. Směs se při teplotě 8 °C míchá po dobu 20 minut. Vzniklé fáze se oddělí na kapalina-kapalina odstředivce. Organická fáze se zmrazí na teplotu -20 °C, přefiltrují se, aby se odstranil led, a odpařují se, dokud nevznikne 40 g tmavého olejovitého surového extraktu. Po vnesení kyano skupiny a vyčištění se získají 3 gramy kyanosafracinu B.

Příklad E

Médium (50 1) obsahující dextrózu (2 %), mannitol (4 %), vysušené pivovarské droždí (kvasinky) (2 %), síran amonný (1 %), hydrogenfosforečnan draselný (0,02 %), chlorid draselný (0,2 %), hexahydrát chloridu železitého (0,001 %), L-tyrosin (0,1 %), uhličitan vápenatý (0,8 %), polypropylenglykol 2000 (0,05 %) a ASSAF 1000 (0,2 %) proti pěnění se nalije do sterilizovaného fermentoru s celkovou kapacitou 75 1, inokuluje se inokulační kulturou (2 %) kmenu A2-2 (FERM BP-14) a za stálého míchání se při teplotě 27 °C až 24 °C po dobu 41 hodin provádí provzdušňovaná kultivace (provzdušňování 75 Emin a míchání 350 otáček za minutu (350 rpm) až 500 otáček za minutu (500 rpm). Hodnota pH se udržuje automatickým dávkováním zředěné kyseliny sírové od 28 hodiny do konce přípravy. Od 16 hodiny do konce přípravy se přidává 1% mannitol. V kultivačním médiu (45 1), po odstranění buněk odstředěním, se pH upraví na hodnotu 3,9 přídavkem 200 ml koncentrované kyseliny octové. Přidá se 25 gramů 97% kyanidu sodného a při teplotě 20 °C se míchá po dobu 1 hodiny a poté se pH upraví na 9,5 přídavkem 1500 ml 10% roztoku hydroxidu sodného. Poté se extrahuje 35 litry ethylacetátu. Směs se při teplotě 8 °C míchá po dobu 20 minut. Vzniklé fáze se oddělí na kapalina-kapalina odstředivce. Organická fáze se vysuší bezvodým síranem sodným a odpařuje se, dokud nevznikne 60 g tmavého olejovitého surového extraktu.

Chromatografií se získá 4,6 gramů kyanosafracinu B.

Příklad 66

K roztoku sloučeniny 25 (7,83 g, 0,0139 mmol) a komerčně dostupného Boc-Cys (Fm) derivátu (Bachem) (8,33 g, 35,04 mmol) v dichlormethanu (535 ml) se za stálého míchání v argonové atmosféře při teplotě 23 °C přidá dimethylaminopyridin (4,28 g, 35,04 mmol) a l-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylkarbodiimidhydrochlorid (6,66 g, 35,04 mmol). Směs se při teplotě 23 °C

- 105CZ 304966 B6 míchá po dobu 2,5 hodiny. Reakční směs se rychle ochladí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (500 ml), organická fáze se oddělí a vodná vrstva se zpětně extrahuje dichlormethanem (250 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují se a odpaří do sucha za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (eluent ethylacetát:hexan s gradientem 1:4 až 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 142 (12,21 g, 93 %) ve formě světle žluté pevné látky.

Rf: 0,35 (hexan:EtOAc 1:1).

’H NMR (300 MHz, CDCfi): δ 7,72 (d, J = 7,3, 2,7 Hz, 2H), 7,55 (dd, Jj = 14,6 Hz, J₂ = 7,6 Hz, 2H), 7,40 až 7,34 (m, 2H), 7,30 až 7,24 (m, 2H), 6,63 (s, IH), 6,08 až 5,99 (m, IH), 5,91 (d, J =

1.5 Hz, IH), 5,80 (d, J= 1,5 Hz, IH), 5,39 (dd, J, = 17,3 Hz, J₂ = 1,7 Hz, IH), 5,24 (dd, J, =

10.5 Hz, J₂ = 1,7 Hz, IH), 5,09 (AB, J = 4,48 Hz, 2H), 5,07 (t, J = 7,8 Hz, IH), 4,34 až 4,29 (m, 2H), 4,17 (d, J = 1,9 Hz, IH), 4,16 až 4,04 (m, 4H), 4,02 až 3,96 (m, 2H), 3,93 (t, J = 5,3 Ηζ,ΙΗ), 3,70 (s, 3H), 3,56 (s, 3H), 3,32 (d, J = 8,0 Hz, IH), 3,23 až 3,17 (m, 2H), 3,0 až 2,89 (m, 3H), 2,65 až 2,57 (m, 2H), 2,29 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,03 (s, 3H), 1,76 (dd, J, = 16,3 Hz, J₂ = 12,7 Hz, IH), 1,45, 1,44 (s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCfi): δ 170,9, 155,3, 148,9, 148,6, 146,1, 146,0, 144,7, 141,2, 141,1, 139,4, 134,0, 131,0, 130,1, 127,8, 127,2, 125,2, 125,0, 124,3, 121,3, 121,2, 120,1, 118,1, 117,6,

112,9, 101,4, 99,5, 80,3, 74,2, 65,6, 60,4, 60,1, 57,9, 57,4, 57,2, 57,1, 56,9, 55,6, 53,2, 47,0, 41,8,

41,7, 36,7, 35,3, 28,5, 26,6, 25,3, 15,9, 9,4.

ESI-MS m/z: vypočítaná C53H₆₀N₄OioS: 945,13, naměřená (M+l)⁺: 946,3.

Příklad 67

Bu₃SnH, AcOH —í-:->

(PPh₃)₂PdCI₂

K roztoku sloučeniny 142 (12,01 g, 0,0127 mmol) v dichlormethanu (318 ml) se za stálého míchání v argonové atmosféře při teplotě 23 °C přidá dichlorbis(trifenylfosfin) palladnatý (0,71 g, 1,015 mmol) a kyselina octová (3,6 ml 0,176 mol). Poté se ke směsi po kapkách přidá tributylstanniumhydrid (10,27 ml, 0,037 mol). Směs se míchá při teplotě 23 °C po dobu 10 minut. Reakční směs se přefiltruje přes sloupec silikagelu spojený hexanem. Zbytek se promyje směsí ethylacetátu a hexanu s gradientem 1:4, 1:1 až 7:3, což vede ke vzniku sloučeniny 143 (10,89 g, 95 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,25 (hexan:EtOAc 2:1).

-106CZ 304966 B6 ^]H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,72 (d, J = 7,6, 2H), 7,61 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 7,52 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,37 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 7,28 (m, 2H), 6,63 (s, 1H), 5,87 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,76 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,58 (bs, 1H), 5,31 (d, J= 5,8 Hz, 1H), 5,17 (d, J= 5,6 Hz, 1H), 4,91 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,17 až 4,06 (m, 4 až 6H), 3,85 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,68 (s, 3H), 3,34 (brd, J =

6,6 Hz, 1H), 3,23 (brd, J = 11,2 Hz, 1H), 3,06 (brd, J = 12,9 Hz, 1H), 3,04 až 2,86 (m, 3H), 2,65 až 2,54 (m, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,94 (s, 3H), 1,80 (dd, Jj = 11,5 Hz, J₂ = 15,8 Hz, 1H),

1,45 (s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 175,3, 170,5, 154,9, 149,1, 147,6, 145,9, 145,8, 145,7, 144,5,

140,9, 140,8, 136,1, 130,9, 127,4, 126,9, 124,3, 124,7, 122,9, 119,7, 117,6, 112,3, 111,4, 106,6,

100,7, 99,7, 80,0, 64,2, 60,3, 59,8, 57,6, 57,0, 56,5, 56,4, 55,2, 52,7, 46,7, 46,5, 41,4, 41,3, 36,9,

36,6, 34,9, 28,2, 26,0, 24,9, 20,9, 20,7,15,7, 14,1, 8,5.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₅oH5₆N40₁₀S: 905,5, naměřená (M+l)⁺: 906,3.

Příklad 68

K roztoku sloučeniny 143 (10 g, 0,011 mol) v bezvodém dichlormethanu (185 ml) se při teplotě -10 °C (teplota lázně -15 °C) přidá roztok anhydridu kyseliny benzenselenové (5,7 g, 0,011 mol) v bezvodém dichlormethanu (185 ml), což vede k úplnému rozpuštění bílých částeček přítomných v roztoku. Při této teplotě se reakční směs míchá po dobu 10 minut. Reakční směs se naředí dichlormethanem (200 ml) a při teplotě -10 °C se přidá nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (500 ml). Organická fáze se oddělí, vysuší síranem sodným, přefiltruje se a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (eluent ethylacetát:hexan s gradientem 1:1, 3:2, 7:3 až 4:1), což vede ke vzniku sloučeniny 144 (9,34 g, 92 %) ve formě žluté pevné látky. Chromatografícky vyčištěná pevná látka se rozpustí v dichlormethanu (250 ml), přidá se aktivní uhlí (3,3 g) a suspenze se míchá při teplotě 23 °C po dobu 1 hodiny. Směs se přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se dichlormethanem (80 ml). Rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku při teplotě 25 až 30 °C, což vede ke vzniku sloučeniny 144 (8,96 g, 88 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,30 a 0,25 (směs izomerů, hexan:EtOAc 1:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃) (směs izomerů): δ 7,73 až 7,61 (m, 4H), 7,37 až 7,30 (m, 4H), 6,62 (s, 1H), 6,59 (s, 1H), 6,53 (s, 1H), 5,72 (s, 1H), 5,70 (s, 1H), 5,61 (s, 1H), 5,55 (bs, 1H), 5,34 (m, 2H), 5,08 (AB sist., Jab = 6,7 Hz, 1H), 5,00 (AB sist., Jab = 5,9 Hz, 1H), 4,67 (m, 1H), 4,50 (m, 1H), 4,38 (dd, Ji = 4,9 Hz, J₂ = 12,9 Hz, 1H), 4,21 (dd, Ji = 6,3 Hz, J₂ = 12,9 Hz, 1H), 4,11 (t, J = 5,9 Hz, 1H), 4,02 (m, 3H), 3,87 (m, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,72 (m, 1H), 3,61 (s, 3H), 3,49 (s,

- 107CZ 304966 B6

3H), 3,27 (m, IH), 3,15 (dd, J, = 1,8 Hz, J₂ = 6,2 Hz, 2H), 3,07 (d, J = 6,3 Hz, IH), 2,94 (m, 4H), 2,86 (m, 2H), 2,42 (m, 2H), 2,25 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,08 (dd, Ji = 2,4 Hz, J₂ = 13,9 Hz, IH), 1,77 (s, 3H), 1,76 (s, 3H), 1,43 (s, 9H).

C NMR (75 MHz, CDC1₃) (směs izomerů): δ 200,6, 171,2, 160,4, 155,6, 148,9, 148,8, 148,3,

145,9, 145,8, 141,3, 141,2, 138,7, 130,9, 127,9, 127,4, 127,3, 127,3, 125,3, 125,1, 124,2, 120,1, 117,1, 111,9, 108,5, 105,0, 104,7, 101,7, 101,3, 99,5, 99,4, 80,5, 72,5, 70,8, 60,5, 60,1, 58,4, 58,0, 57,9, 56,9, 56,8, 56,3, 55,9, 55,5, 55,4, 53,8, 53,7, 47,1, 42,0, 41,8, 41,5, 37,4, 37,3, 35,6,

35,5, 28,5, 25,8, 25,7, 16,1, 16,0, 7,7, 7,3.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₅oH5₆N₄0]iS: 921,3, naměřená (M+l)⁺: 922,3.

Příklad 69

K roztoku sloučeniny DMSO (3,44 ml) v bezvodém dichlormethanu (396 ml) se v argonové atmosféře při teplotě -78 °C přidá anhydrid kyseliny trifluormethansulfonové (3,27 ml,

19,45 mmol) a směs se při této teplotě míchá po dobu 20 minut. Poté se ke směsi při teplotě -78 °C přidá roztok sloučeniny 144 (8,92 g, 9,6 mmol) v bezvodém dichlormethanu (124 ml) a reakční směs se v argonové atmosféře míchá při teplotě —40 °C po dobu 30 minut. Ke směsi se dále přidá diisopropylethylamin (13,5 ml, 73,43 mmol) a směs se v argonové atmosféře při teplotě 0 °C míchá po dobu 45 minut. Ke směsi se dále přidá terc.butanol (3,65 ml, 38,6 mmol) a terc.butyltetramethylguanidin (N₃Me₄terc.Bu) (11,6 ml, 67,46 mmol) a směs se v argonové atmosféře při teplotě 23 °C míchá po dobu 1 hodiny. Reakční směs se naředí dichlormethanem (250 ml) a přidá se nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (500 ml). Organická vrstva se oddělí a následně promyje nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (500 ml) a poté nasyceným vodným roztokem chloridu sodného (500 ml). Organická vrstva se oddělí, vysuší síranem sodným, přefdtruje se a odpaří se do sucha za sníženého tlaku při teplotě 25 až 30 °C. Zbytek ve formě pevné látky se čistí rychle sloupcovou chromatografií (eluent ethylacetát:hexan s gradientem 1:4 až 2:3), což vede ke vzniku sloučeniny 145 (4,99 g, 68 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,44 (hexan:EtOAc 3:2).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃) (směs izomerů): δ 6,79 (s, IH), 6,09 (s, IH), 6,00 (s, IH), 5,20 (d, J = 5,4 Hz, IH), 5,14 (d, J = 5,6 Hz, IH), 5,02 (d, J = 11,7 Hz, IH), 4,63 (d, J = 9,0 Hz, IH), 4,50 (m, IH), 4,33 (d, J = 5,4 Hz, IH), 4,30 (m, IH), 4,25 (bs, IH), 4,18 (d, J = 2,4 Hz, IH), 4,17 (dd, J₃ = 1,3 Hz, J₂ = 11,7 Hz, IH), 3,78 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 3,42 (m, 2H), 2,93 (m, 2H), 2,35 (m, IH), 2,31 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 2,09 (m, IH), 2,05 (s, 3H), 1,45 (s, 9H).

- 108 CZ 304966 B6 ¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 207,3, 170,9, 168,8, 149,8, 148,6, 146,0, 141,1, 140,7, 131,7,

130,6, 125,1, 120,6, 118,3, 113,7, 102,2, 99,4, 80,0, 61,6, 60,4, 59,8, 59,4, 59,2, 57,7, 55,0, 54,7, 54,0, 41,9, 41,6, 33,1, 31,8, 28,7, 23,9, 20,6, 16,1, 14,3, 9,8.

ESI-MS m/z: vypočítaná C38H46N4O11S: 766,86, naměřená (M+l)⁺: 767,3.

Příklad 70

Me

K roztoku sloučeniny 145 (1,0 g, 1,3 mmol) v acetonitrilu (50 ml) a dichlormethanu (25 ml) se při teplotě 23 °C přidá jodid sodný (1,52 g, 10,01 mmol). Směs se ochladí na teplotu 0 °C) a po částech za udržování teploty na 0 °C se přidá chlorid hlinitý (1,33 g, 10,01 mmol). Reakční směs se při teplotě 0 °C míchá po dobu 2,5 hodiny. Reakční směs se naředí dichlormethanem (25 ml) a přidá se nasycený vodný roztok vinanu draselného (100 ml). Vodná fáze se oddělí a extrahuje se dichlormethanem (2 x 75 ml). Nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (50 ml) se přidá k vodné fázi, která se dále extrahuje dichlormethanem (2 x 50 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují se a odpaří se do sucha za sníženého tlaku při teplotě nižší než 25 °C. Zbytek ve formě pevné látky se čistí sloupcovou chromatografií na amino-silikagelu (eluent ethylacetát:hexan), což vede ke vzniku sloučeniny 35 (487 mg, 60 %) ve formě žluté pevné látky. Experimentální data sloučeniny 35 byla již dříve popsána v PCT/GB00/01 852.

Sloučenina 36, ET-770 a ET-743 se připraví postupy, které jsou popsány v PCT/GB00/01 852.

Cesta 2

Příklad 71

(21) ⁽¹⁴⁶⁾

Roztok sloučeniny 21 (9,84 g, 18,97 mmol) v THF (569 ml) a H₂O (285 ml) se v ledové lázni ochladí na teplotu 0 °C. Poté se ke směsi při teplotě 0 °C přidá NaNO₂ (1,96 g, 28,45 mmol) a

- 109CZ 304966 B6

90% vodný roztok AcOH (18,97 ml, 0,33 mol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 18 hodin. Po ochlazení reakční směsi na teplotu 0 °C se přidá nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (300 ml, alkalické pH) a dichlormethan (500 ml). Po extrakci se vodná fáze dále extrahuje dichlormethanem (2 x 300 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbytek ve formě pevné látky se rozpustí v MeOH (379 ml) a při teplotě 0 °C se přidá NaOH (38 ml) o koncentraci 1 mol/1 (1 M). Směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 4 hodin. Po naředění EtOAc (600 ml) při teplotě 0 °C se organická vrstva promyje vodou (400 ml) a nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (100 ml, alkalické pH). Po extrakci se vodná fáze dále extrahuje EtOAc (3 x 300 ml). Organické extrakty se vysuší Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:EtOAc s gradientem 3:1 až 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 146 (4,55 g, 46 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,33 (hexan:EtOAc 1:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,48 (s, 1H), 6,15 až 6,02 (m, 1H), 5,92 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,86 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,77 (s, 1H), 5,39 (dd, J, = 1,5 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,26 (dd, J, = 1,5 Hz, J₂ = 10,5 Hz, 1H), 4,24 až 4,15 (m, 3H), 4,04 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,97 (t, J = 3,3 Hz, 1H), 3,74 (s, 3H), 3,64 (dt, J, = 3,3 Hz, J₂ = 11,1 Hz, 1H), 3,43 (dd, Ji = 3,3 Hz, J₂= 10,5 Hz, 1H), 3,38 až 3,34 (m, 2H), 3,31 (t, J = 2,7 Hz, 1H), 3,22 (dd, J, = 2,4 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 3,10 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18,3 Hz, 1H), 2,49(d, J = 18,3 Hz, 1H), 2,34 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,88 (dd, J, = 12 Hz, J₂= 15,9 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 148,6, 146,7, 144,4, 143,0, 138,9, 133,9, 130,2, 129,1, 121,1,

120,9, 117,7, 117,4, 116,8, 113,3, 112,3, 101,1, 74,3, 63,7, 60,6, 60,1, 58,1, 56,9, 56,7, 55,4,

41,7, 26,2, 25,7, 15,7, 9,3.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₂9H₃₃N₃O6: 519,59, naměřená (M+l)⁺: 520,5.

Příklad 72

K roztoku sloučeniny 146 (47,35 g, 0,091 mol) a komerčně dostupného Boc-Cys (Fm) derivátu (Bachem) (54,6 g, 0,137 mol) v dichlormethanu (2,8 1) se za stálého míchání v argonové atmosféře při teplotě 23 °C po kapkách po dobu 1,5 hodiny přidává dimethylaminopyridin (5,6 g, 0,046 mol) a l-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylkarbodiimidhydrochlorid (43,6 g, 0,227 mol). Směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu více než 1 hodiny. Reakce se iychle ochladí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (11) a organická fáze se oddělí. Vodná vrstva se zpětně extrahuje dichlormethanem (2 x 500 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (eluent

-110CZ 304966 B6 ethylacetát:hexan s gradientem 1:4 až 3:1), což vede ke vzniku sloučeniny 147 (74,3 g, 93 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,5 (hexan:EtOAc 1:1).

'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,73 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 7,63 až 7,55 (m, 2H), 7,39 až 7,35 (m, 2H), 7,29 až 7,25 (m, 2H), 6,41 (s, 1H), 6,07 až 5,97 (m, 1H), 5,92 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,80 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,67 (s, 1H), 5,34 (dd, J, = 1,8 Hz, J₂ = 17,4 Hz, 1H), 5,23 (dd, Jj = 1,8 Hz, J₂ = 10,5 Hz, 1H), 5,04 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,32 až 4,29 (m, 1H), 4,13 až 3,91 (m, 9H), 3,72 (s, 3H), 3,31 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 3,26 až 3,17 (m, 2H), 2,96 až 2,87 (m, 3H), 2,68 až 2,54 (m, 2H), 2,27 (s, 3H), 2,24 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 1,83 (dd, J, = 12,6 Hz, J₂ = 15,9 Hz, 1H), 1,45 (s, 9H).

^,3C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,9, 155,4, 149,0, 147,1, 146,2, 146,0, 144,7, 143,0, 141,1,

139.4, 134,1, 131,5, 129,1, 127,8, 127,2, 125,0, 121,3, 120,9, 120,1, 118,2, 117,6, 117,2, 112,9,

112.4, 101,4, 80,3, 76,6, 74,4, 65,3, 61,0, 60,4, 57,4, 56,9, 56,7, 55,6, 53,0, 46,9, 41,8, 36,7, 35,3,

31,8, 28,5, 26,6, 25,2, 22,9, 16,0, 9,5.

ESI-MS m/z: vypočítaná C_5IH5₆N₄O9S: 900,3, naměřená (M+l)⁺: 901,3.

Příklad 73

K roztoku sloučeniny 147 (0,562 g, 0,624 mol) vCH₃CN (3,12 ml) se při teplotě 0 °C přidá MEMCI (1,07 ml, 9,36 mmol), DIPEA (2,17 ml, 12,48 mmol) a DMPA (0,0076 g, 0,06 mmol). Reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 5,5 hodiny. Reakční směs se naředí CH₂C1₂ (50 ml) a extrahuje se HC1 (50 ml) o koncentraci 0,1 mol/l (0,1 N). Vodná fáze se znova extrahuje CH₂C1₂ (50 ml). Organické fáze se vysuší Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se ve vakuu a zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (CH₂Cl₂:EtOAc 10:1, 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 148 (539 mg, 87 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,50 (CH₂Cl₂:EtOAc 6:1).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,73 až 7,71 (m, 2H), 7,57 (dd, Ji = 7,2 Hz, J₂ = 15,3 Hz, 2H), 7,40 až 7,34 (m, 2H), 7,29 až 7,26 (m, 2H), 6,62 (s, 1H), 6,08 až 5,99 (m, 1H), 5,91 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,79 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,35 (dd, J, = 1,2 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 5,21 (bs, 1H), 5,13 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 5,04 (brd, J = 9 Hz, 1H), 4,33 až 4,29 (m, 2H), 4,16 až 3,90 (m, 8H), 3,85 až 3,78 (m, 1H), 3,69 (S, 3H), 3,60 až 3,55 (m, 2H), 3,38 (s, 3H), 3,31 (brd, J = 8,1 Hz, 1H), 3,21 až 3,17 (m, 2H), 2,98 až 2,88 (m, 3H), 2,64 až 2,56 (m, 2H), 2,29 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,75 (dd, Ji = 11,7 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 1,47 (s, 9H).

- 111 CZ 304966 B6

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,5, 155,0, 148,6, 148,5, 148,2, 145,77, 145,6, 144,4, 140,8,

140,7, 139,0, 133,6, 130,7, 130,5, 127,4, 126,9, 124,8, 124,6, 123,8, 120,8, 119,7, 117,8, 117,2,

122,5, 111,9, 101,0, 98,1, 80,0, 77,4, 77,0, 76,6, 73,8, 71,6, 69,2, 65,0, 60,2, 60,0, 59,8, 59,0,

56,8, 56,7, 56,6, 55,2, 52,7, 52,7, 46,6, 41,3, 36,2, 34,9, 29,6, 28,2, 26,3, 24,9, 15,6, 14,1, 9,0.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₅oH₆₄N₄OiiS: 988,4, naměřená (M+l)⁺: 989,3.

Příklad 74

K roztoku sloučeniny 148 (38,32 g, 0,039 mol) v dichlormethanu (1 1) se za stálého míchání v argonové atmosféře při teplotě 23 °C přidá dichlorbis(trifenylfosfin) palladnatý (2,17 g, 0,0031 mol) a kyselina octová (11,1 ml, 0,195 mol). Poté se ke směsi po kapkách přidá tributylstanniumhydrid (36,5 ml, 0,136 mol). Směs se ke směsi po kapkách přidá tributylstanniumhydrid (36,5 ml, 0,136 mol). Směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 15 minut. Reakční směs se přefiltruje přes sloupec silikagelu spojený hexanem. Zbytek se promyje směsí ethylacetátu a hexanu s gradientem 0:100, 1:4, 1:3, 2:5, 2:3, 1:1, 2:1, 3:1 až 100:0, což vede ke vzniku sloučeniny 149 (35,07 g, 95 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,25 (hexan:EtOAc 2:1).

‘H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,74 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,63 až 7,53 (m, 2H), 7,39 až 7,34 (m, 2H), 7,30 až 7,27 (m, 2H), 6,62 (s, 1H), 5,87 (m, 1H), 5,75 (s, 1H), 5,69 (bs, 1H), 5,37 (d, J = 6 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,96 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,44 (brd, J = 8,7 Hz, 1H), 4,18 až 3,70 (m, 11H), 3,69 (s, 3H), 3,38 (s, 3H), 3,34 až 3,18 (m, 3H), 2,99 až 2,88 (m, 3H), 2,63 až 2,58 (m, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 1,78 (dd, Ji = 12,9 Hz, J₂= 15,63 Hz, 1H), 1,41 (s, 9H).

^,3C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,8, 155,2, 149,0, 148,0, 146,2, 146,0, 144,8, 141,1, 136,4, 131,3, 131,2, 127,8, 127,2, 125,1, 125,0, 123,2, 120,0, 118,1, 112,6, 111,6, 107,2, 101,0, 98,9,

98,8, 80,3, 71,8, 69,8, 64,9, 60,6, 60,2, 59,2, 57,1, 56,9, 55,5, 53,0, 47,0, 46,9, 41,8, 37,0, 35,3,

28,5, 26,2, 25,2, 21,9, 21,3, 16,1, 14,4, 9,0.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₅₂H₆oN₄OnS: 948,4, naměřená (M+l)⁺: 949,3.

-112CZ 304966 B6

Příklad 75

K roztoku sloučeniny 149 (15 g, 0,0158 mol) v bezvodém dichlormethanu (265 ml) se po kapkách při teplotě -10 °C (teplota lázně -15 °C) po dobu 30 minut přidává roztok anhydridu kyseliny benzenselenové (7,4 g, 0,0143 mol) v bezvodém dichlormethanu (265 ml), což vede k úplnému rozpuštění bílých částeček přítomných v roztoku. Při této teplotě se reakční směs dále míchá po dobu 10 minut. Reakční směs se naředí dichlormethanem (200 ml) a při teplotě -10 °C se přidá nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (500 ml). Organická fáze se oddělí, vysuší síranem sodným, přefiltruje se a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (eluent ethylacetát:hexan s gradientem 1:2 až 100:0), což vede ke vzniku sloučeniny 150 (14,20 g, 89 %) ve formě žluté pevné látky. Chromatograficky vyčištěná pevná látka se rozpustí v dichlormethanu (250 ml) a přidá se aktivní uhlí (4,95 g). Suspenze se při teplotě 23 °C míchá po dobu 1 hodiny. Směs se přefiltruje přes podložku z celitu a promyje se dichlormethanem (80 ml). Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku, což vede ke vzniku sloučeniny 150 (13,72 g, 86 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,37 (hexan:EtOAc 1:2).

Ή NMR (300 MHz, CDC1₃) (směr izomerů): δ 7,73 (d, J = 6,7 Hz, 4H), 7,63 (m, 2H), 7,54 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,40 až 7,34 (m, 4H), 7,31 až 7,27 (m, 4H), 6,62 (s, 2H), 5,86 (s, IH), 5,81 (s, IH), 5,75 (s,lH), 5,72 (s, IH), 5,70 (s, IH), 5,35 (d, J = 5,9 Hz, IH), 5,30 (d, J = 8,4 Hz, IH), 5,23 (d, J = 5,9 Hz, IH), 5,22 (d, J = 5,9 Hz, IH), 5,13 (d, J = 5,9 Hz, IH), 4,97 (d, J = 8,8 Hz, IH), 4,43 (m, 2H), 4,20 až 4,01 (m, 8H), 3,97 až 3,86 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 3,80 až 3,74 (m, IH), 3,69 (s, 3H), 3,66 až 3,64 (m, 4H), 3,54 (m, 2H), 3,38 (s, 3H), 3,35 (s, 3H), 3,34 až 2,90 (m, 8H),

2,60 až 2,31 (m, 4H), 2,27 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 1,97 (s, 3H), 1,94 až 1,81 (m, 2H), 1,77 (s, 3H), 1,43 (s, 9H), 1,41 (s, 9H).

13,

C NMR (75 MHz, CDC1₃) (směs izomerů): δ 200,2, 198,3, 170,7, 170,5, 160,0, 155,2, 154,9,

148.5, 148,4, 145,5, 142,1, 140,9, 138,3, 130,9, 130,5, 130,0, 129,8, 127,5, 126,9, 125,0, 124,9,

124,7, 123,8, 122,5, 119,8, 117,2, 116,7, 111,5, 108,1, 104,6, 104,3, 101,3, 100,9, 98,0, 80,1,

72,1, 71,5, 70,5, 69,2, 69,0, 66,4, 63,5, 60,7, 60,1, 59,6, 58,9, 58,8, 58,0, 56,7, 56,4, 56,2, 55,9,

55.5, 55,0, 53,5, 46,7, 41,7, 41,3, 41,1, 36,9, 35,2, 35,1, 31,4, 28,1, 25,4, 25,3, 22,5, 15,7, 15,6, 14,0, 7,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C52H60N4O12S: 964,4, naměřená (M+l)⁺: 965,3, (M+23)⁺: 987,3.

-113CZ 304966 B6

Příklad 76

Reakční baňka se dvakrát vyžíhá, několikrát se propláchne argonem a udržuje se v argonové atmosféře. K roztoku DMSO (385,0 μΐ) v bezvodém CH₂C1₂ (42 ml) se při teplotě -78 °C po kapkách přidá anhydrid kyseliny trifluormethansulfonové (366,5 μΐ, 2,16 mmol). Reakční směs se při teplotě -78 °C míchá po dobu 20 minut. Poté se pomocí kanyly (doba přidávání 5 min) při teplotě -78 °C přidá roztok sloučeniny 150 (1 g, 1,03 mmol) vbezvodém CH₂C1₂ (10 ml jako hlavní přídavek a 5 ml na promytí). Během přidávání se v baňkách udržuje teplota -78 °C a barva se změní ze žluté na hnědou. Reakční směs se při teplotě -40 °C míchá po dobu 35 minut. Během tohoto časového intervalu se roztok změní ze žluté na tmavě zelenou. Po uplynutí této doby se po kapkách přidá ’Pr₂NEt (1,51 ml, 9,55 mmol) a reakční směs se při teplotě 0 °C nechá stát po dobu 45 minut a během této doby se barva roztoku změní na hnědou. Poté se k reakční směsi po kapkách přidá terc.BuOH (409,5 μΐ, 4,33 mmol) a terc.butyltetramethyl-guanidin (1,31 ml,

7,61 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 40 minut. Po uplynutí této doby se k reakční směsi po kapkách přidá acetanhydrid (1,03 ml, 10,89 mmol) a reakční směs se nechá reagovat při teplotě 23 °C po dobu více než 1 hodiny. Poté se reakční směs naředí CH₂C1₂ (25 ml) a promyje se nasyceným vodným roztokem NH4CI (50 ml), NaHCO₃ (50 ml) a NaCl (50 ml). Organické vrstvy se vysuší Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (vnitřní průměr 2,0 cm, výška náplně oxidu křemičitého 9,0 cm, eluent ethylacetáthexan s gradientem 20:80, 30:70 až 40:60), což vede ke vzniku sloučeniny 151 (832,6 mg, 99 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf = 0,48 (hexan:EtOAc 3:2).

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,78 (s, 1H), 6,09 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,99 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,32 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 5,19 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,01 (d, J - 11,7 Hz, 1H), 4,62 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,50 (bs, 1H), 4,34 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 4,28 (dd, J, = 2,4 Hz, J₂ = 6,8 Hz, 1H), 4,24 (s, 1H), 4,17 (m, 2H), 3,90 (m, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,58 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,42 až 3,37 (m, 2H), 3,37 (s, 3H), 2,91 (m, 2H), 2,36 až 2,08 (m, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 1,44 (s, 9H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,9, 168,9, 168,0, 155,4, 149,8, 148,6, 146,0, 141,1, 140,6, 131,6, 131,1, 130,6, 129,0, 125,1, 120,6, 118,3, 102,2, 98,4, 79,9, 71,9, 69,4, 651,6, 60,4, 59,8,

59,4, 59,2, 54,9, 54,7, 54,0, 41,6, 30,6, 29,1, 28,7, 23,9, 23,2, 20,6, 16,1, 14,2, 11,2, 9,8.

ESI-MS m/z: vypočítaná C^HseN^nS: 810,91, naměřená (M+l)⁺: 811,3.

- 114CZ 304966 B6

Příklad 77

K roztoku sloučeniny 151 (2,9 g, 3,57 mmol) v CH₂C1₂ (120 ml) se při teplotě 23 °C přidá MeSO₃H (1,4 ml, 21,46 mmol). Reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 30 minut a po uplynutí této doby se ke směsi při teplotě 0 °C přidá nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (200 ml). Organická fáze se oddělí, vysuší síranem sodným, přefiltruje se a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (eluent ethylacetát:hexan s gradientem 0:1 až 1:0), což vede ke vzniku sloučeniny 35 (1,43 g, 64 %) ve formě světle žluté pevné látky. Experimentální data sloučeniny 35 byla již dříve popsána v PCT/GB00/01 852.

Sloučenina 36, ET-770 a ET-743 se připraví postupy, které jsou popsány v PCT/GB00/01 852.

Cesta 3

První krok této cesty (přeměna sloučeniny 21 na sloučeninu 146) byl popsán výše v příkladu 71.

Příklad 78

Na₂CO₃,BnCO₂CI aceton, H₂O

HO

(152)

K roztoku komerčně dostupného OH Cys(Fm)-H HCl (Bachem) (40 g, 0,119 mol) v acetonu (500 ml) a vodě (500 ml) se při teplotě 0 °C přidá roztok Na₂CO₃ (238 ml) o koncentraci 1 mol/l (1 M) a BnCO₂Cl (18,7 ml, 0,131 mol). Reakční směs se míchá při teplotě 60 °C po dobu 30 minut, směs se rychle ochladí HC1 o koncentraci 0,1 mol/l (0,1 N) a extrahuje se etherem (3 x 400 ml). Organická fáze se oddělí, vysuší se síranem hořečnatým, přefiltruje se a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbytek ve formě pevné látky se rozpustí ve směsi EtOAc/CH₂Cl₂ 1:1, vysráží se hexanem a nechá se při teplotě 4 °C reagovat přes noc. Poté se suspenze přefiltruje, pevná látka se promyje hexanem (200 ml) a filtrát se vysuší ve vakuu, což vede ke vzniku sloučeniny 152 (50,16 g, 97 %) ve formě bílé pevné látky.

- 115CZ 304966 B6 'H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 10,66 (bs, 1H), 7,74 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,69 až 7,64 (m, 2H),

7,62 až 7,29 (m, 9H), 5,97 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 5,14 (bs, 2H), 4,70 až 4,64 (m, 1H), 4,09 až 4,05 (m, 1H), 3,12 až 3,09 (m, 2H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 175,2, 155,9, 145,5, 141,0, 135,8, 128,5, 128,2, 128,1, 127,5, 127,0, 124,7, 119,8, 84,8, 67,3, 46,8, 37,0.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₂₅H₂₃NO₄S: 433,52, naměřená (M+l)⁺: 434,4.

Příklad 79

K roztoku sloučeniny 146 (10 g, 19,2 mmol) a sloučeniny 152 (12,5 g, 28,8 mmol) v dichlormethanu (800 ml) se za stálého míchání v argonové atmosféře při teplotě 0 °C po kapkách po dobu 1 hodiny přidává dimethylaminopyridin (705 mg, 5,77 mmol), l-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylkarbodiimidhydrochlorid (9,2 g, 48,1 mmol) a diisopropylethylamin (7,4 ml, 42,3 mmol). Směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu více než 1,5 hodiny. Reakce se rychle ochladí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (600 ml). Organická fáze se oddělí a opět promyje nasyceným vodným roztokem chloridu amonného (500 ml) a nasyceným vodným roztokem chloridu sodného (500 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (RP18, CH₃CN:H₂O 4:1), což vede ke vzniku sloučeniny 153 (13,89 g, 77 %) ve formě světle žluté pevné látky.

’H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,74 až 7,72 (m, 2H), 7,61 až 7,53 (m, 2H), 7,37 až 7,24 (m, 9H),

6.39 (s, 1H), 6,09 až 5,96 (m, 1H), 5,90 (s, 1H), 5,84 (s, 1H), 5,78 (s, 1H), 5,34 (dd, Jj = 1,5 Hz, J₂ = 17,4 Hz, 1H), 5,32 (bs, 1H), 5,24 (dd, Jj = 1,5 Hz, J₂ = 10,2 Hz, 1H), 5,17 až 5,07 (m, 2H),

4.40 (dd, Ji = 3,6 Hz, J₂ = 10,8 Hz, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,18 až 4,01 (m, 6H), 3,92 (brt, J = 6,3 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,30 až 3,19 (m, 3H), 2,99 až 2,85 (m, 3H), 2,65 (dd, Ji = 4,5 Hz, J₂ = 14,4 Hz, 1H), 2,55 (d, J= 18,3 Hz, 1H), 2,26 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 1,86 (dd, J, = 11,7 Hz, J₂= 15,9 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,2, 155,6, 148,6, 146,8, 145,7, 145,6, 144,3, 142,6, 140,7, 139,0, 133,7, 131,1, 128,8, 128,4, 128,1, 128,0, 127,4, 126,9, 124,7, 124,6, 121,0, 120,5, 119,7,

117,8, 117,3, 116,8, 112,5, 112,0, 101,0, 74,1, 67,0, 64,7, 60,7, 59,9, 57,0, 56,6, 56,3, 55,2, 53,1,

46,5, 41,4, 36,4, 34,8, 26,2, 24,8, 15,6, 9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C54H54N4O9S: 934,36, naměřená (M+l)⁺: 935,4.

-116CZ 304966 B6

Příklad 80

(153)

(154)

K roztoku sloučeniny 153 (13,89 g, 14,85 mmol) v CFfiCN (74,3 ml) se při teplotě 0 °C přidá MEMC1 (25,4 ml, 223 mmol), DIPEA (52 ml, 297 mmol) a DMAP (0,181 g, 0,15 mmol). Směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 5 hodin. Reakční směs se naředí CH₂C1₂ (400 ml) a extrahuje se HCl (300 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Vodná fáze se znova extrahuje CH₂C1₂ (2 x 50 ml). Organická fáze se vysuší Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se ve vakuu a zbytek se čistí lychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, CH₂Cl₂:EtOAc 10:1, 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 154 (13,47 g, 88 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,27 (CH₂C1₂-.EtOAc 6:1).

’HNMR (300 MHz, CDCfi): δ 7,73 až 7,70 (m, 2H), 7,58 až 7,50 (m, 2H), 7,38 až 7,22 (m, 9H), 6,59 (s, IH), 6,08 až 5,98 (m, IH), 5,89 (s, IH), 5,77 (s, IH), 5,35 (d, J= 17,1 Hz, IH), 5,31 až

5,28 (m, IH), 5,23 (d, J = 6,9 Hz, IH), 5,13 (d, J = 6,9 Hz, IH), 5,12 až 5,05 (m, 2H), 4,37 až

4,29 (m, 2H), 4,15 až 3,77 (m, 9H), 3,68 (s, 3H), 3,58 až 3,55 (m, 2H), 3,37 (s, 3H), 3,30 až 3,27 (m, IH), 3,21 až 3,16 (m, 2H), 2,96 až 2,84 (m, 4H), 2,64 až 2,58 (m, IH), 2,55 (d, J = 18 Hz, IH), 2,27 (s, 3H), 2,16 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,75 (dd, J, = 12,3 Hz, J₂ = 16,2 Hz, IH).

¹³C NMR (75 MHz, CDCfi): δ 171,9, 170,2, 155,5, 148,7, 148,6, 148,3, 145,8, 145,7, 144,5,

142.1, 140,9, 139,1, 136,1, 133,8, 130,8, 130,5, 128,5, 128,3, 128,1, 127,6, 127,0, 124,9, 124,7,

123,9, 122,2, 120,9, 119,8, 117,8, 117,3, 112,6, 112,0, 101,1, 98,2, 74,0, 71,7, 69,3, 67,1, 65,1,

60.1, 59,8, 59,0, 59,0, 56,9, 56,8, 56,7, 55,3, 53,3, 46,7, 41,4, 36,5, 35,0, 31,6, 29,7, 26,4, 25,0,

22,6, 15,7, 14,1,9,2.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₅₈H₆₂N₄O|iS: 1023,2, naměřená (M+23)⁺: 1046,3.

-117CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 154 (20,84 g, 0,02 mmol) v dichlormethanu (530 ml) se za stálého míchání v argonové atmosféře při teplotě 23 °C přidá dichlorbis(trifenylfosfm) palladnatý (1,14 g,

1,63 mmol) a kyselina octová (11,64 ml, 0,2 mol). Poté se ke směsi po kapkách přidá tributylstanniumhydrid (27,44 ml, 0,1 mol). Směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 15 minut. Reakční směs se přefiltruje přes sloupec silikagelu spojený hexanem. Zbytek se promyje směsí ethylacetátu a hexanu s gradientem 1:4, 1:1, 3:2 až 7:3, což vede ke vzniku sloučeniny 155 (18,78 g, 94 %) ve formě světle žluté pevné látky.

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,71 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,59 (d, J= 7,5 Hz, 1H), 7,53 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,41 až 7,23 (m, 9H), 6,60 (s, 1H), 5,87 (bs, 2H), 5,74 (s, 1H), 5,40 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 5,33 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 9 Hz, 1H), 5,09 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,97 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,56 (dd, J, = 3 Hz, J₂ = 11,1 Hz, 1H), 4,19 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,16 až 3,87 (m, 9H), 3,66 (s, 3H), 3,38 (s, 3H), 3,32 až 3,20 (m, 3H), 2,96 až 2,87 (m, 3H), 2,62 až 2,54 (m, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 1,97 (s, 3H), 1,82 (dd, J, = 13,2 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,0, 155,4, 149,0, 147,5, 145,7, 145,6, 144,4, 140,8, 135,9,

130,9, 128,4, 128,1, 128,0, 127,4, 126,9, 124,7, 124,6, 122,7, 119,7, 117,7, 112,4, 111,4, 100,6,

98,7, 71,5, 69,4, 67,0, 64,9, 63,9, 59,7, 59,6, 58,8, 57,0, 56,5, 56,4, 55,1, 54,9, 53,1, 52,5, 46,5,

41,4, 36,8, 34,9, 25,8, 24,7, 15,7, 8,7.

Příklad 82

(155)

(156)

K roztoku sloučeniny 155 (18,5 g, 18,82 mmol) v bezvodém dichlormethanu (530 ml) se při teplotě -10 °C (teplota lázně -15 °C) po kapkách přidá roztok anhydridu kyseliny benzenselenové (9,68 g, 18,82 mmol) v bezvodém dichlormethanu (290 ml), což vede k úplnému rozpuštění bílých částeček přítomných v roztoku. Při této teplotě se reakční směs míchá po dobu 10 minut. Reakční směs se rychle ochladí nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (600 ml). Organická fáze se vysuší síranem sodným, přefiltrují se a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (eluent ethylacetát:hexan s gradientem 1:1, 3:2, 7:3 až 4:1), což vede ke vzniku sloučeniny 156 (17,62 g, 88 %) ve formě světle žluté pevné látky.

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃) (směs izomerů): δ 7,73 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,63 (d, J = 7,5 Hz, 2H),

7.40 až 7,29 (m, 9H), 6,59 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 5,68 (s, 1H), 5,66 (s, 1H), 5,58 (s, 1H), 5,56 (s, 1H), 5,23 (d, J = 6 Hz, 1H), 5,15 až 5,05 (m, 4H), 4,76 až 4,68 (m, 1H), 4,64 až 4,55 (m, 1H),

4.40 až 4,37 (m, 1H), 4,15 až 3,68 (m, 8H), 3,60 (s, 3H), 3,57 (s, 3H), 3,39 (s, 3H), 3,36 (s, 3H), 3,25 až 2,78 (m, 7H), 2,38 až 2,24 (m, 2H), 2,20 (s, 3H), 2,18 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,09 (m, 1H), 2,04 (s, 3H), 1,77 (s, 3H), 1,58 (s, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná CssHsgN^nS: 999,13, naměřená (M+l)⁺: 1000,0.

-118CZ 304966 B6

Příklad 83

1. DMSO, Tf₂O

2. DIPEA

3. tercBuOH

4. N₃Me₄tercBu

5. Ac₂O, CH₂CI₂

Reakční baňka se dvakrát vyžíhá, několikrát se propláchne argonem a udržuje se v argonové atmosféře. K roztoku DMSO (1789 μί) v bezvodém CH₂C1₂ (20 ml) se při teplotě -78 °C po kapkách přidá anhydrid kyseliny trifluormethansulfonové (169 μί, 1 mmol). Reakční směs se při teplotě -78 °C míchá po dobu 20 minut. Poté se pomocí kanyly (doba přidávání 5 min) při teplotě -78 °C přidá roztok sloučeniny 156 (0,5 g, 0,5 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (4 ml) jako hlavní přídavek a 1,5 ml na promytí). Během přidávání se v baňkách udržuje teplota -78 °C a barva se změní ze žluté na hnědou. Reakční směs se při teplotě -40 °C míchá po dobu 35 minut. Během tohoto časového intervalu se roztok změní ze žluté na tmavě zelenou. Po uplynutí této doby se po kapkách přidá 'Pr₂NEt (0,7 ml, 4,42mmol) a reakční směs se při teplotě 0 °C nechá stát po dobu 45 minut a během této doby se barva roztoku změní na hnědou. Poté se k reakční směsi po kapkách přidá terc.BuOH (189 μί, 2 mmol) a terc.butyltetramethylguanidin (0,6 ml, 3,49 mmol) a směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 40 minut. Po uplynutí této doby se k reakční směsi po kapkách přidá acetanhydrid (0,47 ml, 4,97 mmol) a směs se nechá reagovat při teplotě 23 °C po dobu více než 1 hodiny. Poté se reakční směs naředí CH₂C1₂ (15 ml) a promyje se nasyceným vodným roztokem NH4CI (25 ml), NaHCO₃ (25 ml) a NaCl (25 ml). Organické vrstvy se vysuší Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (vnitřní průměr 2,0 cm, výška náplně oxidu křemičitého 9 cm, eluent ethylacetáthexan s gradientem 1:4, 1:3, 1:2 až 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 157 (128 mg, 30 %) ve formě světle žluté pevné látky.

Rf: 0,37 (hexan:EtOAc 3:2) ‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,73 (bs, 5H), 6,66 (s, 1H), 6,09 (s, 1H), 5,99 (s, 1H), 5,30 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 6 Hz, 1H), 5,06 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 5,00 (s, 1H), 4,83 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,50 (s, 1H), 4,34 až 4,17 (m, 7H), 3,90 až 3,87 (m, 2H), 3,66 (s, 3H), 3,65 až 3,56 (m, 2H), 3,37 (s, 3H), 2,89 až 2,90 (m, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,18(s, 3H), 2,15 až 2,04 (m, 2H), 2,03 (s, 3H), 1,99 (s, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C₄₃H4₈N₄Oi₂S: 844,93, naměřená (M+l)⁺: 845,8.

-119CZ 304966 B6

Příklad 84

K roztoku sloučeniny 157 (100 mg, 0,118 mmol) v CH2CI2 (2 ml) a v CH₃CN (2 ml) se při teplotě 0 °C přidá Nal (71 mg, 0,472 mmol) a TMSC1 (60 μΐ, 0,472 mmol). Směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 50 minut, reakce se rychle ochladí vodou (30 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (2 x 20 ml). Organické fáze se postupně promyjí nasyceným vodným roztokem NaCl (20 ml) a nasyceným vodným roztokem dithioničitanu sodného (20 ml), vysuší se Na₂SO₄, přefiltrují se a za10 koncentrují se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (eluent ethylacetát:hexan 1:4, 1:2 až 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 158 (62 mg, 70 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,21 (hexan:ethylacetát 1:1).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,36 (bs, 5H), 6,44 (s, 1H), 6,07 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,97 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,81 (bs, 1H), 5,10 až 5,00 (m, 3H), 4,82 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 4,49 (bs, 1H), 4,35 až 4,30 (m, 1H), 4,21 až 4,17 (m, 2H), 4,16 až 4,14 (m, 2H), 3,65 (s, 3H), 3,41 až 3,36 (m, 2H), 2,88 až 2,85 (m, 2H), 2,28 (s, 3H), 2,24 až 2,03 (m, 2H), 2,17 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,00 (s, 3H).

^,3CNMR(75 MHz, CDC1₃): 170,5, 168,8, 155,9, 148,3, 146,0, 143,1, 141,2, 140,6, 136,6, 130,6, 130,0, 128,8, 128,7, 128,5, 121,0, 120,3, 118,3, 118,2, 113,7, 113,6, 102,2, 67,2,61,5, 60,8, 60,3, 59,6, 59,5, 54,8, 54,7, 54,1, 41,9, 41,6, 32,9, 23,9, 20,8, 15,5, 9,8.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃9H₄₀N₄Oi₀S: 756,82, naměřená (M+l)⁺: 757,3.

Příklad 85

(35)

K roztoku sloučeniny 158 (100 mg, 0,132 mmol) v MeOH (6,8 ml) se při teplotě 23 °C přidá HCO₂H (360 μί) a 10% Pd/C (140 mg, 0,132 mmol) a reakční směs se míchá po dobu 15 minut. Poté se k reakční směsi přidá toluen (7 ml) a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Azeotro30

- 120CZ 304966 B6 pická destilace s toluenem se třikrát opakuje. Zbytek se naředí dichlormethanem (15 ml) a přidá se nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (15 ml). Vodná fáze se oddělí a extrahuje se dichlormethanem (2x10 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují se a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií na amino-silikagelu (eluent ethylacetátu:hexan s gradientem 1:2, 1:1 až 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 35 (57 mg, 70 %) ve formě žluté pevné látky. Experimentální data sloučeniny 35 byla již dříve popsána v PCT/GB00/01 852.

Sloučenina 36, ET-770 a ET-743 se připraví postupy, které jsou popsány v PCT/GB00/01 852.

Cesta 4

První krok této cesty (přeměna sloučeniny 21 na sloučeninu 146) byl popsán výše v příkladu 71.

Příklad 86

(146) (159)

K roztoku sloučeniny 146 (18 mg, 0,032 mmol), katalyzátoru DMAP, imidazolů (5 mg, 0,08 mmol) v DMF (0,005 ml) se při teplotě 0 °C přidá terc.butyldifenylsilylchlorid (12,5 μΐ, 0,048 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 4 hodin. Poté se ke směsi při teplotě 0 °C přidá voda (30 ml) a směs se extrahuje směsí hexan:ethylacetát 1:10 (2 x 40 ml). Organická fáze se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:EtOAc 3:1), což vede ke vzniku sloučeniny 159 (27 mg, 88 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,29 (hexan: EtOAc 3:1).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,72 až 7,41 (m, 2H), 7,40 až 7,20 (m, 8H), 6,46 (s, 1H), 6,16 až 6,00 (m, 1H), 5,77 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,71 (s, 1H), 5,63 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,24 (dd, Ji = 1,2 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,23 (dd, Ji = 1,2 Hz, J₂ = 10,2 Hz, 1H), 4,18 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,13 až 4,00 (m, 4H), 3,77 (s, 3H), 3,63 (dd, Ji = 2,4 Hz, J₂ = 7,5 Hz, 1H), 3,39 až 3,19 (m, 4H), 2,99 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 18,0 Hz, 1H), 2,68 (d, J = 17,7 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 1,99 (dd, J, = 12,6 Hz, J₂ = 16,3 Hz, 1H), 0,89 (s, 9H).

HNMR (75 MHz, CDC1₃): δ 148,3, 146,6, 144,0, 142,5, 139,0, 135,7, 135,4, 133,9, 133,6,

132,2, 131,2, 129,5, 129,4, 128,3, 127,5, 127,4, 121,8, 120,9, 118,7, 117,3, 117,2, 112,9, 111,7, 100,8, 74,2, 68,0, 61,6, 60,6, 60,3, 59,0, 57,4, 56,7, 55,4, 41,7, 29,6, 26,6, 26,5, 25,5, 18,9, 15,8, 9,3.

ESI-MS m/z: vypočítaná C4₅H₅₁N₃O₆Si: 757,9, naměřená (M+l)⁺: 758,4.

- 121 CZ 304966 B6

Příklad 87

(159) (26)

K. roztoku sloučeniny 159 (2,4 g, 3,17 mmol) v CH₃CN (16 ml) se při teplotě 0 °C přidá MOMBr (2,6 ml, 31,75 mmol), DIPEA (8,3 ml, 47,6 mmol) a DMAP (16 mg, 0,127 mmol). Reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 6 hodin. Reakční směs se naředí CH₂C1₂ (50 ml) a extrahuje se HCI (50 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 N). Vodná fáze se znova extrahuje CH₂C1₂ (50 ml). Organické fáze se vysuší Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se ve vakuu a zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, CH₂Cl₂:EtOAc 15:1, 5:1), což vede ke vzniku sloučeniny 26 (1,78 g, 70 %) ve formě bílé pevné látky. Experimentální data sloučeniny 26 byla již dříve popsána v PCT/GB00/01 852.

Experimentální postupy přípravy Meziproduktu 11, sloučeniny 160,161,162 a 163 jsou popsány vPCT/GBOO/Ol 852.

Příklad 88

CH₂CI₂. ch₃cn

TMSCI, Nal

K roztoku sloučeniny 163 (15,8 g, 0,02 mol) v bezvodém CH₂C1₂ (250 ml) a v acetonitrilu (300 ml) se v argonové atmosféře při teplotě 23 °C přidá Nal (31,5 g, 0,21 mol) a CITMS (čerstvě předestilovaný s CaH₂, 26,7 ml, 0,21 mol). Reakční směs se míchá po dobu 40 minut. Poté se reakční směs rozdělí mezi CH₂C1₂ (200 ml) a vodu (300 ml). Organická vrstva se promyje nasyceným vodným roztokem NaCl (2 x 300 ml). Organická fáze se vysuší Na₂SO₄, přefdtruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (eluent ethylacetát:hexan 2:3), což vede ke vzniku sloučeniny 164 (10,74 g, 76 %) ve formě světle žluté pevné látky.

Rf: 0,25 (hexan:EtOAc 3:2).9 'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,57 (s, 1H), 6,08 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,96 až 5,85 (m, 1H), 5,76 (bs, 1H), 5,30 (dd, Ji = 1,5 Hz, J₂ = 17,3 Hz, 1H), 5,23 (dd, J, = 1,5 Hz, J₂ = 10,2 Hz, 1H), 5,00 (d, J = 12,1 Hz, 1H), 4,81 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,58 až 4,45 (m, 3H),

- 122CZ 304966 B6

4,34 až 4,28 (m, IH), 4,23 (m, 2H), 4,17 až 4,00 (m, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,40 až 3,38 (m, 2H), 2,91 až 2,85 (m, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,24 až 2,23 (m, 2H), 2,19 (s, 3H), 2,02 (s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,1, 168,4, 155,2, 148,0, 145,5, 142,8, 140,7, 140,1, 132,7,

130,2, 129,6, 120,7, 119,9, 117,8, 113,3, 101,9, 65,5, 61,0, 60,4, 59,9, 59,2, 59,0, 54,3, 53,6, 41,5, 41,2, 32,6, 29,5, 23,5, 20,4, 15,6, 9,4.

ESI-MS m/z: vypočítání C₃₅H₃₈N₄Oi₀S: 706,76, naměřená (M+l)⁺: 707,2.

Příklad 89

(164)

K roztoku sloučeniny 164 (2 g, 2,85 mol) v dichlormethanu (142 ml) se za stálého míchání v argonové atmosféře při teplotě 23 °C přidá dichlorbis(trifenylfosfin) palladnatý (0,2 g, 0,28 mmol) a kyselina octová (0,65 ml, 11,4 mmol). Poté se ke směsi po kapkách po dobu 25 minut přidává tributylstanniumhydrid (4,51 ml, 17,02 mmol). Po přídavku Bu₃SnH se směs při teplotě 23 °C míchá po dobu více než 20 minut. Reakční směs se přefiltruje přes sloupec silikagelu spojený hexanem. Zbytek se promyje směsí ethylacetátu a hexanu s gradientem 1:2 až 15:1, což vede ke vzniku sloučeniny 35 (1,38 g, 78 %). Experimentální data sloučeniny 35 byla již dříve popsána v PCT/GB00/01 852.

Sloučenina 36, ET-770 a ET-743 se připraví postupy, které jsou popsány v PCT/GB00/01 852.

Cesta 5 25

První krok této cesty (přeměna sloučeniny 21 na sloučeninu 146) byl popsán výše v příkladu 71.

Příklad 90

(146) (165)

K roztoku sloučeniny 146 (8,72 g, 16,78 mmol) v DMF (20,1 ml) se při teplotě 0 °C přidá imidazol (3,43 g, 50,34 mmol), terc.butyldimethylchlorsilan (7,58 ml, 50,34 mmol) a DMAP (0,2 g, 1,7 mmol). Reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 3,5 hodiny, poté se reakční směs rychle ochladí vodou (100 ml) a extrahuje se směsí EtOAc/Hex 1:3 (2 x 75 ml). Organické fáze

- 123 CZ 304966 B6 se promyjí HCI (50 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 M) a vodná fáze se opět extrahuje směsí EtOAc/hexan 1:3 (40 ml). Organické fáze se vysuší síranem sodným, přefiltrují se a zakoncentrují se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (hexan:EtOAc 10:1, 3:1), což vede ke vzniku sloučeniny 165 (9,85 g, 93 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,39 (hexan:EtOAc 2:1).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,43 (s, 1H), 6,15 až 6,03 (m, 1H), 5,92 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,84 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,67 (s, 1H), 5,41 (dd, J, = 1,5 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,26 (dd, Ji = 1,5 Hz, J₂ = 10,5 Hz, 1H), 4,44 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,20 až 4,08 (m, 3H), 3,97 (dd, Ji = 2,7 Hz, J₂ = 8,1 Hz, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,61 (dd, J, = 2,71 Hz, J₂ = 9,9 Hz, 1H), 3,18 (brd, J = 8,7 Hz, 1H), 3,22 až 3,16 (m, 2H), 2,99 (dd, J, = 8,1 Hz, J₂ = 17,4 Hz, 1H), 2,65 (d, J = 17,4 Hz, 1H), 2,28 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,89 (dd, Ji = 12 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 0,8 (s, 9H), -0,05 (s, 3H), 0,09 (s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 148,2, 146,5, 143,8, 142,4, 138,9, 133,8, 131,0, 128,0, 121,5,

120.4, 118,4, 117,1, 112,8, 111,6, 100,7, 74,0, 68,2, 61,5, 60,2, 58,6, 57,1, 56,5, 55,2, 41,3, 26,2,

25.4, 25,2,20,6, 17,8, 15,3, 13,8, 9,0,-3,9,-6,0.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₅H4₇N₃O6Si: 633,85, naměřená (M+l)⁺: 634,2.

K roztoku sloučeniny 165 (7,62 g, 12,02 mmol) v THF (87,64 ml) a H₂O (0,24 ml) se při teplotě -6 °C přidá MEMC1 (2,33 g, 20,43 mmol). Během 45 minut se ke směsi po částech přidává 60% NaH (0,72 g, 18,03 mmol) a při této teplotě se směs míchá po dobu 1,5 hodiny. Reakční směs se rychle ochladí vodou (150 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (2x 100 ml). Organické fáze se vysuší Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se ve vakuu, což vede ke vzniku sloučeniny 166 (8,69 g, 100 %) ve formě bílé pevné látky, která se bez dalšího čištění použije v následujících krocích.

Rf: 0,24 (hexan:EtOAc 2:1).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,64 (s, 1H), 6,16 až 6,05 (m, 1H), 5,92 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,85 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,41 (dd, J, = 1,51 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,29 až 5,24 (m, 2H), 5,14 (d, J = 6 Hz, 1H), 4,42 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,21 až 4,06 (m, 3H), 4,01 až 3,95 (m, 2H), 3,88 až 3,82 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,64 až 3,57 (m, 3H), 3,39 (s, 3H), 3,29 (brd, J = 7,5 Hz, 1H), 3,25 až 3,15 (m, 2H), 3,00 (dd, Ji = 8,1 Hz, J₂ = 17,4 Hz, 1H), 2,65 (d, J = 18 Hz, 1H), 2,30 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 1,82 (dd, Ji = 12 Hz, J₂ = 15,6 Hz, 1H), 0,79 (s, 9H), -0,06 (s, 3H), -0,11 (s, 3H).

¹³C NM (75 MHz, CDC1₃): δ 148,4, 148,1, 144,1, 139,2, 133,9, 130,9, 130,8, 130,2, 128,8, 125,1,

124,2, 121,5, 118,8, 117,45, 113,0, 111,9, 101,0, 98,2, 74,1, 71,7, 69,3, 68,3, 61,7, 59,6, 59,0,

58,9, 57,3, 57,1, 55,5, 41,6, 29,7, 26,4, 25,8, 25,5, 25,4, 15,7, 9,2, -5,6, -5,6.

-124CZ 304966 B6

ESI-MS m/z: vypočítaná C39H55N3O8S1: 721,3, naměřená (M+l)⁺: 722,3.

Bu,SnH, AcOH -i-—-->

(PPh₃)₂PdCI₂, CH₂C1₂

K roztoku sloučeniny 166 (10,76 g, 14,90 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (275 ml) se v argonové atmosféře při teplotě 23 °C přidá (PPh₃)₂PdCl₂ (837 mg, 1,19 mmol), kyselina octová (4,26 ml,

74,5 mmol) a tributylstanniumhydrid (11,85 ml, 44,7 mmol). Reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 15 min (TLC EtOAc/hexan 1:1, bez obsahu výchozích látek). Ke směsi se přidá hexan (100 ml) a směs se prolije kolonou na rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:hexan s gradientem 0:100, 1:4, 2:3 až 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 167 (9,95 g, 98 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,42 (hexan:EtOAc 3:7).

‘HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,63 (s, IH), 5,89 (d, J = 1,4 Hz, IH), 5,79 (d, J = 1,4 Hz, IH), 5,76 (m, IH), 5,38 (d, J = 5,6 Hz, IH), 5,23 (d, J = 5,9 Hz, IH), 4,53 (d, J = 2,7 Hz, IH), 4,17 (dd, J, = 1,95 Hz, J₂ = 6,05 Hz, IH), 4,11 (dd, J, = 7,0 Hz, J₂ = 12,5 Hz, IH), 4,01 až 3,92 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 3,67 (m, 3H), 3,40 (s, 3H), 3,29 (m, IH), 3,24 až 3,13 (m, 3H), 2,99 (dd, J, = 8,0 Hz, J₂ = 17,5 Hz, IH), 2,67 (d, J = 17,5 Hz, IH), 2,28 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 1,80 (dd, Ji = 11,2 Hz, J₂ = 14,9 Hz, IH), 0,82 (s, 9H), 0,03 (s, 3H), -0,07 (s, 3H).

CNM (75 MHz, CDC1₃): δ 148,4, 147,3, 145,5, 144,1, 136,2, 134,9, 134,8, 130,9, 130,2, 124,8, 123,1, 118,6, 112,8, 112,1, 106,2, 100,4, 98,4, 71,5, 69,2, 68,9, 61,7, 59,6, 58,7, 58,6, 56,9, 56,6, 55,3, 41,5, 29,5, 25,7, 25,3, 17,9, 15,5, 8,7, -5,7, -5,8.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₆H₅₁N₃O8Si: 681,89, naměřená (M+l)⁺: 682,3.

HPLC: Podmínky: Sloupec: Symetrie Cl8, mobilní fáze AcN-fosfátový pufr 25 mmol/1 (25 mM), pH = 5, izokratícká eluce AcN (65 %) po 5 minutách s gradientem AcN 65 až 92 % za 31 minut, 0 0,6 ml/min, ť 40 °C. Retenční čas 27,89 minut. HPLC čistota 89,62 %.

Příklad 93

(167)

- 125CZ 304966 B6

K roztoku sloučeniny 167 (9,95 g, 14,6 mmol) vbezvodém CH₂C1₂ (300 ml) se po kapkách v argonové atmosféře při teplotě -15 °C přidá roztok anhydridů kyseliny benzenselenové (7,51 g,

14,6 mmol, čistota činidla 70 %) v bezvodém CH₂C1₂ (120 ml), což vede k úplnému rozpuštění bílých částeček přítomných v roztoku. Při teplotě -15 °C se reakční směs míchá po dobu 15 minut (TLC EtOAc/hexan 1:1, bez obsahu výchozích látek). K reakční směsi se při této teplotě přidá nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (500 ml). Organická fáze se oddělí a vodná fáze se extrahuje CH₂C1₂ (500 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, s gradientem 2:3 až 3:1), což vede ke vzniku sloučeniny 168 (9,86 g, 97 %) ve formě žluté pevné látky.

Rf: 0,33 (hexan:EtOAc 3:7).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃) (poměr izomerů 3:2): δ 6,59 (s, 1H), 6,57 (s, 1H), 5,77 (s, 1H), 5,76 (s, 1H), 5,68 (s, 1H), 5,63 (s, 1H), 5,19 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,09 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 5,00 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 4,40 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,27 (d, J = 2,44 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 3,95 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 3,86 až 3,75 (m, 2H), 3,81 (s, 3H), 3,72 až 3,68 (m, 2H), 3,65 (m, 2H), 3,54 (s, 3H), 3,50 (m, 3H), 3,31 (s, 3H), 3,29 (s, 3H), 3,24 (m, 1H), 3,09 (dt, J = 3,2 Hz, J = 7,6 Hz, 1H), 3,02 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 2,92 (m, 2H), 2,48 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 2,43 (d, J = 9,3 Ηζ,ΙΗ), 2,21 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,13 (s, 3H), 2,03 (m, 2H), 1,73 (s, 3H), 1,71 (s, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,77 (s, 9H), 0,04 (s, 3H), 0,02 (s, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C36H5N3O9SÍ: 697,89, naměřená (M+l)⁺: 698,8.

HPLC: Podmínky: Sloupec: Symetrie Cl8, mobilní fáze AcN-fosfátový pufr 25 mmol/1 (25 mM), pH = 5, s gradientem AcN 30 až 100 % za 50 minut. 0 1,2 ml/min, ť 40 °C. Retenční čas 30,70 minut a 30,95 minut (dva izomery). HPLC čistota 60,77 % a 31,99 %.

Příklad 94

OMe

Me

O

Me

OTBDMS

TBAF/THF

CH₂CI₂

OMe

Me

OH (168) (169)

Kroztoku sloučeniny 168 (16,38 g, 23,47 mmol) vbezvodém THF (727 ml) o koncentraci 0,03 mol/1 (0,03 M) se po kapkách při teplotě 23 °C přidá roztok TBAF v TEIF (59 ml, 59 mmol) o koncentraci 1 mol/1 (1 M). Reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 45 minut. Poté se reakční směs rozdělí mezi nasycený vodný roztok NaCl (850 ml) a CH₂C1₂ (950 ml). Obě vrstvy se oddělí a organická fáze se vysuší bezvodým Na₂SO₄, přefiltruje se a zakoncentruje se za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:hexan s gradi- 126CZ 304966 B6 entem 40:60, 50:50, 70:30, 90:10 až 100:0), což vede ke vzniku sloučeniny 169 (12,17 g, 89 %) ve formě světle žluté pevné látky.

Rf: 0,1 (hexan:EtOAc 3:7).

'HNMR (300 MHz, CDC1₃) (poměr izomerů 3:2): δ 6,63 (s, 1H), 6,57 (s, 1H), 5,79 (s, 1H), 5,77 (s, 1H), 5,75 (s, 1H), 5,62 (s, 1H), 5,23 (s, 1H), 5,18 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 5,01 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 4,22 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,09 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,00 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 3,87 až 3,64 (m, 6H), 3,55 (s, 3H), 3,51 až 3,44 (m, 2H), 3,30 (s, 3H), 3,29 (s, 3H), 3,26 (m, 1H), 3,18 (dt, Ji = 2,9 Hz, J₂ = 7,3 Hz, 1H), 2,94 (m, 4H), 2,50 (m, 4H), 2,22 (s, 3H), 2,16 (s, 3H), 2,15 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,02 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 1,72 (s, 3H), 1,69 (s, 3H).

¹³C NM (75 MHz, CDC1₃): δ 200,2, 200,1, 159,6, 158,5, 148,5, 148,4, 148,1, 147,9, 140,5,137,4,

130.9, 130,4, 130,1, 130,0, 125,1, 124,9, 123,8, 122,7, 116,9, 116,6, 113,3, 110,7, 104,5, 103,9,

101,4, 100,7, 98,1, 97,9, 71,9, 71,5, 71,4, 70,1, 69,0, 69,0, 62,0, 60,1, 59,5, 58,7, 58,5, 58,1, 57,4,

56.9, 56,8, 56,4, 55,9, 55,1, 55,0, 41,3, 41,0, 36,1, 31,3, 25,3, 25,2, 22,4, 15,6, 15,5, 13,8, 7,0,

6,8.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃₀H₃7N₃O₉: 583,63, naměřená (M+l)⁺: 584,2.

Příklad 95

K roztoku sloučeniny 169 (11,49 g, 19,69 mmol) a Alloc-Cys-(Fm) (11,32 g, 29,53 mmol) (jeho příprava je uvedena v Kruše, C. H., Holden, K. G., J. Org. Chem., 1985, 50, pp. 2792-2794) v bezvodém CH₂C1₂ (688 ml) se při teplotě 23 °C přidá DMAP (2,4 g, 19,69 mmol) a EDC-HC1 (9,44 g, 49,22 mmol). Poté se ke směsi při teplotě 0 °C přidá DIPEA (5,14 ml, 29,53 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 3 hodin. Reakční směs se postupně promývá nasyceným vodným roztokem NaHCO₃ (500 ml), NaCl (400 ml) a NH4CI (2 x 300 ml). Organická vrstva se vysuší Na₂SO₃ (500 ml), NaCl (400 ml) a NH4CI (2 x 300 ml). Organická vrstva se vysuší Na₂SO4, přefiltruje se a zakoncentruje se za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:hexan s gradientem 1:1, 6:4 až 7:3), což vede ke vzniku sloučeniny 170 (14,76 g, 79 %) ve formě světle žluté pevné látky.

Rf: 0,31 a 0,40 (směs izomerů) (hexan:EtOAc 3:7).

*H NMR (300 MHz, CDC1₃): δ 7,74 (d, J = 7,6 Hz, 4H), 7,63 (dd, J = 7,0 Hz, J = 15,3 Hz, 4H), 7,38 (t, J = 7,3 Hz, 4H), 7,29 (m, 4H), 6,61 (s, 1H), 6,54 (s, 1H), 5,89 (m, 2H), 5,73 (s, 1H), 5,70 (s, 1H), 5,69 (s, 1H), 5,62 (s, 1H), 5,55 (m, 1H), 5,32 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 5,23 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 5,22 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 4,68 (m, 1H), 4,56 (m, 4H), 4,51 (m, 2H), 4,38 (dd, Ji = 4,5 Hz, J₂ = 12,6 Hz, 1H), 4,22

- 127CZ 304966 B6 (dd, Ji = 6,2 Hz, J₂ = 11,1 Hz, 1H), 4,14 až 3,88 (m, 12H), 3,83 (s, 3H), 3,79 až 3,69 (m, 4H), 3,61 (s, 3H), 3,56 (m, 4H), 3,39 (s, 3H), 3,36 (s, 3H), 3,23 (m, 2H), 3,16 (d, J = 6,0 Hz, 2H), 3,07 (d, J = 6,1 Hz, 2H), 3,00 až 2,81 (m, 6H), 2,46 až 2,34 (m, 4H), 2,25 (s, 3H), 2,20 (s,3H), 2,16 (s, 3H), 2,07 (m, 1H), 1,83 (dd, J, = 9,5 Hz, J₂ = 15,1 Hz, 1H), 1,78 (s, 3H), 1,77 (s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 200,3, 198,4, 170,3, 160,0, 158,1, 148,7, 148,7, 148,5, 148,2, 145,6, 145,6, 145,5, 142,2, 141,1, 141,0, 141,0, 138,5, 132,4, 132,3, 131,1, 130,6, 130,1, 129,8,

128,8, 127,6, 127,1, 127,1, 125,1, 125,0, 124,8, 124,7, 124,7, 124,0, 122,7, 119,9, 118,1, 118,0,

117.2, 116,8, 111,6, 108,3, 104,8, 104,5, 101,5, 101,0, 98,2, 98,2, 72,3, 71,7, 71,7, 70,6, 69,3,

69.2, 66,4, 66,0, 66,0, 65,5, 63,8, 60,8, 60,2, 59,8, 59,0, 58,9, 58,1, 56,8, 56,6, 56,5, 56,3, 56,1,

55.7, 55,3, 55,2, 53,9, 46,9, 41,9, 41,4, 41,2, 37,2, 36,9, 35,4, 31,5, 29,6, 25,6, 25,4, 22,6, 15,8,

15.7, 14,1,7,3,7,0.

ESI-MS m/z: vypočítaná C5iH₅₆N₄O]₂S: 948,36, naměřená (M+l)⁺: 949,3.

Příklad 96

1. DMSO, Tf₂O

2. DIPEA

3. terc.-BuOH

4. N₃Me₄terc.Bu

5. Ac₂O, CH₂CI₂

OMe

^VO ČN (171)

Reakční baňka se dvakrát vyžíhá, několikrát se propláchne argonem a udržuje se v argonové atmosféře. K roztoku DMSO (5,4 ml) v bezvodém CH₂Cl₂ (554 ml) se při teplotě -78 °C po kapkách přidá anhydrid kyseliny trifluormethansulfonové (5,11 ml, 30,4 mmol). Reakční směs se při teplotě -78 °C míchá po dobu 20 minut. Poté se pomocí kanyly při teplotě -78 °C přidá roztok sloučeniny 170 (14,43 g, 15,2 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (188 ml). Během přidávání se v baňkách udržuje teplota -78 °C a barva reakční směsi je žlutá. Reakční směs se při teplotě -40 °C míchá po dobu 35 minut. Během tohoto časového intervalu se roztok změní ze žluté na tmavě zelenou. Po uplynutí této doby se po kapkách přidá ‘Pr₂NEt (21,2 ml, 121,6 mmol) a reakční směs se při teplotě 0 °C nechá stát po dobu 45 minut. Během této doby se barva roztoku změní na bledě hnědou. Poté se k reakční směsi po kapkách přidá terc.BuOH (5,8 ml, 60,8 mmol) a terc.butyltetra-methylguanidin (18,3 ml, 106,4 mmol) a reakční směs se míchá při teplotě 23 °C po dobu 40 minut. Po uplynutí této doby se k reakční směsi po kapkách přidá acetanhydrid (14,34 ml, 152 mmol) a směs se nechá reagovat při teplotě 23 °C po dobu více než 1 hodiny. Poté se reakční směs naředí CH₂C1₂ (38 ml) a promyje se nasyceným vodným roztokem NH4CI (500 ml), NaHCCb (500 ml) a NaCl (500 ml). Organické vrstvy se vysuší Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:hexan s gradientem 3:7 až 4:6), což vede ke vzniku sloučeniny 171 (6,24 g, 52 %) ve formě světle žluté pevné látky.

Rf: 0,38 (hexan:EtOAc 1:1).

- 128CZ 304966 B6 'HNMR (300 MHz, CDC1₃): δ 6,78 (s, 1H), 6,07 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,98 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,92 (m, 1H), 5,32 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,31 (dd, J, = 1,5 Hz, J₂ = 17,1 Hz, 1H), 5,23 (dd, J, = 1,5 Hz, J₂ = 10,4 Hz, 1H), 5,19 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 5,01 (d, J= 11,5 Hz, 1H), 4,81 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,53 až 4,51 (m, 3H), 4,35 až 4,27 (m, 2H), 4,24 (s, 1H), 4,18 až 4,13 (m, 2H), 3,94 až 3,84 (m, 2H), 3,73 (s, 3H), 3,58 (t, J = 4,7 Hz, 2H), 3,43 až 3,37 (m, 2H), 3,36 (s, 3H), 2,91 (m, 2H), 2,27 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,36 až 2,06 (m, 2H), 2,02 (s, 3H).

^BC NMR (75 MHz, CDC1₃): δ 170,23, 168,49, 155,26, 149,62, 148,26, 145,63, 140,85, 140,24, 132,74, 131,60, 130,11, 124,89, 124,70, 120,14, 117,89, 117,84, 113,21, 101,89, 98,03, 92,67, 71,60, 69,04, 65,70, 61,20, 60,35, 59,36, 59,01, 58,89, 54,71, 54,42, 53,79, 41,53, 41,19, 32,68, 29,53, 23,57, 20,26, 15,62, 9,45.

ESI-MS m/z: vypočítaná C₃9H4₆N4Oi₂S: 794,87, naměřená (M+l)⁺: 796, (M+23)⁺ 817.

HPLC: Podmínky: Sloupec: Symetrie Cl8, mobilní fáze AcN-fosfátový pufr (pH = 5), s gradientem 45 až 65 % za 15 minut a 65 až 90 % za 36 minut. 0 0,8 ml/min, t^a 40 °C. Retenční čas 19,374 minuty. HPLC čistota 83,17 %.

Příklad 97

AllocHN

K roztoku sloučeniny 171 (2,26 g, 2,85 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (74 ml) a acetonitrilu (74 ml) se při teplotě 0 °C přidá Nal (3,42 g, 22,8 mmol) a TMSC1 (čerstvě předestilovaný s CaH₂) (2,6 ml, 22,8 mmol) a reakční směs se míchá po dobu 35 minut. K reakční směsi se při této teplotě přidá nasycený vodný roztok hydrogenuhličitanu sodného (150 ml). Organická fáze se oddělí a vodná fáze se extrahuje CH₂C1₂ (2 x 100 ml). Organické extrakty se vysuší síranem sodným, přefiltrují se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku, což vede ke vzniku sloučeniny 164 (2,4 g, 100 %) jako světle žluté pevné látky, která se bez dalšího čištění použije v následujících reakcí. Experimentální data sloučeniny 164 byla již dříve popsána v příkladu 88. Přeměna sloučeniny 164 na sloučeninu 35 byla již dříve popsána v příkladu 89.

Meziprodukty 35, 36, ET-770 a ET-743 se připraví postupy, které jsou popsány v PCT/GB00/01 852.

-129CZ 304966 B6

Cesta 6

Příklad 98

K roztoku sloučeniny 144 (7 g, 7,6 mmol) v MeOH (140 ml) se přidá NaOH (15,1 ml) o koncentraci 0,1 mol/1 (0,1 M) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 10 minut. K reakční io směsi se přidá nasycený vodný roztok NH4CI (100 ml). Organická fáze se oddělí a promyje se

5% HCI dokud se barva nezmění na žlutou. Organický extrakt se vysuší síranem sodným, přefiltruje se a rozpouštědlo se odstraní destilací za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:hexan s gradientem 0:1, 1:3, 1:2, 1:1, 1:1 až 3:1), což vede ke vzniku sloučeniny 161 (3,76 g, 85 %). Experimentální data sloučeniny 116 byla již dříve popsána v patentu US 5 721 362.

Příklad 99

K roztoku sloučeniny 161 (200 mg, 0,37 mmol) a cysteinu 152 (240 mg, 0,55 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (20 ml) se při teplotě 23 °C přidá DMAP (110 mg, 0,925 mmol) a EDC HCI (170 mg, 0,925 mmol) a reakční směs se při této teplotě míchá po dobu 1,5 hodiny. Reakční směs se po25 stupně promývá nasyceným vodným roztokem NaHCO₃ (15 ml), NaCl (15 ml) a NH4CI (2 x 10 ml). Organická vrstva se vysuší Na₂SO₄, přefiltruje se a zakoncentruje se za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:hexan s gradientem 1:4 až 1:2), což vede ke vzniku sloučeniny 172 (285 mg, 80 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,3 (hexan:EtOAc 2:1).

- 130CZ 304966 B6 ’HNMR (300 MHz, CDCfi): δ 7,73 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,59 až 7,57 (m, 2H), 7,40 až 7,28 (m, 9H), 6,60 (s, IH), 5,69 (s, IH), 5,65 (s, IH), 5,54 (d, J = 7,8 Hz, IH), 5,11 až 5,08 (m, 4H), 4,52 až 4,4,49 (m, IH), 4,21 až 3,90 (m, 6H), 3,83 (s, 3H), 3,49 (s, 3H), 3,21 (d, J = 6,6 Hz, IH), 3,09 až 2,90 (m, 6H), 2,41 (d, J = 18 Hz, IH), 2,34 až 2,31 (m, IH), 2,25 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 1,88 až 1,83 (m, IH), 1,77 (s, 3H).

¹³C NMR (75 MHz, CDCfi): δ 198,7, 170,5, 158,4, 155,9, 148,9, 148,8, 145,8, 142,5, 141,3,

136,2, 131,4, 130,0, 128,8, 128,6, 128,4, 127,9, 127,3, 125,3, 125,0, 124,9, 123,0, 120,1, 117,5,

108,5, 104,8, 101,7, 99,5, 70,8, 67,4, 60,5, 57,8, 57,0, 56,5, 56,0, 55,5, 47,1, 41,6, 37,4, 37,1,

31,8,25,8, 22,8, 15,9, 14,3, 7,6.

ESI-MS m/z: vypočítaná C53H54N4O11S: 954,35, naměřená (M+23)⁺: 977,8.

Příklad 100

Reakční baňka se dvakrát vyžíhá, několikrát se propláchne argonem a udržuje se v argonové atmosféře. K roztoku DMSO (977 μΐ) v bezvodém CH₂C1₂ (118 ml) se při teplotě -78 °C po kapkách přidá anhydrid kyseliny trifluormethansulfonové (930 μΐ, 5,5 mmol). Reakční směs se při teplotě -78 °C míchá po dobu 20 minut. Poté se pomocí kanyly (doba přidávání 5 min) při teplotě -78 °C přidá roztok sloučeniny 172 (2,63 g, 2,75 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (26 ml jako hlavní přídavek a 13 ml na promytí). Během přidávání se v obou baňkách udržuje teplota -78 °C a barva reakční směsi se změní ze žluté na hnědou. Reakční směs se při teplotě -40 °C míchá po dobu 35 minut. Během tohoto časového intervalu se roztok změní ze žluté na tmavě zelenou. Po uplynutí této doby se po kapkách přidá 'Pr₂NEt (3,48 ml, 22 mmol) a reakční směs se při teplotě 0 °C nechá stát po dobu 45 minut, během této doby se barva roztoku změní na hnědou. Poté se k reakční směsi po kapkách přidá terc.BuOH (1,04 ml, 11 mmol) a terc.butyltetramethylguanidin (3,31 ml, 19,25 mmol) a reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 40 minut. Po uplynutí této doby se k reakční směsi po kapkách přidá acetanhydrid (2,6 ml, 27,5 mmol) a směs se nechá reagovat při teplotě 23 °C po dobu více než 1 hodiny. Poté se reakční směs naředí CH₂C1₂ (70 ml) a postupně promyje nasyceným vodným roztokem NH₄C1 (180 ml), NaHCCfi (180 ml) a NaCl (180 ml). Organické vrstvy se vysuší Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se za sníženého tlaku. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, hexan:EtOAc s gradientem 4:1, 3:1 až 2:1), což vede ke vzniku sloučeniny 173 (1,145 g, 52 %) ve formě bílé pevné látky.

Rf: 0,31 (hexan:EtOAc 3:2).

’HNMR (300 MHz, CDCfi): δ 7,37 (bs, 5H), 6,67 (s, IH), 6,08 (d, J = 1,2 Hz, IH), 5,99 (d, J = 1,2 Hz, IH), 519 až 5,00 (m, 4H), 4,82 (d, J = 9,3 Hz, IH), 4,49 (bs, IH), 4,32 až 4,15 (m, 5H),

- 131 CZ 304966 B6

3,67 (s, 3H), 3,55 (s, 3H), 3,44 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 3,39 (d, J = 6 Hz, 1H), 2,90 až 2,87 (m, 2Η). 2,28 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 2,15 až 2,07 (m, 2H), 2,03 (s, 3H), 2,00 (s, 3H).

ESI-MS m/z: vypočítaná C41H44N4O11S: 800,87, naměřená (M+23)⁺ 823,7.

Příklad 101

O' j OMe

NHCbz

Me

O

Me ú- o

ČN

Nal, TMSCI

CH₂CI_2i ch₃cn

NHCbz

Me

O

(158) (173)

K roztoku sloučeniny 173 (100 mg, 0,125 mmol) v CH2CI2 (2 ml) a CH₃CN (2 ml) se při teplotě 0 °C přidá Nal (75 mg, 0,5 mmol) a TMSCI (63 μί, 0,5 mmol). Reakční směs se při teplotě 23 °C míchá po dobu 50 minut, poté se směs rychle ochladí vodou (30 ml) a extrahuje se CH₂C1₂ (2 x 20 ml). Organické fáze se postupně promyjí nasyceným vodným roztokem NaCl (20 ml) a dithioničitanem sodným (20 ml), vysuší se Na₂SO₄, přefiltrují se a zakoncentrují se ve vakuu. Zbytek se čistí rychlou sloupcovou chromatografií (SiO₂, EtOAc:hexan s gradientem 1:4, 1:2 až 1:1), což vede ke vzniku sloučeniny 158 (66 mg, 70 %) ve formě bílé pevné látky. Experimentální data sloučeniny 158 byla již dříve popsána v příkladu 19.

Přeměna sloučeniny 158 na sloučeninu 35 byla již dříve popsána v příkladu 85.

Meziprodukty 36, ET-770 a ET-743 se připraví postupy, které jsou popsány v PCT/GB00/01 852.

Rf: 0,21 (hexan:EtOAc 1:1).

Odkazy na literaturu

European Patent 309 477.

US Patent 5 721 362.

Sakai, R., Jares-Erijman, E. A., Manzanares, I., Elipe, Μ. V. S. and Rinehart, K. L. J. Am. Chem. Soc., 1996, 118,9017-9023.

Martinez, E. J., Owa, T., Schreiber, S. L. and Corey, E. J. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3496-3501.

Japanese Kokai JP-A2 59/225 189.

Japanese Kokai JP-A2 60/084 288.

Arai, T., Kubo, A. In The Alkaloids, Chemistry and Pharmacology, Brossi, A. Ed., Academie: New York, 1983, Vol 21, pp. 56-110.

-132CZ 304966 B6

Remers, W. A., In The Chemistry of Antitumor Antibiotics, Vol. 2, Wiley, New York, 1988, pp. 93-118.

Gulavita, Ν. K., Scheuer, P. J., Desilva E. D. Abst. Indo-United States Symp. on Bioactive Compounds from Marině Organisms, Goa, India, Feb. 23-27, 1989, p. 28.

Arai, T,. Takahashi, K., Kubo, A., J Antibiot., 1977, 30, 1015-1018.

Arai, T., Takahashi, K., Nakahara, S., Kubo, A., Experientia, 1980, 36, 1025-1028.

Mikami, Y., Takahashi, K., Yazawa, K., Hour-Young, C., Arai, T., Saito, N., Kubo, A., J. Antibiot., 1988,41,734-740.

Arai, T., Takahashi K., Ishiguro, K., Yazawa, K., J. Antibiot., 1980, 33, 951-960.

Yazawa, K., Takahashi, K., Mikami, Y., Arai, T., Saito, N., Kubo, A., J. Antibiot., 1986, 39, 1639-1650.

Arai, T., Yazawa, K., Takahashi, K., Maeda, A., Mikami, Y., Antinicrob. Agent Chemother. 1985,28, 5-11.

Takahashi, K., Yazawa, K., Kishi, K., Mikami, Y., Arai, T., Kubo, A., J. Antibiot., 1982, 35, 196-201.

Yazawa, K., Asaoka, T., Takahashi, K., Mikami, Y., Arai, T., J. Antibiot., 1982, 35, 915-917. Frincke, J. M., Faulkner, D. J., J. Am. Chem. Soc., 1982, 104, 265-269.

He, H.-Y., Faulkner, D. J., J. Org. Chem., 1989, 54, 5822-5824.

Kubo, A., Saito, N., Kitahara, Y., Takahashi, K., Tazawa, K., Arai, T., Chem. Pharm. Bull., 1987, 35, 440-442.

Trowitzsch-kienast, W., Irschik, H., Reichenback, H., Wray, V., Hófle, G., Liebigs Ann. Chem., 1988, 475—181.

Ikeda, Y., Idemoto, H., Hirayama, F., Yamamoto, K., Iwao, K., Asano, T., Munakata, T., J. Antibiot., 1983,36, 1279-1283.

Asaoka, T., Yazawa, K., Mikami, Y., Arai, T., Takahashi, K., J. Antibiot., 1982, 35, 1708-1710.

Lown, J. W., Hanstock, C. C., Joshua, A. V., Arai, T., Takahashi, K., J. Antibiot., 1983, 36, 1184-1194.

Munakata etal., United States Patent 4 400 752, 1984.

Y. Ikeda et al., the Joumal of Antibiotics., VOL XXXVI, N° 10, 1284, 1983.

Cooper, R., Unger, S., The Joumal of Antibiotics. VOL XXXVIII, N° 1, 1985.

Corey et al., United States Patent 5 721 362,1998.

Corey et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 118, pp. 9202-92034, 1996.

Proč. Nati. acad. Sci., USA, Vol. 96, pp. 3496-3501, 1999.

Průmyslová využitelnost

Sloučeniny tohoto vynálezu se používají pro výrobu farmaceutických prostředků, které se používají při léčbě karcinomů jako je leukémie, rakovina plic, rakovina tlustého střeva, rakovina ledvin a melanom.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   5 1. Způsob výroby ecteinascidinové sloučeniny, vyznačující se tím, že obě chránicí skupiny ze sloučeniny A (A), ío kde Prot^NH je amin chránicí skupina, kde Prot^OH je hydroxyl chránicí skupina.

   se odstraní v jediném kroku za vzniku sloučeniny α-aminolaktonu vzorce 35
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Prot^NH je t-butyloxykarbonyl a 20 Prot^OH je methoxymethyl.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Prot^NI1 je t-butyloxykarbonyl a Prot^OH je methoxyethoxymethyl.

   25
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje další krok oxidace aaminolaktonu vzorce (35)

   - 134CZ 304966 B6 (35) transaminací na odpovídající α-ketolakton vzorce 36 (36)
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že zahrnuje podrobení a-keto laktonu vzorce 36 (36)

   Pictet-Spenglerové reakci za přítomnosti aminu vzorce za stereospecifického vytvoření spirotetrahydroisochinolinové sloučeniny Et770

   - 135 CZ 304966 B6 (Et770)
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že zahrnuje další krok nahrazení nitrilu na C-21 u sloučeniny Et770 (Et743)
7. 7, Způsob výroby ecteinascidinové sloučeniny, vyznačující se tím, že se při kroku způsobu oxiduje α-aminolakton vzorce 35

   - 136CZ 304966 B6
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že zahrnuje podrobení a ketolaktonu vzorce 36

   Pictet-Spenglerové reakci za přítomnosti aminu vzorce za stereospecifického vytvoření spirotetrahydroisochinolinové sloučeniny Et770

   - 137CZ 304966 B6 <Et770)
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že zahrnuje další krok nahrazení nitrilu na C-21 u sloučeniny Et770 (Et743)
10. 10. Způsob výroby ecteinascidinové sloučeniny, vyznačující se tím, že se při kroku způsobu podrobí α-ketolakton vzorce 36 .η».

    (36)

    Pictet-Spenglerové reakci za přítomnosti aminu vzorce za stereospecifického vytvoření spirotetrahydroisochinolinové sloučeniny Et770

    HO,

    MeO* <Et770)
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že zahrnuje další krok nahrazení nitrilu na C-21 u sloučeniny Et770 (Et770) hydroxylem za vzniku Et743

    - 139CZ 304966 B6 jako meziprodukt způsobu podle nároků 1, 4 a 7.
12. 13. α-Ketolakton vzorce 36 (36), jako meziprodukt způsobu podle nároků 4, 5, 7, 8 a 10.

    Konec dokumentu