SK279471B6 - Kompozícia zlúčenín, farmaceutické prostriedky s i - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka zlúčeniny ktorá spôsobuje inhibíciu proteázy, pre ktorú je kódom vírus ľudskej imunodeficiencie HIV. Túto látku a jej farmaceutický prijateľné soli je možné použiť na prevenciu alebo pri liečenie infekcie HIV a pri liečení výsledného syndrómu AIDS. Vynález sa týka aj farmaceutických prostriedkov, ktoré túto látku obsahujú.

Doterajší stav techniky

Retrovírus ako vírus ľudskej imunodeficiencie HIV je pôvodcom komplexného ochorenia, ktoré zahrnuje progresívnu deštrukciu imunitného systému za vzniku syndrómu AIDS a degenerácie centrálneho aj periférneho nervového systému. Vírus bol predtým označovaný tiež ako LA V, HTLV-III alebo ARV. Spoločnou vlastnosťou replikácie retrovírusu je rozsiahle postranslačné spracovanie prekurzorových polyproteínov pôsobením proteázy, pre ktorú je vírus kódom za vzniku vírusových bielkovín, nevyhnutných na štruktúru a funkciu vírusu. Pri inhibicii tohto spracovania nemôže dochádzať k tvorbe normálneho infekčného vírusu. Napríklad v publikácii Kohl N. E a ďalší, Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 4686, 1988 sa dokazuje, že pri genetickej inaktivácii proteázy, pre ktorú je vírus kódom, dochádza k produkcii nezrelých a neinfekčných častíc vírusu. Tieto výsledky dokazujú, že inhibícia proteázy HIV je nádejnou metódou na liečenie syndrómu AIDS a na prevenciu a liečenie infekcie HIV.

Nukleotidová sekvencia HIV dokazuje prítomnosť génu pol v otvorenom čítacom rámci, ako bolo opísané v Ratner L. a ďalší, Náture, 313, 277, 1985. Homológia reťazca aminokyselín dokazuje, že gén pol je kódovým reťazcom na reverznú transkriptázu, endonukleázu a HIV proteázu podľa publikácií Toh H. a ďalší, EMBO J., 4, 1267, 1985, Powcr M. D. a ďalší, Science, 231, 1567, 1986, Pearl L. H. a ďalší, Náture, 329, 351, 1987. Zlúčeniny, ktoré budú ďalej opísané, sú schopné spôsobiť inhibíciu HIV proteázy.

V opise budú použité nasledujúce skratky:

označenie ochranné skupiny

BOC (Boe) CBZ (Cbz) TBS{TBDMS)	terc, bulyloxyka rbonyl benzyloxyka rbonyl terc.tutyldimetylsilyl
HBT (HOBT alebo HOBt)	aktlvačná skupina a väzbové činidlá t -hydroxy benzotriazolhydrát
BOR	benzotriazoLI -ytoxytris(dimetyi)-
BOP-CI	amino)fosfóniLirnhexafluórfo$fát bis(2-cxo-3-oxazolidinyl)fo8finchlorid
EDC	1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyí)karbodiirnid-
(BOC)2O(BOC20)	hydrochlorid iné látky di-tercbutyldikarbonát
n-Bu4aN+F-	telrabutylamóniumfluorid
nBuLí (n-Bufí)	n-butyllltitirn
DMF	dimetylformarnid
Et3N	trietylamin
EtOAc	etylacetát
TFA	kyselina trifluôroctová
DMAP	dimetytaminopyridín
OME	dimetoxyetán
LOA	litiumdiizopropylamid
THF	tetrahydrofurán
Ila	aminokyseliny L-izoleucin
Val	L-valln

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvorí J (L-735,524) vzorca, kompozícia zlúčeniny

ktorou je N-(2(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4(S)-hydroxy-5 -(1 -(4-pyridylmetyl)-2(S)-N'-(terc.butylkarbamoyl)piperazinyl))pentánamid, alebo farmaceutický prijateľnej soli tejto látky, s azidotymidínom (AZT) alebo 2’,3'-di-deoxyinozín (ddl) alebo 2',3-di-deoxycitidín (ddC), ako aj farmaceutický prostriedok na liečenie a prevenciu infekcie HIV, syndrómu AIDS a príbuzných ochorení, ktorý ako svoju účinnú zložku obsahuje kompozíciu uvedených zlúčenín.

Podstatu vynálezu tvorí aj použitie kompozície zlúčeniny J alebo jej farmaceutický prijateľnej soli, s AZT alebo ddl alebo ddC na výrobu liečiva na liečenie a prevenciu infekcie HIV, syndrómu AIDS a príbuzných ochorení alebo na inhibíciu HlV-proteázy.

Zlúčenina podľa vynálezu môže mať stredy asymetrie a môže sa vyskytovať ako racemát, zmes racemátov a jednotlivé diastereomér alebo enantiomér, pričom vynález zahrnuje všetky izoméme formy týchto látok.

Farmaceutický prijateľné soli zlúčeniny J ako vo vode alebo v oleji rozpustné alebo dispergovateľné produkty, zahrnujú bežné netoxické soli alebo kvartéme amóniové soli, ktoré je možné tvoriť napríklad s anorganickými alebo organickými kyselinami alebo bázami. Ako príklady adičných solí s kyselinami je možné uviesť acetáty, adipáty, algináty, aspartáty, benzoáty, benzénsulfonáty, bisulfáty, butyráty, citráty, soli kyseliny gáfrovej, gafŕosulfonáty, cyklopentánpropionáty, diglukonáty, dodecylsulfáty, etánsulfonáty, fumaráty, glukoheptanoáty, glycerofosfáty, hemisulfáty, heptanoáty, hexanoáty, hydrochloridy, hydrobromidy, hydrojodidy, 2-hydroxyetánsulfonáty, laktáty, maleáty, metánsulfonáty, 2-naftylénsulfonáty, nikotináty, oxaláty, pamoáty, pektináty, persulfáty, 3-fenylpropionáty, pikráty, pivaláty, propionáty, sukcináty, tartráty, tiokyanáty, tosyláty a undekanoáty. Soli s bázami zahrnujú amóniové soli, soli s alkalickými kovmi, ako sodné a draselné soli, soli s kovmi alkalických zemín, ako vápenaté a horečnaté soli, soli s organickými bázami, ako dicyklohexylamínom alebo s N-metyl-D-glukamínom a soli s aminokyselinou, ako arginínom, lyzínom a podobne. Bázické skupiny, obsahujúce dusík, môžu tiež byť kvartemizované pôsobením rôznych činidiel, ako sú nižšie alkylhalogenidy, ako metyl-, etyl-, propyl- alebo butylchlorid, -bromid a -jodid, dialkylsulfáty, ako dimetylsulfát, dietylsulfát alebo dibutylsulfát a tiež diamylsulfáty, halogenidy s dlhým reťazcom, ako decyl-, lauryl-, myristyl- a stearylchlorid, -bromid a -jodid, aralkylhalogenidy, ako benzylbromid a fenetylbromid a podobne. Z ďalších farmaceutický prijateľných soli je možné uviesť etanoláty sulfátov a sulfáty.

Ďalej bude uvedená reakčná schéma, ktorá opisuje spôsob výroby zlúčeniny J v príklade 1.

Amidové väzby, použité na získanie zlúčeniny podľa vynálezu sa typicky vytvárajú karbodiimidovou metódou s použitím reakčných činidiel, ako sú dicyklohexylkarbodiimid alebo l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid.

Ďalšie postupy na tvorbu amidovej alebo peptidovej väzby zahrnujú syntetické postupy cez chlorid kyseliny, azid, zmesný anhydrid alebo aktivovaný ester, vynález však nemá byť na tieto postupy obmedzený. Typicky sa amid vytvára v roztoku, je však možné použiť aj syntézu v tuhej fáze klasickým Merrifíeldovým postupom. Typické je tiež naviazanie a odstránenie prípadných ochranných skupín.

Ďalšie informácie, týkajúce sa syntézy zlúčenín uvedeného typuje možné získať v EP 337 714.

Zlúčeninu podľa vynálezu je možné použiť pri výrobe a vyhľadávaní protiv [rusových zlúčenín. Pomocou uvedenej látky je napríklad možné izolovať mutanty enzýmov, ktoré je potom možné využiť na vyhľadávanie účinnejších protivírusových zlúčenín. Okrem toho jc možné zlúčeninu podľa vynálezu použiť pri stanovení miest väzby iných protivírusových látok na proteázu HIV, napríklad kompetitívnou inhibiciou.

Zlúčeninu podľa vynálezu je možné použiť pri inhibícii proteázy HIV pri prevencii alebo liečení infekcie vírusom HIV a na liečenie syndrómu AIDS, ktorý je dôsledkom tejto infekcie. Zlúčeninou podľa vynálezu je možné liečiť celý rad stavov, ktoré sprevádzajú infekciu HIV, ako AIDS, ARC (komplex, príbuzný AIDS), s príznakmi aj bez príznakov, zlúčeniny je možné tiež použiť pri skutočnom alebo pravdepodobnom styku s vírusom HIV. Môže ísť napríklad o predchádzajúci styk s vírusom pri krvnej transfúzii, transplantácii orgánu, výmene telových tekutín, po pohryznutí, náhodnom poranení o infekčnú ihlu alebo po styku s krvou chorého v priebehu chirurgického zákroku.

Na uvedené účely je možné zlúčeninu podľa vynálezu podávať perorálne, parenterálne, to znamená podkožné, vnútrožilovo, vnútrosvalovo, intrastemálne alebo infúziou a tiež obsahujú bežné netoxické farmaceutické nosiče, pomocné látky alebo nosné prostredia.

Tieto farmaceutické prostriedky sa podávajú v množstve, ktoré obsahuje zlúčeninu podľa vynálezu alebo jej soľ v takom množstve, že je možné predpokladať dostatočnú účinnosť.

Farmaceutické prostriedky môžu mať formu suspenzií alebo tabliet na perorálne podanie, sprejov do nosa, sterilných injekčných prostriedkov, ako sterilných suspenzií vo vode alebo v oleji alebo môže ísť o čapíky.

Pri perorálnom podaní vo forme suspenzie sa tieto suspenzie pripravujú spôsobom, známym vo farmaceutickom priemysle, môžu obsahovať mikrokryštalickú celulózu na zväčšenie objemu, kyselinu alginovú alebo alginát sodný na uľahčenie tvorby suspenzie, metylcelulózu na úpravu viskozity a známe sladidlá alebo látky na úpravu chuti. V prípade tabliet s okamžitým uvoľnením účinnej látky môžu tieto tablety obsahovať mikrokryštalickú celulózu, hydrogénfosforečnan vápenatý, škrob, stearan horečnatý a laktózu a/alebo ďalšie pomocné zložky, spojivá, dezintegračné činidlá, riedidlá a klzné látky.

Pri podaní do nosa vo forme aerosólu alebo inhaláciou je možné uvedené prostriedky pripraviť taktiež známym spôsobom, napríklad vo forme roztokov vo fyziologickom roztoku chloridu sodného za použitia benzylalkoholu alebo iného vhodného konzervačného činidla, látky na zvýšené vstrebávanie na zvýšenie biologickej dostupnosti, fluorované uhľovodíky a/alebo známe solubilizačné alebo dispergačné činidlá.

Roztoky alebo suspenzie na injekčné podanie je taktiež možné pripraviť známym spôsobom s použitím vhodných netoxických, z parenterálneho hľadiska prijateľných riedidiel alebo rozpúšťadiel, ako sú manitol, 1,3-butándiol, voda, Ringerov roztok alebo izotonický roztok chloridu sodného, je možné pridávať vhodné dispergačné činidlá, zmá čadlá alebo činidlá na vznik suspenzie, ako sterilné oleje vrátane syntetických mono- alebo diglyceridov a alifatické kyseliny, napríklad kyselinu olejovú.

V prípade rektálneho podania vo forme čípkov je možné prostriedky pripraviť tak, že sa účinná látka zmieša s vhodnými nedráždivými pomocnými látkami, ako sú kakaové maslo, syntetické glyceridy alebo polyetylénglykoly, ktoré sú pri bežných teplotách tuhé, ale v konečníku skvapalnia a/alebo sa rozpustia a uvoľnia účinnú látku.

Pri prevencii alebo liečení uvedených stavov sa používajú denné dávky rádovo 0,02 až 5,0 alebo 10,0 g, pričom pri perorálnom podaní sú dávky dvakrát a päťkrát vyššie. Napríklad infekciu HIV je možné účinne liečiť podaním 1,0 až 50 mg účinnej látky/kg hmotnosti 1 až 4 x denne. Pri výhodnom spôsobe podania sa podávajú dávky 100 až 400 mg každých 6 hodín perorálne. Je zrejmé, že špecifická veľkosť dávok a častosť podania týchto dávok sa môže u rôznych chorých meniť a bude závisieť od celého radu faktorov, napríklad od metabolickej stálosti a dĺžky pôsobenia tejto látky, od veku, hmotnosti, zdravotného stavu, pohlavia, spôsobu stravovania, od spôsobu a času podania, od vylučovania, od použitej kombinácie použitých látok a tiež od závažnosti liečeného stavu.

Podstatu vynálezu tvorí aj použitie kombinácií inhibítorov proteázy HIV podľa vynálezu s jednou alebo väčším počtom látok, ktoré je taktiež možné použiť na liečenie AIDS. Zlúčenina podľa vynálezu je napríklad s úspechom možné podávať v kombinácii s účinným množstvom protivírusových látok, imunomodulátorov, látok proti infekcii alebo tiež spolu s vakcínami, príklady týchto látok sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:

Tabuľka C

Pľotivínjsové látky

Názov	výrobca	indikácia
AL-721	Ethigen (Los Angeles, CA)	ARC, PGL, HIV pozitivita, AIDS
rekombinantný ľudský interferón beta Acemannan	Triton Biosciences (Almeda, CA) Carrington Labs (Irving.TX)	AIDS, Kaposiho sarkôm, ARC ARC (vief aj imunomodulátoiy)
Cytovene	Syntex (Palo Alto, CA)	CMV, ohrozujúci žrak
Canciclovir	Syntex (Palo Alto, CA)	periférny reti- nitis CMV
d4T (didehydrodeoxylimidln)	Bristol-Myeľs (New York, NY)	AIDS. ARC
ddl (dideoxyinozín}	(Bristol-Myers (New York, NY)	AIDS, ARC
EL1C	Elán Corp. PLC (Gainesville, GA)	Infekcia HIV (virf. aj imunomodulátory)
Fosfonomravčan trisodný	Astra Pharm. Products, Inc. (Westborought, MA)	CMV retinitís, infekcia HIV, iné CMV infekcie

Dideoxycytidin	Hoffman-La Roche	AIDS.ARC	Acemannan	Carrington Labs,	AIDS. ARC(vitf.
ddC	(Nutíey. NJ)			Inc. (Irving.TX)	aj protŕvírusové látky
Novapren	Novaferon Labs, Inc. (Akron, OH)	inhibítor HIV	CL 246 738	Američan Cyanamid	AIDS. Kaposiho
	Diapren, Inc.			(Peari Rivar, NY)	sarkóm
	(Roseville, MN)			Lederie Labs
				(Wayne, NJ)
Peptid T	Penlnsula Labs	AIDS
oktapeplkd	(Belmorit, CA)		EL 10	Elán Corp. PLC	Infekcia HIV (viď
				(Gainesville, <3A)	aj protivlnjsové
Zidovudin, AZT	Burroughs	pokročilá AIDS,			látky)
	Wellcorne	ARC, pediatrická
	(Rsch. Triangle	AIDS, Kaposiho	Gamma Interfe'ón	Genentech	ARC v kombinácii
	Park, NC)	sarkóm, infekcia		(S.San Francisco,	s w/TNF (faktor -
		HIV bez príznakov miernejší priebeh		CA)	nekrózy nádorov)
		HIV, neurologické	Faktor stimulujúci	Genetics In s trií-	AIDS
		príznaky, kombl·	kolónie granulocy-	Ie (Cambridge.MA)
		novaná liečba	tov makrofágov	Sandoz
				(EastHanover. NJ)
Ansamycin ĽM 427	Adria Laborato-	ARC
	rieš (Dublin, OH),		Faktor stimulujúci	Hoechst-Roussel	AIDS
	Erbamont (Stám-		kolónie granulocy-	(Somerville, NJ)
	tord, CT)		tov makrofágov	Immunex
				(Seattle, Wa)
Dextransulfát	Ueno Fine Chem.	AIDS.ARC, HIV
	Ind. Ltd. (Osaka,	pozitivita bez	Faktor stimulujúci	Schering-Plough	AIDS v kombinácii
	Japonsko)	príznakov	kolónie granulocy-	(Madison, NJ)	w/AZT
Virazol	Víratek/INC	HIV pozitivita	tov makrofágov
Ribavirin	(Cosla Mesa.CA)	bez príznakov, LAS, ARC	Imunostimulačné	Rorer	seropozitlvny HIV
Alfa Interferon	Burroughs	Kaposiho sarkóm,
	Wellcorne	HIV v kombinácii	častice jadra HIV	(Ft. Washington,
	(Rsch. Triangle Park. NC)	w/retrovir		PA)
Acyclovir	Burroughs	AIDS, ARC, HIV	IL-2	Cetus	AIDS v kombinácii
	Wellcorne	pozitivita bež príznakov, kombi-	lnterteukin-2	(Emeryville, CA)	s w/AZT
		nácia s AZT	IL-2	Hoffman-La Roche	AIDS, ARC. HIV,
Protilátky, neutra·	Advanced Blothe·	AIDS, ARC	lnterleukln-2	(Nutley, NJ)	v kombinácii
lizujúce pH-labilný	rapy Concepts			Immunex	w/AZT
alfa-acerantný interferón v inwnoadsor-	(Rockville, MD)		imunoglobulln pre	Cutter Biological	AIDS v pediatrii,
pčnom stĺpe';			vnútrožilové podanie	(Berkeley, CA)	v kombinácii s
			(ľudský)		w/AZT
L-697 661	Merck	AIDS.ARC, HIV
	{Rahway, NJ)	pozitivita bez	IMREG-1	Imreg	AIDS, Kaposiho
		príznakov, aj v kombinácii s AZT		(NewOrieans, LA)	sarkóm. ARC, PGL
L-696 229	Merck	AIDS.ARC, HIV	IMREG-2	Imreg	AIDS. Kaposiho
	(Rahway, NJ)	pozitivita bez príznakov, aj		(New Orleans, LA)	sarkóm, ARC, PGL
		v kombinácii s AZT	imunotiol (dietyl-	Merieux Inštitúte	AIDS.ARC
			ditiokarbamát	(Miami, FL)
	Imunomodulátory
Názov	výrobca	indikácia	Aifa-2 interferón	Schering Plough	Kaposiho sarkóm, w/AZT. AIDS
				(Madison, NJ)
AS-101	Wyeth-Ayerst Labs. (Philadelphia, PA)	AIDS	Metionin-enkefalin	TNI Phamaceutica) (Chicago, IL)	AIDS, ARC
Bropirimin	Upjohn (Kalamazoo, Ml)	AIDS v pokročilom stave	MTP-FE (muramyltripeptid)	Ciba-Geigy Corp. (Summint, NJ)	Kaposiho sarkóm

faktor stimulujúci kolónie granuiocytov	Amgen (Thousand Oaks, CA)	AIDS, v kombinácii s w/AZT
rCD4 (rekombinantný	Genentech	AIDS, ARC
rozpustný ľudský CD4)	(S. San Franctsco, CA)
rCD4-lgG	Genentech	AIDS, ARC
hybridy	(S. San Francísco, CA)
rekombinantný raz·	Biogen	AIDS. ARC
pustný ľudský CD4	(Cambridge, MA)
Interferón alfa-2	Hoflman-La Róčha	KápôSiho sarkóm,
	(Nutley, NJ)	AIDS. ARC, v kombinácii 9 w/AZT
SK&F10652S	SmithKline &	HIV infekda
rozpustný T4	French Laboratories (Phiadelphia, PA)
Tymcpentln	Immunobiology Reeearch Inštitúte (Annandale, NJ)	HIV infekcia
Faktor nekrózy	Genentech	ARC. v kombiné-
nádorov, TNF	(S, San Frarcisco,	cii swfgamma
	CA) Antiinfekčné látky	interferônom
Názov	výrobca	indikácia
Ciindamycfn s	Upjohn	PCP
Primaqufnom	(Kalamazoo, Ml)
Fluconazol	Pfizer	kryptokoková
	(NôwYcrk, NY)	meningitis, kandidáza
Nyslatinové	Squibb Corp.	prevencia orálnej
pastilky	(Princeton.NJ]	kardidázy
Omidyl	Merrell Dow	PCP
Eflomlthine	(Cindnnati, OH)
Pentamidln	LyphoMed	PCP
Izotionate (IM a IV)	(Rosemont, IL)
Trimethoprim		antibakteriálny
Trimethoprim sulfát		antibakteriálny
Pritrexim	Burroughs Wellcome (Rsch. Triangle Park, NC)	PCP
Pentamidinizotionát	Fisons Corporation	PCP
na inhaláciu	(Bedford, MA)
Spiramycín	Rhône-Poulenc	kryplosporidiálna
	Pharmaceuticals (Princeton, NJ)	hnačka
Intraconazol	(Jansen Pharm.	histoplazmóza,
R51211	(Piscataway, NJ)	kryptokoková meningitis
Trimetrexát	Warner-Lambert Iné látky	PCP
Názov	výrobca	indikácia
Rekombinantný	Ortho. Pharm. Corp.	ťažká anémia pri
ľudský erytropoetín	(Raritan, NJ) 1	iečbe AZT
Megestrolacetát	Bristol-Myers	liečenie anorexie
	(New York, NY)	spojené so syndrómom AIDS
Celková enterálna	Notwlch Eaton	hnačka a
výživa	Pharmaceuticals	maabsorpčný syn-
	Noiwich, NY)	dróm pri AIDS.

Rozsah kombinácií zlúčeniny podľa vynálezu s antivírusovými preparátmi proti AIDS, imunomodulačnými preparátmi, látkami na potlačenie infekcii alebo vakcínami sa neobmedzuje uvedeným zoznamom, ale zahrnuje základné kombinácie s akýmikoľvek farmaceutickými prípravkami na liečbu AIDS.

Zlúčeninou v tabuľke C označenou ako L-697, 661 alebo '661'je 3-([4,7-dichlór-l,3-benzoxazol-2-yl)-metyl]amino)-5-ctyl-6-metylpyridín-2(lH)-on a L-696,229 je 3-([2-1,3-benzooxazol-2-yl)etyl]-5-etyl-6-metylpyridin-2( 1H)-on. Syntézy zlúčenín L-697,661 a L-699,229 sú opísané v EPO 484071 a EPO 462800 s odkazom. Syntézy ddC, ddl a AZT sú tiež opísané v EP 0484071.

Vo výhodných kombináciách sa súčasne alebo striedavo podáva zlúčenina J a nenukleozidový inhibítor HIV reverznej transkriptázy. Eventuálnou treťou zložkou v kombinácii je nukleozid inhibujúci HIV reverznú transkriptázu, ako napríklad AZT, ddC alebo ddl. Vhodným nenukleozidovým inhibítorom HIV reverznej transkriptázy je zlúčenina L-697,661. Tieto kombinácie majú synergický účinok obmedzujúci šírenie HIV. Výhodnými kombináciami sú:

1, L-735,524 s L-697,661 a eventuálne AZT alebo ddl alebo ddC,

2. L-735,524 s AZT alebo ddl alebo ddC.

Skúška inhibície mikrobiálnej expresie HIV proteázy

Skúška inhibície expresie proteázy E. coli s 0,5 mg/ml (na začiatku reakcie) peptidového substrátu (Val-Ser-Gln-Asn-(betanaftyl)Ala-Pro-Ile-Val) sa vykoná počas 1 hodiny pri teplote 30 °C v 50 mM roztoku octanu sodného s pH 5,5. Do 25 μΐ roztoku peptidu vo vode sa pridajú rôzne koncentrácie inhibítora v 1,0 μΐ DMSO.

Reakcia sa začne pridaním 15 μΐ (0,11 ng) 0,33 nM roztoku proteázy v 0,133 M roztoku octanu sodného s hodnotou pH 5,5 a 0,1 % roztoku albumínu hovädzieho séra. Reakcia sa skončí pridaním 160 μΐ 5 % roztoku kyseliny fosforečnej. Produkty reakcie sa oddelia HPLC, stĺpec so širokými pórmi 5 cm, C = 18 reverzná fáza, gradient acetonitrilu, 0,1 % kyselina fosforečná (VYDAC). Veľkosť inhibície sa urči podľa výšky vrcholov produktov. HPLC produktov, nezávisle vzniknutých, udáva množstvo a konfirmáciu zloženia produktov. Výsledné zlúčeniny príkladov 1 až 7 vrátane vykazujú hodnoty IC v rozmedzí 1 až 100 nM. Zlúčeniny A, B a J majú hodnoty IC_5o v rozmedzí približne od 0,3 do 6 nM.

Inhibícia šírenia vírusov

Príprava suspenzie HIV infikovaných MT-4 buniek

MT bunky infikované v deň O vírusom kmeňa HIV-1, zásobnej kultúry Illb s koncentráciou 250 000/ml pri riedení 1 : 1000 (konečná koncentrácia 125 pg p24/ml; dostačujúci výťažok v deň 1 je < alebo = 1 % infikovaných buniek a 25 až 100 % v 4. dni). Bunky sa infikujú a rastú na pôde so zložením: RPMI 1640 (Whittaker BioProducts), 10 % roztok inaktivovaného fetálneho hovädzieho séra, 4 mM roztok glutamínu (Gibco Labs) a zmes Penicilínu a Streptomycínu v pomere 1 : 100 (Gibco Labs). Zmes sa inkubuie cez noc v atmosfére 5 % oxidu uhličitého a pri teplote 37 °C.

Pôsobenie inhibítorov

Pripraví sa matrica z kombinácie dvoch zlúčenín (pozri tabuľka S) v rozsahu nanomolámych koncentrácií. V deň 1 sa pridá do 96 jamôk mikrotitračnej platne s obsahom 50 000 HIV infikovaných MT-4 buniek v jednej jamke podiel 125 μΐ inhibítora. Inkubácia sa vykonáva 3 dni v atmosfére 5 % oxidu uhličitého a pri teplote 37 °C.

Meranie šírenia vírusu

S použitím viackanálovej pipety sa naočkované bunky znova uvedú do suspenzie a 125 μΐ sa odoberie a prenesie na oddelenú mikrotitračnú platňu. Vykoná sa skúška supernatantu na HIV p24 antigén.

Koncentrácia HIV p24 antigénu sa určí ďalej opísanou enzýmovou imunoskúškou. Merané podiely p24 antigénu sa pridajú do jamiek s obsahom monoklonálnej protilátky špecifickej proti HIV povrchovému antigénu (core antigén). Jamky sa premyjú, rovnako ako po nasledujúcich stupňoch postupu. Najprv sa pridá biotinylovaná špecifická protilátka proti HIV, potom konjugovaná strepavidin-chrenová peroxidáza a po pridaní peroxidu vodíka a tetrametylbenzidínového substrátu vznikne farebná reakcia, ktorej intenzita je priamo úmerná koncentrácii HIV p24 antigénu.

Výpočet stupňa synergie

Kombináciou dvoch inhibítorov (tabuľka 5) dôjde k výraznému zosilneniu inhibície množenia vírusu v porovnaní so samotným inhibítorom alebo so súčtom inhibícií oboch inhibítorov. Tak napríklad zlúčením zlúčeniny 524 a AZT sa inhibícia výrazne zosilní v porovnaní so samotnou zlúčeninou 524 alebo AZT alebo v porovnaní so súčtom ich inhibícií. Tento poznatok sa získal výpočtom veľkosti frakčnej inhibičnej koncentrácie (FIC) metódou Eliona a spol. uvedenú v J. Biol. Chem. 208,477 (1954). Najmenšia hodnota FICS, ktorá zodpovedá hodnote synergie, bola nameraná pre rôzne kombinácie dvoch zlúčenín (pozri tabuľka S). Tieto výsledky udávajú základnú synergiu v inhibícii šírenia vírusu. Čím menšie je číslo, tým väčšia je synergia.

Tabuľka S

Kombinácie dvoch zlúčenín maximálna synergia

524 + ddl 0,7

524 + AZT 0,7

524 + 661

524 je zlúčenina L-735,524 (zlúčenina J). Ostatné zlúčeniny sú opísané v uvedenej tabuľke C.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

N-(2(R)-hydroxy-1 (S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4(S)-hydroxy-5-(l-(4-(3pyridyI-metyl)-2(S)-N'-(t-butylkarboxamido)-piperazinyl))pentamid

Časť 1: Príprava dihydro-5(S)-((trifluórmetánsulfonyl)oxymetyl)-3(R)fenylmetyl-3(2H)-furanónu

Do roztoku 18,4 g (89,2 mmol) dihydro-5(S)-(hydroxymetyl)-3(R)-fenylmetyl-3(2H)-furanónu v 350 ml metylénchloridu ochladeného na teplotu 0 °C sa pridá

13.51 ml (115,98 mmol) 2,6-lutidínu a potom po kvapkách

16.51 ml (98,1 mmol) anhydridu kyseliny trifluórmetánsulfónovej. Po 1,5 hodine pri teplote 0 °C sa reakčná zmes vleje do 300 ml zmesi ľadu a nasýteného roztoku chloridu sodného a vzniknutá reakčná zmes sa 0,5 hodiny mieša. Vodný podiel sa trikrát extrahuje 150 ml metylénchloridu, organický podiel sa premyje dvakrát 75 ml 10 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej, 100 ml nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, 100 ml vody a po sušení nad síranom horečnatým, filtrácii a zahustení vznikne zvyšok ako tuhá látka. Vzniknutý zvyšok sa po absorpcii na 120 x

150 mm stĺpci silikagélu čistí rýchlou chromatografiou pri elúcii gradientom koncentrácií zmesi hexánov a etylacetátu v pomere 4 : 1 až 3 : 1 za vzniku výslednej zlúčeniny s teplotou topenia 53 až 54 °C.

Časť 2: Príprava 4-( 1,1-dimetyl)-1-fénylmetyl)-l,2(S),4-piperazíntrikarboxylátu

Syntéza zlúčeniny sa vykoná postupom uvedeným C. F. Biggom, S. J. Haysom, P. M. Novakom, J. T. Drummondom, G. Johnsonom s T. P. Bubovskim v Tetrahedron Lett. 1989, 30, 5193. Ako východisková zlúčenina sa použije kyselina 2(S)-piperazínkarboxylová. Pozri: E-Felder, S. Maffei, S. Pietra a D. Pitre: Hev. Chim. Acta 1960, 117, 888.

Časť 3: Príprava N-t-butyl-4-(l,l-dimetyletoxykarbonylamino)-1 -fenylmetyl-karbonylamino)piperazín-2(S)-karboxamidu

Do roztoku 9,90 g (27,16 mmol) 4-(1,1-dimetyl)-1-fenylmetyl)-l,2(S),4-piperazíntrikarboxylátu v 75 ml dimetylformamidu ochladeného na teplotu 0 °C sa pridá 5,73 g (29,88 mmol) EDC, 4,03 g (29,88 mmol) HOBT, 3,14 ml (29,88 mmol) t-butylamínu a4,16 ml (29,88 mmol) trietylamínu. Reakčná zmes sa 18 hodín mieša a následne sa reakčná zmes zahustí na polovicu objemu. Reakčná zmes sa zriedi 600 ml etylacetátu a premyje sa dvakrát 75 ml 10 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej, raz 75 ml nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, trikrát 75 ml vody a raz 50 ml nasýteného roztoku chloridu sodného a po sušení nad síranom horečnatým, filtrácii a zahustení vznikne zvyšok ako tuhá látka. Vzniknutý zvyšok sa rozotrie so zmesou etylacetátu a hexánu v pomere 1 : 2. Filtráciou vznikne biela tuhá látka výslednej zlúčeniny s teplotou topenia 134 až 135 °C.

Časť 4: Príprava N-t-buty 1-4-( 1,1-dimety letoxykarbonylamino)piperazín-2(S)-karboxamidu

Do zmesi 1,20 g (2,86 mmol) N-t-buty 1-4-(1,1-dimetyletoxykarbonylamino)-1 -fenylmetylkarbonylamino)-piperazín-2(S)-karboxamidu a 1,1 g (0,086 mmol) 10 % roztoku paládia na aktívnom uhlí sa pridá 15 ml metanolu. Do banky sa privádza vodík a reakčná zmes sa mieša 2 hodiny, filtruje sa cez celit a premyje sa etanolom. Rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu za vzniku peny výslednej zlúčeniny.

H-NMR (300 MHz, CDC1J δ 6,65 (br, 1H), 4,10 (m, 1H), 3,81 (br, 1H), 3,21 (dd, J = 18 a 7 Hz, 1H), 3,02 - 2,70 (m, 4H), 2,10 - 2,0 (br, 1H), 1,50 (s, 9H), 1,41 (s, 9H).

Časť 5: Príprava dihydro-5(S)-(4-(l,l-dimetyletoxykarbonylamino))-2(S)-N-(t-butylkarboxamido)piperazinyl)-metyl)-3(R)-fenylmetyl-3(2H)-furanónu

Do roztoku 22,40 g (0,0662 mol) dihydro-5(S)-((trifluórmetánsulfonyl)-oxymetyl)-3(R)-fenylmetyl-3(2H)-furanónu (časť 1) a 18,0 g (0,063 mol) N-(t-buty 1-4-( 1,1-dimetyletoxykarbonylamino)piperazín-2(S)-karboxamidu rozpusteného v 180 ml izopropanolu sa pridá 11,53 ml (0,0662 mol) N,N-di-izopropyletylamínu. Po 2,5 hodinách sa pridá ďalších 1,2 g dihydro-5(S)-((trifluórmetánsulfonyl)oxymetyl)-3(R)-fenylmetyl-3(2H)-furanónu a po 3,5 hodinách sa dokončenie reakcie dokáže chromatografiou na tenkej vrstve. Rozotrením s 200 ml zmesi etylacetátu a hexánov v pomere 1 : 2 vznikne biela tuhá látka, ktorá sa filtruje a odloží. Olej sa čistí po absorpcii na 120 x 150 mm stĺpci silikagélu rýchlou chromatografiou pri elúcii gradientom koncentrácií zmesi etylacetátu a hexánov v pomere l:l,2:l,3:laž čistý etylacetát za vzniku výslednej zlúčeniny.

H-NMR (400 MHz, CDCip δ 7,34 - 7,17 (m, 5H), 6,31 (br s, IH), 4,38 (br m, IH), 3,96 - 3,92 (m, IH), 3,79 (br m, IH), 3,16 (dd, J = 13,6 a 4,4 Hz, IH), 3,08 - 2,99 (m, 3H), 2,90 - 2,82 (m, IH), 2,80 (dd, J = 13,5 a 8,9 Hz), 2,78 (m, IH), 2,67 - 2,61 (m, IH), 2,58 - 2,49 (m, IH), 2,38 - 2,32 (m, IH), 2,32 - 2,04 (m, IH), 1,99 - 1,92 (m, IH), 1,45 (s, 9H), 1,29 (s, 9H).

Časť 6: Príprava 2(R)-fenylmetyl-4(S)-(t-butyldimetylsilyloxy)-5-( 1 -(4-( 1,1 -dimetyletoxykarbonylamino)))-2(S)-N-(t-butylkarboxamido)piperazinyl))pentanamidu

Do roztoku 25,50 g (52,50 mmol) dihydro-5(S)-(4-(l,l-dimetyletoxykarbonylamino))-2(S)-N-(t-butylkarboxamido)piperazinyl)metyl)-3(R)-fenylmetyl-3(2H)-furanónu rozpusteného v 120 ml DME ochladeného na teplotu 0 °C sa pridá roztok 60 ml vody a 1,512 g (63,01 mmol) hydroxidu lítneho. Po 0,5 hodine sa reakcia zastaví pridaním 10 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej na dosiahnutie pH 6 a roztok sa zahustí vo vákuu. Zvyšok sa rozpustí v 50 ml vody a extrahuje sa štyrikrát 75 ml etylacetátu a organický podiel sa premyje raz 20 ml vody a raz 20 ml nasýteného roztoku chloridu sodného. Vodný podiel sa spätne extrahuje dvakrát 75 ml etylacetátu a zlúčené organické podiely sa sušia nad síranom horečnatým a zahustia sa za vzniku žltej tuhej látky. Tento surový produkt sa rozpustí v 100 ml dimetylformamidu a po pridaní 17,87 g (0,262 mol) imidazolu a ochladení na teplotu 0 °C sa pridá 31,50 g (0,21 mol) t-butyldimetylsilylchloridu. Táto reakčná zmes sa 1 hodinu mieša pri teplote 0 °C a následne sa zohreje na teplotu miestnosti. Po 20 hodinách sa reakcia ukončí pridaním 10 ml metanolu a zahustí sa na polovicu objemu. Po pridaní 100 ml vody s obsahom pufru s pH 7 a vodný podiel sa extrahuje štyrikrát 100 ml etylacetátu a zlúčené organické podiely sa premyjú dvakrát 50 ml 10 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej, trikrát 75 ml vody a raz 50 ml nasýteného roztoku chloridu sodného. Po sušení nad síranom horečnatým a zahustení vznikne výsledná zlúčenina, ktorá sa bez ďalšieho čistenia použije v ďalšom postupe syntézy.

Časť 7: Príprava N-(2(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4(S)-(t-butyl-dimetylsilyloxy)-5-(l -(4-( 1,1 -dimetyletoxykarbonylamino)))-2(S)-N-(t-butylkarboxamido)piperazinyl))pentamidu

Do 27,0 g (0,0446 mol) surovej výslednej zlúčeniny z predchádzajúcej časti 6 rozpustenej v 180 ml dimetylformamidu a ochladenej na teplotu 0 °C sa pridá 8,98 g (0,0468 mmol) EDC, 6,32 g (0,0468 mmol) HOBT a 7,31 g (0,049 mol) aminohydroxyindánu. Po pridaní 6,52 ml (0,0468 mol) trietylamínu sa reakčná zmes mieša 2 hodiny pri teplote 0 °C a 16 hodín pri teplote miestnosti. Reakcia sa zastaví pridaním 500 ml etylacetátu. Organický podiel sa premyje dvakrát 100 ml 10 % roztokom kyseliny chlorovodíkovej, raz 100 ml nasýteného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, trikrát 150 ml vody a raz 75 ml nasýteného roztoku chloridu sodného. Po sušení nad síranom horečnatým a zahustení vznikne biela pena výslednej zlúčeniny.

'H-NMR (400 MHz, CDClp δ 7,4 - 7,17 (m, 9H), 6,51 (br s, IH), 5,79 (br s, IH), 5,23 (m, IH), 4,23 (br s, 1H), 4,06 (m, IH), 3,96 - 3,84 (m, 2H), 3,07 - 2,78 (m, 8H), 3,65 (dd, J = 9,6 a 4,1 Hz, IH), 2,56 - 2,44 (m, 2H), 2,29 (dd, J = 12,0 a 4,5 Hz, IH), 2,17 - 2,09 (m, IH), 1,79 (br s, IH), 1,44 (s, 9H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (s, IH), 0,84 (s, 9H), 0,12 (s, 3H), 0,08 (s, 3H).

Časť 8: Príprava N-(2(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4(S)-(hydroxy)-5-( 1 -(4-( 1,1 -dimetyletoxykar bonylamino)))-2(S)-N-(t-butylkarboxamido)-piperazinyl))pentamidu

Do 32,20 g (0,0437 mmol) N-(2(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4(S)-(t-butyldimetylsilyloxy)-5-( 1 -(4-( 1,1 -dimetyletoxykarbonyl-amino)))-2(S)-N-(t-butylkarboxamido)-piperazinyl))pentamidu sa pridá 437 ml (0,437 mol) 1,0 M roztoku tetrabutylamóniumfluoridu v tetrahydrofuráne (Aldrich) a vzniknutá reakčná zmes sa 18 hodín mieša a následne zahustí na objem 200 ml. Po zriedení 700 ml etylacetátu sa roztok premyje dvakrát 100 ml vody, raz 50 ml nasýteného roztoku chloridu sodného a vodný podiel sa opäť dvakrát extrahuje 200 ml etylacetátu. Zlúčené organické podiely sa sušia nad síranom horečnatým a zahustia sa za vzniku oleja. Vzniknutý zvyšok sa po absorpcii na 120 x 150 mm stĺpci silikagélu čisti rýchlou chromatografiou pri elúcii zmesou metylénchloridu, chloroformu nasýteného amoniakom a metanolu, s rastúcou koncentráciou metanolu 1 %, 1,5 % a 2 %, za vzniku bielej peny výslednej zlúčeniny.

H-NMR (400 MHz, CDCip δ 7,31 - 7,11 (m, 9H), 6,41 (br s, IH), 6,23 (d, J = 8,6 Hz, IH), 5,25 (dd, J = 8,6 a 4,7 Hz, IH), 4,21 (m, IH), 3,83 - 3,82 (m, 2H), 3,78 - 3,61 (m, 2H), 3,22 - 3,19 (m, 2H), 3,03 - 2,78 (m, 8H), 2,62 -

- 2,58 (m, IH), 2,41 - 2,35 (m, 2H), 2,04 - 2,02 (m, IH), 1,57 - 1,50 (m, IH), 1,45 (s, 9H), 1,32 (s, 9H).

Časť 9: Príprava N-(2(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4(S)-(hydroxy)-5-( 1 -(2(S)-N-(t-butylkarboxamido)piperazinyl))pentamidu

Do roztoku 21,15 g (0,034 mol) N-(2(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4(S)-(hydroxy)-5-(l -(4-(1,1-dimetyletoxykarbonylamino)))-2(S)-N-(t-butylkarboxamido)-piperazinyl))pentamidu v 350 ml metylénchloridu ochladeného na teplotu 0 °C sa pridá 22,43 ml (0,204 mol) 2,6-lutidínu a následne počas 5 minút 32,85 ml (0,170 mol) trimetylsilyltrifluóracetátu. Po 0,5 hodine sa reakcia zastaví pridaním 80 ml 10 % roztoku kyseliny chlorovodíkovej a potom sa 0,5 hodiny reakčná zmes mieša. Po pridaní 100 ml nasýteného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného sa pridá tuhý hydrogenuhličitan sodný do dosiahnutia pH 8 reakčnej zmesi. Vodný podiel sa extrahuje štyrikrát 100 ml etylacetátu, zlúčené organické extrakty sa premyjú raz 50 ml vody, raz 75 ml nasýteného roztoku chloridu sodného, sušia sa nad síranom horečnatým a zahustia sa. Vzniknutý zvyšok sa po absorpcii na stĺpci 120 x 150 mm silikagélu čistí rýchlou chromatografiou pri elúcii zmesou metylénchloridu, chloroformu nasýteného amoniakom a metanolu s rastúcim gradientom koncentrácií metanolu 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 % až 10 %. Vznikne biela pena výslednej zlúčeniny.

H-NMR (400 MHz, CDC1) δ 7,53 (s, IH), 7,29 - 7,09 (m, 9H), 6,52 (d, J = 8,3 Hz, IH), 5,24 (dd, J = 8,2 a 4,9 Hz, IH), 4,23 (dd, J = 4,7 a 4,03 Hz, IH), 4,25 - 4,00 (br s, IH), 3,83 - 3,81 (m, IH), 3,03 - 2,88 (m, 4H), 2,82 -

- 2,73 (m, 7H), 2,50 - 1,60 (br s, 2H), 2,45 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 2,32 - 2,29 (m, IH), 1,98 (m, IH), 1,51 (m, IH), 1,33 (s, 9H).

Časť 10: Príprava N-(2(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4(S)-hydroxy-5-( 1 -(4-(3-pyridylmetyl)-2(S)-N'-(t-butylkarboxamido)piperazinyl))pentamidu

Do 10,0 g (0,019 mol) N-(2(R)-hydroxy-l(S)-indanyl)-2(R)-fenylmetyl-4(S)-(hydroxy)-5-(l-(2(S)-N-(t-butylkarboxamido)piperazinyl))pentamidu a 3,45 g (0,021 mol) 3-pikolylchloridu rozpusteného v 40 ml dimetylformamidu sa pridá 5,85 ml (0,042 mol) trietylamínu. Po 3 hodinách sa pridá ďalších 0,313 g 3-pikolylchloridu. Po ďalších 2 hodi7 nách sa reakčná zmes zriedi 400 ml etylacetátu a premyje sa trikrát 75 ml vody, raz 100 ml nasýteného roztoku chloridu sodného, suší sa nad síranom horečnatým a zahustí sa. Vzniknutý zvyšok sa rozotrie s 30 ml etylacetátu a po oddelení bielej zrazeniny sa kryštalizáciou z etylacetátu vznikne výsledná zlúčenina s teplotou topenia 167,5 až 168 °C.

Uvedený príklad ukazuje základný princíp vynálezu a má ilustratívnu úlohu. Všetky variácie a modifikácie prípravy vynálezu patria do rozsahu vynálezu.

Claims (4)

1. Kompozícia zlúčeniny J vzorca alebo farmaceutický prijateľnej soli tejto látky, s azidotymidínom AZT alebo 2',3'-di-deoxyinozínom ddl alebo 2',3-di-deoxycitidinom ddC.

2. Farmaceutický prostriedok na liečenie a prevenciu infekcie HIV, syndrómu AIDS a príbuzných ochorení, vyznačujúci sa tým, že ako svoju účinnú zložku obsahuje kompozíciu zlúčenín podľa nároku 1.

3. Kompozícia podľa nároku 1, na použitie pri liečbe AIDS, na prevenciu infekcie HIV, na liečbu infekcie IIIV alebo na inhibíciu HlV-proteázy.

4. Použitie kompozície podľa nároku 1 na výrobu farmaceutického prostriedku na liečbu AIDS, na liečbu infekcie HIV, na prevenciu infekcie HIV alebo na inhibíciu HlV-proteázy.