CZ296341B6

CZ296341B6 - Prostredek pro zajistení prodlouzené insulinotropní úcinnosti

Info

Publication number: CZ296341B6
Application number: CZ0027594A
Authority: CZ
Inventors: Edward Danley@Dennis; Alan Gelfand@Robert; Francis Geoghegan@Kieran; Kim@Yesook; Joseph Lambert@William; Qi@Hong
Original assignee: Scios Inc.
Priority date: 1993-04-07
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 2006-02-15
Also published as: BR9401185A; CA2116478A1; AU682328B2; HU225496B1; HU9400350D0; AU5501694A; DE69434588D1; IL108611A0; ZA94878B; CN1544084A; JP2006213727A; JP2010006841A; CN1311865C; EP0619322B1; JP5081213B2; ATE314393T1; NO940436D0; HUT68525A; JPH072695A; HK1070589A1

Abstract

Prostredek pro zajistení prodlouzené insulinotropní úcinnosti obsahuje polypeptid vzorce Z-H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-I-A-W-L-V-X, ve kterém Z a X mají význam vysvetlený v popise, pricemz tento polypeptid má rozpustnost rovnou nebo mensí nez 500 .mi.g/ml za fyziologických podmínek a prostredek poskytuje pacientovi, kterému je podáván, koncentrace uvedeného polypaptidu, které dostacují ke zvýsení úcinku insulinu v casovém intervalu nezbytném pro dosazení trvalé glykemické kontroly diabetes mellitus nezávislého na insulinu.

Description

Prostředek pro zajištění prodloužené insulinotropní účinnosti

Oblast techniky

Tento vynález se týká prostředků pro zajištění prodloužené insulinotropní účinnosti, založených na peptidu 1 typu glukagonu (glucagon-like peptide 1, GLP-1) a jeho derivátech. Tyto prostředky jsou vhodné pro léčbu diabetes mellitus nezávislého na insulinu (Non-Insulin Dependent Diabetes mellitus, NIDDM).

Dosavadní stav techniky

Sekvence aminokyselin GLP-1 je známa jako

His-ASP-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-GlyArg-Gly (id. č. sekvence: 1)

GLP-1 popsal Lopez, L.C. a kol., P.N.A.S., USA 80, 5485 až 5489 (1963), Bell, G.I. a kol. Nátuře 302, 716 až 718 (1983), Heindrich, G. a kol., Endocrinol. 115, 2176 až 2181 (1984) a Ghiglione, M. a kol., Diabetologia 27, 599 až 600 (1984).

Během zpracování ve slinivce a ve střevě přechází GLP-1 na 31-aminokyselinový peptid s aminokyselinami 7-37 peptid GLP-1, který se zde označuje jako GLP-1 (7-37).

Ukázalo se, že tento peptid má insulinotropní účinnost, tzn. je schopen stimulovat nebo vyvolávat stimulaci syntézy nebo exprese hormonu insulinu. Pro tuto svou insulinotropní účinnost se GLP-1 (7-37) také označuje jako insulinotropin.

Peptid GLP-1 (37) má tuto sekvenci aminokyselin:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 2)

Peptid GLP-1 (7-37), některé jeho deriváty a jeho použití k léčbě diabetes mellitus u savců je popsáno v patentech US 5 118 666 (dále patent '666) a US 5 120 712 (dále patent '712). Deriváty GLP-l(7-37), popsané v patentech '666 a '712, zahrnují polypeptidy, které obsahují nebo neobsahují jednu nebo více aminokyselin, které nemusejí být přítomny v přirozeně se vyskytující sekvenci. Další deriváty GLP-1 (7-37), popsané v patentech '666 a '712, zahrnují určité C-koncové soli, estery a amidy, přičemž soli a estery jsou definovány jako OM, kde M je farmaceuticky přijatelný kation nebo nižší (C]-C₆) rozvětvená nebo nerozvětvená alkylová skupina, a amidy jsou definovány jako -NR²R³, kde R² a R³ jsou stejné nebo různé substituenty, zvolené ze skupiny zahrnující vodík a nižší (C]-C₆) rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu.

Některé další polypeptidy, označované jako zkrácený GLP-1 nebo zkrácený insulinotropin, které mají insulinotropní účinnost, a jejich deriváty jsou popsány v patentové přihlášce

PCT/US89/01121 (WO 90/11296). Tyto polypeptidy, zde označované jako GLP-l(7-36), GLP1(7-35) a GLP-l(7-34), mají tyto sekvence aminokyseliny:

-1 CZ 296341 B6

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-AIa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id. č. sekvence: 4)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id č. sekvence: 5)

Deriváty polypeptidů, popsané vPCT/US89/01121, zahrnují polypeptidy s nevýznamnými náhradami aminokyselin nebo s přidanými aminokyselinami k usnadnění kondenzace s nosnou bílkovinou nebo zvýšení insulinotropního účinku. Další deriváty insulinotropinu, popsané vPCT/US89/01121, zahrnují určité C-koncové soli, estery a amidy, přičemž soli a estery jsou definovány jako OM, kde M je farmaceuticky přijatelný kation nebo nižší rozvětvená nebo nerozvětvená alkylová skupina, a amidy jsou definovány jako -NR²R³, kde R² a R³ jsou stejné nebo různé substituenty, zvolené ze skupiny zahrnující vodík a nižší rozvětvenou nebo nerozvětvenou alkylovou skupinu.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je prostředek pro zajištění prodloužené insulinotropní účinnosti, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje polypeptid obecného vzorce

Z-H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-I-A-W-L-V-X ve kterém

Z nepředstavuje žádný zbytek nebo znamená H-D-E-F-E-R- a

X je vybrán ze souboru sestávající z K, K-G, K-G-R a K-G-R-G, kde polypeptid má rozpustnost rovnou nebo menší než 500 pg/ml za fyziologických podmínek a tento prostředek poskytuje pacientovi, kterému je podáván, koncentrace uvedeného polypeptidu, které dostačují ke zvýšení účinku insulinu v časovém intervalu nezbytném pro dosažení trvalé glykemické kontroly diabetes mellitus nezávislého na insulinu.

Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v prostředku, ve kterém polypeptid je v krystalické nebo amorfní formě.

Další výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v prostředku, ve kterém polypeptidem je farmaceuticky přijatelná adiční sůl tohoto peptidu s kyselinou, peptidem je farmaceuticky přijatelná karboxylátová sůl tohoto peptidu, peptidem je farmaceuticky přijatelná adiční sůl tohoto peptidu s alkálií, peptidem je farmaceuticky přijatelný nižší alkylester tohoto peptidu či peptidem je farmaceuticky přijatelný amid tohoto peptidu, přičemž farmaceuticky přijatelný amid je vybrán ze souboru zahrnujícího amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid.

-2CZ 296341 B6

Další provedení tohoto vynálezu spočívá v prostředku, který je formulován pro subkutánní, intramuskulární, transdermální podání, podání orální inhalací, nasální inhalací nebo pro gastrointestmální podání.

Podle jiného výhodného provedení tohoto vynálezu prostředek že dále obsahuje polymer zvolený ze souboru zahrnujícího polyethylenglykol, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol, kopolymery polyoxyethylenu s polyoxypropylenem, polysacharidy zvolené ze souboru zahrnujícího celulózu, deriváty celulózy, chitosan, arabskou gumu, gumu karaya, guarovou gumu, xanthanovou gumu, tragant, kyselinu alginovou, karagenan, agarózu a furcellarany, dextran, škrob, deriváty škrobu, kyselinu hyaluronovou, polyestery, polyamidy, polyanhydridy a polyortho-estery.

Podle ještě jiného výhodného provedení tohoto vynálezu prostředek dále obsahuje farmaceuticky přijatelnou s vodou nemísitelnou olejovou suspenzi, kde uvedený olej je zvolen ze souboru zahrnujícího podzemnicový olej, sezamový olej, mandlový olej, ricinový olej, kameliový olej, olej z bavlníkových semen, olivový olej, kukuřičný olej, sojový olej, saflorový olej, kokosový olej, estery mastných kyselin a estery alifatických alkoholů.

Podle rovněž výhodného provedení tohoto vynálezu prostředek dále obsahuje smáčedlo, kterým je neionogenní povrchově aktivní látka, nebo dále obsahuje suspendační činidlo.

Podle ještě jiného výhodného provedení prostředek dále obsahuje kov zvolený ze souboru zahrnujícího dvojmocný zinek Zn(II), dvojmocný nikl Ni(II), dvojmocný kobalt Co (Π), dvojmocný hořčík mg (II), dvojmocný vápník Ca (Π), jednomocný draslík K(I), dvojmocný mangan Μη (Π), dvojmocné železo Fe (II) a dvojmocnou měď Cu(II).

Výhodné provedení tohoto vynálezu představuje též prostředek, kterým je vodná suspenze schopná prodloužené glykemické kontroly.

Podle taktéž výhodného provedení tohoto vynálezu prostředek dále obsahuje fenolickou sloučeninu, která je vybrána ze souboru zahrnujícího fenol, kresol, resorcinol a methylparaben.

Výhodné provedení tohoto vynálezu také spočívá v prostředku, ve kterém uvedená sůl je zvolena ze souboru zahrnujícího síran amonný, síran sodný, síran lithný, chlorid lithný, citrát sodný, citrát amonný, fosforečnan sodný, fosforečnan draselný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid amonný, acetát sodný, acetát amonný, síran hořečnatý, chlorid vápenatý, dusičnan amonný a formiát sodný a jejich kombinace.

Dále se detailněji popisují výhodná provedení a také aplikační možnosti tohoto vynálezu v širších souvislostech.

Předmětný vynález poskytuje široké možnosti léčby diabetes mellitus.

Jedno provedení způsobu léčby diabetes mellitus, nezávislého na insulinu, u napadeného savce spočívá v dlouhodobě opakovaném podávání sloučeniny s prodlouženým působením po každém podání, nutným k trvalé glykemické kontrole uvedené savce, kde sloučenina je zvolena ze skupiny zahrnující

a) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id č. sekvence: 2),

-3CZ 296341 B6

b) peptid se sekvenci aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-V al-X (id č. sekvence: 7), kde X je zvoleno ze skupiny zahrnující (A) Lys, (B) Lys-Glya (C) Lys-Gly-Arg,

c) derivát polypeptidů zahrnující primární strukturu

H₂N-W-COOH kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (idč. sekvence: l)a

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Glu-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id č. sekvence: 6), přičemž tento derivát po zpracování v organismu sekvence přechází na derivát polypeptidů s insulinotropní účinností,

d) derivát polypeptidů zahrnující primární strukturu

H₂N-R-COOH kde R je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Aa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 2),

His-Aa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3)

His-Aa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id č. sekvence: 4) a

-4(JZ ZV0J41 B6

His-Aa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5, a

e) derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto derivátů s alkálii, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid.

Výhodný je způsob, kdy se uvedené podávání provádí subkutánně.

Výhodný je rovněž způsob, kdy podávání je intramuskulární.

Výhodný je také způsob, kdy podávání je transdermální.

Zvlášť výhodný je způsob, kdy podávání se koná infuzní pumpou.

Dále je výhodný způsob, kdy podávání je orální inhalací.

Dále je výhodný způsob, kdy podávání je nasální inhalací.

Dále je výhodný způsob, kdy podávání je gastrintestinální.

V dalším provedení je vynález zaměřen na prostředek zahrnující (i) sloučeninu zvolenou ze skupiny zahrnující

a) peptid se sekvencí aminokyselin

b) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Aa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-V al-X (id. č. sekvence: 7)

-5CZ 296341 B6 kde X je zvoleno ze skupiny zahrnující (A) Lys, (B) Lys-Gly a (C) Lys-Gly-Arg,

c) derivát polypeptidů zahrnující primární struktury

H₂N-W-COOH kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-GIu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 1) a

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 6), přičemž tento derivát po zpracování v organismu savce přechází na derivát polypeptidů s insulinotropní účinností,

d) derivát polypeptidů zahrnující primární strukturu

H₂N-R-COOH, kde R je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-He-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 2),

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id. č. sekvence: 4) a

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id č. sekvence: 5), a

-6derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a (ii) polymer, schopný prodlužovat působení uvedené sloučeniny k dosažení trvalé glykemické kontroly.

Zvlášť výhodný je prostředek, kde polymer má nízkou molekulovou hmotnost.

Dále je zvlášť výhodný prostředek, kde polymer je zvolen ze skupiny zahrnující polyethylenglykol, polyvinylpyrrolidon, polyvinyalkohol, kopolymery polyoxyethylen-polyoxypropylen, polysacharidy, zvolené ze skupiny zahrnující celulózu, deriváty celulózy, chitosan, arabskou gumu, gumu karaya, guarovou gumu, xanthanovou gumu, tragantovou gumu, kyselinu alginovou, karagenan, agarózu, dále furcellarany, dextran, škrob, deriváty škrobu, kyselinu hyaluronovou, polyestery, polyamidy, polyanhydridy a polyorthoestery, přičemž zvlášť výhodné polymery jsou zvoleny ze skupiny zahrnující polyethylenglykol a polyvinylpyrrolidon.

a) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 2),

b) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-V al-X (id. č. sekvence: 7), kde X je zvoleno ze skupiny zahrnující (A) Lys, (B) Lys-Glya (C) Lys-Gly-Arg,

c) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-W-COOH kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 1) a

d) derivát polypeptidů zahrnující primární strukturu

H₂N-R-COOH kde R je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Iie-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5), a derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a

-8CZ ZV0J41 £50 (ii) farmaceuticky přijatelnou s vodou nemísitelnou olejovou suspenzi, umožňující prodloužené podávání uvedené sloučeniny.

Zvlášť výhodný je prostředek, kdy uvedený olej je zvolen ze skupiny zahrnující podzemnicový olej, sezamový olej, mandlový olej, ricinový olej, kameliový olej, olej z bavlníkových semen, olivový olej, kukuřičný olej, sojový olej, saflorový olej, kokosový olej, estery mastných kyselin a estery mastných alkoholů.

Dále je zvlášť výhodný prostředek, dále zahrnující smáčedlo, zejména neinogenní povrchově aktivní látku.

Dále je zvlášť výhodný prostředek, dále zahrnující látku k podpoře suspenze.

a) peptid se sekvencí aminokyselin

b) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (id. č. sekvence: 7), kde X je zvoleno ze skupiny zahrnující (A) Lys, (B) Lys-Glya (C) Lys-Gly-Arg,

c) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-W-COOH kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-GlyArg-Gly (id. č. sekvence: 1) a

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 6),

-9CZ 296341 B6 přičemž tento derivát po zpracování v organismu savce přechází na derivát polypeptidu s insulinotropní účinností,

d) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-R-COOH kde R je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-GIy-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-AIa-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence. 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5), deriváty uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a (ii) dvojmocný zinek Ζη(Π) v komplexu s peptidem.

Výhodný je prostředek, schopný trvalého glykemického působení.

Zvlášť výhodný je prostředek, kde zinečnatý produkt je amorfní.

-10CZ Z9&341 B6

V ještě dalším provedení je vynález zaměřen na prostředek zahrnující (i) sloučeninu zvolenou ze skupiny zahrnující

a) peptid se sekvencí aminokyselin

b) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (id. č. sekvence. 7), kde Xje zvoleno ze skupiny zahrnující (A) Lys, (B) Lys-Glya (C) Lys-Gly-Arg,

c) derivát polypeptidů zahrnující primární strukturu

H₂N-W-COOH kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 6), přičemž tento derivát po zpracování v organismu savce přechází na derivát polypeptidů s insulinotropní účinností,

d) derivát polypeptidů zahrnující primární strukturu

H2N-R-COOH

-11 CZ 296341 B6 kde R je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Alar-AlarLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5), a derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a (ii) kov zvolený ze skupiny zahrnující dvojmocný nikl Ni (II), dvojmocný kobalt Co (II), dvojmocný hořčík mg(II), dvojmocný vápník Ca (Hjjednomocný draslík K(I), dvojmocný mangan Mn(II), dvojmocné železo Fe(II) a dvojmocnou měď Cu (II).

a) peptid se sekvencí aminoskupin

-12CZ 290341 Β6

b) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (id. č. sekvence: 7), kde X ze zvoleno ze skupiny zahrnující (A) Lys, (B) Lys-Glya (C) Lys-Gly-Arg,

c) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-W-COOH kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser~SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 6), přičemž tento derivát po zpracování v organismu savce přechází na derivát polypeptidu s insulinotropní účinností,

d) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-R-COOH kde R je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser—Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-T rp-Leu-V al-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 2),

-13 CZ 296341 B6

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5), a derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a (ii) bazický polypeptid, přičemž uvedený prostředek je vodná suspenze, schopná trvalé glykemické kontroly.

Zvlášť výhodný je prostředek, kde bazickým polypeptidem je protamin.

a) peptid se sekvencí aminokyselin

b) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-V al-X (id. č. sekvence: 7), kde X je zvoleno ze skupiny zahrnující (A) Lys, (B) Lys-Gly a (C) Lys-Gly-Arg,

c) derivát polypeptidů zahrnující primární struktur

H₂N-W-COOH

- 14CZ Z9Ů341 tíĎ kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerT yr-Leu-Glu-Gly-Gly-Gln-Ala-Ala-Ly s-Glu-Phe-Ile-Ala-T rp-Leu-V al-Ly s-GlyArg-Gly (id. č. sekvence: 1) a

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerT yr-Leu-Glu-Gly-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-T rp-Leu-V al-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 7), přičemž tento derivát po zpracování v organismu savce přechází na derivát polypeptidu s insulinotropní účinností,

d) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-R-COOH kde R je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. c. sekvence: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys~Gly (id. č. sekvence: 4) a

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence 5), derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a

-15CZ 296341 B6 (ii) fenolickou sloučeninu, přičemž uvedený prostředek je vodná suspenze, schopná trvalé glykemické kontroly.

Zvlášť výhodný je prostředek, kde uvedená fenolická sloučenina je zvolena ze skupiny zahrnující fenol, kresol, resorcinol a methylparaben.

V ještě dalším provedení je vynález zaměřen na prostředek zahrnující (i) sloučeninu zvolenou ze skupiny zahrnující a) peptid se sekvencí aminokyselin

a) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln~Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 2),

b) peptid se sekvencí aminokyselin

c) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-W-COOH kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 6), přičemž tento derivát po zpracování v organismu savce přechází na derivát polypeptidu s insulinotropní účinností,

d) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-R-COOH

-16CZ. tso kde R je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 2), His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5), a derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptid, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a (ii) bazický polypeptid a fenolickou sloučeninu, přičemž uvedený prostředek je vodná suspenze, schopná trvalé glykemické kontroly.

a) peptid se sekvencí aminokyselin

-17CZ 296341 B6

b) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-T rp-Leu-V al-X (id. č. sekvence: 7), kde X je zvoleno ze skupiny zahrnující (A) Lys, (B) Lys-Gly a (C) Lys-Gly-Arg,

c) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-W-COOH kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-SerTyr-Leu-Glu-Gly-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Tip-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 6), přičemž tento derivát po zpracování v organismu savce přechází na derivát polypeptidu s insulinotropní účinností,

d) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H2N-R-COOH kde R je sekvence aminokyselin, zvolené ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (id. č. sekvence: 3),

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala~AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (id. č. sekvence: 4), a

-18ΌΔ ZVOJ41 t5O

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5), derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a (ii) bazický polypeptid, fenolickou sloučeninu a kovový ion, přičemž uvedený prostředek je vodná suspenze, schopná trvalé glykemické kontroly.

Výhodný je prostředek, kde uvedeným bazickým polypeptidem je protamin.

Rovněž výhodný je prostředek, kde uvedeným kovovým iontem je zinek.

a) peptid se sekvencí aminokyselin

b) peptid se sekvencí aminokyselin

c) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-W-COOH

-19CZ 296341 B6 kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

d) derivát polypeptidů zahrnující primární strukturu h₂n-r-cooh kde R je sekvence aminokyselin, zvolené ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-T rp-Leu-V al-Lys (id. č. sekvence: 5), a derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a

-20CZ. ZV0J41 tso (ii) přičemž uvedené peptidy a jejich deriváty byly podrobeny podmínkám vedoucím ke vzniku amorfního nebo krystalického stavu.

Výhodný je prostředek, kde uvedenými podmínkami jsou vysoké smykové napětí, působení solí nebo jejich kombinace.

Zvlášť výhodný je prostředek, kde uvedená sůl je zvolena ze skupiny zahrnující síran amonný, síran sodný, síran lithný, chlorid lithný, citrát sodný, citrát amonný, fosforečnan sodný, fosforečnan draselný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid amonný, acetát sodný, acetát amonný, síran hořečnatý, chlorid vápenatý, dusičnan amonný a formiát sodný a jejich kombinace.

a) peptid se sekvencí aminokyselin

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLy s-Glu-Phe-Ile-Ala-T rp-Leu-V al-Lys-Gly-Arg-Gly (id. č. sekvence: 2),

b) peptid se sekvencí aminokyselin

c) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-W-COOH kde W je sekvence aminokyselin, zvolená ze skupiny zahrnující

-21 CZ 296341 B6 přičemž tento derivát po zpracování v organismu savce přechází na derivát polypeptidu s insulinotropní účinností,

d) derivát polypeptidu zahrnující primární strukturu

H₂N-R-COOH kde R je sekvence aminokyselin, zvolené ze skupiny zahrnující

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-AlaLys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (id. č. sekvence: 5), a derivát uvedených peptidů (a) až (d), zvolený ze skupiny zahrnující (1) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s kyselinou, (2) farmaceuticky přijatelnou karboxylátovou sůl těchto peptidů, (3) farmaceuticky přijatelnou adiční sůl těchto peptidů s alkálií, (4) farmaceuticky přijatelný nižší alkylester těchto peptidů a (5) farmaceuticky přijatelný amid těchto peptidů, zvolený ze skupiny zahrnující amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid, a (ii) systém uvolňování liposomů.

Zvlášť výhodný je prostředek, kde uvedený liposom je na bázi fosfolipidu.

Rovněž zvlášť výhodný je prostředek, kde uvedený liposom není na bázi fosfolipidu.

Léčba diabetes mellitus, nezávislého na insulinu, je založeno na prodlouženém podávání prostředku podle tohoto vynálezu.

Není-li uvedeno jinak, zde užívaný výraz „derivát“ zahrnuje, aniž by se na ně omezoval, polypeptidy obsahující znázorněnou primární strukturu, kde na C-konci je zahrnuta jedna nebo více L-aminokyselin; kde C-koncová karboxylová skupina tvoří ester s (C|-C₆) přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinou; kde C-koncová karboxylová skupina tvoří karboxamid nebo

-22CZ Z90J41 Β6 substituovaný karboxamid; kde kyselé aminokyselinové zbytky (Asp a/nebo Glu) tvoří ester nebo karboxamid; a jejich kombinace.

Do rozsahu vynálezu spadají svrchu popsané polypeptidy, tedy také polypeptidy vykazující homologii dostatečnou k zachování insulinotropní účinnosti těchto polypeptidů, jakož i varianty výše popsaných polypeptidů, zahrnující nevýznamné náhrady aminokyselin a mající insulinotropní účinnost.

Peptid GLP-1 (7-37), jeho izolace, charakterizace a použití k léčbě diabetes mellitus je popsáno v patentech US 5 118 666 a 5 120 712.

V souvislosti s vynálezem bylo nyní zjištěno, že k dosažení trvalé glykemické kontroly pacientů s diabetes mellitus, nezávislým na insulinu, je během jídla a po něm nutné prodloužené zvýšení GLP-1 a příbuzných polypeptidů v plazmě. Překvapivě bylo zjištěno, že zvýšení GLP-1 a příbuzných peptidů pouze kolem doby jídla, i po dobu až jedné hodiny, neumožňuje adekvátní kontrolu hladiny glukózy. Podávání GLP-1 a příbuzných peptidů tedy vyžaduje systém prodlouženého uvolňování. Tento systém prodlouženého uvolňování vede ke zvýšení účinku insulinu.

Zde využívaný výraz „zvýšení činku insulinu“ zahrnuje, aniž by se na ně omezoval, tato působení: zvýšení syntézy insulinu, zvýšení sekrece insulinu, zvýšení odběru glukózy ve svalech a v tuku a snížení produkce glukózy v játrech.

Polypeptidy podle vynálezu se připravují různými známými způsoby. Například je možno použít automatických syntetizátorů peptidů, jako je syntetizátor peptidů v pevné fázi Applied Biosystems (ABI) 430A. Rovněž je možno použít technologii rekombinace DNA, kde se sekvence DNA, kódující polypeptid, operativně naváže na expresní vektor a použije k transformaci vhodné hostitelské buňky. Transformovaná hostitelská buňka se pak kultivuje za podmínek, za nichž dochází k expresi polypeptidů. Polypeptid se pak z kultury izoluje. Dále je možno použít kombinaci syntézy a technologie rekombinace DNA k výrobě amidických a esterových derivátů podle vynálezu a/nebo k produkci fragmentů požadovaného polypeptidů, které se pak spojují metodami, odborníkům známými.

Deriváty polypeptidů podle vynálezu se připravují metodami, odborníkům známými. Například C-koncové alkylesterové deriváty polypeptidů podle vynálezu se připravují reakcí požadovaného (C]-C₆)alkanolu s požadovaným polypeptidem v přítomnosti katalytické kyseliny, kde je HC1. Vhodné reakční podmínky pro tuto tvorbu alkylesteru zahrnují reakční teplotu asi 50 °C a reakční dobu asi 1 h až asi 3 h. Podobně je možno získávat deriváty polypeptidů podle vynálezu, zahrnující (C]-C₆)alkylestery zbytků ASP a/nebo Glu uvnitř polypeptidů.

Karboxamidové deriváty polypeptidů podle vynálezu se rovněž připravují metodami syntézy v pevné fázi, známými odborníků. Viz například „Solid Phase Peptide Synthesis“, Stewart, J. M. et al., Pierce Chem. Co. Press, 1984.

Alternativně nebo v kombinaci s výše uvedenými metodami je možno deriváty polypeptidů podle vynálezu připravoval modifikací sekvence DNA, kódující takový polypeptid, přičemž se zbytek bazické aminokyseliny nahradí zbytkem jiné bazické aminokyseliny nebo zbytkem kyselé nebo neutrální aminokyseliny, nebo se zbytek kyselé aminokyseliny nahradí zbytkem jiné kyselé aminokyseliny nebo zbytkem bazické nebo neutrální aminokyseliny, nebo se zbytek neutrální aminokyseliny nahradí zbytkem jiné neutrální aminokyseliny nebo zbytkem kyselé nebo bazické aminokyseliny. Takové změny primární sekvence polypeptidů je možno provést také přímou syntézou derivátu. Tyto metody jsou odborníkům známé. Takové deriváty, aby mohly být použity k provádění vynálezu, však musejí samozřejmě mít insulinotropní účinek.

Insulinotropní účinnost derivátu polypeptidů podle vynálezu se zjišťuje tímto způsobem:

-23CZ 296341 B6

Z pankreatické tkáně normálních krys se izolují pankreatické ostrůvky modifikací metody podle Lacyho, P.E. et al., Diabetes 16, 35-39 (1967), přičemž se kolagenázový výluh pankreatické tkáně dělí na Ficollově gradientu (27 %, 23 %, 20,5 % a 11 % v Hankově rovnovážném solném roztoku, pH 7,4). Ostrůvky se odebírají z rozhraní 20,5%/ll%, promyjí se a pod stereomikroskopem ručně sesbírají tak, by neobsahovaly exokrinní a jinou tkáň. Ostrůvky se inkubují přes noc v médiu RPMI 1640, doplněném 10 % fetálního bovinního síra a obsahujícím 11 mM glukózy, při 37 °C a se směsí 95 % vzduch/5 % CO₂. Pak se ostrůvky přenesou do média RPMI 1640, doplněného 10% fetálního bovinního séra a obsahujícího 5,6 mM glukózy, a inkubují 60 min, 37 °C, 95 % vzduchu/5 % CO₂. Studovaný derivát polypeptidu se připraví v koncentracích 1 nM a lOnM v médiu RPMI, obsahujícím 10% fetálního bovinního séra a 16,7 mM glukózy. Asi 8 až 10 izolovaných ostrůvků se pak přenesou pipetou do celkového objemu 250 μΐ média, obsahujícího derivát polypeptidu na 96jamkových mikrotitračních plotnách. Ostrůvky se inkubují v přítomnosti derivátu polypeptidu po dobu 90 min při 37 °C, 95 % vzduchu/5 % CO₂. Pak se odeberou alikvotní díly média bez ostrůvků a v objemu 100 μΐ se radioimunoanalýzou pomocí soustavy Equater Insulin RIA (Binax, Inc., Portland, ME) zjišťuje množství přítomného insulinu.

Dávky účinné pro léčbu při náběhu diabetů dospělých se pohybují od asi 1 pg/kg do 1000 pg/kg za den, podává-li se polypeptid podle vynálezu, například intravenózně, intramuskulámě nebo subkutánně. Výhodná dávka pro intravenózní infuze během jídel a mezi jídly je asi 4 až 10 ng/kg/min nebo asi 0,6 až 1,4 pg/den, vztaženo na lOOkg pacienta. Je však nutno zdůraznit, že dávky mimo toto rozmezí jsou rovněž možné a jsou rovněž vrozsahu vynálezu. Odpovídající dávka, jejíž určení je v kompetenci ošetřujícího lékaře, je důsledkem intenzity chorobného stavu a dále odpovědi organismu na podávaný derivát, věku, hmotnosti, pohlaví a léčebné historie pacienta.

Prodlouženého podávání je možno dosáhnout subkutánní, intramuskulámí nebo transdermální cestou, orální inhalací, nasální inhalací, gastrointestinální cestou nebo pomocí infuzní pumpy.

Prodloužené podávání GLP-1 a příbuzných peptidů je možno rovněž provádět formulací do formy roztoku v různých vodorozpustných polymerech. Tyto polymery mají obecně nízkou molekulovou hmotnost (< 15 kDa). Jako neomezující příklady takovýchto polymerů s nízko molekulovou hmotností je možno uvést polyethylenglykol, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol a kopolymery polyoxyethylen-polyoxypropylen. Je možno použít i polymery o vyšší molekulové hmotnosti. Jako jejich neomezující příklady je možno uvést polysacharidy, jako je celulóza a její deriváty, chitosan, arabská guma, karayová guma, guarová guma, xanthanová guma, tragant, kyselina alginová, karagenan, agaróza, furcelleran. V posledně uvedeném případě jsou výhodné polymery, které jsou degradovány in vivo buď enzymaticky, nebo hydrolýzou, například dextran; škrob a jeho deriváty, kyselina hyaluronová, polyestery, polyamidy, polyanhydridy a polyorthoestery. Akumulaci tkáně, spojené s biologicky nedegradovatelnými vysokomolekuíárními polymery, se zabraňuje použitím nízkomolekulámích polymerů nebo biodegradabilních polymerů. Formulace typicky obsahují GLP-1 nebo příbuzné peptidy v množství přibližně 1 mg/ml, přičemž koncentrace závisí na polymeru, avšak nejčastěji v koncentracích až do hodnot, umožňujících dosažení viskozity 50 cps, a dále popřípadě vhodný pufr, tonizační prostředek a konzervační prostředek. Údaje pro krysy a člověka in vivo demonstrují, že tyto formulace jsou schopny vyvolávat po až 24 h v krvi měřitelný insulinotropin. Naproti tomu například insulinotropin formulovaný ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem vyvolává rychlé (»15 min) píky hodnot v plazmě s poklesem pod mez detekce již po 4 h. Graf koncentrace v plazmě v závislosti na čase ukazuje, že rychlost absorpce insulinotropinu například z místa injekce se v přítomnosti polymerů významně snížila.

GLP-1 a příbuzné peptidy mohou být rovněž formulovány jako částice suspendované ve farmaceuticky přijatelném oleji. Výhodnými oleji jsou triglyceridy. Jako jejich neomezující příklady je možno uvést podzemnicový olej, sezamový olej, mandlový olej, ricinový olej, kameliový olej, bavlníkový olej, olivový olej, kukuřičný olej, sojový olej, saflorový olej a kokosový olej. Jsou

-24CZ ZV0P41 B6 přijatelné i oleje jiného typu, například estery mastných kyselin a estery mastných alkoholů, pokud je olej mísitelný s vodou a je špatným rozpouštědlem pro peptid. Formulace může dále obsahovat vhodné konzervační přísady, smáčedla a prostředky podporující suspenzi. Hmotnostní procentický podíl insulinotropinu ve formulaci se může například pohybovat od 0,01 do 10%. Údaje pro krysy in vivo ukazují, že tyto formulace jsou schopny dosahovat měřitelných hodnot insulinotropinu v krvi například až po dobu 24 h. Naproti tomu například insulinotropin formulovaný ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem vyvolává rychlé 15 min) píky hodnot v plazmě s poklesem pod mez detekce již po 4 h. Graf koncentrace v plazmě v závislosti na čase ukazuje, že rychlost absorpce insulinotropinu z místa injekce se v olejových suspenzích významně snížila.

GLP-1 a příbuzné peptidy mohou být také formulovány v nízkorozpustné formě pro podávání v kombinaci s kovovým iontem, přednostně ve formě soli. Výhodným iontem je zinek (II). Touto kombinací vzniká amorfní nebo krystalická kompozice. Je možno použít i další kovové ionty, zahrnující Ni(II), Co(II), mg(U), Ca(U), K(I), Mn(II), Fe(II) a Cu(II).

Další formy prodlouženého dávkování zahrnují liposomy, bud’ multilamelámí, nebo unilamelámí, jejichž příprava je odborníkům známá. Liposomy, ať multilamelámí nebo unilamelární, mohou být na bázi fosfolipidů nebo ne.

Dalším typem formulace s prodlouženým uvolňováním je vodná suspenze insulinotropinových precipitátů nebo agregátů, získaných s použitím srážedel, například fenolických sloučenin nebo bazických polypeptidů nebo kovových iontů nebo solí, a/nebo s použitím velkého smykového napětí. Současně je možno použít více než jedno srážedlo. Precipitáty mohou být buď krystalické, nebo amorfní.

Krystaly insulinotropinu je možno získat z roztoku léčiva ve vodě s použitím gradientu pH (buď od vysokého do nízkého, nebo od nízkého do vysokého) a/nebo teplotního gradientu a/nebo solí ke snížení rozpustnosti. Soli zahrnují citrát amonný, fosforečnan sodný nebo draselný, chlorid sodný, draselný nebo amonný, acetát sodný nebo amonný, síran hořečnatý, chlorid vápenatý, dusičnan amonný, formiát sodný a veškeré další soli, které mohou snížit rozpustnost léčiva. Není-li sůl, použitá ke krystalizací, farmaceuticky přijatelná, je možno matečný roztok po dokončení krystalizací nahradit farmaceuticky přijatelným médiem. Je-li k dosažení požadovaného farmakokinetického profilu nutné další snížení rozpustnosti léčiva, je možno krystaly podrobit zpracování ionty kovů, jako je zinek nebo vápník, a/nebo fenolickými sloučeninami. Toto zpracování se může uskutečnit pouhým včleněním těchto přísad do suspenze krystalů.

Rozpustnost precipitátů nebo agregátů insulinotropinu se za fyziologických podmínek může pohybovat od méně než 1 pg/ml do 500 pg/ml. Údaje u krys in vivo ukazují, že tyto formulace jsou schopny dosahovat například měřitelných hodnot insulinotropinu v krvi po alespoň 30 h.

Vodná média, používaná prou vedené formulace, mohou být jakéhokoli typu pufračního systému, který je vhodný pro injekce, nebo i s čistou vodou. Hodnota pH konečné formulace může být jakákoli, pokud je formulace schopna použití pro injekce. Protamin může být přidáván ve formě jakékoli soli (například síranu, chloridu atd.) nebo protaminové báze. Příklady rozmezí koncentrace složek, použitelných pro přípravu formulace, je možno uvést takto: fenol (0,5 až 5,0 mg/ml), m-kresol (0,5 až 5,5 mg/ml), protamin (0,02 až 1,0 mg/ml), zinek (molámí poměr zinek/insulinotropin 0,10 až 6), chlorid sodný (až 100 mg/ml) a fosfátový pufř (5-500 mM).

Je možno použít i dalších fenolických nebo nefenolických sloučenin. Jako jejich neomezující příklady je možno uvést resorcino, methylparaben, propylparaben, benzylalkohol, chlorkresol, kresol, benzaldehyd, ketachol, pyrogallol, hydrochinon, n-propylgallát, butylovaný hydroxyanisol, butylovaný hydoxytoluen. Neomezujícími příklady bazických polypeptidů jsou polylysin, polyarginin atd.

-25CZ 296341 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje účinek prodloužené infuze (7 h) 4 ng/kg/min insulinotropinu na hodnotu glukózy v plazmě u pacientů s NIDDM.

Obr. 2 znázorňuje účinek krátkodobé infuze (60 min) 10 ng/kg/min insulinotropinu na hodnotu glukózy v plazmě u pacientů s NIDDM:

Obr. 3 znázorňuje účinek prodloužené infuze (7 h) 2 ng/kg/min a 4 ng/kg/min insulinotropinu na hodnotu glukózy v plazmě u pacientů s NIDDM.

Obr. 4 Střední (n=3) koncentrace insulinotropinu v plazmě u krys po subkutánním podání jednotlivých dávek 0,5 mg/0,5 ml v různých vodných suspenzích (AS).

Obr. 5 Střední (n=3) koncentrace insulinotropinu v plazmě u krys po subkutánním podání jednotlivých dávek 0,5 mg/0,5 ml v různých vodných suspenzích (AS).

Obr. 6 Střední (n=3) koncentrace insulinotropinu v plazmě u krys po subkutánním podání jednotlivých dávek 0,5 mg/0,5 ml v různých vodných suspenzích (AS).

Obr. 7 Střední (n=3) koncentrace insulinotropinu v plazmě u krys po subkutánním podání jednotlivých dávek 0,5 mg/0,5 ml v různých vodných suspenzích (AS).

Obr. 8 Střední (n=3) koncentrace insulinotropinu v plazmě u krys po subkutánním podání jednotlivých dávek 0,5 mg/13 ml v různých vodných suspenzích (AS).

Obr. 9 Střední (n=3) koncentrace insulinotropinu v plazmě u krys po subkutánním podání jednotlivých dávek 0,5 mg/13 ml v různých vodných suspenzích (AS).

Obr. 10 znázorňuje farmakokinetické studie precipitátu insulinotropinu se zinkem.

Příklady provedení vynálezu

K bližšímu objasnění vynálezu jsou uvedeny příklady praktického provedení, které však neomezují jeho rozsah, daný připojenými patentovými nároky.

Příklad 1

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku Al mg insulinotropinu bylo naváženo do 5ml odměmé baňky. Kdispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 4 ml fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem (PBS). Pak bylo přidáno tolik PBS, aby byla baňka zaplněna (q.s). Do lOml odměmé baňky bylo naváženo 20 mg insulinotropinu. K dispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky byl přidán PBS v množství q.s. Objemy obou baněk byly spojeny přefiltrováním pomocí skleněné injekční jehly přes filtr 0,22 μ (nízká vazba proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok Al obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

-26CL Z90541 B6

Příprava roztoku B1 mg protaminsulfátu a 4 mg fenolu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu a fenolu bylo přidáno q.s. PBS. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok Bl obsahoval 0,6 mg/ml proteinové báze a 4,4 mg/ml fenolu v PBS.

Vodná suspenze 1

1,5 ml roztoku Al bylo opipetováno do 3,5 ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku Bl. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 1 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu, 0,3 mg/ml protaminové báze a 2,2 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys,

Příklad 2

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A2 mg insulinotropinu bylo naváženo do 5ml odměmé baňky. K dispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 4 ml fyziologického roztoku PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Do lOml odměmé baňky bylo naváženo 20 mg insulinotropinu. K dispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky byl přidán PBS v množství q.s. Objemy obou baněk byla spojeny přefiltrováním pomocí skleněné injekční jehly přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A2 obsahoval 2mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B2

2g protaminsulfátu a 44 mg fenolu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu a fenolu bylo přidáno q.s. PBS. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B2 obsahoval 0,15 mg/ml protaminové báze a 4,4 mg/ml fenolu v PBS.

Vodná suspenze 2

1,5 ml roztoku A2 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku B2. Lahvičky byly zazátkovány a zataveny pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 2 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu, 0,075 mg/ml protaminové báze a 2,2 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 3

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A3 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K dispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A3 byl přefiltrován pomocí skleněné injekční jehly přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A3 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

-27CZ 296341 B6

Příprava roztoku B3 mg protaminsulfátu, 44 mg fenolu a 323 mg glycinu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu, fenolu a glycerinu bylo přidáno q.s. PBS. Tento roztok byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B3 obsahoval 0,6 mg/ml protaminové báze, 4,4 mg/ml fenolu a 32 mg/ml glycerinu v PBS.

Vodná suspenze 3

1,5 ml roztoku A3 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku B3. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 3 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu, 0,3 mg/ml protaminové báze, 2,2 mg/ml fenolu a 16 mg/ml glycerinu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 4

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A4 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K dispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A4 byl přefiltrován pomocí skleněné injekční jehly přes filtr 0,22 μ (Millipore Millex-GV) do lOml skleněné lahvičky. Roztok A4 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B4 mg protaminsulfátu a 52 mg m-kresolu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu a w-kresolu bylo přidáno q.s. PBS. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B4 obsahoval 0,6 mg/ml protaminové báze a 5 mg/ml M-kresolu v PBS.

Vodná suspenze 4

1,5 ml roztoku A4 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku B4. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořily krystaly. Vodná suspenze 4 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu, 0,3 mg/ml rotaminové báze a 2,5 mg/ml zn-kresolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 5

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A5 mg insulinotropinu bylo naváženo do 25ml odměmé baňky. K dispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 23 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A5 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do 50ml skleněné lahvičky. Roztok A5 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

-28CZ. ZVO.W1 tso

Příprava zásobního roztoku fenolu

0,44 g fenolu bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 95 ml PBS. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno q.s. PBS. Vzniklý roztok (4,4 mg/ml fenolu) byl použit k přípravě roztoku B5.

Příprava roztoku B5

Roztok B5 byl připraven přefiltrováním 25 ml zásobního roztoku fenolu přes filtr 0,2 μ do 50ml skleněné lahvičky. Roztok B5 obsahoval 4,4 mg/ml fenolu v PBS.

Vodná suspenze 5

1,25 ml roztoku A5 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,25 ml roztoku B5. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 5 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu a 2,2 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 6

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A6 mg insulinotropinu bylo naváženo do 25ml odměmé baňky. K dispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 23 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A6 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do 50ml skleněné lahvičky. Roztok A6 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava zásobního roztoku fenolu

0,44 g fenolu bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 95 ml PS. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno q.s. PBS. Vzniklý roztok (4,4 mg/ml fenolu) byl použit k přípravě roztok B6.

Příprava roztoku B6

Roztok B6 byl připraven navážením 1,25 mg protaminsulfátu do 25ml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu bylo do baňky přidáno přibližně 20 ml zásobního roztoku fenolu. Do baňky bylo přidáno množství q.s. zásobního roztoku fenolu. Roztok B6 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do 50ml skleněné lahvičky. Roztok B6 obsahoval 4,4 mg/ml fenolu a 0,038 mg/ml protaminové báze v PBS.

Vodná suspenze 6

1,25 ml roztoku A6 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,25 ml roztoku B6. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 6 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu, 2,2 mg/ml fenolu a 0,019 mg/ml protaminové báze v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

-29CZ 296341 B6

Příklad 7

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A7 mg insulinotropinu bylo naváženo do 25ml odměrné baňky. K dispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 23 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A7 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do 50ml skleněné lahvičky. Roztok A7 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava zásobního roztoku fenolu

0,44 g fenolu bylo naváženo do lOOml odměrné baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 95 ml PBS. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno q.s. PBS. Vzniklý roztok (4,4 mg/ml fenolu) byl použit k přípravě roztoku B7.

Příprava roztoku B7

Roztok B7 byl připraven navážením 2,5 mg protaminsulfátu do 25ml odměrné baňky. K rozpuštění protaminsulfátu bylo do baňky přidáno přibližně 20 ml zásobního roztoku fenolu. Do baňky bylo přidáno množství q.s. zásobního roztoku fenolu. Roztok B7 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do 50ml skleněné lahvičky. Roztok B7 obsahoval 4,4 mg/ml fenolu a 0,075 mg/ml protaminové báze v PBS.

Vodná suspenze 7

1,25 ml roztok A7 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,25 ml roztoku B7. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 7 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu, 2,2 mg/ml fenolu a 0,038 mg/ml protaminové báze v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 8

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A12 mg insulinotropinu bylo naváženo do 1 Oml odměrné baňky. K. dispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A12 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A12 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Roztok B12

Roztok B12 byl připraven navážením 20 mg fenolu do lOml odměrné baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno množství q.s. PBS. Roztok

B12 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B12 obsahoval 2 mg/ml fenolu v PBS.

-30CZ 290341 B6

Vodná suspenze 12 ml roztoku A12 bylo odpipetováno do lOml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 4 ml roztoku B12. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 12 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu a 1 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 9

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A15 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml fosfátového pufru (PB). Do baňky bylo přidáno q.s. PB. Roztok A15 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A15 obsahoval mg/ml insulinotropinu v PB.

Příprava roztoku Β15

Roztok Β15 byl připraven navážením 8 mg protaminsulfátu do 1 Oml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PB. Do baňky bylo přidáno množství q.s. PB. Roztok B15 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok Β15 obsahoval 0,6 mg/ml protaminové báze v PBS.

Vodná suspenze 15 ml roztoku A15 bylo odpipetováno do lOml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchá a pomocí pipety bylo přidáno 3 ml roztoku B15. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 15 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu a 0,3 mg/ml protaminové báze v PB. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 10

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztok A16 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PB. Do baňky bylo přidáno q.s. PB. Roztok A16 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A16 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PB.

Příprava roztoku Β16

Roztok B16 byl připraven navážením 44 mg fenolu do lOml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PB. Do baňky bylo přidáno množství q.s. PB. Roztok B16 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B16 obsahoval 4,4 mg/ml fenolu v PB.

-31 CZ 296341 B6

Vodná suspenze 16 ml roztoku A16 bylo odpipetováno do lOml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 3 ml roztoku B16. Lahvičky byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h mírně míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 16 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu a 2,2 mg/ml fenolu v PB. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 11

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Vodná suspenze 17 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PB. Do baňky bylo přidáno q.s. Obsah baňky byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky typu I. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 17 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu v PB. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 12

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Vodná suspenze 18 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Obsah baňky byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky typu I. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl mírně (za ujištění, že nevzniká pěna ani bubliny) 16 h míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 18 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 13

Suspenze insulinotropinu (0,2 mg/ml)

Příprava roztoku A22

Roztok A22 byl připraven navážením 2 mg insulinotropinu do 5ml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 3 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS.Roztok A22 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A22 obsahoval 0,4 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B22

Roztok B22 byl připraven navážením 44mg fenolu do lOml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno množství q.s. PBS. Roztok B22 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B22 obsahoval 4,4 mg/ml fenolu v PBS.

-32VZ. ÍVOO41 BO

Vodná suspenze 22

1,5 ml roztoku A22 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lavičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku B22. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 22 obsahovala 0,2 mg/ml insulinotropinu a 2,2 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 14

Suspenze insulinotropinu (0,2 mg/ml)

Příprava roztoku A23

Roztok A23 byl připraven navážením 2 mg insulinotropinu do 5ml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 3 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A23 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A23 obsahoval 0,4 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B23

Roztok B23 byl připraven navážením 8,8 mg fenolu do lOml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno množství q.s. PBS. Roztok B23 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B23 obsahoval 0,88 mg/ml fenolu v PBS.

Vodná suspenze 23

1,5 ml roztoku A23 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku B23. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 23 obsahovala 0,2 mg/ml insulinotropinu a 0,44 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 15

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A24

Roztok A24 byl připraven navážením 10 mg insulinotropinu do 5ml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 3 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A24 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A24 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B24

Roztok B24 byl připraven navážením 8 mg protaminsulfátu do lOml odměmé baňky.

K rozpuštění protaminsulfátu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno množství q.s. PBS. Roztok B24 byl přefiltrován přes filtr 0,2 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B24 obsahoval 0,6 mg/ml protaminové báze v PBS.

-33CZ 296341 B6

Vodná suspenze 24

1,5 ml roztoku A24 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku B24. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 24 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu a 0,3 mg/ml protaminové báze v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 16

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A25

Roztok A25 byl připraven navážením 10 mg insulinotropinu do 5ml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 3 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A25 byla přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A25 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B25

Roztok B25 byl připraven navážením 53 mg w-kresolu do lOml odměmé baňky. K rozpuštění m-kresolu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno množství q.s. PBS. Roztok B25 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B25 obsahoval 5,3 mg/ml w-kresolu v PBS.

Vodná suspenze 25

1,5 ml roztok A25 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku B25. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 25 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu a 2,5 mg/ml zn-kresolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 17

Suspenze insulinotropinu (0,5 mg/ml)

Příprava roztoku A29

Roztok A29 byl připraven navážením 25 mg insulinotropinu do 25ml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 20 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A29 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do 50ml skleněné lahvičky. Roztok A29 obsahoval 1 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B29

Roztok B29 byl připraven navážením 50 mg fenolu do 50ml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 40 ml PBS. Do baňky bylo přidáno množství q.s. PBS. Roztok

B29 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do 50ml skleněné lahvičky. Roztok B29 obsahoval

1,0 mg/ml fenolu v PBS.

-34CZ. t5O

Vodná suspenze 29

1,5 ml roztoku A29 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku B29. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 29 obsahovala 0,5 mg/ml insulinotropinu a 0,5 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 18

Suspenze insulinotropinu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A31 mg insulinotropinu bylo naváženo do 5ml odměrné baňky. Kdispergaci a rozpuštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 4 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok A31 byl přefiltrován jehlou přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok A31 obsahoval 2 mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B31

Roztok B31 byl připraven navážením 50 mg fenolu do 50ml odměrné baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 40 ml PBS. Do baňky bylo přidáno množství q.s. PBS. Roztok B31 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do 50ml skleněné lahvičky. Roztok B31 obsahoval 1 mg/ml fenolu v PBS.

Vodná suspenze 31

1,5 ml roztoku A31 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl magneticky míchán a pomocí pipety bylo přidáno 1,5 ml roztoku B31. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 16 h míchán, aby se vytvořila suspenze. Vodná suspenze 31 obsahovala 1 mg/ml insulinotropinu a 0,5 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo krys.

Příklad 19

Suspenze insulinotropinu (4 mg/ml)

Příprava roztoku A51

22,1 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml odměrné baňky. Krozpuštění léčiva bylo do baňky napipetováno 5 ml PBS. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok A51 obsahoval 4,44mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B51

110 mg fenolu a 30 mg protaminsulfátu bylo naváženo do 5ml odměrné baňky. K rozpuštění fenolu a protaminsulfátu bylo do baňky přidáno přibližně 4 ml PBS. Baňka byla doplněna po rysku PBS. Roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok B51 obsahoval 22 mg/ml fenolu a 4,5 mg/ml protaminové báze v PBS.

-35CZ 296341 B6

Vodná suspenze 51 ml roztoku A51 a 0,33 ml roztoku B51 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl mírně třepán k dosažení homogenní směsi. Lahvička byla ponechána stát 16 h při teplotě místnosti. Vodná suspenze 51 obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,44 mg/ml protaminové báze a 2,2 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 20

Suspenze insulinotropinu (4 mg/ml)

Příprava roztoku A52

22,2 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění léčiva bylo do baňky napipetováno 5 ml PBS. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok A52 obsahoval 4,44mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B52

110 mg fenolu a 15,6 mg dihydrátu acetátu zinku bylo naváženo do 5ml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu a dihydrátu acetátu zinku bylo do baňky přidáno přibližně 4 ml vody pro injekce. Baňka byla doplněna po rysku vodou pro injekce. Roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok B52 obsahoval 22 mg/ml fenolu a 7,8 mg/ml dihydrátu acetátu zinku ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 52 ml roztoku A52 a 0,33 ml roztoku B52 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl mírně třepán k dosažení homogenní směsi. Lahvička byla ponechána stát 16 h při teplotě místnosti. Vodná suspenze 52 obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,78 mg/ml dihydrátu acetátu zinku a 2,2 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 21

Suspenze insulinotropinu (4 mg/ml)

Příprava roztoku fenolu.

244 mg fenolu bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 90 ml vody pro injekce. Baňka byla doplněna po rysku vodou pro injekce. Pomocí 5% roztoku NaOH bylo pH tohoto roztoku nastaveno na 9,0. Roztok fenolu obsahoval 2,44 mg/ml fenolu ve vodě pro injekce o pH 9,0.

Příprava roztoku A71

22,2 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml skleněné lahvičky. K rozpuštění léčiva bylo do lahvičky napipetováno 5 ml roztoku fenolu. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok A71 obsahoval 4,44 mg/ml insulinotropinu a 2,44 mg/ml fenolu ve vodě pro injekce.

-36CZ, ZV0J41 t50

Příprava roztoku B71

116 mg protaminsulfátu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml vody pro injekce. Baňka byla doplněna po rysku vodou pro injekce. Roztok byl přefdtrován přes fdtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok B71 obsahoval 8,7 mg/ml protaminové báze ve vodě pro injekce.

Příprava roztoku C71

156 mg dihydrátu acetátu zinku a 1,632 g NaCl bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku a NaCl bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml vody pro injekce. Baňka byla doplněna po rysku vodou pro injekce. Tento roztok byl přefiltrován přes fdtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok C71 obsahoval 15,6 mg/ml dihydrátu acetátu zinku a 163,2 mg/ml NaCl ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 71 ml roztok A71, 0,165 ml roztoku B71 a 0,165 ml roztoku C71 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl mírně třepán k dosažení homogenní směsi. Lahvička byla ponechána stát 16 h při teplotě místnosti. Vodná suspenze 71 obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,435 mg/ml protaminové báze, 0,78 mg/ml dihydrátu acetátu zinku, 8,16 mg/ml NaCl a 2,2 mg/ml fenolu ve vodě pro injekce. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 22

Suspenze insulinotropinu (4 mg/ml)

Příprava roztoku m-kresolu

244 mg zn-kresolu bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění m-kresolu bylo do baňky přidáno přibližně 90 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce doplněna po rysku. Pomocí 5% roztoku NaOH bylo pH tohoto roztoku nastaveno na 9,0. Roztok w-kresolu obsahoval 2,44 mg/ml m-kresolu ve vodě pro injekce o pH 9,0.

Příprava roztoku Al00

22,2 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml skleněné lahvičky. K rozpuštění léčiva bylo do lahvičky napipetováno 5 ml roztoku w-kresolu. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok A100 obsahoval 4,44 mg/ml insulinotropinu a 2,44 mg/ml zu-kresolu ve vodě pro injekce.

Příprava roztoku B100

116 mg protaminsulfátu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce naplněna po rysku. Roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok B100 obsahoval 8,7 mg/ml protaminové báze ve vodě po injekce.

Příprava roztoku Cl00

156 mg dihydrátu acetátu zinku a 1,632 g NaCl bylo naváženo do lOml odměmé baňky.

K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku a NaCl bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce doplněna po rysku. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr

-37CZ 296341 B6

0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok Cl00 obsahoval 15,6 mg/ml dihydrátu acetátu zinku a 163,2 mg/ml NaCl ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 100 ml roztoku A100, 0,165 ml roztoku B100 a 0,165 ml roztoku Cl00 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl mírně třepán k dosažení homogenní směsi. Lahvička byla ponechána stát 16 h při teplotě místnosti. Vodná suspenze 100 obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,435 mg/ml protaminové báze, 0,78 mg/ml dihydrátu acetátu zinku, 8,16 mg/ml NaCl a 2,2 mg/ml m-kresolu ve vodě pro injekce. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 23

Suspenze insulinotropinu (4 mg/ml)

Příprava roztoku A68

22,2 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml skleněné lahvičky. K. rozpuštění léčiva bylo do lahvičky napipetováno 5 ml PBS. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok A68 obsahoval 4,4mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B68

116 mg protaminsulfátu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce naplněna po rysku. Roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok B68 obsahoval 8,7 mg/ml protaminové báze ve vodě pro injekce.

Příprava roztok C68

156 mg dihydrátu acetátu zinku a 440 mg fenolu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku a fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce doplněna po rysku. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok C68 obsahoval 15,6 mg/ml dihydrátu acetátu zinku a 44 mg/ml fenolu ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 68 ml roztoku A68, 0,165 ml roztoku B68 a 0,165 ml roztoku C68 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl mírně třepán k dosažení homogenní směsi. Lahvička byla ponechána stát 16 h při teplotě místnosti. Vodná suspenze 68 obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,435 mg/ml protaminové báze, 0,78 mg/ml dihydrátu acetátu zinku a 2,2 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 24

Suspenze insulinotropinu (4 mg/ml)

Příprava roztoku A67

-38CZ. tSO

22,2 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml skleněné lahvičky. K rozpuštění léčiva bylo do lahvičky napipetováno 5 ml PBS. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok A67 obsahoval 4,44mg/ml insulinotropinu v PBS.

Příprava roztoku B67

116 mg protaminsulfátu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění protaminsulfátu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce naplněna po rysku. Roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok B67 obsahoval 8,7 mg/ml proteinové báze ve vodě pro injekce.

Příprava roztok C67

156 mg dihydrátu acetátu zinku a 440 mg w-kresolu bylo naváženo do lOml odměmé baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku a m-kresolu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce doplněna po rysku. Tento roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do lOml skleněné lahvičky. Roztok C67 obsahoval 15,6 mg/ml dihydrátu acetátu zinku a 44 mg/ml w-kresolu ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 67 ml roztoku A67, 0,165 ml roztoku B67 a 0,165 ml roztoku C67 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Obsah lahvičky byl mírně třepán k dosažené homogenní směsi. Lahvička byla ponechána stát 16 h při teplotě místnosti. Vodná suspenze 67 obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,435 mg/ml protaminové báze, 0,78 mg/ml dihydrátu acetátu zinku a 2,2 mg/ml ui-kresolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 25

Příprava roztoku A39

67,6 mg insulinotropinu bylo naváženo do skleněné lahvičky. K rozpuštění insulinotropinu bylo do lahvičky přidáno přibližně 22 ml vody pro injekce. K vyčiření roztoku bylo pH lahvičky pomocí NaOH nastaveno na 9,6. Voda pro injekce byla přidána do lahvičky v množství poskytujícím konečnou koncentraci léčiva 2,5 mg/ml.

Příprava roztoku B39

386,8 mg dihydrátu acetátu zinku bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku bylo do baňky přidáno přibližně 80 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce naplněna po rysku. Roztok B39 obsahoval 3,9 mg/ml dihydrátu acetátu zinku ve vodě pro injekce.

Příprava roztoku C39

1,095 g fenolu bylo naváženo do 50ml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 40 ml vody pro injekce. Banka byla vodou pro injekce doplněna po rysku. Roztok C39 obsahoval 21,9 mg/ml fenolu ve vodě pro injekce.

Příprava roztoku D39

2,25 g NaCl bylo naváženo do 25ml odměmé baňky. K rozpuštění NaCl bylo do baňky přidáno přibližně 20 ml roztoku C39. Baňka byla roztokem C39 doplněna po rysku. Roztok D39 obsahoval 9 % (w/v) NaCl a 21,9 mg/ml fenolu ve vodě po injekce.

-39CZ 296341 B6

Vodná suspenze 39

Všechny roztoky byly přefiltrovány přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu). 9 ml roztok A39 bylo přeneseno do lOml vzorkovací lahvičky. Za mírného míchání byl do lahvičky přidán 1 ml roztoku B39. Okamžitě se vytvořily sraženiny. Bylo naměřeno pH 7,0. Lahvička byla ponechána stát asi 18 h při teplotě místnosti. 4 ml vzorku bylo přeneseno do zvláštní lOml lahvičky a do lahvičky bylo přidáno 0,44 ml roztoku D39. Vzorek byl 5 minut mírně míchán a pak ponechán stát přes noc při teplotě místnosti.

Vodná suspenze 39 obsahovala 2 mg/ml insulinotropinu, 2,2 mg/ml fenolu, 0,9 % NaCl a 0,39 mg/ml dihydrátu acetátu zinku. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 26

Příprava roztoku A53

32,5 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml skleněné lahvičky. Do lahvičky bylo přidáno 6 ml vody pro injekce. Kvyčiření roztoku bylo pH obsahu lahvičky pomocí 1% (w/v) NaOH nastaveno na 9,6. Voda pro injekce byla přidána do lahvičky v množství poskytujícím koncentraci léčiva 5,0 mg/ml.

Příprava roztoku B53

390 mg dihydrátu acetátu zinku bylo naváženo do 50ml odměrné baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku bylo do baňky přidáno přibližně 40 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce naplněna po rysku. Roztok B53 obsahoval 7,8 mg/ml dihydrátu acetátu zinku ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 53

Všechny roztoky byly přefiltrovány přes filtr 0,22 μ (s nízko vazbou proteinu). 2,4 ml roztoku A53 bylo přeneseno do 3,5ml lahvičky. Za mírného míchání bylo do lahvičky přidáno 300 μΐ roztoku B53. Okamžitě po přídavku se vytvořily dvojlomné sraženiny. Bylo naměřeno pH 6,8. Lahvička byla ponechána stát 20 h při teplotě místnosti, přímo do supematantu usazené suspenze bylo přidáno 7,5 μΐ wi-kresolu. K rozpuštění w-kresolu pak byla suspenze mírně míchána. Za míchání bylo k suspenzi přidáno 300 μΐ 9% roztoku NaCl. Vodná suspenze 53 obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,9 % NaCl, 0,78 mg/ml dihydrátu acetátu zinku a 2,5 mg/ml m-kresolu ve vodě pro injekce. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 27

Příprava roztoku A54

32,5 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml skleněné lahvičky. Do lahvičky bylo přidáno ml vody pro injekce. Kvyčeření roztoku bylo pH obsahu lahvičky pomocí 1% (w/v) NaOH nastaveno na 9,6. Voda pro injekce byla přidána do lahvičky v množství poskytujícím koncentraci léčiva 5,0 mg/ml.

-40CZ 290341 BO

Příprava roztoku B54

390 mg dihydrátu acetátu zinku bylo naváženo do 50ml odměrné baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku bylo do baňky přidáno přibližně 40 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce naplněna po rysku. Roztok B54 obsahoval 7,8 mg/ml dihydrátu acetátu zinku ve vodě pro injekce.

Příprava roztoku C54

1.1 g fenolu a 4,5 g NaCl bylo naváženo do 50ml odměrné baňky. Do baňky bylo přidáno přibližně 40 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce doplněna po rysku. Roztok C54 obsahoval 22 mg/ml fenolu a 90 mg/ml NaCl.

Vodná suspenze 54

Všechny roztoky byly přefiltrovány přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu). 2,4 ml roztoku A54 bylo přeneseno do 3,5ml lahvičky. Za míchání bylo do lahvičky přidáno 300 μΐ roztoku B54. Okamžitě po přídavku se vytvořily dvojlomné sraženiny. Bylo naměřeno pH 6,8. Vzorek byl ponechán stát 20 h při teplotě místnosti. Za mírného míchání bylo přidáno 300 μΐ roztoku C54. Vodná suspenze 54 obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,78 mg/ml dihydrátu acetátu zinku, 2,2 mg/ml fenolu a 9 mg/ml NaCl ve vodě pro injekce. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 28

Příprava roztoku A57 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml skleněné lahvičky. Do lahvičky byly přidány 3 ml vody pro injekce. K úplnému rozpuštění léčiva bylo pH obsahu lahvičky pomocí 5% NaOH nastaveno na 9,9. Roztok A57 obsahoval 5,0 mg/ml insulinotropinu ve vodě pro injekce.

Příprava roztoku B57

780 mg dihydrátu acetátu zinku bylo naváženo do lOOml odměrné baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku bylo do baňky přidáno přibližně 80 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce naplněna po rysku. Roztok B57 obsahoval 7,8 mg/ml dihydrátu acetátu zinku ve vodě po injekce.

Příprava roztoku C57

2.2 g fenolu a 9 g NaCl bylo naváženo do lOOml odměrné baňky. Do baňky bylo k rozpuštění fenolu a NaCl přidáno přibližně 80 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce doplněna po rysku. Roztok C57 obsahoval 22 mg/ml fenolu a 90 mg/ml NaCl ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 57

2,4 ml roztoku A57 bylo přeneseno do 3,5ml lahvičky. Za mírného míchání bylo k roztoku přidáno 300 μΐ roztoku B57. Okamžitě po přídavku roztoku B57 se vytvořily sraženiny. Bylo naměřeno pH 7,1. Vzorek byl ponechán stát 24 h při teplotě místnosti. Za mírného míchání bylo přidáno 300 μΐ roztoku C57. Vodná suspenze 57 obsahovala 4 mg/mil insulinotropinu, 0,78 mg/ml dihydrátu acetátu zinku, 2,2 mg/ml fenolu a 9 mg/ml NaCl ve vodě pro injekce. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

-41 CZ 296341 B6

Příklad 29

Příprava roztoku A64

53,3 mg insulinotropinu bylo naváženo do 30mi skleněné lahvičky. Po přídavku 11 ml vody pro injekce bylo pH obsahu pomocí 5% NaOH (w/v) nastaveno na 8,3. Pomocí zředěné HC1 bylo pH upraveno až na 6,0 k ujištění, že roztok stále zůstává čirý. Voda pro injekce byla přidána v množství poskytujícím koncentraci léčiva 4,4 mg/ml. Roztok A64 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu) do 3,5ml vzorkovací lahvičky. 1,8 ml přefiltrovaného roztoku bylo přeneseno do zvláštní sterilní 3,5ml lahvičky, která byla ponechána stát 3 dny při teplotě místnosti ke krystalizaci.

Příprava roztoku B64

780 mg dihydrátu acetátu zinku bylo naváženo do 50ml odměmé baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku bylo do baňky přidáno přibližně 40 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce naplněna pro rysku. Roztok B64 obsahoval 15,6 mg/ml dihydrátu acetátu zinku ve vodě pro injekce.

Příprava roztoku C64 g NaCl bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. Do baňky bylo k rozpouštění NaCl přidáno přibližně 80 ml vody pro injekce. Baňka byl vodou pro injekce doplněna po rysku. Roztok C64 obsahoval 180 mg/ml NaCl ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 64

Po dokončení krystalizaci roztoku A64 bylo k suspenzi krystalů za pomalého míchání přidáno 100 μΐ roztoku B64. Vzorek pak byl ponechán stát 3 dny při teplotě místnosti. Za mírného míchání bylo k suspenzi krystalů přidáno 100 μΐ roztoku C64. Zředěným NaOH bylo pH suspenze upraveno na 7,3. Přímo do suspenze kiystalů s upraveným pH bylo přidáno 5,0 μ /M-kresolu. Vodná suspenze obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,78 mg/ml dihydrátu acetátu zinku, 9 mg/ml NaCl a 2,5 mg/ml w-kresolu ve vodě pro injekce. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 30

Příprava roztoku A69 g NaCl bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění NaCl bylo do baňky přidáno přibližně 80 ml vody pro injekce. Roztok A69 obsahoval 1 % (w/v) NaCl ve vodě pro injekce.

Příprava roztoku B69

390 mg dihydrátu acetátu zinku byla navážena do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku bylo do baňky přidáno přibližně 80 ml vody pro injekce. Baňka byla vodou pro injekce naplněna po rysku. Roztok 69 obsahoval 3,9 mg/ml dihydrátu acetátu zinku ve vodě pro injekce.

Příprava emulze C69

2,5 ml sterilně přefiltrovaného (0,22 μ s nízkou vazbou proteinu) w-kresolu bylo přeneseno do lOOml odměmé baňky. Baňka byla doplněna po rysku vodou pro injekce a sonifíkována kzískání homogenní suspenze. Emulze C69 obsahovala 25 mg/ml zw-kresolu ve vodě pro injekce.

-42CZ. ZV0J41 tJO

Vodná suspenze 69

35,74 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml skleněné lahvičky. Bylo přidáno 7 ml roztoku A69. K rozpuštění léčiva bylo pH obsahu lahvičky upraveno na 9,2. Zředěnou HC1 pak bylo pH roztoku upraveno na 6,5. Byla přidána voda pro injekce v množství poskytujícím koncentraci léčiva 4,4 mg/ml. Roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu). Roztok byl ponechán stát 6 dnů při teplotě místnosti, přičemž vykrystaloval insulinotropin. 1,5 ml suspenze krystalů bylo přeneseno do zvláštní lahvičky. Za mírného míchání bylo přidáno 167 μΐ roztoku B69. Vzorek byl ponechán stát 1 den při teplotě místnosti. K supernatantu usazené suspenze bylo přidáno 167 μΐ emulze C69. K rozpuštění m-kresolu byl vzorek míchán. Vodná suspenze 69 obsahovala 3,6 mg/ml insulinotropinu, 0,36 mg/ml acetátu zinku, 8,17 mg/ml NaCl a 2,28 mg/ml w-kresolu ve vodě pro injekce. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 31

Příprava roztoku A101 g acetátu sodného bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění acetátu sodného bylo do baňky přidáno přibližně 80 ml vody pro injekce. Baňka byla po rysku doplněna vodou pro injekce. Roztok A200 obsahoval 100 mg/ml acetátu sodného ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 101

44,4 mg insulinotropinu bylo naváženo do lOml skleněné lahvičky. Do baňky bylo přidáno 8 ml vody pro injekce. Kvyčiření roztoku bylo pH obsahu lahvičky upraveno na 9,3. K roztoku insulinotropinu byl přidá 1 ml roztoku A200. Pak bylo pH sníženo na 6,5. Roztok byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu). Přefiltrovaný roztok byl ponechán stát 3 dny při teplotě místnosti, aby byla proběhnout krystalizace. Vodná suspenze 101 obsahovala 4,9 mg/ml insulinotropinu a 11,1 mg/ml acetátu sodného ve vodě pro injekce. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 32

Příprava roztoku A82

9g NaCl bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění NaCl bylo do baňky přidáno přibližně 80 ml vody pro injekce. Baňka byla doplněna po rysku vodou pro injekce. Roztok A82 obsahoval 9 % (w/v) NaCl ve vodě pro injekce.

Příprava roztoku B82

789 mg dihydrátu acetátu zinku bylo naváženo do lOOml odměmé baňky. K rozpuštění dihydrátu acetátu zinku bylo do baňky přidáno přibližně 80 ml vody pro injekce. Baňka byla doplněna po rysku vodou pro injekce. Roztok B82 obsahoval 7,89 mg/ml dihydrátu acetátu zinku ve vodě pro injekce.

Příprava emulze C82

2,5 ml sterilně přefiltrovaného (0,22 μ s nízkou vazbou proteinu) m-kresolu bylo přeneseno do lOOml odměmé baňky.

-43CZ 296341 B6

Baňka byla doplněna po rysku vodou pro injekce a sonifikována k získáni homogenní suspenze. Emulze C82 obsahovala 25 mg/ml m-kresolu ve vodě pro injekce.

Vodná suspenze 82

Všechny roztoky byly přefiltrovány přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu). 45,34 mg insulinotropinu bylo přidáno do lOml skleněné lahvičky, do níž bylo přidáno 8 ml vody. Pomocí 5% NaOH bylo pH nastaveno na 9,3. Po přídavku 1 ml roztoku A82 do lahvičky bylo zředěno HC1 pH roztoku upraveno na 6,55. Roztok (5 mg/ml insulinotropinu) byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ (s nízkou vazbou proteinu). Ke sterilně přefiltrovanému roztoku insulinotropinu bylo přidáno 81 μΐ vodné suspenze 101 (viz příklad 31) a vzorek byl protřepáním dispergován. Vzorek pak byl ponechán stát 72 h při teplotě místnosti k vytvoření suspenze krystalů. 2,4 ml suspenze bylo přeneseno do 3,5ml lahvičky. Za mírného míchání bylo přidáno 300 μΐ roztoku B82. Zředěným NaOH bylo pH obsahu lahvičky upraveno 300 μΐ roztoku B82. Zředěným NaOH bylo pH obsahu lahvičky upraveno na 7,3. K supematantu usazené suspenze bylo přidáno 300 μΐ emulze C82. Vodná suspenze 82 obsahovala 4 mg/ml insulinotropinu, 0,79 mg/1 dihydrátu acetátu zinku,

2.5 mg/ml w-kresolu a 0,9 % NaCl ve vodě pro injekce. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 33

Suspenze GLP-1 (7-36)amidu (1 mg/ml)

Příprava roztoku A26

Roztok A26 byl připraven navážením 10 mg GLP-1 (7-36) amidu do 5ml odměmé baňky. K rozpouštění léčiva bylo do baňky přidáno přibližně 3 ml PBS. Roztok A26 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok 26 obsahoval 2 mg/ml GLP-l(7-36) v PBS.

Příprava roztok B26

Roztok B26 byl připraven navážením 44 mg fenolu do lOml odměmé baňky. K rozpuštění fenolu bylo do baňky přidáno přibližně 8 ml PBS. Do baňky bylo přidáno q.s. PBS. Roztok B26 byl přefiltrován přes filtr 0,22 μ do lOml skleněné lahvičky. Roztok B26 obsahoval 4,4 mg/ml fenolu v PBS.

Vodná suspenze 26

1.5 m roztoku A26 bylo odpipetováno do 3,5ml skleněné lahvičky typu I. Za míchání magnetickým míchadlem bylo do lahvičky odpipetováno 1,5 ml roztoku B26. Lahvička byla zazátkována a zatavena pomocí hliníkového krytu. Obsah lahvičky byl 18 h mírně míchán (s dohledem na to, aby nevznikala pěna ani bubliny) k vytvoření suspenze. Vodná suspenze 26 obsahovala 1 mg/ml GLP-1 (7-36)amidu a 2,2 mg/ml fenolu v PBS. Tato suspenze byla použita pro farmakokinetické studie in vivo u krys.

Příklad 34

V jedné formě provedení vynálezu se připravují nízkorozpustná forma GLP-l(7-37) uvedením

GLP-1 (7-37) o koncentraci 2 až 15 mg/ml vpH 7 až 8,5 do styku s roztokem soli kovového iontu za vzniku roztoků s 1 až 8 mg/ml GLP-1 (7-3 7) při molámích poměrech zinku k GLP-1 (7-37) asi 1:1 až 270:1. Vytvoří se hustá sraženina, která se nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Rozpustnost GLP-l(7-37) v roztok kovového iontu se mění s použitým kovem.

-44CZ. 290341 B6

Provedená měření rozpustnosti pelety GLP-l(7-37) v rozpouštědle bez obsahu kovu, jako je PBS a voda, ukazují, že nízkorozpustné formy GLP-1 (7-37) vznikají s ionty zinku, kobaltu a niklu.

Tabulka 1: Schopnost různých solí kovových iontů produkovat nízkorozpustný GLP-1 (7-37)

sůl kovového iontu	rozpust, v roztoku kovu	rozpustn. v PBS
acetát Zn	0,04 pg/ml	0,04 pg/ml
chlorid Zn	0,04 pg/ml	0,03 pg/ml
chlorid Co	0,11 pg/ml	0,04 pg/ml
síran Ni	0,14 pg/ml	0,07 pg/ml
chlorid Mn	0,23 pg/ml	1,64 pg/ml
chlorid Mg	1,75 pg/ml	nesráží se
chlorid Ca	1,98 pg/ml	nesráží se

Pozn.: V každém případě bylo přidáno 100 μΐ roztoku kovového iontu o koncentraci 5 ml ke 100 μΐ GLP-1 (7-37) o koncentraci 5 mg/ml, promícháno a ponecháno stát přes noc. Nerozpustná peleta byla odstředěna. Byla změřena koncentrace GLP-1 (7-37), zbylého v roztoku kovového iontu. Peleta byla resuspendována ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (PBS), sonifíkována a ponechána stát přes noc. Nerozpustný podíl byl znovu peletován a změřena koncentrace GLP-l(7-37).

Příklad 35

Mikrokrystalické formy GLP-l(7-37) je možno získat smísením roztoků GLP-l(7-37) v pufru o pH 7 až 8,5 s určitými kombinacemi solí s nízkomolekulámích polyethylenglykolů (PEG). V tabulce 2 je uvedeno šest konkrétních kombinací podmínek, vedoucích k produkci mikrokrystalických forem GLP-1 (7-3 7).

Tabulka 2. Vybraná činidla produkující mikrokrystaly

č. činidla	sůl	pufr	srážedlo
1	žádná	žádný	0,4M tartrát K,Na
2	0,2M citrát Na	0,lM tris pH 8,5	30% PEG 400
3	0,2M mgCl₂	0,lM HEPES pH 7,5	28% PEG 400
4	0,2M mgCl₂	0,lM HEPES pH 7,5	30% PEG 400
5	0,5M K₂HPO₄	žádný	20% PEG 8000
6	žádná	žádný	30% PEG 1500

Pozn.: K činidlu byl přidán zásobní roztok GLP-l(7-37) o koncentraci 5 mg/ml v 50mM tris pH 8,1 v poměru 1:1. V kapkách byla sledována a zaznamenávána nepřítomnosti nebo přítomnosti nerozpustného GLP-1 (7-37) v krystalické nebo amorfní formě. Obecně se jeví, že nízkomolekulámí PEG favorizují krystalické formy. Tris je tris-(hydroxymethyl)aminomethan a HEPES je N-2-(hydroxyethyl)piperazin-N-2-ethansulfonová kyselina.

Příklad 36

K získání mikrokrystalických forem a vysokých výtěžků jsou nutné specifické kombinace koncentrací GLP-1 (7-37) a PEG. Tabulka 3 ukazuje konkrétní kombinace koncentrací PEG 600 a

-45CZ 296341 B6

GLP-l(7-37), které produkují mikrokrystalické formy v protikladu k amorfním formám léčiva. Výtěžek GLP-1 (7-37) v nerozpustné formě je rovněž uveden.

Tabulka 3. Tvorba/výtěžek krystalického GLP-l(7-37)

GLP-l(7-37)__________

2,0 mg/ml (forma/výtěžek)

3.5 mg/ml (forma/výtěžek)

5,0 mg/ml (forma/výtěžek)

6.5 mg/ml (forma/výtěžek)

8,0 mg/ml (forma/výtěžek)

9.5 mg/ml (forma/výtěžek)

PEG 600 amorfhí/8 % krystalická/62 % amorfní/34 % amorfní/52 % amorfní/55 % amorfhí/69 %

22,5% PEG 600 amorfní/10 % krystalická/26 % krystalická/63 % krystalická/76 % krystalická 82 % krystalická/85 %

30% PEG 600 amorfní 8 % krystalická/ 59 % krystalická/ 72 % krystalická/ 82 % amorfní/ 66 % amorfní/ 83 %

Pozn.: Mikrokrystaly GLP-l(7-37) se připravují spojením roztoků GLP-l(7-37) o koncentraci mg/ml v tris pufru o pH 8, 60% polyethylenglykolu 600 (PEG 600) v H₂O a tris pufru io pH 8 za vzniku konečné koncentrace 15 až 30 % PEG a 3 až 10 mg/ml GLP-1. Poté, co roztok stál přes noc, vytvoří se mikrokrystaly GLP-1 (7-37) s výtěžkem 50 až 85 %.

Příklady 37

Tento příklad osvětluje jinou formu vynálezu, která zahrnuje ošetření předem vytvořených mikrokrystalů GLP-1 (7-37) ionty různých kovů za vzniku nízkorozpustných mikrokrystalických forem. Mikrokrystaly GLP-l(7-37), připravené při koncentraci GLP-l(7-37) 8 mg/ml a 22,5 % PEG jako v příkladu 22, mají rozpustnost ekvivalentní čistému lyofilizovanému GLP-l(7-37). 20 K dosažení požadované nízké rozpustnosti pro dlouhodobé uvolňování léčiva je možno na tyto předem připravené mikrokrystaly působit před noc při teplotě místnosti kovových solí v poměru kov:GLPl(7-37) 1:1 až 260:1. Přebytek kovové soli je možno odstranit s použitím odstřeďování a promývání. V tabulce 4 jsou uvedeny výsledky ošetření solemi některých dvojmocných kationtů kovů.

Tabulka 4: Rozpustnost různě ošetřených kiystalů GLP-1 (7-37)

přísada	mg/ml GLP-1 (7-37) v roztoku	mg/ml GLP-l(7-37) v PBS	mg/ml GLP-l(7-37) v PBS/EDTA
žádná (PBS)	1,2	1,2	-
citrát pH 5,2	0,15	-	—
ZnCl₂ pH 5,2	0,03	0,03	1,1
ZnAc pH 5,2	0,01	0,02	1,1
ZnAc pH 6,5	0,06	0,02	0,92
MgSO₄ pH 5,2	0,50	0,55	-
NiSO₄pH 5,2	0,10	0,04	0,45
MnCl₂ pH 5,2	0,10	0,10	—
CaCl₂ pH 5,2	0,40	0,27	-

Pozn.: Krystaly GLP-1 (7-37) se pěstují v roztoku 8 mg/ml IST v 50mM tris o pH 8 s přídavkem 22,5% PEG 600 vH₂O. Všechny roztoky přísady obsahují 100 mM soli dvojmocného kovu v lOmM citrátu o pH 5,2 nebo Na MES o pH 6,5.

-46V,Z. AVUJ¹»! CO

Příklad 38

S použitím metod podle vynálezu byly připraveny jak amorfní, tak mikrokrystalické nízkorozpustné formulace s použitím acetátu zinečnatého. U krys (tři zvířata na jednu formulaci) byly aplikovány subkutánní injekce a radioimunoanalýzou byly měřeny hladiny GLP-l(7-37) v plazmě za 24 h. Obr. 8 znázorňuje prodloužené trvání léčiva v plazmě oproti kontrolní subkutánní injekci rozpustného GLP-l(7-37).

Příklad 39 % hm./obj. polyethylenglykol 3350 (PEG) mg/ml insulinotropin mM fosfátový pufr.

q.s. sterilní voda pro injekce

Pomocí sterilní vody pro injekce byl připraven 50% (hm./hm.) roztok PEG. Zvlášť byl z bezvodého dihydrogenfosforečnanu sodného (26,85 mg/ml) a monohydrátu hydrogenfosforečnanu sodného (1,41 mg/ml) připraven 200mM fosfátový pufr. Podle potřeby bylo pH roztoku pufru upraveno na hodnotu 8 buď hydroxidem sodným, nebo kyselinou chlorovodíkovou. Příslušné množství insulinotropinu bylo rozpuštěno v dostatečném množství roztoku pufru a roztok insulinotropinu o koncentraci 10 mg/ml. K roztoku insulinotropinu bylo přidáno příslušné množství roztoku PEG a roztok byl doplněn na požadovaný objem dostatečným množstvím sterilní vody pro injekce. Výsledný roztok pak byl sterilně přefiltrován filtrem 0,2 μ a asepticky rozplněn do lahviček. Roztok (0,5 ml) byl subkutánně injekčně aplikován krysám a pomocí RIA byla sledována hladina plazmového insulinotropinu.

Příklad 40

1,32 % hm./obj. hydroxyethylcelulóza (HEC) mg/ml insulinotropin mM fosfátový pufr

100 mM chlorid sodný

q.s. sterilní voda pro injekce

S použití sterilní vody pro injekce byl připraven roztok hydroxyethylcelulózy o koncentraci 2 % hm./hm. Zvlášť byl připraven 200mM fosfátový pufr s použitím bezvodého dihydrogenfosforečnanu sodného (26,85 mg/ml) a monohydrátu hydrogenfosforečnanu sodného (1,41 mg/ml). Podle potřeby bylo pH roztoku pufru upraveno na hodnotu 8 buď hydroxidem sodným, nebo kyselinou chlorovodíkovou. Příslušné množství insulinotropinu a chloridu sodného bylo rozpuštěno v dostatečném množství pufru na roztok insulinotropinu o koncentraci 10 mg/ml. K roztoku insulinotropinu bylo přidáno příslušné množství roztoku HEC a roztok byl na požadovaný objem doplněn dostatečným množstvím sterilní vody pro injekce. Výsledný roztok byl pak sterilně přefiltrován filtrem 0,2 μ a asepticky rozplněn do lahviček. Roztok (0,5 ml) byl subkutánně aplikován krysám a analýzou RIA byl sledován plazmový insulinotropin.

Příklad 41 % hm./obj. Pluronic F127 mg/ml insulinotropin mM fosfátový pufr

q.s. sterilní voda pro injekce

-47CZ 296341 B6

S použitím sterilní vody pro injekce byl připraven roztok Pluronicu F127 o koncentraci 20% hm./hm. K rozpuštění polymeru byl použit Polytron (homogenizátor vzorků) s ledovou lázní. Zvlášť byl připraven 200mM fosfátový pufr s použitím bezvodého dihydrogenfosforečnanu sodného (26,85 mg/ml) a monohydrátu hydrogenfosforečnanu sodného (1,41 mg/ml). Podle potřeby bylo pH roztoku pufru upraveno na hodnotu 8 buď hydroxidem sodným, nebo kyselinou chlorovodíkovou. Příslušné množství insulinotropinu bylo rozpuštěno v dostatečném množství pufru na roztok insulinotropinu o koncentraci 10 mg/ml. K roztoku insulinotropinu bylo přidáno příslušné množství roztoku Pluronicu a roztok byl na požadovaný objem doplněn dostatečným množstvím sterilní vody pro injekce. Výsledný roztok byl pak sterilně přefiltrován filtrem 0,2 μ a asepticky rozplněn do lahviček. Roztok (0,5 ml) byl subkutánně aplikován krysám a analýzou RIA byl sledován plazmový insulinotropin.

Příklad 42 suspenze podzemnicového oleje (mleto v kulovém mlýně) mg/ml insulinotropin % Tween 80

K podzemnicovému oleji byl přidán Tween 80 v množství 1 %. Tento roztok byl sterilně přefiltrován přes filtr 0,2 pm. V oleji pak byl suspendován pevný insulinotropin. Velikost částic byla snížena v kulovém mlýně Szesvari Attritor při rychlosti otáčení 40 min¹ po dobu 18 h (plášť se studenou vodou). Vzniklá suspenze pak byla rozplněna do lahviček. Suspenze (0,5 ml) byla subkutánně aplikována krysám a analýzou RIA byla sledována hladina plazmového insulinotropinu.

Příklad 43

22,6 % hm./obj. dextran mg/ml insulinotropin mM fosfátový pufř

q.s. sterilní voda pro injekce

S použitím sterilní vody pro injekce byl připraven roztok dextranu o koncentraci 50 % hm./hm. Zvlášť byl připraven 200mM fosfátový pufr s použitím bezvodého dihydrogenfosforečnanu sodného (26,85 mg/ml) a monohydrátu hydrogenfosforečnanu sodného (1,41 mg/ml). Podle potřeby bylo pH roztoku pufru upraveno na hodnotu 8 buď hydroxidem sodným, nebo kyselinou chlorovodíkovou. Příslušné množství insulinotropinu bylo rozpuštěno v dostatečném množství pufru na roztok insulinotropinu o koncentraci 5,0 mg/ml. K roztoku insulinotropinu bylo přidáno příslušné množství roztoku dextranu a roztok byl na požadovaný objem doplněn dostatečným množstvím sterilní vody pro injekce. Výsledný roztok byl pak sterilně přefiltrován přes filtr 0,2 pm a asepticky rozplněn do lahviček. Roztok (0,5 ml) byl subkutánně aplikován krysám a analýzou RIA byla sledována hladina plazmového insulinotropinu.

Příklad 44

Insulinotropin byl vykrystalován ze směsi fyziologického roztoku s fosfátovým pufrem (PBS), ethanolu a w-kresolu. Ve skleněné lahvičce byla pomocí PBS vytvořena homogenní suspenze insulinotropinu (10 mg/ml) a za míchání obsahu lahvičky magnetickým míchadlem byl do lahvičky přidán velký objem (9násobek objemu suspenze) ethanolu. Vytvořily se velmi jemné amorfní částice insulinotropinu. K lahvičce byl přidán w-kresol do výsledné koncentrace m-kresolu 1 % (obj./obj.). K zamezení odpařování rozpouštědla byla lahvička uzavřena. Krystalizační směs byla uchovávána několik dní při teplotě místnosti. Z amorfních částic vyrostly jehličkovité destičky krystalů. Délka krystalů je mezi 50 a 200 pm a jejich šířka mezi 2 a 4 pm.

-48vz. 150

Příklad 45

Insulinotropin (1 až 4 mg/ml) byl rozpuštěn v 1% roztoku síranu sodného (nebo acetátu sodného, chloridu sodného nebo síranu amonného) při pH vyšším než 8 a pH roztoku bylo zředěnou kyselinou chlorovodíkovou sníženo na 6,0 až 7,5. Čirý roztok byl ponechán stát při teplotě místnosti. Po několika dnech byly získány jehličkovité nebo destičkovité krystaly v závislosti na podmínkách krystalizace.

Příklad 46

GLP-l(7-37) byl při pH 8,5 až 9,5 rozpuštěn v 50 mM glycinovém pufru, obsahujícím 0,1 až 0,2 M NaCl, na koncentraci 1 až 5 mg/ml. Byl přidán roztok zinečnaté solil (acetátu nebo chloridu) vmolámím poměru zinek:GLP-1 (7-37) 0,5:1 až 1,5:1. Přes noc při teplotě místnosti vyrostly krystaly GLP-1 (7-37) s výtěžkem 70 až 97 %.

Příklad 47

Krystaly GLP-1 (7-37) je možno vypěstovat difusí par s použitím peptidu rozpouštěného ve lOOmM tris při pH 8 až 9,5 o koncentraci 10 až 20 mg/ml. Roztok peptidu se smíchá v poměru 1:1 se stejným pufrem, obsahujícím 0,5 až 2,5 M NaCl, pak se ekvilibruje v zataveném systému proti plnému pufru (tj. tris s 0,5 až 2,5 M NaCl).

POPIS SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE (i) PŘIHLAŠOVATEL: Kim,Yessok

Lambert, William J.

Qi, Hong

Gelfand, Robert A. Geoghegan, Kieran F. Danley, Dennis E.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Peptidy s prodlouženým uvolňováním (iii) POČET SEKVENCÍ: 7 (iv) KORESPONDENČNÍ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Pfizerlnc.

(B) ULICE: 235 East 42^nd Street, 20^th Floor (C) MĚSTO: New York (D) STÁT: New York (E) ZEMĚ: USA (F) PSČ: 10017-5755 (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Pateitln Release # 1,0, verse #1,25

-49CZ 296341 B6 (iv) DATA O SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) ZATŘÍDĚNÍ:

(vili) INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Sheyka, Robert F.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 31,304 (C) KONTAKT/ZNAČKA: PC391 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: (212)573-1189 (B) TELEFAX: (212)573-1939 (C) TELEX: N/A (2) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÝ: ne (iv) PROTISMĚR: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-terminální (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: - (B) KMEN: - (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: - (E) HAPLOTYP: - (H) BUNĚČNÁ LINIE: - (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: - (B) KLON: - (viii) POZICE V GENOMU:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT:- (B) POZICE MAPY: - (C) JEDNOTKY: - (xi) POPIS SEKVENCE: ID Č. SEKV. 1

-50VZ. 471KW1 DO

His Asp Glu Phe Glu

Arg

His

Ala Glu Gly 10

Thr Phe Thr Ser

1

5

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu

Gly

Gin

Ala

Lys

Glu

Phe

15

20

25

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

Gly

30

35

(2) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 2 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 aminokyselina (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÝ: ne (iv) PROTISMĚR: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-terminální (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: - (B) KLON: - (viii) POZICE V GENOMU:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT:- (B) POZICE MAPY: - (C) JEDNOTKY: - (xi) POPIS SEKVENCE: ID Č. SEKV. 2

His 1

Ala

Glu

Gly

Thr 5

Phe

Thr

Ser

Asp

Val 10

Ser

Tyr

Leu

Glu 15

Gly

Gin

Ala

Lys 20

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp 25

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

Gly

(2) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 3 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselina

-51 CZ 296341 B6 (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÝ: ne (iv) PROTISMĚR: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-terminální (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: - (B) KMEN: - (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: - (E) HAPLOTYP: - (H) BUNĚČNÁ LINIE: 20 (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: - (B) KLON: - (viii) POZICE V GENOMU:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT:- (B) POZICE MAPY: - (C) JEDNOTKY: - (xi) POPIS SEKVENCE: ID Č. SEKV. 3

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu 15 10

Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys 15 20 25

Gly Arg (2) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 4 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 aminokyselina (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÝ: ne (iv) PROTISMĚR: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-terminální (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

-52ΌΛ 4VOJ41 tíO (A) ORGANISMUS: - (B) KMEN: - (C) INDIVIDUÁLNÍ IZOLÁT: - (E) HAPLOTYP: - (H) BUNĚČNÁ LINIE: - (vii) OKAMŽITÝ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: - (B) KLON: - (viii) POZICE V GENOMU:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT:- (B) POZICE MAPY: - (C) JEDNOTKY: - (xi) POPIS SEKVENCE: ID Č. SEKV. 4

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu

10

Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys 15 20 25

Gly (2) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 5 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 aminokyselina (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÝ: ne (iv) PROTISMĚR: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-terminální (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: - (B) KLON: - (viii) POZICE V GENOMU:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT:- (B) POZICE MAPY: - (C) JEDNOTKY: -53CZ 296341 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: ID Č. SEKV. 5

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu 15 10

Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys 15 20 25 (2) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 6 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 aminokyselina ίο (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÝ: ne (iv) PROTISMĚR: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-terminální (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: - (B) KLON: - (viii) POZICE V GENOMU:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT:35 (B) POZICE MAPY: - (C) JEDNOTKY: - (xi) POPIS SEKVENCE: ID Č. SEKV. 6

His

Asp

Glu

Phe

Glu

Arg

His

Ala

Glu

Gly

Thr

Phe

Thr

Ser

1

5

10

Asp

Val

Ser

Tyr

Leu

Glu

Gly

Gin

Ala

Lys

Glu

Phe

15

20

25

Ile

Ala

Trp

Leu

Val

Lys

Gly

Arg

30

35

-54CZ 296341 B6 (2) INFORMACE O SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO: 7 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 aminokyselina (B) TYP: aminokyselina (C) VLÁKNO: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (h) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÝ: ne (iv) PROTISMĚR: ne (v) TYP FRAGMENTU: N-terminální (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) KNIHOVNA: - (B) KLON: - (viii) POZICE V GENOMU:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT:- (B) POZICE MAPY: - (C) JEDNOTKY: - (xi) POPIS SEKVENCE: ID Č. SEKV. 7

His 1

Ala

Glu

Gly

Thr 5

Phe

Thr

Ser

Asp

Val 10

Ser

Tyr Leu

Glu 15

Gly

Gin

Ala

Lys 20

Glu

Phe

Ile

Ala

Trp 25

Leu

Val

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Prostředek pro zajištění prodloužení insulinotropní účinnosti, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid obecného vzorce

Z-H-A-E-G-T-F-T-S-D-V-S-S-Y-L-E-G-Q-A-A-K-E-F-I-A-W-L-V-X ve kterém

Z nepředstavuje žádný zbytek nebo znamená H-D-E-F-E-R- a

X je vybrán ze souboru sestávající z K, K-G, K-G-R a K-G-R-G, kde polypeptid má rozpustnost rovnou nebo menší než 500 pg/ml za fyziologických podmínek a tento prostředek poskytuje pacientovi, kterému je podáván, koncentrace uvedeného polypeptidů, které dostačují ke zvýšení účinku insulinu v časovém intervalu nezbytném pro dosažení trvalé glykemické kontroly diabetes mellitus nezávislého na insulinu.

1. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že polypeptid je v krystalické nebo amorfní formě.
2. Prostředek podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že polypeptidem je farmaceuticky přijatelná adiční sůl tohoto peptidu s kyselinou.
3. Prostředek podle nároku 1, vyznačující přijatelná karboxylátová sůl tohoto peptidu.
4. Prostředek podle nároku 1, vyznačující přijatelná adiční sůl tohoto peptidu s alkálií.
5. Prostředek podle nároku 1, vyznačující přijatelný nižší alkylester tohoto peptidu.

se t í m , že peptidem je farmaceuticky se tí m , že peptidem je farmaceuticky se tí m , že peptidem je farmaceuticky
6. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptidem je farmaceuticky přijatelný amid tohoto peptidu, přičemž farmaceuticky přijatelný amid je vybrán ze souboru zahrnujícího amid, nižší alkylamid a nižší dialkylamid.
7. Prostředek podle nároku 1, který je formulován pro subkutánní, intramuskulámí, transdermální podání, podání orální inhalací, nasální inhalací nebo pro gastrointestinální podání.
8. Prostředek podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje polymer zvolený ze souboru zahrnujícího polyethylenglykol, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol, kopolymery polyoxyethylenu s polyoxypropylenem, polysacharidy zvolené ze souboru zahrnujícího celulózu, deriváty celulózy, citosan, arabskou gumu, gumu karaya, guarovou gumu, xanthanovou gumu, tragant, kyselinu alginovou karagenan, agarózu a furcellarany, dextran, škrob, deriváty škrobu, kyselinu yaluronovou, polyestery, polyamidy, polyanhydridy a polyortho-estery.
9. Prostředek podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m , že dále obsahuje farmaceuticky přijatelnou s vodou nemísitelnou olejovou suspenzi, kde uvedený olej je zvolen ze souboru zahrnujícího podzemnicový olej, sezamový olej, mandlový olej, ricinový olej, kameliový olej, olej

CZ, 290341 B6 z bavlníkových semen, olivový olej, kukuřičný olej, sojový olej, salforový olej, kokosový olej, estery mastných kyselin a estery alifatických alkoholů.
10. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje smáčedlo, kte-

5 rým je neionogenní povrchově aktivní látka.
11. Prostředek podle nárok 1,vyznačující se tím, že dále obsahuje suspendační činidlo.

10
12. Prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že dále obsahuje kov zvolený ze souboru zahrnujícího dvojmocný zinek Zn(II), dvojmocný nikl Νί(Π), dvojmocný kobalt Co(II), dvojmocný hořčík mg(II), dvojmocný vápník Ca(II), jednomocný draslík K(I), dvojmocný mangan Mn(II), dvojmocné železo Fe(II) a dvojmocnou měď Cu(II).

15
13. Prostředek podle nároku 1, kterým je vodná suspenze schopná prodloužené glykemické kontroly.
14. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje fenolickou sloučeninu, která je vybrána ze souboru zahrnujícího fenol, kresol, resorcinol a methylparaben.
15. Prostředek podle jakéhokoli z nároků 3, 4 nebo 5, vyznačující se tím, že uvedená sůl je zvolena ze souboru zahrnujícího síran amonný, síran sodný, síran lithný, chlorid lithný, citrát sodný, citrát amonný, fosforečnan sodný, fosforečnan draselný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid amonný, acetát sodný, acetát amonný, síran hořečnatý, chlorid vápenatý, dusičnan

25 amonný a formiát sodný a jejich kombinace.