PL180697B1

PL180697B1 - Kompozycja farmaceutyczna o przedluzonym dzialaniu polipeptydu GLP-1 i jego pochodnych stosowana w leczeniu cukrzycy insulinoniezaleznej u ssaków oraz sposób otrzymywania kompozycji farmaceutycznej o przedluzonym dzialaniu polipeptydu GLP-1 i jego pochodnych PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL180697B1
Application number: PL94302370A
Authority: PL
Inventors: Dennis E Danley; Robert A Gelfand; Kieran F Geoghegan; Yesook Kim; William J Lambert; Hong Qi
Original assignee: Scios Inc
Priority date: 1993-04-07
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 2001-03-30
Also published as: ZA94878B; EP0619322A2; AU682328B2; DE69434588D1; HUT68525A; JP4610503B2; ATE314393T1; JPH072695A; KR100186885B1; NO940436L; BR9401185A; EP0619322B1; HK1070589A1; CN1106698A; DE69434588T2; HU225496B1; JP2006213727A; ES2255051T3; HU9400350D0; IL108611A

Abstract

1 Kompozycja farmaceutyczna o przedluzonym dzialaniu polipeptydu GLP-1 i jego pochodnych stosowana w leczeniu cukrzycy insu- l inoniezaleznej, umozliwiajaca przedluzona kontrole glikemii, znamienna tym, ze zawiera ( 1) zwiazek dobrany z grupy, do której naleza (a) peptyd o sekwencji aminokwasowej, His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-GIn-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg- Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI 2) (b) peptyd o sekwencji aminokwasowej His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (NR IDEN- TYFIKACYJNY SEKWENCJI 7) gdzie X dobrany jest z grupy, do której naleza (A) Lys (B) Lys-Gly, 1 (C) Lys-Gly-Arg (c) wykazujaca w wyniku przemiany w organizmie ssaka aktywnosc insulinotropowa pochodna polipeptydu o strukturze pierwszorze- dowej H2N-W-COOH gdzie W stanowi sekwencje aminokwasowa dobrana z grupy, do której naleza His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala- Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI 1) 1 His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala -Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI 6) (d) pochodna polipeptydu o strukturze pierwszorzedowej H2N-R-COOH gdzie R stanowi sekwencje aminokwasowa dobrana z grupy, do której naleza PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu polipeptydu GLP-1 stosowana w leczeniu cukrzycy insulinoniezależnej (NIDDM), oraz sposób jej otrzymywania. Kompozycja według wynalazku zawiera pohpeptydy glukagonopodobne (GLP-1) i ich pochodne.

Sekwencja ammokwasowa GLP-1- znana jest jako:

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 1)

GLP-1 opisali Lopez, L.C. i wsp. w P.N.A.S. USA 80: 5485-5489 (1983); oraz Bell, G.I. i wsp. wNature 302; 716-718 (1983); Heinrich, G. i wsp., Endocrinol. 115: 2176-2181 (1984) i Ghiglione, M. i wsp., Diabetologia 27: 599-600 (1984).

GLP-1 podlega przemianom w trzustce i jelitach, gdzie przetwarzany jest do 31aminokwasowego peptydu, zawierającego aminokwasy 7-37 GLP-1; w dalszym ciągu mniejszego opisu polipeptyd ten zwany jest GLP-1 (7-37).

Stwierdzono, że polipeptyd ten wykazuje aktywność msuhnotropową, tzn. pobudza, pośrednio lub bezpośrednio, syntezę lub ekspresję hormonu insuliny. Z powodu swej aktywności insuhnotropowej, GLP-1 (7-37) nazywany jest, zamiennie, insuhnotropiną.

GLP-1 (7-37) ma następującą sekwencję aminokwasową:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-LysGlu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2).

GLP-1 (7-37), niektóre jego pochodne i ich zastosowanie do leczenia cukrzycy u ssaków opisano w patentach USA 5 118 666 (patent ‘666) i 5 120 712 (patent ‘712), które włącza się do mniejszego opisu przez przywołanie. Do pochodnych GLP-1 (7-37), opisanych w patentach ‘666 i ‘712, należąpohpeptydy zawierające dodatkowo, lub pozbawione, jednego lub więcej aminokwasów, które mogąbyć nieobecne w sekwencji występującej w naturze. Dalsze pochodne GLP-1 (7-37), opisane w patentach ‘666 i ‘712, stanowią niektóre C-końcowe sole, estry i amidy, przy czym sole i estry definiuje się jako OM, gdzie M stanowi farmaceutycznie dopuszczalny kation lub niższa (C] do C₆) rozgałęziona grupa alkilowa, a amidy definiuje się jako -NR²R³, gdzie R² i R³ są takie same lub różne i dobierane są z grupy, do której należą wodór i niższa (C_rC₆) grupa alkilowa.

Niektóre inne pohpeptydy, zwane zamiennie GLP-1 pozbawionym ostatnich aminokwasów lub pozbawioną ostatnich ammokwasów insulinotropmą wykazujące aktywność insulinotropową i ich pochodne, opisano w PCT/US/89/01121 (WO 90/11296). Pohpeptydy te, zwane w dalszym ciągu niniejszego opisu GLP-1 (7-36), GLP-1 (7-35) i GLP-1 (7-34) mają, odpowiednio, następujące sekwencje aminokwasowe.

180 697

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-A la-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 4)

His-Ala-Ghi-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 5).

W opisie patentowym nr WO 90/11296 me ma żadnych wskazówek dotyczących możliwości stworzenia kompozycji służących do przedłużania lub podtrzymywania kontroli poziomu glukozy. W opisie patentowym nr WO 90/11296 ujawniono jedynie takie kompozycje, w których GLP-1 jest uwięziony w liposomach, mikrokapsułkach albuminowych, mikroemułsjach, nanocząsteczkach i nanokapsułkach lub emulsjach (str. 16, cały pierwszy paragraf). Znane kompozycje pozwalają jedynie na zwiększenie ekspresji insuliny bez możliwości kontroli procesu glikemii. W przeciwieństwie do tych znanych kompozycji, kompozycja według wynalazku dotyczy agregatów (skupisk), kompozycji osadowych lub specyficznych kompozycji, które to kompozycje wykazująnowy i nieoczekiwany efekt - przedłużone działanie GLP-1, co umożliwia kontrolę procesu ghkemii czyli utrzymanie stałego poziomu glukozy we krwi.

Do pochodnych polipeptydów, opisanych w PCT/US/89/01121, należą polipeptydy zawierające podstawienia aminokwasowe, lub dodatkowe aminokwasy, dla zwiększenia wiązania się ich z białkiem nośnikowym lub dla zwiększenia ich działania msuhnotropowego Dalsze pochodne insulinotropiny, opisane w PCT/US/89/01121, stanowią niektóre C-końcowe sole, estry i amidy, przy czym sole i estry definiuje się jako OM, gdzie M stanowi farmaceutycznie dopuszczalny kation lub niższą rozgałęzioną lub nierozgałęzioną grupę alkilową a amidy definiuje się jako -NR²R³, gdzie R² i R³ są takie same lub różne i dobierane są z grupy, do której należą wodór i niższa grupa alkilowa.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna stosowana w leczeniu cukrzycy msulinomezależnej do wielokrotnego podawania przez dłuższy okres czasu. W kompozycji według wynalazku substancja czynna wykazuje przedłużone działanie po każdym podaniu. To przedłużone działanie jest niezbędne do zapewnienia utrzymującej się przez dłuższy czas kontroli całości procesu glikemii.

Nieoczekiwanie okazało się, że kompozycja według wynalazku wykazuje wydłużenie okresu obecności GLP-1 we krwi do wartości od 24 do 30 godzin, podczas gdy w znanych rozwiązaniach wartość ta wynosi maksimum 4 godziny. Tak oczekiwane przedłużenie działania GLP-1 pozwala na utrzymującą się przez dłuższy czas kompleksową kontrolę procesu glikemii.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja o przedłużonym działaniu GLP-11 jego pochodnych stosowana w leczeniu cukrzycy msulinomezależnej, umożliwiająca kontrolę procesu glikemii zawierająca:

(i) związek dobrany z grupy, do której należą:

(a) peptyd o sekwencji aminokwasowej:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NRIDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2) (b) peptyd o sekwencji aminokwasowej:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 7) gdzie X dobrany jest z grupy, do której należą:

(A) Lys (B) Lys-Gly, i (C) Lys-Gly-Arg (c) wykazująca w wyniku przemiany w organizmie ssaka aktywność insuhnotropowąpochodna polipeptydu o strukturze pierwszorzędowej

H₂N-W-COOH

180 697 gdzie W stanowi sekwencję aminokwasową dobraną z grupy, do której należą:

His-Asp-GIu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 1) i

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 6) (d) pochodna polipeptydu o strukturze pierwszorzędowej

H₂N-R-COOH gdzie R stanowi sekwencję aminokwasową dobraną z grupy, do której należą

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NRIDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 4)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Iłe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI· 5);

i pochodna peptydów od (a) do (d) z grupy, do której należą:

(1) farmaceutycznie dopuszczalna kwasowa sól addycyjna tych peptydów;

(2) farmaceutycznie dopuszczalna sól karboksylowa tych peptydów;

(3) farmaceutycznie dopuszczalna zasadowa sól addycyjna tych peptydów;

(4) farmaceutycznie dopuszczalny niższy ester alkilowy tych peptydów;

(5) farmaceutycznie dopuszczalny amid tych peptydów, przy czym ten farmaceutycznie dopuszczalny amid dobrany jest z grupy, do której należy amid, niższy amid alkilowy i niższy amid dwualkilowy, 1 (ii) cynk (II) w kompleksie z peptydem.

Kompozycja zawierająca cynk umożliwia utrzymującą się kontrolę procesu glikemu, a kompozycja jest w formie bezpostaciowej, krystalicznej lub w postaci wodnej zawiesiny 1 zawiera cynk oraz peptyd (a)-(d) w stosunku molowym 0,10 do 6.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera związek cynku bezpostaciowy łub krystaliczny.

Inna odmiana wynalazku dotyczy kompozycji zawierającej:

(i) związek dobrany z grupy, do której należą:

(a) peptyd o sekwencji aminokwasowej:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Vał-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gły-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-IIe-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NRIDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2) (b) peptyd o sekwencji aminokwasowej·

(A) Lys (B) Lys-Gly, 1 (C) Lys-Gly-Arg (c) wykazująca w wyniku przemiany w organizmie ssaka aktywność msulmotropowąpochodna pohpeptydu o strukturze pierwszorzędowej

H2N-W-COOH gdzie W stanowi sekwencję aminokwasową dobraną z grupy, do której należą:

180 697

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Giy (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 1) i

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Le u-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 6) (d) pochodna polipeptydu o strukturze pierwszorzędowej

H₂N-R-COOH gdzie R stanowi sekwencję ammokwasową dobraną z grupy, do której należą:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 5);

i pochodna peptydów od (a) do (d) z grupy, do której należą:

(1) farmaceutycznie dopuszczalna kwasowa sól addycyjna tych peptydów;

(2) farmaceutycznie dopuszczalna sól karboksylowa tych peptydów;

(3) farmaceutycznie dopuszczalna zasadowa sól addycyjna tych peptydów;

(4) farmaceutycznie dopuszczalny niższy ester alkilowy tych peptydów;

(5) farmaceutycznie dopuszczalny amid tych peptydów, przy czym ten farmaceutycznie dopuszczalny amid dobrany jest z grupy, do której należy amid, niższy amid alkilowy i niższy amid dwualkilowy, i (u) pohpeptyd zasadowy, związek fenolowy i jon cynku, przy czym kompozycja ta stanowi zawiesinę wodną umożliwiającą utrzymującą kontrolę procesu glikemii, i zawiera 1 do 4 mg/ml peptydu (a)-(d), o stosunku molowym cynku do peptydu (a)-(d) od 0,10 do 6; zasadowego polipeptydu od 0,02 do 1,0 mg/ml i 0,5 do 6 mg/ml związku fenolowego.

Korzystna jest kompozycja, w której ten pohpeptyd zasadowy stanowi protamina.

Innym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania kompozycji farmaceutycznej o przedłużonym działaniu polipeptydu GLP-11 jego pochodnych stosowanej w leczeniu cukrzycy insulinomezależnej, w którym poddaje się wysokim naprężeniom ścinającym i/lub działaniu soli mieszaninę zawierającą:

(i) związek dobrany z grupy, do której należą:

(a) peptyd o sekwencji aminokwasowej:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2) (b) peptyd o sekwencji aminokwasowej:

H₂N-W-COOH gdzie W stanowi sekwencję ammokwasową dobraną z grupy, do której należą:

180 697

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 1) i

His-Asp-Glu-Phe-Ghi-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 6), (d) pochodna polipeptydu o strukturze pierwszorzędowej

H₂N-R-COOH gdzie R stanowi sekwencję aminokwasową dobraną z grupy, do której należą:

i pochodna peptydów od (a) do (d) z grupy, do której należą:

(1) farmaceutycznie dopuszczalna kwasowa sól addycyjna tych peptydów, (2) farmaceutycznie dopuszczalna sól karboksylowa tych peptydów;

(3) farmaceutycznie dopuszczalna zasadowa sól addycyjna tych peptydów;

(4) farmaceutycznie dopuszczalny niższy ester alkilowy tych peptydów;

(5) farmaceutycznie dopuszczalny amid tych peptydów;

przy czym ten farmaceutycznie dopuszczalny amid dobrany jest z grupy, do której należy amid, niższy amid alkilowy 1 niższy amid dwuałkilowy.

W korzystnym wykonaniu warunki te stanowi duże naprężenie ścmające, wystawienie na działanie soli, lub ich kombinacja.

Szczególnie korzystny jest sposób, w którym stosuje się sól dobraną z grupy, do której należy siarczan amonowy, siarczan sodowy, siarczan litowy, chlorek litowy, cytrynian sodowy, cytrynian amonowy, fosforan sodowy, fosforan potasowy, chlorek sodowy, chlorek potasowy, chlorek amonowy, octan sodowy, octan amonowy, siarczan magnezowy, chlorek wapniowy, azotan amonowy 1 mrówczan sodowy; oraz ich kombinacje.

W leczeniu cukrzycy insulinoniezależnej u ssaka, wymagającego takiego leczenia, stosuje się długotrwałe podawanie kompozycji według wynalazku.

O ile me wskazano inaczej, termin „pochodne”, w rozumieniu mniejszego opisu 1 załączonych zastrzeżeń, obejmuje, ale me jest do nich ograniczony, pohpeptydy o przedstawionej strukturze pierwszorzędowej, które na swym końcu C mają jeden lub więcej L-ammokwasów; których C-końcowa grupa karboksylowa tworzy ester z (C_rC₆) grupą alkilową o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu; których C-końcowa grupa karboksylowa tworzy karboksyamid lub podstawiony karboksyamid; których kwasowe reszty aminokwasowe (Asp i/lub Glu) tworzą ester lub karboksamid; i ich kombinacje.

Zakresem mniejszego wynalazku objęte sąpolipeptydy wykazujące homologię do wyżej opisanych peptydów, gdy ta homologia jest wystarczająca do nadania takim polipeptydom aktywności insulinotropowej. Zakresem niniejszego wynalazku objęte są również warianty wyżej opisanych polipetydów, zawierające niekonsekwentne podstawienia aminokwasowe 1 wykazujące aktywność msulinotropową.

Peptyd glukagonopodobny - 1 (7-37), jego wyizolowywame, charakterystykę i zastosowanie w leczeniu cukrzycy opisano w patencie USA nr 5 118 66615 120 712, które w całości włącza się do mniejszego opisu przez przywołanie.

180 697

Długotrwały wysoki poziom w osoczu GLP-11 pokrewnych pohpeptydów jest niezbędny zarówno w czasie posiłków, jak i poza nimi, dla osiągnięcia utrzymującej się kontroli procesu ghkemii u pacjentów z cukrzycą insulinomezależną. Niespodziewanie stwierdzono, że wzrost poziomu GLP-1 i pokrewnych polipeptydów wyłącznie tuż przed, w czasie i tuż po posiłkach, nawet przez okres do jednej godziny, me zapewnia odpowiedniej kontroli poziomu glukozy. Tak więc podawanie GLP-1, i pokrewnych peptydów, wymaga systemu przedłużonego uwalniania Ten system przedłużonego uwalniania wzmaga działanie insuliny.

Zwrot „wzmaganie działania insuliny”, w rozumieniu niniejszego opisu i załączonych zastrzeżeń, obejmuje, ale nie jest do nich ograniczony, jedno lub więcej z następujących zjawisk: zwiększanie syntezy insuliny, zwiększanie wydzielania insuliny, zwiększanie wychwytu glukozy przez tkankę mięśniowąi tłuszczową oraz zmniejszanie produkcji glukozy przez wątrobę.

Polipeptydy według wynalazku wytwarzane są różnymi sposobami dobrze znanymi specjalistom. Na przykład polipeptydy syntetyzować można z zastosowaniem automatycznych urządzeń do syntezy peptydów takich, jak syntezator peptydowy fazy stałej Applied Biosystems (ABI) 430A. Zamiast tego, polipeptydy według wynalazku wytwarzać można z zastosowaniem rekombinacyjnej technologii DNA, przy czym sekwencja DNA, kodująca polipeptyd, przyłączona jest w sposób umożliwiający jej działanie do wektora ekspresyjnego i stosuje się ją do transformacji odpowiedniej komórki gospodarza. Stransformowanąkomórkę gospodarza hoduje się następnie w warunkach, w których polipeptyd ulega ekspresji. Polipeptyd odzyskuje się następnie z hodowli. Można także zastosować kombinację syntezy i technik rekombinacji DNA dla wytworzenia pochodnych amidowych lub estrowych według wynalazku i/lub dla wytworzenia fragmentów pożądanego pohpeptydu, które następnie łączy się sposobami dobrze znanymi specjalistom. Pochodne polipeptydów wytwarza się sposobami dobrze znanymi specjalistom. Na przykład, pochodne pohpeptydów według wynalazku, zawierające na końcu C ester alkilowy, wytwarza się, poddając pożądany (C[-C₆) alkohol reakcji z pożądanym polipeptydem w obecności kwasu katalitycznego takiego, jak HC1. Odpowiednie warunki reakcji dla wytworzenia takiego estru alkilowego stanowią: temperatura reakcji wynosząca około 50°C i czas reakcji wynoszący około 1 godziny do około 3 godzin. Podobnie, wytworzyć można w ten sposób pochodne pohpeptydów według wynalazku, zawierające estry (C_rC₆)alkilowe reszt Asp i/lub Glu.

Pochodne karboksyamidowe pohpeptydów według wynalazku można również wytworzyć metodami syntezy peptydów fazy stałej, dobrze znanymi specjalistom. Por. np. Solid Phase Peptide Synthesis, Stewart, J. M. i wsp. Pierce Chem. Co. Press, 1984.

Zamiast, lub w kombinacji z powyżej opisanymi sposobami, pochodne polipeptydów według wynalazku wytwarzać można, modyfikując sekwencję kodującą DNA dla takiego peptydu tak, aby zasadową resztę aminokwasową zastąpić inną zasadową resztą aminokwasową lub kwasową lub obojętną resztą aminokwasową albo kwasową resztę aminokwasową zastępuje się inną kwasową resztą aminokwasową lub zasadową lub obojętną resztą aminokwasową albo obojętną resztę aminokwasową zastępuje się inną obojętną resztą aminokwasową lub kwasową lub zasadową resztą aminokwasową. Takich zmian pierwszorzędowej sekwencji polipeptydów dokonać można także poprzez bezpośrednią syntezę pochodnej. Sposoby takie są dobrze znane specjalistom. Oczywiście, aby pochodne takie były przydatne w zastosowaniu według wynalazku, muszą one wykazywać działanie msulinotropowe.

Aktywność insuhnotropową pochodnej polipeptydu według wynalazku określa się w następujący sposób.

Wyizolowuje się wyspy trzustkowe z tkanki trzustkowej uzyskanej od normalnych szczurów, stosując modyfikację metody opisanej przez Lacy, P.E., i wsp., w Diabetes 16: 35-39 (1967), w której produkt trawienia tkanki trzustkowej przez kolagenazę oddziela się na gradiencie Ficolla (27%, 23%, 20,5% i 11%) w zrównoważonym roztworze soli Hanksa o pH o wartości 7,4. Wyspy zbiera się z powierzchni granicznej 20,5%, 5%, 11%, płucze i oczyszcza ręcznie z wydzielmy i innych tkanek pod mikroskopem dwuokularowym o dwóch tubusach. Wyspy inkubuje się przez noc w pożywce RPMI 1640, uzupełnionej 10% bydlęcą surowicą płodową i zawierającej 11 mM glukozy, w temperaturze 37°C w 95% powietrza/5% CO₂ Wyspy przenosi

180 697 się następnie do pożywki RPMI 1640, uzupełnionej 10% bydlęcą surowicą płodową i zawierającej 5,6 mM glukozy. Wyspy inkubuje się przez 60 minut w temperaturze 37°C w 95% powietrza /5% CO₂. Pochodną polipeptydu, przeznaczona do dalszych badań, wytwarza się w stężeniu 1 nM i 10 nM w pożywce RPMI zawierającej 10% bydlęcą surowicę płodową i zawierającej 16,7 mM glukozy, około 8-10 wyizolowanych wysp przenosi się następnie pipetą do całkowitej objętości 250 μΐ pożywki zawierającej pochodnąpohpeptydu w 96-zagłębieniowej płytce do mikromiareczkowania. Wyspy inkubuje się następnie w obecności pochodnej pohpeptydowej w temperaturze 37°C w 95% powietrza/5% CO₂, przez 90 minut. Następnie zbiera się jednakowej objętości próbki pożywki nie zawierającej wysp trzustkowych i mierzy się ilość insuliny zawartej w 100 μΐ tej pożywki testem radioimmunologicznym, stosując zestaw Equate Insulin RIA Kit (Binax, Inc., Portland, ME).

Dawkowanie skuteczne w leczeniu cukrzycy rozpoczynającej się w wieku dorosłym wynosi około 1 pg/kg do 1000 pg/kg dziennie przy podawaniu pochodnej polipeptydowej według wynalazku, na przykład, dożylnie, domięśniowo lub podskórnie. W przypadku podawania dożylnego w czasie posiłków i między posiłkami korzystne dawki wynoszą od około 4 do 10 ng/kg/min lub około 0,6-1,4 pg/dzień, dla pacjenta o masie 100 kg. Należyjednak zaznaczyć, że możliwe są wyższe lub niższe dawki i są one również objęte zakresem wynalazku. Odpowiednie dawki mogą być i będą określane przez lekarza zapisującego kompozycję w zależności od ciężkości danego przypadku, jak również odpowiedzi uzyskiwanej przy podawaniu pochodnej oraz wieku, wagi, płci pacjenta oraz danych z wywiadu lekarskiego.

Przedłużone podawanie osiągnąć można przez podawanie podskórne, domięśniowe lub przezskóme, wziewanie doustne, wziewanie donosowe, podawanie doustne lub podawanie w pompie infuzyjnej.

Przedłużone podawanie GLP-1 i pokrewnych peptydów osiągać można także stosując kompozycję w postaci roztworu w różnych polimerach rozpuszczalnych w wodzie. Polimery te są na ogół polimerami o niskiej masie cząsteczkowej (< 15 kDa). Nieograniczające przykłady takich polimerów o niskiej masie cząsteczkowej stanowią alkohol poliwinylowy oraz kopolimery polioksyetyleno-polioksypropylenowe. Stosować można polimery o wyższej masie cząsteczkowej. Nieograniczające przykłady takich polimerów o wyższej masie cząsteczkowej stanowią wielocukry takie, jak chitozan, guma arabska, guma karaya, guma guar, guma ksantanowa, tragakanta, kwas alginowy, karagenma, agaroza i furcelleran. W tym ostatnim przypadku korzystne sąpolimery ulegające in vivo degradacji enzymatycznej lub hydrolitycznej, jak np. dekstran, skrobia i jej pochodne, kwas hiahironowy, wielobezwodniki oraz poliortoestry. Akumulacji tkankowej, związanej ze stosowaniem polimerów o wysokiej masie cząsteczkowej i nie ulegających biologicznej degradacji, unika się, stosując polimery o niskiej masie cząsteczkowej lub polimery ulegające biologicznej degradacji. Kompozycje typowo zawierają GLP-1, lub pokrewne peptydy, w ilości około 1 mg/ml, przy czym stężenie zależy od polimeru, lecz typowo nie przekracza wartości, przy której osiągana jest lepkość 50 cps, i możliwie odpowiedni bufor, środek tonizujący i konserwujący. Dane z badań in vivo u szczurów i człowieka wykazują ze takie preparaty umożliwiają osiągnięcie mierzalnego poziomu insulinotropiny we krwi przez okres np. do 24 godzin. Przeciwnie, insulinotropina w postaci, na przykład, preparatu zawierającego sól fizjologiczną zbuforowaną fosforanem, daje w wyniku szybkie (w ciągu około 15 minut) osiągnięcie szczytowego poziomu w osoczu, a następnie poziom w osoczu spada poniżej granic wykrywalności w czasie wynoszącym nieco powyżej 4 godzin. Wykresy stężenia w osoczu w funkcji czasu sugerują że szybkość wchłaniania insulinotropiny, na przykład, z miejsca wstrzyknięcia, ulega znacznemu zmniejszeniu w obecności polimerów.

GLP-11 pokrewne peptydy mogą być także wytwarzane w postaci cząstek zawieszonych w farmaceutycznie dopuszczalnym oleju. Korzystnymi olejami są trój glicerydy. Nieograniczające przykłady takich olejów stanowią olej arachidowy, olej sezamowy, olejek ze słodkich migdałów, olej rycynowy, olej kamehowy, olej z nasion bawełny, oliwa, olej kukurydziany, olej sojowy, olej szafranowy i olej kokosowy. Dopuszczalne są oleje innych klas pod warunkiem, że olej jest me mieszający się z wodą i peptyd słabo się w nim rozpuszcza. Kompozycja farmaceutyczna

180 697 zawierać również może odpowiednie środki konserwujące, zwilżające i zawieszające. Procentowa zawartość wagowa insulinotropiny w kompozycji może, na przykład, wahać się od 0,01 do 10%. Dane z badań in vivo u szczurów wykazują, że takie kompozycje umożliwiają osiągnięcie mierzalnego poziomu insulinotropiny we krwi przez okres np. do 24 godzin. Przeciwnie, insuhnotropina w postaci, na przykład, kompozycji zawierającej sól fizjologicznązbuforowaną fosforanem, daj e w wyniku szybkie (w ciągu około 15 minut) osiągnięcie szczytowego poziomu w osoczu, a następnie poziom w osoczu spada poniżej granic wykrywalności w czasie wynoszącym nieco powyżej 4 godzin. Wykresy stężenia w osoczu w funkcji czasu sugerują, że szybkość wchłaniania insulinotropiny z miejsca wstrzyknięcia ulega znacznemu zmniejszeniu w zawiesinach olejowych.

GLP-1 i peptydy pokrewne można również wytwarzać w postaci słabo rozpuszczalnej do podawania w połączeniu z jonem metalu, korzystnie, w postaci soli. Korzystny jon stanowi cynk (II). Połączenie może dać w wyniku preparat bezpostaciowy lub krystaliczny.

Innąpostacią o przedłużonym uwalnianiu j est wodna zawiesina osadów lub agregatów insulinotropiny, wytworzonych z zastosowaniem środków strącających, np. związków fenolowych lub pohpeptydów zasadowych, lub jonów lub soli metali, i/lub z zastosowaniem dużego naprężenia ścinającego. Można stosować jednocześnie więcej niż jeden środek strącający. Osady mogą być krystaliczne lub bezpostaciowe.

Kryształy insulinotropiny otrzymać można z roztworu kompozycji w wodzie, stosując gradient pH (od wartości wysokich do niskich lub też od wartości niskich do wysokich) i/lub gradient temperatury i/lub soli dla zmniejszenia rozpuszczalności. Możliwe sole stanowią cytrynian amonowy, fosforan sodowy lub potasowy, chlorek sodowy, potasowy lub amonowy, octan sodowy lub amonowy, siarczan magnezowy, chlorek wapniowy, azotan amonowy, mrówczan sodowy i wszelkie inne sole, mogące zmniejszyć rozpuszczalność kompozycji. Jeśli sól stosowana do krystalizacji nie jest dopuszczalna farmaceutycznie, ciecz macierzystą po zakończeniu krystalizacji zastąpić można środkiem farmaceutycznie dopuszczalnym. Jeżeli dla osiągnięcia pożądanego profilu farmakokinetycznego niezbędne jest dalsze zmniejszenie rozpuszczalności kompozycji, kryształy poddawać można obróbce jonami metali takich, jak cynk lub wapń, i/lub związkami fenolowymi. Obróbki dokonuje się dodając po prostu tych środków do zawiesiny.

Rozpuszczalność kryształów lub osadów insulinotropiny w warunkach fizjologicznych wahać się może od poniżej 1 pg/ml do 500 pg/ml. Dane z badań in vivo u szczurów wykazują, że takie kompozycje umożliwiają osiągnięcie mierzalnego poziomu insulinotropiny we krwi przez, na przykład, co najmniej 30 godzin.

Środowisko wodne używane do produkcji powyższych kompozycji mogą stanowić jakiekolwiek systemy buforowe, możliwe do zastosowania we wstrzyknięciach, lub nawet czysta woda. pH końcowej postaci kompozycji może mieć dowolną wartość pod warunkiem, że kompozycję tę podaje się do stosowania we wstrzyknięciach. Protaminę dodawać można w postaci dowolnej soli (np. siarczanu, chlorku itd.) lub zasady protaminowej. Przy wytwarzaniu kompozycji stosować można np. następujące zakresy stężeń składników: fenol - 0,5-5,0 mg/ml, m-krezol- 0,5-5,5 mg/ml, protamina- 0,02-1,0 mg/ml, cynk -w stosunku molowym cynku do insulinotropiny 0,10-6, chlorek sodowy - do 100 mg/ml, bufor fosforanowy - 5-500 M.

Stosować można również inne związki fenolowe lub niefenolowe. Nieograniczające przykłady takich związków stanowią: rezorcyna, metylparaben, propylparaben, alkohol benzylowy, chlorokrezol, krezol, benzaldehyd, katechol, pirogallol, hydrochinon, galusan n-propylowy, butylowany hydroksyanizol, butylowany hydroksytoluen. Nie ograniczające przykłady polipeptydów zasadowych stanowią pohlizyna, poliarginina itp.

Wyniki badań kompozycji zawierających GLP-1 przedstawiono na załączonych rysunkach na których: figura 1 przedstawia wpływ długotrwałego podawania (7 godzin) 4 ng/kg/min insulinotropiny na poziom glukozy w osoczu u pacjentów chorych na cukrzycę insulinoniezależną. Figura 2 wpływ krótkiego podawania (60 minut) 10 ng/kg/min insulinotropiny na poziom glukozy w osoczu u pacjentów chorych na cukrzycę insulinoniezależną. Figura 3 - wpływ długotrwałego podawania (7 godzin) 2 ng/kg/min i 4 ng/kg/mm insulinotropiny na poziom glukozy w osoczu u pacjentów chorych na cukrzycę insulinoniezależną. Figura 4 pokazuje średnie (n=3) stężenie insulinotropiny w

180 697 osoczu szczurów po podskórnym podaniu im pojedynczych dawek 0,5 mg/0,5 ml w różnych zawiesinach wodnych. Figura 5 - średnie (n=3) stężenie insulmotropiny w osoczu szczurów po podskórnym podaniu im pojedynczych dawek 0,5 mg/0,5 ml w różnych zawiesinach wodnych. Figura 6 - średnie (n=3) stężenie insulinotropiny w osoczu szczurów po podskórnym podaniu im pojedynczych dawek 0,5 mg/0,5 ml w różnych zawiesinach wodnych. Figura 7 - średnie (n=3) stężenie insulinotropiny w osoczu szczurów po podskórnym podaniu im pojedynczych dawek 0,5 mg/0,5 ml w różnych zawiesinach wodnych. Figura 8 - średnie (n=3) stężenie insulinotropiny w osoczu szczurów po podskórnym podaniu im pojedynczych dawek 0,5 mg/0,13 ml w różnych zawiesinach wodnych. Figura 9 - średnie (n=3) stężenie insulinotropiny w osoczu szczurów po podskórnym podaniu im pojedynczych dawek 0,5 mg/0,13 ml w różnych zawiesinach wodnych. Figura 10 przedstawia badania farmakokinetyczne insulinotropinowego osadu cynkowego. Figury 1-3 przedstawiają wpływ podania insulinotropiny na poziom glukozy w osoczu krwi u pacjentów cierpiących na cukrzycę typu U. Na rysunkach obserwujemy około 2-krotny spadek stężenia glukozy w osoczu krwi, na skutek długotrwałego (przez 7 godzin) lub krótkotrwałego (60 min) podania insulinotropiny.

Jednakże we wszystkich doświadczeniach (w przypadku krótkotrwałego i długotrwałego wlewu insulinotropiny) wraz z zakończeniem podawania tego związku następuje powrót stężenia glukozy w osoczu do wartości wyj ściowej, lub nawet wyższej (zwłaszcza j ak przedstawiono na figurze 2, gdzie doświadczenie zostało przeprowadzone w trakcie posiłku). Zatem wydzielanie insuliny (czego rezultatem jest obniżenie glukozy w osoczu krwi), jest ściśle skorelowane z obecnością w organizmie pacjenta insulinotropiny. Wyniki te otrzymano stosując znane preparaty farmaceutycznie zawierające związki aktywne oparte na sekwencji aminokwasowej GLP-1.

W przypadku preparatów farmaceutycznych będących przedmiotem niniejszego wynalazku stężenie insulinotropiny utrzymywane jest na prawie stałym poziomie po jednorazowym podaniu zawiesiny wodnej przez ok. 24 godziny. Figury 4-9 przedstawiają stężenia insulinotropiny po podaniu jednorazowej dawki o stężeniu 0,5 mg/ml, poszczególnych zawiesin wodnych (z ang. Aqueous Suspension - AS). W przykładach, będących częścią opisu ujawniono skład jakościowy i ilościowy badanych zawiesin. Na figurze 1 przedstawiono stężenie insulinotropiny w osoczu krwi podanej w zawiesinach wodnych Al, A2, A3, A4, A5, A6 i A7. Skład zawiesin wodnych AS 1 - AS7 ujawniająprzykłady 1 - 7, i są one następujące: zawiesina wodna AS 1:1 mg/ml insuhnotropiny w PBS; 0,3 mg/ml zasady protaminowej oraz 2,2 mg/ml fenolu w PBS; zawiesina wodna AS2: 1 mg/ml insulinotropiny w PBS; 0,075 mg/ml zasady protaminowej oraz 2,2 mg/ml fenolu w PBS; zawiesina wodna AS3: 1 mg/ml insulinotropiny w PBS; 0,3 mg/ml zasady protaminowej oraz 2,2 mg/ml fenolu i 16 mg/ml gliceryny w PBS; zawiesina wodna AS4:1 mg/ml insulinotropiny w PBS; 0,3 mg/ml zasady protaminowej oraz 2,5 mg/ml m-krezolu w PBS; zawiesina wodna AS5:1 mg/ml insulinotropiny w PBS; oraz 2,2 mg/ml fenolu w PBS; zawiesina wodna AS6: 1 mg/ml insulinotropiny w PBS; 2,2 mg/ml fenolu i 0,019 zasady protaminowej w PBS; zawiesina wodna AS7:1 mg/ml insulinotropiny w PBS; 0,038 mg/ml zasady protaminowej oraz 2,2 mg/ml fenolu w PBS. Analogicznie w przykładach 8-12 ujawniono skład zawiesin wodnych AS12, AS15, AS16, AS17 oraz AS18, których działanie przedstawiono na fig. 5. W przykładach 13 -16 ujawniono skład zawiesin wodnych 16AS22, AS23, AS241AS25, których działanie przedstawiono na fig. 6. Skład zawiesin wodnych AS 29 oraz A31, których działanie przedstawiono na rys. 7 ujawniono w przykładzie 17118. Skład zawiesin wodnych AS51, AS52, AS69 i AS71, których działanie przedstawiono na rys.8 ujawniono w przykładzie 19,20,21,22 oraz zawiesin AS531AS64, których działanie przedstawiono na fig. 9, ujawniono w przykładach 23 i 24. Rysunek 10 przedstawia wyniki badań farmakokinetycznych osadu insulinotropiny w obecności jonów cynku. Obecność jonów cynku powoduje znaczne wydłużenie czasu, względem kontroli, gdy stężenie insulinotropiny we krwi jest znaczące. Wynik podobny przedstawi fig. 8, na którym przedstawiono wyniki otrzymane dla zawiesiny wodnej AS52, zawierającej oprócz związku aktywnego (insulinotropina) również jony metalu (w postaci dwuwodnego octanu cynku) i fenolu. Dzięki zastosowaniu jonów metalu otrzymano wydłużenie

180 697 działania zawiesiny wodnej z 24 do 30 godzin, co potwierdza wyjątkowość roztworu zwierającego jony metalu.

Po ogólnym opisaniu wynalazku, podaj emy poniżej szczegółowe przykłady, które nie ograniczają zakresu niniejszego wynalazku.

Przykład 1

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu Al

Do 5 ml kolby pomiarowej odważono 10 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 4 ml soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem (phosphate buffered salinę - PBS) dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Dodano PBS w ilości wystarczającej („ile potrzeba” - ąuantum satis - q.s.) do wypełnienia kolby. Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 20 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano PBS w ilości q.s. Zawartość obu kolb połączono, filtrując ją szklaną strzykawką przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór Al zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu BI

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 8 mg siarczanu protaminy i 44 mg fenolu. Dodano q.s. PBS dla rozpuszczenia siarczanu protaminy i fenolu. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór Β1 zawierał 0,6 mg/ml zasady protaminowej i 4,4 mg/ml fenolu w PBS.

Zawiesina wodna 1

1,5 ml roztworu Al przeniesiono zapomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typul. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocą pipety 1,5 ml roztworu BI do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano delikatnemu mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 1 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny, 0,3 mg/ml zasady protaminowej i 2,2 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę te zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 2

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A2

Do 5 ml kolby pomiarowej odważono 10 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 4 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 20 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano PBS w ilości q.s. Zawartość obukolb połączono, filtrując ją szklaną strzykawką przez fi ltr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A2 zawierał 2 mg/ml insuhnotropmy w PBS.

Wytwarzanie roztworu B2

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 2 mg siarczanu protaminy i 44 mg fenolu. Do kolby dodano q.s. PBS dla rozpuszczenia siarczanu protaminy i fenolu. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B2 zawierał 0,15 mg/ml zasady protaminowej i 4,4 mg/ml fenolu w PBS.

Zawiesina wodna 2

1,5 ml roztworu A2 przeniesiono za pomocą pipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocą pipety 1,5 ml roztworu B2 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 2 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny, 0,075 mg/ml zasady protaminowej i 2,2 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę te zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 3

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A3

180 697

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 20 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A3 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A3 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B3

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 8 mg siarczanu protaminy, 44 mg fenolu i 323 mg gliceryny. Do kolby dodano q.s. PBS dla rozpuszczenia siarczanu protaminy, fenolu i gliceryny. Roztwór ten przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B3 zawierał 0,6 mg/ml zasady protaminowej, 4,4 mg/ml fenolu i 32 mg/ml gliceryny w PBS.

Zawiesina wodna 3

1,5 ml roztworu A3 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 1,5 ml roztworu B3 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 3 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny, 0,3 mg/ml zasady protaminowej, 2,2 mg/ml fenolu i 16 mg/ml gliceryny w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakologicznych in vivo u szczurów

Przykład 4

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A4

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 20 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A4 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm (Milhpore Millex-GV) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A4 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B4

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 8 mg siarczanu protaminy i 52 mg m-krezolu. Dodano q.s. PBS dla rozpuszczenia siarczanu protaminy i m-krezolu. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B4 zawierał 0,6 mg/ml zasady protaminowej i 5 mg/ml m-krezolu w PBS.

Zawiesina wodna 4

1,5 ml roztworu A4 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 1,5 ml roztworu B4 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania kryształów. Zawiesina wodna 4 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny, 0,3 mg/ml zasady protaminowej, 2,5 mg/ml mkrezolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokmetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 5

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A5

Do 25 ml kolby pomiarowej odważono 50 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 23 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A5 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 50 ml fiolki szklanej. Roztwór A5 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu podstawowego fenolu

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 0,44 g fenolu. Do kolby dodano około 95 ml PBS dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q.s. PBS dla rozpuszczenia fenolu. Powstały roztwór (4,4 mg/ml fenolu) zastosowano do wytworzenia roztworu B5.

Wytwarzanie roztworu B5

Roztwór B5 wytworzono przez przefiltrowanie 25 ml roztworu podstawowego fenolu przez filtr 0,2 pm do 50 ml fiolki szklanej. Roztwór B5 zawierał 4,4 mg/ml fenolu w PBS.

180 697

Zawiesina wodna 5

1,25 ml roztworu A5 przeniesiono za pomocą pipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 1,25 ml roztworu B5 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 5 zawierała 1 mg/ml insulinotropmy 12,2 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 6

Zawiesina msulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A6

Do 25 ml kolby pomiarowej odważono 50 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 23 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A6 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 50 ml fiolki szklanej. Roztwór A6 zawierał 2 mg/ml insulinotropmy w PBS.

Wytwarzanie roztworu podstawowego fenolu

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 0,44 g fenolu Do kolby dodano około 95 ml PBS dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q.s. PBS dla rozpuszczenia fenolu. Powstały roztwór (4,4 mg/ml fenolu) zastosowano do wytworzenia roztworu B6.

Wytwarzanie roztworu B6

Roztwór B6 wytworzono odważając 1,25 mg siarczanu protaminy do 25 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 20 ml roztworu postawowego fenolu dla rozpuszczenia siarczanu protaminy. Do kolby dodano q.s. roztworu podstawowego fenolu. Roztwór B6 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 50 ml fiolki szklanej. Roztwór B6 zawierał 4,4 mg/ml fenolu i 0,038 zasady protaminowej w PBS.

Zawiesina wodna 6

1,25 ml roztworu A6 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 1,25 ml roztworu B6 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiołki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 6 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny, 2,2 mg/ml fenolu i 0,019 mg/ml zasady protaminowej w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 7

Zawiesina msulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A7

Do 25 ml kolby pomiarowej odważono 50 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 23 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A7 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 50 ml fiolki szklanej. Roztwór A7 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu podstawowego fenolu

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 0,44 g fenolu. Do kolby dodano około 95 ml PBS dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q.s. PBS dla rozpuszczenia fenolu. Powstały roztwór (4,4 mg/mł fenolu) zastosowano do wytworzenia roztworu B7.

Wytwarzanie roztworu B7

Roztwór B7 wytworzono odważając 2,5 mg siarczanu protaminy do 25 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 20 ml roztworu podstawowego fenolu dla rozpuszczenia siarczanu protaminy. Do kolby dodano q.s. roztworu podstawowego fenolu. Roztwór B7 przefiltrowano przez filtr 0,22 pmm do 50 ml fiolki szklanej. Roztwór B7 zawierał 4,4 mg/ml fenolu i 0,075 zasady protaminowej w PBS.

Zawiesina wodna 7

1,25 ml roztworu A7 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 1,25 ml roztworu B7 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość

180 697 fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 7 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny, 2,2 mg/ml fenolu i 0,038 mg/ml zasady protaminowej w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokmetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 8

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A12

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 20 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A12 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A12 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Roztwór B12

Roztwór B12 wytworzono odważając 20 mg fenolu do 10 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 8 ml PB S dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q. s. PB S. Roztwór B12 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B12 zawierał 2 mg/ml fenolu w PB S.

Zawiesina wodna 12 ml roztworu Al2 przeniesiono za pomocąpipety do 10 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 4 ml roztworu B12 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 12 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny 11 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokmetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 9

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu Al 5

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 20 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 8 ml buforu fosforanowego (phosphate buffer - PB) dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PB. Roztwór Al 5 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór Al5 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PB.

Wytwarzanie roztworu B15

Roztwór B15 wytworzono odważając 8 mg siarczanu protaminy do 10 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 8 ml PB dla rozpuszczenia siarczanu protaminy. Do kolby dodano q.s. PB. Roztwór BI5 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór BI5 zawierał 0,6 mg/ml zasady protammowej w PBS.

Zawiesina wodna 15 ml roztworu A15 przeniesiono za pomocąpipety do 10 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 3 ml roztworu B15 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 15 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny i 0,3 mg/ml zasady protaminowej w PB. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 10

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu Al6

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 20 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 8 ml PB dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PB. Roztwór Al 6 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A16 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PB.

Wytwarzanie roztworu B16

Roztwór BI6 wytworzono odważając 44 mg fenolu do 10 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 8 ml PB dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q.s. PB. Roztwór B16 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B15 zawierał 4,4 mg/ml fenolu w PB.

180 697

Zawiesina wodna 16 ml roztworu Al 6 przeniesiono za pomocą pipety do 10 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocą pipety 3 ml roztworu B16 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 16 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny 12,2 mg/ml fenolu w PB. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in νινο u szczurów.

Przykład 11

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Zawiesina wodna 17

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 10 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 8 ml PB dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PB. Zawartość kolby przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej typu I. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 17 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny PB. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 12

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Zawiesina wodna 18

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 10 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS Zawartość kolby przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej typu I. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano delikatnemu mieszaniu (zważając, aby nie utworzyła się piana ani pęcherzyki) przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesma wodna 18 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 13

Zawiesina insulinotropiny (0,2 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A22

Roztwór A22 wytworzono odważając 2 mg insulinotropiny do 5 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 3 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A22 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A22 zawierał 0,4 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B22

Roztwór B22 wytworzono odważaj ąc 44 mg fenolu do 10 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór B22 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B22 zawierał 4,4 mg/ml fenolu w PBS.

Zawiesina wodna 22

1,5 ml roztworu A22 przeniesiono za pomocą pipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocą pipety 1,5 ml roztworu B22 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 22 zawierała 0,2 mg/ml insulinotropiny i 2,2 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 14

Zawiesina insulinotropiny (0,2 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A23

Roztwór A23 wytworzono odważając 2 mg insulinotropiny do 5 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 3 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A23 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A23 zawierał 0,4 mg/ml insulinotropiny w PBS.

180 697

Wytwarzanie roztworu B23

Roztwór B23 wytworzono odważając 8,8 mg fenolu do 10 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór B23 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B23 zawierał 0,88 mg/ml fenolu w PBS

Zawiesina wodna 23

1,5 ml roztworu A23 przeniesiono za pomocą pipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I.

Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 1,5 ml roztworu B23 do fiołki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 23 zawierała 0,2 mg/ml insulinotropmy 10,44 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 15

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A24

Roztwór A24 wytworzono odważając 10 mg insulinotropiny do 5 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 3 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A24 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A24 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B24

Roztwór B24 wytworzono odważając 8 mg siarczanu protaminy do 10 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozpuszczenia siarczanu protaminy. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór B24 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B24 zawierał 0,6 mg/ml zasady protaminowej w PBS.

Zawiesina wodna 24

1,5 ml roztworu A24 przeniesiono za pomocą pipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I.

Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 1,5 ml roztworu B24 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 24 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny i 0,3 mg/ml zasady protammowej w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 16

Zawiesina insulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A25

Roztwór A25 'wytworzono odważając 10 mg insulinotropiny do 5 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 3 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A25 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A25 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B25

Roztwór B25 wytworzono odważając 53 mg m-krezolu do 10 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozpuszczenia m-krezolu. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór B25 przefilrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B25 zawierał 5,3 mg/ml m-krezolu w PBS.

Zawiesina wodna 25

1,5 ml roztworu A25 przeniesiono za pomocą pipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I.

Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocą pipety 1,5 ml roztworu B25 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 25 zawierała 1 mg/ml insulinotropiny i 2,5 mg/ml m-krezolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych m vivo u szczurów.

180 697

Przykład 17

Zawiesina insulinotropiny (0,5 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A29

Roztwór A29 wytworzono odważając 25 mg msulinotropiny do 25 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 20 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A29 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 50 ml fiolki szklanej. Roztwór A29 zawierał 1 mg/ml msulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B29

Roztwór B29 wytworzono odważając 50 mg fenolu do 50 ml kolby pomiarowej Do kolby dodano około 40 ml PBS dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór B29 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 50 ml fiolki szklanej. Roztwór B29 zawierał 1,0 mg/ml fenolu w PBS.

Zawiesina wodna 29

1,5 ml roztworu A29 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I.

Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 1,5 ml roztworu B29 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny Zawiesina wodna 29 zawierała 0,5 mg/ml insulinotropiny 10,5 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 18

Zawiesina msulinotropiny (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A31

Do 5 ml kolby pomiarowej odważono 10 mg insulinotropiny. Do kolby dodano około 4 ml PBS dla rozproszenia i rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A31 przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A31 zawierał 2 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B31

Roztwór B31 wytworzono odważając 50 mg fenolu do 50 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 40 ml PBS dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór B31 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 50 ml fiolki szklanej. Roztwór B31 zawierał 1 mg/ml fenolu w PBS.

Zawiesina wodna 31

1,5 ml roztworu A31 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I.

Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocąpipety 1,5 ml roztworu B31 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano mieszaniu przez 16 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 31 zawierała Img/ml msulinotropiny i 0,5 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 19

Zawiesma msulinotropiny (4 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A51

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 22,2 mg msulinotropiny. Do fiolki przeniesiono pipetą 5 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Roztwór ten przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm, (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A51 zawierał 4,44 mg/ml msulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B51

Do 5 ml kolby pomiarowej odważono 110 mg fenolu i 30 mg siarczanu protaminy.

Do kolby dodano około 4 mł PBS dla rozpuszczenia fenolu i siarczanu protaminy. Kolbę wypełniono PBS do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B51 zawierał 22 mg/ml fenolu i 4,5 mg/ml zasady protaminowej w PBS.

180 697

Zawiesina wodna 51 ml roztworu A5110,33 ml roztworu B51 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu L Zawartość fiolki poddano delikatnemu wstrząsaniu dla zapewnienia jednorodnego zmieszania. Fiolkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Zawiesina wodna 51 zawierała 4 mg/ml insulmotropiny i 0,44 mg/ml zasady protammowej 12,2 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokmetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 20

Zawiesina msulinotropiny (4 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A52

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 22,2 mg insulmotropiny. Do fiolki przeniesiono pipetą 5 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Roztwór ten przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A52 zawierał 4,44 mg/ml insulmotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B52

Do 5 ml kolby pomiarowej odważono 110 mg fenolu 115,6 mg dwuwodnego octanu cynkowego. Do kolby dodano około 4 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia fenolu i dwuwodnego octanu cynku. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B52 zawierał 22 mg/ml fenolu i 7,8 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego w wodzie do wstrzyknięć.

Zawiesina wodna 52 ml roztworu A5210,33 ml roztworu B52 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano delikatnemu wstrząsaniu dla zapewnienia jednorodnego zmieszania. Fiolkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Zawiesina wodna 52 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny i 0,78 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego i 2,2 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokmetycznych ιη νινο u szczurów.

Przykład 21

Zawiesina insulinotropiny (4 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu fenolu

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 244 mg fenolu. Do kolby dodano około 90 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia fenolu. Kolbę wypełniono do znaczka wodą do wstrzyknięć. pH tego roztworu doprowadzono do wartości 9,0 za pomocą 5% roztworu NaOH. Roztwór fenolu zawierał 2,44 mg/ml fenolu w wodzie do wstrzyknięć, pH 9,0.

Wytwarzanie roztworu A71

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 22,2 mg insulinotropiny. Do fiolki przeniesiono pipetą 5 ml roztworu fenolu dla rozpuszczenia środka. Roztwór ten przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A71 zawierał 4,44 mg/ml insulmotropiny i 2,44 mg/ml fenolu w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu B71

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 116 mg siarczanu protaminy. Do kolby dodano około 8 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia siarczanu protaminy. Kolbę wypełniono woda do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący nizsze białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B71 zawierał 8,7 mg/ml siarczanu protaminy w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu C71

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 156 mg dwuwodnego octanu cynkowego 1 1,632 g NaCl. Do kolby dodano około 8 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego i NaCl. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór C71 zawierał 15,6 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego i 163,2 mg/ml NaCl w wodzie do wstrzyknięć.

180 697

Zawiesina wodna 71 ml roztworu A71, 0,165 ml roztworu B71 i 0,165 ml roztworu C71 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano delikatnemu wstrząsaniu dla zapewnienia jednorodnego zmieszania. Fiolkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Zawiesina wodna 71 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny, 0,435 mg/ml zasady protaminowej, 0,78 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego, 8,16 mg/ml NaCl i 2,2 mg/ml fenolu w wodzie do wstrzyknięć. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 22

Zawiesina insulinotropiny (4 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu m-krezolu

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 244 m gm-krezolu. Do kolby dodano około 90 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia m-krezolu. Kolbę wypełniono do znaczka wodą do wstrzyknięć. pH tego roztworu doprowadzono do wartości 9,0 za pomocą 5% roztworu NaOH. Roztwór m-krezolu zawierał 2,44 mg/ml m-krezolu w wodzie do wstrzyknięć, pH 9,0.

Wytwarzanie roztworu Al00

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 22,2 mg insulinotropiny. Do fiolki przeniesiono pipetą 5 ml roztworu m-krezolu dla rozpuszczenia środka. Roztwór ten przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A100 zawierał 4,44 mg/ml insulinotropiny i 2,44 mg/ml m-krezolu w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu BI00

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 116 mg siarczanu protaminy. Do kolby dodano około 8 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia siarczanu protaminy. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B100 zawierał 8,7 mg/ml siarczanu protaminy w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu C100

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 156 mg dwuwodnego octanu cynkowego 1 1,632 g NaCl. Do kolby dodano około 8 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego i NaCl. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór Cl00 zawierał 15,6 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego i 163,2 mg/ml NaCl w wodzie do wstrzyknięć.

Zawiesina wodna 100 ml roztworu A100, 0,165 ml roztworu BI00 i 0,165 ml roztworu Cl00 przeniesiono za pomocą pipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano delikatnemu wstrząsaniu dla zapewnienia jednorodnego zmieszania. Fiolkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Zawiesina wodna 100 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny, 0,435 mg/ml zasady protaminowej, 0,78 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego, 8,16 mg/ml NaCl i 2,2 mg/ml m-krezolu w wodzie do wstrzyknięć. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów

Przykład 23

Zawiesina insulinotropiny (4 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A68

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 22,2 mg insulinotropiny. Do fiolki przeniesiono pipetą 5 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Roztwór ten przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A68 zawierał 4,44 mg/ml insulmotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B68

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 116 mg siarczanu protaminy. Do kolby dodano około 8 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia siarczanu protaminy. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe

180 697 białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B68 zawierał 8,7 mg/ml siarczanu protaminy w wodziedo wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu C68

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 156 mg dwuwodnego octanu cynkowego i 440 mg fenolu. Do kolby dodano około 8 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego i fenolu. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór C68 zawierał 15,6 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego i 44 mg/ml fenolu w wodzie do wstrzyknięć

Zawiesina wodna 68 ml roztworu A68,0,165 ml roztworu B68 i 0,165 ml roztworu C68 przeniesiono za pomocą pipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano delikatnemu wstrząsaniu dla zapewnienia jednorodnego zmieszania. Fiolkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Zawiesina wodna 68 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny, 0,43 5 mg/ml zasady protaminowej, 0,78 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego i 2,2 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów

Przykład 24

Zawiesina insulinotropiny (4 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A67

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 22,2 mg insulinotropiny. Do fiolki przeniesiono pipetą 5 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Roztwór ten przefiltrowano strzykawką przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A67 zawierał 4,44 mg/ml insulinotropiny w PBS.

Wytwarzanie roztworu B67

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 116 mg siarczanu protaminy. Do kolby dodano około 8 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia siarczanu protaminy Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący nizsze białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B67 zawierał 8,7 mg/ml siarczanu protammy w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu C67

Do 10 ml kolby pomiarowej odważono 156 mg dwuwodnego octanu cynkowego i 440 mg m-krezolu. Do kolby dodano około 8 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego i m-krezołu. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór ten przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka) do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór C67 zawierał 15,6 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego i 44 mg/ml m-krezolu w wodzie do wstrzyknięć.

Zawiesina wodna 67 ml roztworu A67,0,165 ml roztworu B67 i 0,165 ml roztworu C67 przeniesiono za pomocąpipety do 3,5 ml fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano delikatnemu wstrząsaniu do zapewnienia jednorodnego zmieszania. Fiolkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 16 godzin. Zawiesina wodna 67 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny, 0,435 mg/ml zasady protami nowej, 0,78 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego 12,2 mg/ml m-krezolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 25

Wytwarzanie roztworu A39

Do fiolki szklanej odważono 67,6 mg insulinotropiny. Do fiolki dodano około 22 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia insulinotropiny. pH zawartości fiolki doprowadzono do wartości 9,6 za pomocą NaOH, do uzyskania klarownego roztworu. Do fiolki dodano wody do wstrzyknięć w takiej ilości, aby końcowe stężenie środka wynosiło 2,5 mg/ml.

Wytwarzanie roztworu B39

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 386,8 mg dwuwodnego octanu cynkowego. Do kolby dodano około 80 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cyn

180 697 kowego. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór B39 zawierał 3,9 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu C39

Do 50 ml kolby pomiarowej odważono 1,095 g fenolu. Do kolby dodano około 40 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia fenolu. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór C39 zawierał 21,9 mg/ml fenolu w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu D39

Do 25 ml kolby pomiarowej odważono 2,25 g NaCl. Do kolby dodano około 20 ml roztworu C39 dla rozpuszczenia NaCl. Kolbę wypełniono do znaczka roztworem C39. Roztwór D39 zawierał 9% (stężenie wagowe) NaCl 121,9 mg/ml fenolu w wodzie do wstrzyknięć.

Zawiesina wodna 39

Wszystkie roztwory przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka). 9 ml roztworu A39 przeniesiono do 10 ml fiolki na próbkę. Do fiolki dodano 1 ml roztworu B39, delikatnie mieszając. Natychmiast powstały strąty. Wartość zmierzonego pH wynosiła 7,0. Fiolkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez około 18 godzin. 4 ml próbki przeniesiono do oddzielnej 10 ml fiolki i do fiolki dodano 0,44 ml roztworu D39. Próbkę mieszano delikatnie przez 5 minut, a następnie pozostawiono przez noc w temperaturze otoczenia. Zawiesina wodna 39 zawierała 2 mg/ml insulinotropiny, 2,2 mg/ml fenolu, 0,9% NaCl i 0,39 mg/ml octanu cynkowego. Zawiesinę te zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 26

Wytwarzanie roztworu A53

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 32,5 mg insulinotropiny Do fiolki dodano 6 ml wody do wstrzyknięć. pH zawartości fiolki doprowadzono do wartości 9,6 za pomocą 1% (stężenie wagowe) NaOH, do uzyskania klarownego roztworu. Dodano wody do wstrzyknięć w ilości odpowiedniej do uzyskania stężenia środka wynoszącego 5,0 mg/ml.

Wytwarzanie roztworu B53

Do 50 kolby pomiarowej odważono 390 mg dwuwodnego octanu cynkowego. Do kolby dodano około 40 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór B53 zawierał 7,8 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego w wodzie do wstrzyknięć.

Zawiesina wodna 53

Wszystkie roztwory przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka). 2,4 ml roztworu A53 przeniesiono do 3,5 ml fiolki. Do fiolki dodano 300 pl/ml roztworu B53, delikatnie mieszając. Natychmiast po jego dodaniu powstał dwójłomny osad. Wartość zmierzonego pH wynosiła 6,8. Następnie fiolkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez około 20 godzin. Po sedymentacji roztworu bezpośrednio do jego nadsączu dodano 7,5 pl m-krezolu. Następnie zawiesinę mieszano delikatnie aż do rozpuszczenia m-krezolu. W czasie mieszania do zawiesiny dodano 300 pl 9% roztworu NaCl. Zawiesina wodna 53 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny, 0,9% NaCl, 0,78 mg/ml octanu cynkowego i 2,5 mg/ml m-krezolu w wodzie do wstrzyknięć. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych m νινο u szczurów.

Przykład 27

Wytwarzanie roztworu A54

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 32,5 mg insulinotropiny. Do fiolki dodano 6 ml wody do wstrzyknięć. pH zawartości fiolki doprowadzono do wartości 9,6 za pomocą 1% (stężenie wagowe) NaOH, do uzyskania klarownego roztworu. Dodano wody do wstrzyknięć w ilości odpowiedniej do uzyskania stężenia środka wynoszącego 5,0 mg/ml.

Wytwarzanie roztworu B54

Do 50 ml kolby pomiarowej odważono 390 mg dwuwodnego octanu cynkowego. Do kolby dodano około 40 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór B54 zawierał 7,8 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego w wodzie do wstrzyknięć.

180 697

Wytwarzanie roztworu C54

Do 50 ml kolby pomiarowej odważono 1,1 g fenolu i 4,5 g NaCl. Około 40 ml wody do wstrzyknięć. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór C54 zawierał 22 mg/ml fenolu i 90 mg/ml NaCl.

Zawiesina wodna 54

Wszystkie roztwory przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka). 2,4 ml roztworu A54 przeniesiono do 3,5 ml fiolki. Do fiolki dodano 300 pl roztworu B54, mieszając. Natychmiast po jego dodaniu powstały dwójłomne straty. Wartość zmierzonego pH wyniosła 6,8 Próbkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 20 godzin. Dodano 300 pl roztworu C54, delikatnie mieszając. Zawiesina wodna 54 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny, 0,78 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego, 2,2 mg/ml fenolu 19 mg/ml NaCl w wodzie do wstrzyknięć. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 28

Wytwarzanie roztworu A57

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 15 mg insulinotropiny. Do fiolki dodano 3 ml wody do wstrzyknięć. pH zawartości fiolki doprowadzono do wartości 9,9 za pomocą 5% NaOH, do uzyskania całkowitego rozpuszczenia środka. Roztwór A57 zawierał 5,0 mg/ml insulinotropiny w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu B57

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 780 mg dwuwodnego octanu cynkowego. Do kolby dodano około 80 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór B57 zawierał 7,8 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu C57

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 2,2 g fenolu 19 g NaCl. Do kolby dodano około 80 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia fenolu i NaCl. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór C57 zawierał 22 mg/ml fenolu i 90 mg/ml NaCl.

Zawiesina wodna 57

2,4 ml roztworu A57 przeniesiono do 3,5 ml fiolki. W czasie dodawania 300 pl roztworu B57 roztwór delikatnie mieszano. Natychmiast po dodaniu roztworu B57 powstał osad. Wartość zmierzonego pH wyniosła 7,1. Próbkę pozostawiono w warunkach otoczenia przez 24 godziny. Dodano 300 pl roztworu C57, delikatnie mieszając. Zawiesina wodna 57 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny, 0,78 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego, 2,2 mg/ml fenolu 19 mg/ml NaCl w wodzie do wstrzyknięć. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 29

Wytwarzanie roztworu A64

Do 30 ml fiolki szklanej odważono 53,3 mg insulinotropiny. Po dodaniu 11 ml wody do wstrzyknięć, pH zawartości fiolki doprowadzono do wartości 8,3 za pomocą 5% (stężenie wagowe) NaOH, do rozpuszczenia insulinotropiny. pH obniżono do wartości 6,8, używając rozcieńczonego HC1, uważając, aby roztwór wciąż pozostawał klarowny. Dodano wody do wstrzyknięć w ilości odpowiedniej do uzyskania stężenia środka wynoszącego 4,4 mg/ml. Roztwór A64 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący nizsze białka) do 3,5 ml fiolki na próbkę. 1,8 ml przefiltrowanego roztworu przeniesiono do oddzielnej, jałowej, 3,5 ml fiolki i fiolkę pozostawiono w temperaturze otoczenia, dla krystalizacji, przez 3 dni.

Wytwarzanie roztworu B64

Do 50 ml kolby pomiarowej odważono 780 mg dwuwodnego octanu cynkowego. Do kolby dodano około 40 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór B64 zawierał 15,6 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego w wodzie do wstrzyknięć.

180 697

Wytwarzanie roztworu C64

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 18 g NaCl. Do kolby dodano około 80 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia NaCl. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór C64 zawierał 180 mg/ml NaCl w wodzie do wstrzyknięć.

Zawiesina wodna 64

Po zakończeniu krystalizacji w roztworze A64, do krystalicznej zawiesiny dodano 100 μΐ roztworu B64, powoli mieszając. Następnie próbkę pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 3 dni. Do krystalicznej zawiesiny dodano 100 pl roztworu C64, delikatnie mieszając. pH zawiesiny doprowadzono do wartości 7,3 stosując rozcieńczony NaOH. Bezpośrednio do zawiesiny krystalicznej o pH doprowadzonym do odpowiedniej wartości dodano 5,0 μΐ m-krezolu. Zawiesina wodna 64 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny, 0,78 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego, 9 mg/ml NaCl i 2,5 mg/ml m-krezolu w wodzie do wstrzyknięć. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 30

Wytwarzanie roztworu A69

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 1 g NaCl. Do kolby dodano około 80 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia NaCl. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór A69 zawierał 1% (stężenie wagowe) mg/ml NaCl w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu B69

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 390 mg dwuwodnego octanu cynkowego. Do kolby dodano około 80 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór B69 zawierał 3,9 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu C69

Do 100 ml kolby pomiarowej przeniesiono 2,5 ml jałowego przefiltrowanego (filtr 0,22 pm wiążący niższe białka) m-krezolu. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka i poddano działaniu fali dźwiękowej dla uzyskania jednorodnej zawiesiny Emulsja C69 zawierała 25 mg/ml m-krezolu w wodzie do wstrzyknięć.

Zawiesina wodna 69

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 35,74 mg insulinotropiny. Dodano 7 ml roztworu A69 pH zawartości fiolki doprowadzono do wartości 9,2 dla rozpuszczenia środka. pH roztworu doprowadzono następnie do wartości 6,5, stosując rozcieńczony HC1. Dodano wody do wstrzyknięć w ilości odpowiedniej dla uzyskania stężenia środka wynoszącego 4,4 mg/ml. Roztwór przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka). Roztwór pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 6 dni; w ciągu tego czasu insulinotropina uległa krystalizacji. 1,5 ml zawiesiny krystalicznej przeniesiono do oddzielnej fiolki. Dodano 167 pl roztworu B69, delikatnie mieszając. Próbkę pozostawiono w temperaturze otoczenia na 1 dzień. Po sedymentacji zawiesiny do jej nadsączu dodano 167 pl emulsji C69. Próbkę poddano mieszaniu dla rozpuszczenia m-krezolu. Zawiesina wodna 69 zawierała 3,6 mg/ml insulinotropiny, 0,36 mg/ml octanu cynkowego, 8,17 mg/ml NaCl i 2,28 mg/ml m-krezolu w wodzie do wstrzyknięć. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 31

Wytwarzanie roztworu A101

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 10 g octanu sodowego. Do kolby dodano około 80 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia octanu sodowego. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka Roztwór A200 zawierał 100 mg/ml octanu sodowego w wodzie do wstrzyknięć.

Zawiesina wodna 101

Do 10 ml fiolki szklanej odważono 44,4 mg insulinotropiny. Dodano 8 ml wody do wstrzyknięć. pH zawartości fiolki doprowadzono do wartości 9,3 dla uzyskania klarownego roztworu. Do roztworu insulinotropiny dodano 1 ml roztworu A200. Następnie pH roztworu obniżono do wartości 6,5. Roztwór przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka). Przefiltrowany roztwór pozostawiono w temperaturze otoczenia przez 3 dni tak, aby mogła zajść

180 697 krystalizacja. Zawiesina wodna 101 zawierała 4,9 mg/ml insulinotropiny i 11,1 mg/ml octanu sodowego w wodzie do wstrzyknięć. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 32

Wytwarzanie roztworu A82

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 9 g NaCl. Do kolby dodano około 80 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia NaCl. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór A82 zawierał 9% (stężenie wagowe) mg/ml NaCl w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu B82

Do 100 ml kolby pomiarowej odważono 789 mg dwuwodnego octanu cynkowego. Do kolby dodano około 80 ml wody do wstrzyknięć dla rozpuszczenia dwuwodnego octanu cynkowego. Kolbę wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka. Roztwór B82 zawierał 7,89 mg/ml dwuwodnego octanu cynkowego w wodzie do wstrzyknięć.

Wytwarzanie roztworu C82

Do 100 ml kolby pomiarowej przeniesiono 2,5 ml jałowego przefiltrowanego (filtr 0,2pm wiążący niższe białka) m-krezolu. Kolbe wypełniono wodą do wstrzyknięć do znaczka i poddano działaniu fali dźwiękowej dla uzyskania jednorodnej zawiesiny. Emulsja C82 zawierała 25 mg/ml m-krezolu w wodzie do wstrzyknięć.

Zawiesina wodna 82

Wszystkie roztwory przefiltrowano przez filtry 0,22 pm (wiążący niższe białka). Do 10 ml, do której dodano 8 ml wody, dodano 45,34 mg insulinotropiny. pH doprowadzono do wartości 9,3, stosując 5% NaOH. Po dodaniu do fiolki 1 ml roztworu A82, pH roztworu obniżono do wartości 6,55, stosując rozcieńczony HC1. Roztwór (5 mg/ml insulinotropiny) przefiltrowano przez filtr 0,22 pm (wiążący niższe białka). Do jałowego, przefiltrowanego roztworu insulinotropiny dodano 81 pl zawiesiny wodnej 101 (por przykład 31) i rozproszono go, wstrząsając próbką. Następnie próbkę pozostawiono przez 72 godziny w temperaturze otoczenia tak, aby powstała zawiesina krystaliczna. 2,4 ml zawiesiny przeniesiono do 3,5 ml fiolki. Do fiolki dodano 300 pl roztworu B82, delikatnie mieszając. pH zawartości fiolki doprowadzono do wartości 7,3, stosując rozcieńczony NaOH. Po sedymentacji zawieśmy do jej nadsączu dodano 300 pl emulsji C82. Zawiesina wodna 82 zawierała 4 mg/ml insulinotropiny, 0,79 mg/ml bezwodnego octanu cynkowego, 2,5 mg/ml m-krezolu i 0,9% NaCl w wodzie do wstrzyknięć. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

Przykład 33

Zawiesina amidu GLP-1(-7-3 6) (1 mg/ml)

Wytwarzanie roztworu A26

Roztwór A26 wytworzono odważając 10 mg amidu GLP-1(7-36) do 5 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 3 ml PBS dla rozpuszczenia środka. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór A26 przefiltrowanoprzez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór A26 zawierał 2 mg/ml GLP-1(7-36) w PBS.

Wytwarzanie roztworu B26

Roztwór B26 wytworzono odważając 44 mg fenolu do 10 ml kolby pomiarowej. Do kolby dodano około 8 ml PBS dla rozpuszczenia fenolu. Do kolby dodano q.s. PBS. Roztwór B26 przefiltrowano przez filtr 0,22 pm do 10 ml fiolki szklanej. Roztwór B26 zawierał 4,4 mg/ml fenolu w PBS.

Zawiesina wodna 26

1,5 ml roztworu A26 przeniesiono za pomocą pipety do 3,5 fiolki szklanej typu I. Zawartość fiolki poddano mieszaniu magnetycznemu w czasie przenoszenia za pomocą pipety 1,5 ml roztworu B26 do fiolki. Fiolkę zatkano i szczelnie zamknięto pokrywą aluminiową. Zawartość fiolki poddano delikatnemu mieszaniu (zważając, aby nie utworzyła się piana ani pęcherzyki) przez 18 godzin dla umożliwienia powstania zawiesiny. Zawiesina wodna 26 zawierała 1 mg/ml amidu GLP-1 (7-36) 12,2 mg/ml fenolu w PBS. Zawiesinę tę zastosowano do badań farmakokinetycznych in vivo u szczurów.

180 697

Przykład 34

W jednym z wykonań wynalazku, postać o niskiej rozpuszczalności GLP-1 (7-37) wytwarza się, łącząc GLP-1 (7-37) w buforze w ilości od 2 do 15 mg/ml przy wartości pH 7-8,5 z roztworem soli jonu metalu dla uzyskania roztworów, zawierających 1-8 mg/ml GLP-1 (7-37) przy stosunku molowym cynku do GLP-1 (7-37) wynoszącym od 1:1 do 270:1. Powstaje ciężki osad, który pozostawia się przez noc w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalność GLP-1 (7-37) w roztworze jonu metalu zależy od zastosowanego metalu. Następujące wyniki pomiarów rozpuszczalności granulki GLP-1 (7-37) w rozpuszczalniku me zawierającym metalu, takim jak PBS lub woda, wykazują, że jony cynku, kobaltu i niklu dają postacie GLP-1 (7-37) o niskiej rozpuszczalności.

Tabela 1

Zdolność soli jonów różnych metali do powodowania niskiej rozpuszczalności GLP-1 (7-37)

Sól jonu metalu	Rozpuszczalność w roztworze metalu	Rozpuszczalność w PBS
octan Zn	0,04 ąg/ml	0,04 pg/ml
chlorek Zn	0,04 pg/ml	0,03 pg/ml
chlorek Co	0,11 ąg/ml	0,04 ąg/ml
siarczan Ni	0,14 pg/ml	0,07 pg/ml
chlorek Mn	0,23 ąg/ml	1,64 pg/ml
chlorek Mn	1,75 ąg/ml	bez osadu
chlorek Ca	1,98 pg/ml	bez osadu

Uwaga.

W każdym przypadku 100 μΐ 5mM roztworu jonu metalu dodawano do 100 ml GLP-1 (7-37) w stężeniu 5 mg/ml, mieszano i pozostawiono przez noc. Nierozpuszczalne gi udki usuwano przez odwirowywanie. Mierzono stężenie GLP-1 (7-37) pozostałego w roztworze jonu metalu. Granulki ponownie zawieszano w soli fizjologicznej, zbuforowanej fosforanem (PBS), poddawano działaniu fali dźwiękowych i pozostawiano przez noc Materiał nierozpuszczalny poddawano ponownej granulacji i mierzono stężenie GLP-1 (7-37)

Przykład 35

Postacie mikrokrystaliczne GLP-1 (7-37) uzyskać można, mieszając roztwory GLP-1 (7-37) w buforze o pH o wartości 7-8,5 z niektórymi kombinacjami soli i glikoli polietylenowych (polyethylene glycol - PEG) o niskiej masie cząsteczkowej. W tabeli 2 opisano sześć szczególnych zespołów warunków, umożliwiających wytworzenie mikrokrystalicznych postaci GLP-1 (-7-37).

Tabela 2

Wybrane czynniki powodujące tworzenie się mikrokryształów

Odczynnik	Sól	Bufor	Bufor strącający
1	-	-	0,4 M winian K, Na
2	0,2 M cytrynian Na	0,1 M Tns pH 8,5	30% PEG 400
3	0,2 M MgCl₂	0,1 M HEPES pH 7,5	28% PEG 400
4	0,2 M MgCl₂	0,1 M HEPES pH 7,5	30% PEG 400
5	0,5 M K₂HPO₄	-	20% PEG 8000
6	-	-	30% PEG 1500

Uwaga.

Do roztworu podstawowego GLP-1 (7-37) o stężeniu 5 mg/ml w 50 mM Tns o pH 8,1 dodano odczynnika w stosunku 1.1. Krople badano wzrokowo i oceniano w punktach ze względu na nieobecność lub obecność krystalicznego lub bezpostaciowego nierozpuszczalnego GLP-1 (7-37) Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie PEG o niskiej masie cząsteczkowej wydaje się sprzyjać tworzeniu się postaci krystalicznych Tris jest to tris(hydroksymetylo)ammometan, a HEPES jest to kwas N-2-(hydroksyetylo)piperazyno-N-2-etanosulfonowy

180 697

Przykład 36

Dla otrzymywania postaci mikrokrystalicznej z dużąwydajnościąkomeczne sąszczególne kombinacje stężenia GLP-1 (7-37) i PEG. W tabeli 3 przedstawiono szczególne kombinacje stężenia PEG 600 i GLP-1 (7-37), umożliwiające wytwarzanie postaci mikrokrystalicznej, w przeciwieństwie do bezpostaciowych form środka. Przedstawiono również wydajność, z jaką uzyskuje się GLP-1 (7-37) w postaci nierozpuszczalnej.

Tabela 3

Tworzenie się/wydajność krystalicznego GLP-1 (7-37)

GLP-1(7-37)	15 PEG 600	22,5% PEG 600	30% PEG 600
2,0 mg/ml postać/wydaj.	bezpostac./8%	bezpostac.10%	bezpostac/8%
3,5 mg/ml postać/wydaj	krystal./62%	krystal /26	krystal./59%
5,0 mg/ml postać/wydaj	bezpostac./34%	krystal/63%	krystal./72%
6,5 mg/ml postać/wydaj	bezpostac./52%	krystal./76%	krystal./82%
8,0 mg/ml postać/wydaj.	bezpostac./55%	krystal./82%	bezpostac /66%
9,5 mg/ml postać/wydaj	bezpostac./69%	krystal./85%	bezpostac /83%

Uwaga.

Mikrokryształy GLP-1 (7-37) wytwarza się, stosując kombinację stężenia GLP-1 (7-37), wynoszącego 20 mg/ml w buforze tns, przy wartości pH równej 8,60% glikolu polietylenowego 600 (PEG 600) w H₂O i buforu tns przy wartości pH równej 8, dla uzyskania końcowego stężenia wynoszącego 15-30% PEG 13-10 mg/ml GLP-1. Po pozostawieniu przez noc, mikrokryształy GLP-1 (7-37) powstają w roztworze z wydajnością 50-85%

Przykład 37

Doświadczenie to stanowi przykład innego wykonania wynalazku, w którym uprzednio wytworzone mikrokryształy GLP-1 (7-37) traktuje się jonami różnych metali dla wytworzenia postaci mikrokrystalicznych o niskiej rozpuszczalności. Rozpuszczalność mikrokryształów GLP-1 (7-37), wytworzonych w 8 mg/ml GLP-1 (7-37) i 22,5% PEG, jak to opisano w przykładzie 22, jest równa rozpuszczalności czystego, liofilizowanego GLP-1 (7-37). Dla nadania im pożądanej właściwości niskiej rozpuszczalności w celu osiągnięcia długotrwałego uwalniania środka, te uprzednio wytworzone mikrokryształy traktować można roztworami soli metali, przy stosunku metal: GLP-1 (7-37) od 1 : 1 do 260 : 1 przez noc w temperaturze pokojowej. Nadmiar soli metalu usuwa się w procesie odwirowywania/płukania. Tabela 4 przedstawia wyniki obróbki solami niektórych dwuwartościowych kationów metali.

180 697

Tabela 4

Rozpuszczalność kryształów GLP-1 (7-37) poddanych różnym rodzajom obróbki

Domieszki	GLP-1 (7-37) (mg/ml) w roztworze stos do obróbki	GLP-l(7-37) (mg/ml) w PBS	GLP-l(7-37) (mg/ml) w PBS/EDTA
-(PBS)	1,2	1,2	nie wykryto
cytrynian pH 5,2	0,15	me wykryto	me wykryto
ZnCl₂, pH 5,2	0,03	0,03	1,1
ZnAc, pH 5,2	0,01	0,02	1,1
ZnAc, pH 6,5	0,06	0,02	0,92
MgSO₄, pH 5,2	0,50	0,55	nie wykryto
NiSO₄, pH 5,2	0,10	0,04	0,45
MnCl₂, pH 5,2	0,10	0,10	me wykryto
CaCl₂, pH 5,2	0,40	0,27	me wykryto

Uwaga.

Kryształy GLP-1 (7-37) hoduje się w roztworze 8 mg/ml IST w 50 mM przy wartości pH 8 z dodatkiem 22,5% PEG 600 w H₂O. Wszystkie dodatkowe roztwory, stosowane w obróbce, stanowią 100 mM sole jonów dwuwartościowych w 10 mM cytrynianie Na o pH 5,2 lub Na MES o pH 6,5.

Przykład 38

Przy zastosowaniu powyżej opisanych sposobów wytworzono zarówno bezpostaciowe, jak i mikrokrystaliczne preparaty o niskiej rozpuszczalności, stosując octan cynkowy. Wykonano wstrzyknięcia podskórne u szczurów (trzy zwierzęta na preparat) i mierzono poziom GLP-1 (7-37) w osoczu przez 24 godziny testem radioimmunologicznym. Figura 8 przedstawia przedłużone utrzymywanie się środka w osoczu w porównaniu z kontrolnym podskórnym wstrzyknięciem rozpuszczalnego GLP-1 (7-37).

Przykład 39

45% (stężenie wagowe) glikol 3350 PEG mg/ml insulinotropiny mM bufor fosforanowy

q.s jałowej wody do wstrzyknięć (Stenie Water for Injection SWFI)

Wytworzono 50% (wagowo) roztwór PEG, stosując SWFI. Oddzielnie wytworzono 200 mM bufor fosforanowy, stosując bezwodny fosforan dwusodowy (26,85 mg/ml) i jednowodny fosforan jednosodowy (1,41 mg/ml). W razie potrzeby pH roztworu buforowego doprowadzono do wartości 8, stosując wodorotlenek sodowy lub kwas solny. Odpowiednią ilość insulinotropiny rozpuszczono w roztworze buforowym w ilości dostatecznej dla wytworzenia 10 mg/ml roztworu insulinotropiny. Do roztworu insulinotropiny dodano roztwór PEG o odpowiedniej masie i zastosowano SWFI w ilości pozwalającej doprowadzić roztwór do pożądanej objętości. Końcowy roztwór przefiltrowano następnie w sposób jałowy przez filtr 0,2 pm i aseptyczme napełniono nim fiolki. Roztwór (0,5 ml) wstrzykiwano podskórnie szczurom, a następnie oznaczano poziom insulinotropiny w osoczu testem radioimmunologicznym.

180 697

Przykład 40

1, 32% (stężenie wagowe) hydroksyetyloceluloza (HEC) mg/ml insulinotropiny mM bufor fosforanowy

100 mM chlorek sodowy

q.s. jałowej wody do wstrzyknięć (Stenie Water for Injection SWFI)

Wytworzono 2% (wagowo) roztwór hydroksyetylocelulozy, stosując SWFI. Oddzielnie wytworzono 200 mM bufor fosforanowy, stosując bezwodny fosforan dwusodowy (26,85 mg/ml) i jednowodny fosforan jednosodowy (1,41 mg/ml). W razie potrzeby pH roztworu buforowego doprowadzono do wartości 8, stosując wodorotlenek sodowy lub kwas solny. Odpowiednią ilość insulinotropiny i chlorku sodowego rozpuszczono w roztworze buforowym w ilości dostatecznej dla wytworzenia 10 mg/ml roztworu insulinotropiny. Do roztworu insulinotropiny dodano roztwór HEC o odpowiedniej masie i zastosowano SWFI w ilości pozwalającej doprowadzić roztwór do pożądanej objętości. Końcowy roztwór przefiltrowano następnie w sposób jałowy przez filtr 0,2 pm i aseptycznie napełniono nim fiolki. Roztwór (0,5 ml) wstrzykiwano podskórnie szczurom, a następnie oznaczano poziom insulinotropiny w osoczu testem radioimmunologicznym.

Przykład 41

18% (stężenie wagowe) Pluronic F127 mg/ml insulinotropiny mM bufor fosforanowy

q.s. jałowej wody do wstrzyknięć (Sterile Water for Injection SWFI)

Wytworzono 20% (wagowo) roztwór Pluronic FI 27, stosując SWFI. Do rozpuszczenia polimeru zastosowano homogenizator sondujący Polytron z kąpielą lodową. Oddzielnie wytworzono 200 mM bufor fosforanowy, stosując bezwodny fosforan dwusodowy (26,85 mg/ml) i jednowodny fosforan jednosodowy (1,41 mg/ml). W razie potrzeby pH roztworu buforowego doprowadzono do wartości 8, stosując wodorotlenek sodowy lub kwas solny. Odpowiednią ilość insuhnotropiny rozpuszczono w roztworze buforowym w ilości dostatecznej dla wytworzenia 10 mg/ml roztworu insulinotropiny. Do roztworu insulinotropiny dodano roztwór Pluronic o odpowiedniej masie i zastosowano SWFI w ilości pozwalającej doprowadzić roztwór do pożądanej objętości. Końcowy roztwór przefiltrowano następnie w sposób jałowy przez filtr 0,2 pm i aseptycznie napełniono nim fiolki. Roztwór (0,5 ml) wstrzykiwano podskórnie szczurom, a następnie oznaczano poziom insulinotropiny w osoczu testem radioimmunologicznym.

Przykład 42

Zawiesina oleju arachidowego (zmielona w młynie kulowym) mg/ml insulinotropiny

1% Tween 80

Do oleju arachidowego dodano 1% Tween 80. Roztwór ten przefiltrowano następnie w sposób jałowy przez filtr 0,2 pm i aseptycznie napełniono nim fiolki. Następnie w oleju zawieszono insulinotropinę w postaci stałej. Wielkość cząsteczek zmniejszono, stosując mielenie w młynie kulowym za pomocą urządzenia Szesvari Attritor (40 obrotów/minutę) przez 18 godzin (w płaszczu wodnym z zimnej wody). Następnie zawiesiną tą napełniono fiolki. Zawiesinę (0,5 ml) wstrzykiwano podskórnie szczurom, a następnie oznaczano poziom insulinotropiny w osoczu testem radioimmunologicznym.

Przykład 43

22,6% (stężenie wagowe) dekstran mg/ml insulinotropiny mM bufor fosforanowy

q.s. jałowej wody do wstrzyknięć (Stenie Water for Injection - SWFI)

180 697

Wytworzono 50% (wagowo) roztwór dekstranu, stosując SWFI. Oddzielnie wytworzono 200 mM bufor fosforanowy, stosując bezwodny fosforan dwusodowy (26,85 mg/ml) i jednowodny fosforan jednosodowy (1,41 mg/ml). W razie potrzeby pH roztworu buforowego doprowadzono do wartości 8, stosując wodorotlenek sodowy lub kwas solny. Odpowiednią ilość insulinotropiny rozpuszczono w roztworze buforowym w ilości dostatecznej dla wytworzenia 5,0 mg/ml roztworu insulinotropmy. Do roztworu insulinotropiny dodano roztwór dekstranu o odpowiedniej masie i zastosowano SWFI w ilości pozwalającej doprowadzić roztwór do pożądanej objętości. Końcowy roztwór przefiltrowano następnie w sposób jałowy przez filtr 0,2 pm i aseptycznie napełniono nim fiolki. Roztwór (0,5 ml) wstrzykiwano podskórnie szczurom, a następnie oznaczano poziom insulinotropiny w osoczu testem radioimmunologicznym.

Przykład 44

Z mieszanmy soli fizjologicznej zbuforowanej fosforanem (PBS), etanolu i m-krezolu wykrystalizowano insulinotropinę. W fiolce szklanej wytworzono, stosując PBS, jednorodną zawiesinę insulinotropmy (10 mg/ml), i do fiolki dodano dużą objętość etanolu (9-krotność objętości zawiesiny), mieszając magnetycznie zawartość fiolki. Powstały bardzo drobne, bezpostaciowe cząstki insulinotropiny. Do fiolki dodano m-krezolu tak, aby końcowe stężenie m-krezolu wynosiło 1% (obj.). Fiolkę zaopatrzono w nakrywkę, aby zapobiec parowaniu rozpuszczalnika. Mieszaninę krystalizacyjną przechowywano w temperaturze pokojowej przez kilka dni. Z bezpostaciowych cząstek powstały płytki krystaliczne w kształcie igły. Długość kryształów wynosiła pomiędzy 50 a 200 pm, a szerokość - pomiędzy 2 a 4 pm.

Przykład 45

Insulinotropinę (1-4 mg/ml) rozpuszczono w 1% roztworze siarczanu sodowego (lub octanu sodowego, lub chlorku sodowego, lub siarczanu amonowego) o pH o wartości wyższej, niż 8, po czym pH roztworu obniżono do wartości od 6,0 do 7,5, stosując d-HCl. Klarowny roztwór pozostawiono w temperaturze otoczenia. Po kilku dniach otrzymano kryształy w kształcie igły lub płytki, w zależności od warunków krystalizacji.

Przykład 46

GLP-1 (7-37) rozpuszczono w 50 mM buforze glicynowym, zawierającym 0,1 -0,2 M NaCl przy pH o wartości 8,5-9,5, i o stężeniu od 1-5 mg/ml. Dodano roztworu soli cynku (octanu lub chlorku) tak, aby otrzymać stosunek molowy wynoszący od 0,5 : 1 do 1,5 · 1 cynku : GLP-1 (7-37). Kryształy GLP-1 (7-37) rosły w temperaturze otoczenia z wydajnością od 70 do 97%

Przykład 47

Kryształy GLP-1 (7-37) hodować można przez dyfuzję parową stosując peptyd rozpuszczony w 100 mM Tris o pH o wartości 8-9,51 stężeniu 10-20 mg/ml. Roztwór peptydu miesza się w stosunku 1:1 z takim samym buforem, zawierającym od 0,5 do 2,5 M NaCl, a następnie równoważy w szczelnym systemie przeciwprądowo do buforu o pełnej mocy (np. Tris z 0,5-2,5 M NaCl).

180 697

WYKAZ SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Kim, Yesook

Lambert, William J. Qi, Hong Gelfand, Robert A. Geoghegan, Kieran F. Danley, Dennis E.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Przedłużone uwalnianie peptydów (iii) LICZBA SEKWENCJI: 7 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

(A) ADRESAT: Pfizer Inc.

(B) ULICA: 235 East 42^nd Street, 20^th Floor (C) MIASTO: New York (Nowy Jork) (D) STAN: New York (Nowy Jork) (E) KRAJ: USA (Stany Zjednoczone Ameryki Północnej) (F) KOD POCZTOWY: 10017-5755 (v) FORMA CZYTELNA DLA KOMPUTERA:

(A) TYP MEDIUM: DYSK ELASTYCZNY (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn Release #1.0, wersja #1.23 (vi) DANE DOTYCZĄCE BIEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZŁOŻENIA:

180 697 (C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFORMACJA DOTYCZĄCA RZECZNIKA/AGENTA:

(A) NAZWISKO I IMIĘ: Sheyka, Robert F.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 31 304 (C) NUMER REFERENCYJNY/REJESTRU: PC8391 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (212)573-1189 (B) TELEFAKS: (212)573-1939 (C) TELEKS: nie dotyczy (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR 1 (SEQ ID NR 1) (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 37 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) SKRĘCENIE: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) TYP FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: nie dotyczy (B) SZCZEP: nie dotyczy (C) IZOLAT INDYWIDUALNY: nie dotyczy (E) HAPLOTYP: nie dotyczy (H) LINIA KOMÓRKOWA: nie dotyczy (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(A) BIBLIOTEKA: nie dotyczy

180 697 (B) KLON: nie dotyczy (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: nie dotyczy (B) POŁOŻENIE W MAPIE: nie dotyczy (C) JEDNOSTKI: nie dotyczy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 1

His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp 15 10 15

Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala

25 30

Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 35 (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NR 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) SKRĘCENIE: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) TYP FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: nie dotyczy (B) SZCZEP: nie dotyczy (C) IZOLAT INDYWIDUALNY: nie dotyczy (E) HAPLOTYP: nie dotyczy (H) LINIA KOMÓRKOWA: nie dotyczy

180 697 (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(A) BIBLIOTEKA: nie dotyczy (B) KLON: nie dotyczy (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: nie dotyczy (B) POŁOŻENIE W MAPIE: nie dotyczy (C) JEDNOSTKI: nie dotyczy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 2

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15 10 15

Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30

Gly (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NR 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) SKRĘCENIE: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) TYP FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: nie dotyczy (B) SZCZEP: nie dotyczy (C) IZOLAT INDYWIDUALNY: nie dotyczy

180 697 (E) HAPLOTYP: nie dotyczy (H) LINIA KOMÓRKOWA: nie dotyczy (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(A) BIBLIOTEKA: nie dotyczy (B) KLON: nie dotyczy (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: nie dotyczy (B) POŁOŻENIE W MAPIE: nie dotyczy (C) JEDNOSTKI: nie dotyczy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 3

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15 10 15

Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NR 4 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) SKRĘCENIE: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) TYP FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) BIBLIOTEKA: nie dotyczy (B) KLON: nie dotyczy (viil) POŁOŻENIE W GENOMIE:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: nie dotyczy (B) POŁOŻENIE W MAPIE: nie dotyczy (C) JEDNOSTKI: nie dotyczy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 4

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15 10 15

Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly 20 25 (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NR 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) SKRĘCENIE: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) TYP FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) BIBLIOTEKA: nie dotyczy (B) KLON: nie dotyczy (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: nie dotyczy (B) POŁOŻENIE W MAPIE: nie dotyczy (C) JEDNOSTKI: nie dotyczy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 5:

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15 10 15

Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys 20 25 (2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NR 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) SKRĘCENIE: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) TYP FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) BIBLIOTEKA: nie dotyczy (B) KLON: nie dotyczy (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: nie dotyczy (B) POŁOŻENIE W MAPIE: nie dotyczy (C) JEDNOSTKI: nie dotyczy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 6:

His 1

Asp

Glu

Phe

Glu 5

Arg His

Ala

Glu

Gly Thr 10

Phe

Thr

Ser

Asp 15

Val

Ser

Tyr

Leu 20

Glu

Gly

Gin

Ala

Ala 25

Lys

Glu

Phe

Ile

Ala 30

Trp

Leu

Val

Lys

Gly 35

Arg

(2) INFORMACJA DOTYCZĄCA SEQ ID NR 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 aminokwasów (B) TYP: aminokwasowa (C) SKRĘCENIE: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (iii) HIPOTETYCZNA: nie (iv) ANTYSENSOWNA: nie (v) TYP FRAGMENTU: N-końcowy (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) ORGANIZM: nie dotyczy

180 697 (B) SZCZEP: nie dotyczy (C) IZOLAT INDYWIDUALNY: nie dotyczy (E) HAPLOTYP: nie dotyczy (H) LINIA KOMÓRKOWA: nie dotyczy (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:

(A) BIBLIOTEKA: nie dotyczy (B) KLON: nie dotyczy (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:

(A) CHROMOSOM/SEGMENT: nie dotyczy (B) POŁOŻENIE W MAPIE: nie dotyczy (C) JEDNOSTKI: nie dotyczy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NR 7:

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu 15 10 15

Gly Gin Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val 20 25

180 697

Czas (minuty)

180 697 ca

Rys. 2

280 η

260“

240220200

180 160 ~

140120-

Kontrola (n=8)

CP-95,26, wlew podczas posiłku (n=8) Posiłek

-120 -60 0 60 120 180 240 300 360 420

[wiew| ewl =4 |Wlew| [Wlew =

Czas (minuty)

180 697

280 η

2603,240 Ε

220 200” οι .2

160 140 120 -

Ο Kontrola (η=8)

CP-95,253, 2 ng/kg/min (η=8) ▲ CP-96,253, 4 ng/kg/min (η=8) | Podawanie insulinotropiny A Posiłek A Posiłek

100 ----Γ

-120 -60

120 180 240 300 360 420

Czas (minuty)

S

Ε Β, __Zawiesina wodna 1 __Zawiesina wodna 2

—. Zawiesina wodna 3 . . Zawiesina wodna 4 __Zawiesina wodna 5 __Zawiesina wodna 6 _ -Λ- — Zawiesina wodna 7

Czas (godz.)

180 697

Rys. 5

Czas (godz)

180 697

Czas(godz.)

180 697

Stężenie insulinotropiny w osoczu (ng/ml)

Czas(godz.)

180 697

Czas(godz.)

180 697

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja farmaceutyczna o przedłużonym działaniu polipeptydu GLP-1 i jego pochodnych stosowana w leczeniu cukrzycy insulinoniezależnej, umożliwiająca przedłużoną kontrolę glikemii, znamienna tym, że zawiera (i) związek dobrany z grupy, do której należą:

(a) peptyd o sekwencji aminokwasowej;

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2) (b) peptyd o sekwencji aminokwasowej:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -GIu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 7) gdzie X dobrany jest z grupy, do której należą:

(A) Lys (B) Lys-Gly, i (C) Lys-Gly-Arg (c) wykazująca w wyniku przemiany w organizmie ssaka aktywność insulinotropowąpochodna polipeptydu o strukturze pierwszorzędowej

H₂N-W-COOH gdzie W stanowi sekwencję aminokwasową dobraną z grupy, do której należą:

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 1) i

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Le u-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 6) (d) pochodna polipeptydu o strukturze pierwszorzędowej

H2N-R-COOH gdzie R stanowi sekwencję aminokwasową dobraną z grupy, do której należą:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NRIDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-GIu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 4)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 5);

i pochodna peptydów od (a) do (d) z grupy, do której należą:

180 697 (1) farmaceutycznie dopuszczalna kwasowa sól addycyjna tych peptydów;
(2) farmaceutycznie dopuszczalna sól karboksylowa tych peptydów;
(3) farmaceutycznie dopuszczalna zasadowa sól addycyjna tych peptydów;
(4) farmaceutycznie dopuszczalny niższy ester alkilowy tych peptydów, (5) farmaceutycznie dopuszczalny amid tych peptydów, przy czym ten farmaceutycznie dopuszczalny amid dobrany jest z grupy, do której należy amid, niższy amid alkilowy i niższy amid dwualkilowy, i (ii) cynk (II) w kompleksie z peptydem, a kompozycja jest w formie bezpostaciowej, krystalicznej lub w postaci wodnej zawiesiny i zawiera cynk oraz peptyd (a) - (d) w stosunku molowym 0,10 do 6 oraz ewentualnie zasadowy polipeptyd i związek fenolowy.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że kompozycja jest w postaci zawiesiny wodnej i zawiera od 1-4 mg/ml peptydu a-d, od 0,02 do 1,0 mg/ml zasadowego polipeptydu i od 0,5 do 6 mg/ml związku fenolowego.

3. Sposób otrzymywania kompozycji farmaceutycznej o przedłużonym działaniu polipeptydu GLP-1 i jego pochodnych stosowanej w leczeniu cukrzycy insulinoniezależnej, znamienny tym, że poddaje się wysokim naprężeniom ścinającym i/lub działaniu soli mieszaninę zawierającą:

(i) związek dobrany z grupy, do której należą:

(a) peptyd o sekwencji ammokwasowej:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NRIDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2) (b) peptyd o sekwencji aminokwasowej:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 7) gdzie X dobrany jest z grupy, do której należą:

(A) Lys (B) Lys-Gly, i (C) Lys-Gly-Arg (c) wykazująca w wyniku przemiany w organizmie ssaka aktywność insulinotropowąpochodna polipeptydu o strukturze pierwszorzędowej

H2N-W-COOH gdzie W stanowi sekwencję aminokwasową dobraną z grupy, do której należą.

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 1) i

His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-LeuGlu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 6) (d) pochodna polipeptydu o strukturze pierwszorzędowej

H2N-R-COOH gdzie R stanowi sekwencję aminokwasową dobraną z grupy, do której należą:

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly (NRIDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 2)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 3)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 4)

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys -Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys (NR IDENTYFIKACYJNY SEKWENCJI: 5); i

180 697 pochodna peptydów od (a) do (d) z grupy, do której należą:

(1) farmaceutycznie dopuszczalna kwasowa sól addycyjna tych peptydów;

(2) farmaceutycznie dopuszczalna sól karboksylowa tych peptydów;

(3) farmaceutycznie dopuszczalna zasadowa sól addycyjna tych peptydów;

(4) farmaceutycznie dopuszczalny niższy ester alkilowy tych peptydów;
(5) farmaceutycznie dopuszczalny amid tych peptydów, przy czym ten farmaceutycznie dopuszczalny amid dobrany jest z grupy, do której należy amid, nizszy amid alkilowy i niższy amid dwualkilowy.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako sól powodującą utworzenie formy bezpostaciowej stosuje się siarczan amonowy, siarczan sodowy, siarczan litowy, chlorek litowy, cytrynian sodowy, cytrynian amonowy, fosforan potasowy, chlorek sodowy, chlorek potasowy, chlorek amonowy, octan sodowy, octan amonowy, siarczan magnezowy, chlorek wapniowy, azotan amonowy i mrówczan sodowy pojedynczo lub w mieszaninie.

* * *