CZ286412B6 - Synergetic combination of compounds for treating AIDS, pharmaceutical preparation containing such synergetic combination and use of this synergetic combination for preparing pharmaceutical preparation - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká synergické kombinace N-(2-(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmethyl-4(S)-hydroxy-5-(l-(4-(3-pyridylmethyl)-2(S)-N'-terc.butylkarbamoyl)piperazinyl))pentanamidu, označovaného také jako sloučenina J s AZT, ddl nebo ddC, farmaceutického prostředku s obsahem této synergické kombinace, určeného zejména pro léčení a prevenci infekcí HIV, syndromu AIDS nebo pro inhibici HTV-proteázy a také použití této synergické kombinace pro výrobu uvedeného farmaceutického prostředku.

Dosavadní stav techniky

Retrovirus, označovaný jako virus lidské imunodeficience HIV je původcem komplexního onemocnění, které zahrnuje progresivní destrukci imunitního systému za vzniku syndromu AIDS a degeneraci centrálního i periferního nervového systému. Virus byl dříve označován také jako LAV, HTLV-III nebo ARV. Společnou vlastností replikace retroviru je rozsáhlá posttranslační zpracování prekurzorových polyproteinů působením proteázy, pro niž je virus kódem za vzniku virových bílkovin, nezbytných pro strukturu a funkci viru. Při inhibici tohoto zpracování nemůže docházet ke tvorbě normálního infekčního viru. Například v publikaci Kohl N. E. a další, Proč. Nati. Acad. Sci., 85, 4686, 1988 se prokazuje, že při genetické inaktivaci proteázy, pro niž je virus kódem dochází k produkci nezralých a neinfekčních částic viru. Tyto výsledky prokazují, že inhibice proteázy HIV je nadějnou metodou pro léčení syndromu AIDS a pro prevenci a léčení infekce HIV.

Nukleotidová sekvence HTV prokazuje přítomnost genu pol v otevřeném čtecím rámci, jako bylo popsáno v Ratner L. a další, Nátuře, 313, 277, 1985. Homologie řetězce aminokyselin prokazuje, že gen pol je kódovým řetězcem pro reverzní transkriptázu, endonukleázu a HIV proteázu podle publikací Toh H. a další, EMBO J., 4, 1267, 1985, Power M. D. a další, Science, 231, 1567, 1986, Pearl L. H. a další, Nátuře, 329, 351, 1987. Sloučeniny, které budou dále popsány, jsou schopné způsobit inhibici HTV proteázy.

V průběhu popisu přihlášky budou použity následující zkratky:

označení____________________________________ochranné skupiny__________________________

BOC (Boc) terč, butyloxykarbonyl

CBZ (Cbz) benzyloxykarbonyl

TBS (TBDMS) terc.butyldimethylsilyl aktivační skupiny a vazná činidla

HBT (HOBT nebo HOBt) BOP

BOP-C1 EDC

-hydroxybenzotriazolhydrát benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)fosfmchlorid

-ethyl-3-(3-dimethy laminopropy 1)karbodiimidhydrochlorid

-1 CZ 286412 B6 (BOC)₂O(BOC₂O) n-Bu₄N⁺F' nBuLi (n-Buli) DMF

Et₃N

EtOAc

TFA

DMAP

DME

LDA

THF jiné látky_________________ di-terc.butyldikarbonát tetrabutylamoniumfluorid n-butyllithium dimethylformamid triethylamin ethylacetát kyselina trifluoroctová dimethylaminopyridin dimethoxyethan lithiumdiisopropylamid tetrahydrofuran ________________________________________aminokyseliny

Ile L-isoleucin

Val L-valin

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří synergická kombinace N-(2-(R)-hydroxy-l(S)-mdanyl)-2(R)-fenylmethyl-4(S)-hydroxy-5-(l-(4-(3-pyridylmethyl)-2(S)-N'-(terc.butylkarbamoyl)piperazinyl))pentanamidu označovaného také jako sloučenina J, vzorce I

nebo farmaceuticky přijatelné soli této látky s AZT nebo ddl nebo ddC.

Součást podstaty vynálezu tvoří také farmaceutický prostředek pro léčení a prevenci infekce HIV, syndromu AIDS nebo pro inhibici HTV-proteázy, který jako svou účinnou složku obsahuje uvedenou synergickou kombinaci sloučenin.

Do podstaty vynálezu spadá také použití uvedené kombinace sloučenin pro výrobu tohoto farmaceutického prostředku.

Uvedená synergická kombinace sloučenin je nejvýhodnější kombinací z velkého množství dlouho zkoumaných možností.

Sloučenina J, označovaná také jako sloučenina L-735 524 je známý inhibitor HTV proteázy, který se běžně užívá k léčení AIDS. Sloučeniny ddC, ddl a AZT se běžně dodávají a používají a příklady výrobců a použití těchto látek jsou uvedeny v následující tabulce:

-2CZ 286412 B6

Název	Výrobce	Indikace
ddl dideoxyinosin	Bristol-Myers (New York, NY)	AIDS, ARC
ddc dideoxycytidin	Hoffman-La Roche (Nutley,NJ)	AIDS, ARC
AZT Zidovudin	Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle, Park, NC)	AIDS i v pediatrii, ARC, Kaposiho sarkom, HTV bez příznaků Kombinační léčba

Synergickou kombinaci podle vynálezu je možno použít při inhibici proteázy HIV při prevenci nebo léčení infekce virem HIV a k léčení syndromu AIDS, který je důsledkem této infekce. Synergickou kombinací podle vynálezu je tedy možno léčit celou řadu stavů, které provázejí infekci HTV, jako AIDS, ARC (komplex, příbuzný AIDS), s příznaky i bez příznaků, kombinaci je možno také použít při skutečném nebo pravděpodobném styku s virem HTV. Může jít například o předchozí styk s virem při krevní transfuzi, transplantaci orgánu, výměně tělních tekutin, po pokousání, náhodném poranění o injekční jehlu nebo po styku s krví nemocného v průběhu chirurgického zákroku.

K uvedeným účelům je možno synergickou kombinaci podle vynálezu podávat perorálně, parenterálně, to znamená podkožně, nitrožilně, nitrosvalově, intrastemálně nebo infuzí a také inhalací nebo rektálně při použití lékových forem, které obsahují běžné netoxické farmaceutické nosiče, pomocné látky nebo nosná prostředí.

Tyto farmaceutické prostředky se podávají v množství, které obsahuje synergickou kombinací podle vynálezu nebo její sůl v takovém množství, že je možno předpokládat dostatečnou účinnost.

Farmaceutické prostředky mohou mít formu suspenzí nebo tablet pro perorální podání, spreje do nosu, sterilních injekčních prostředků, jako sterilních suspenzí ve vodě nebo v oleji, nebo může jít o čípky.

Při perorálním podání ve formě suspenze se tyto suspenze připravují způsobem, známým ve farmaceutickém průmyslu, mohou obsahovat mikrokrystalickou celulosu pro zvětšení objemu, kyselinu alginovou nebo alginát sodný k usnadnění tvorby suspenze, methylcelulosu k úpravě viskosity a známá sladidla nebo látky pro úpravu chuti. V případě tablet s okamžitým uvolněním účinné látky mohou tyto tablety obsahovat mikrokrystalickou celulosu, hydrogenfosforečnan vápenatý, škrob, stearan hořečnatý a laktosu a/nebo další pomocné složky, pojivá, desintegrační činidla, ředidla, a kluzné látky.

Při podání do nosu ve formě aerosolu nebo inhalací je možno uvedené prostředky připravit rovněž známým způsobem, například ve formě roztoků ve fyziologickém roztoku chloridu sodného při použití benzylalkoholu nebo jiného vhodného konzervačního činidla, látky pro zvýšené vstřebávání ke zvýšení biologické dostupnosti, fluorované uhlovodíky a/nebo známá solubilizační nebo dispergační činidla.

Roztoky nebo suspenze pro injekční podání je rovněž mono připravit známým způsobem při použití vhodných netoxických, z parenterálního hlediska přijatelných ředidel nebo rozpouštědel, jako jsou mannitol, 1,3-butandiol, voda, Ringerův roztok nebo isotonický roztok chloridu sodného, je možno přidávat vhodná dispergační činidla, smáčedla nebo činidla pro vznik

-3CZ 286412 B6 suspenze, jako sterilní oleje včetně syntetických mono- nebo diglyceridů a alifatické kyseliny, například kyselinu olejovou.

V případě rektálního podání ve formě čípků je možno prostředky připravit tak, že se účinná látka smísí s vhodnými nedráždivými pomocnými látkami, jako jsou kakaové máslo, syntetické glyceridy nebo polyethylenglykoly, které jsou při běžných teplotách pevné, avšak v konečníku zkapalní a/nebo se rozpustí a uvolní účinnou látku.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady, v nichž budou popsány zkoušky, jimiž byla prokazována účinnost kombinace podle vynálezu, uvedeny jsou rovněž výsledky provedených zkoušek.

Příklady provedení vynálezu

Zkouška inhibice mikrobiální exprese HTV proteázy

Zkouška inhibice exprese proteázy E. coli s 0,5 mg/ml (na počátku reakce) peptidového substrátu [Val—Ser-Gln-Asn-(betanaftyl)Ala-Pro-Ile-Val se provede během 1 hodiny při teplotě 30 °C v 50 mM roztoku octanu sodného o pH 5,5. Do 25 μΙ roztoku peptidu ve vodě se přidají různé koncentrace inhibitoru v 1,0 μΐ DMSO.

Reakce se zahájí přidáním 15 μΐ (0,11 ng) 0,33 nM roztoku proteázy v 0,133 M roztoku octanu sodného o hodnotě pH 5,5 a 0,1% roztoku albuminu hovězího séra. Reakce se ukončí přidáním 160 μΐ 5% roztoku kyseliny fosforečné. Produkty reakce se oddělí HPLC, sloupec se širokými póry 5 cm, C-18 reversní fáze, gradient acetonitrilu, 0,1% kyselina fosforečná (VYDAC). Velikost inhibice se určí podle výšky vrcholů produktů. HPLC produktů, nezávisle vzniklých, udává množství a konfirmaci složení produktů. Výsledné sloučeniny příkladů 1-7 včetně vykazují hodnoty IC₅₀ v rozmezí 1-100 mM. Sloučeniny A,B a J mají hodnotu IC₅₀ v rozmezí přibližně od 0,3 do 6 nM.

Inhibice šíření virů

A: Příprava suspenze HTV infikovaných MT-4 buněk

MT buňky infikované v den 0 virem kmene HTV-1, zásobní kultury Hlb s koncentrací 250 000/ml při ředění 1:1000 (konečná koncentrace 125 pg p24/ml; dostačující výtěžek v den 1 je < nebo = 1% infikovaných buněk a 25-100% v den 4). Buňky se infikují a rostou na půdě o složení: RPMI 1640 (Whittaker BioProducts), 10% roztok inaktivovaného fetálního hovězího séra, 4 mM roztok glutaminu (Gibco Labs) a směs Penicillinu a Streptomycinu v poměru 1:100 (Gibco Labs). Směs se inkubuje přes noc v atmosféře 5% oxidu uhličitého a při teplotě 37 °C.

B: Působení inhibitorů

Připraví se matrice ze synergické kombinace dvou sloučenin (viz tabulka S) v rozsahu nanomolámích koncentrací. V den 1 se přidá do 96 jamek mikrotitrační plotny s obsahem 50 000 HIV infikovaných MT-4 buněk v jedné jamce podíl 125 μΐ inhibitoru. Inkubace se provádí 3 dny v atmosféře 5% oxidu uhličitého a při teplotě 37 °C.

-4CZ 286412 B6

C: Měření šíření viru

Za použití vícekanálové pipety se naočkované buňky znovu uvedou do suspenze a 125 μΐ se odebere a přenese na oddělenou mikrotitrační plotnu. Provede se zkouška supematantu na HIV p24 antigen.

Koncentrace HTV p24 antigenu se určí dále popsanou enzymovou imunoesejí. Měřené podíly p24 antigenu se přidají do jamek s obsahem monoklonální protilátky specifické proti HTV povrchovému antigenu (core antigen). Jamky se promyjí, stejně jako po následujících stupních postupu. Nejprve se přidá biotinylovaná specifická protilátka proti HTV, pak konjugovaná strepavidin-křenová peroxidáza a po přidání peroxidu vodíku a tetrametylbenzidinového substrátu vznikne barevná reakce, jejíž intenzita je přímo úměrná koncentraci HTV p24 antigenu.

Výpočet stupně synergie

Synergickou kombinací dvou inhibitorů (tabulka 5) dojde k výraznému zesílení inhibice množení viru ve srovnání se samostatným inhibitorem nebo se součtem inhibicí obou inhibitorů. Tak například sloučením sloučeniny 524 a AZT se inhibice výrazně zesílí ve srovnání se samotnou sloučeninou 524 nebo AZT nebo ve srovnání se součtem jejich inhibicí. Tento poznatek se získal výpočtem velikosti frakční inhibiční koncentrace (FIC) metodou Eliona a spol. uvedenou v J. Biol. Chem. 208, 477 (1954). Nejmenší hodnota FIC, která odpovídá největší hodnotě synergie, byla naměřena pro různé synergické kombinace dvou sloučenin (viz tabulka S.) Tyto výsledky udávají základní synergie v inhibicí šíření viru. Čím menší je číslo, tím větší je synergie.

Tabulka S

Kombinace dvou sloučenin 524 +ddl 524 +AZT maximální synergie

0,7

0,7

524 je sloučenina L-735,524 (sloučenina J). Ostatní sloučeniny jsou popsané ve shora uvedené tabulce.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Synergická kombinace pro léčení AIDS, vyznačující se tím, že obsahuje N-(2-(R)-hydroxy-1 (S)-indany l)-2-(R)-feny lmethy 1-4—(S)-hydroxy-5-( 1 -(4-{3-pyridylmethyl)-2-(S)-N'-(terc.butylkarbamoyl)piperazinyl))pentanamid, sloučenina J, vzorce I nebo farmaceuticky přijatelnou sůl této látky, se zidovudinem, dideoxyinosinem nebo dideoxycitidinem.
2. 2. Farmaceutický prostředek pro léčení a prevenci infekce HIV, syndromu AIDS nebo pro inhibici HlV-proteázy, vyznačující se tím, že jako svou účinnou složku obsahuje synergickou kombinaci sloučenin podle nároku 1.
3. 3. Použití synergické kombinace podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení AIDS, léčení nebo prevenci infekce HIV nebo pro inhibici HlV-proteázy.