CZ285104B6 - Deriváty kyseliny žlučové, způsob jejich přípravy a použití těchto sloučenin jako léčiv - Google Patents

Abstract

Vynález se týká derivátů kyseliny žlučové obecného vzorce Z(X-GS).sub.n .n., ve kterém GS znamená zbytek kyseliny žlučové nebo modifikovaný zbytek kyseliny žlučové, X znamená můstkovou skupinu nebo kovalentní vazbu, přičemž GS je přes X vázán libovolně, Z znamená centrální můstkovou skupinu a n znamená 3 nebo 4, a způsobu přípravy těchto sloučenin. Tyto sloučeniny jsou farmakologicky účinné a mohou být proto použity jako léčiva, zejména jako hypolipidemika.ŕ

Description

Deriváty kyseliny žlučové, léčivo tyto deriváty obsahující a tyto deriváty pro použití jako léčivo

Oblast techniky

Vynález se týká derivátů kyseliny žlučové, léčiv, které tyto deriváty obsahují jako účinnou látku, a těchto derivátů pro použití jako léčiv.

Dosavadní stav techniky

Kyseliny žlučové jsou syntetizovány v játrech v několika enzymatických stupních. Takto syntetizované kyseliny žlučové se potom shromažďují ve žlučníku, odkud jsou vylučovány do tenkého střeva. Zde tyto kyseliny plní v průběhu trávicího procesu důležité fyziologické funkce, přičemž zde například vystupují jako kofaktory nebo pankreatické lipázy a jako přirozené detergenty při resorpci tuků a vitamínů rozpustných v tucích. Aktivními a pasivními transportními procesy dospěje největší část žlučových kyselin z tenkého střeva vrátnicí zpět do jater.

Polymery vázající žlučové kyseliny jsou jíž dlouhou dobu používány jako léčiva. Tyto polymery se používají při léčení nemocí, u kterých je žádoucí inhibice zpětné resorpce kyseliny žlučové. Tak může být při zvýšené hladině cholesterolu v krvi v důsledku redukce žlučových kyselin nacházejících se v enterohepatitickém krevním oběhu indukována v játrech zvýšená produkce žlučových kyselin z cholesterolu. To vede ke zvýšené spotřebě LDL-cholesterolu v krvi v játrech a k urychlení LDL-katabolismu. Docílený účinek spočívá ve snížení aterogenního cholesterolu v krvi.

Polymery, které se k tomuto účelu používají jako léčiva, například Cholestyramin nebo Colestipol, však musí být prodávány ve velkých denních dávkách, pohybujících se od 12 do 30 g. Přijatelnost těchto polymerů pro pacienta a lékaře kromě uvedeného vysokého dávkování zhoršují také chuť a nepříjemná vůně těchto polymerů.

Uvedené polymeiy mají vzhledem k jejich velmi malé selektivitě vedlejší účinky. Ve vysoké míře se slučují i s vitaminy a současně podávanými léčivy a navíc mění kvalitativní složení žlučových kyselin ve žluči. Tyto vlastnosti se potom projevují v různých gastrointestinálních poruchách (například zácpa, stearorrhoea), avitaminóza a zvýšeném riziku tvorby žlučových kamenů (choletitiáza).

Nyní byly s překvapením nalezeny deriváty kyseliny žlučové, které nemají výše uvedené nedostatky.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou deriváty kyseliny žlučové obecného vzorce Ia a Ib

- 1 CZ 285104 B6

-2CZ 285104 B6 ve kterých

E znamená jednoduchou vazbu, atom kyslíku nebo skupinu NH,

Y znamená skupinu -OL, skupinu -NHL, skupinu -NL₂, aminokyselinu zvolenou z množiny, zahrnující alanin, glycin, prolin, cystein, hystidin, glutamin, kyselinu asparagovou, isoleucin, arginin, kyselinu glutamovou, lysin, serin, fenylalanin, leucin, threonin, tryptofan, methionin, valin, tyrosin, asparagin, nebo aminosulfonovou kyselinu zvolenou z množiny zahrnující

-NHCH₂-CO₂H, -NH-CH₂CH₂-SO₃H, -N-CH₂CH₂-SO₃H, -N-CH₂-CO₂H, ch₃ ch₃

-nh-chco₂h

R⁶ a jejich alkylesteiy, ve kterých alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a soli alkalických kovů a kovů alkalických zemin, -Oka, kde Ka znamená kation, jako například kation alkalického kovu nebo kovu alkalických zemin, nebo také kvartémí amoniový ion, přičemž

L znamená atom vodíku, alkylový nebo alkylenový zbytek obsahující nejvýše 10 uhlíkových atomů, který je přímý nebo rozvětvený, cykloalkylový zbytek obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů, fenylový zbytek, který je nesubstituován nebo jednou až třikrát substituován atomem fluoru, atomem bromu, alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo alkoxyskupinou obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, benzylový zbytek, který je nesubstituován nebo jednou až třikrát substituován atomem fluoru, atomem chloru, atomem bromu, alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo alkoxy-skupinou obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, a

R⁶ znamená methylovou skupinu, isopropylenovou skupinu, isobutylovou skupinu, 2butylovou skupinu, benzylovou skupinu, 4-hydroxybenzylovou skupinu, hydroxymethylovou skupinu, 1-hydroxyethylovou skupinu, skupinu H₃CSCH₂CH₂-, skupinu HO₂CCH₂skupinu HOCCH₂CH₂- nebo

Y znamená skupinu obecného vzorce II

R² až R⁵ nezávisle jeden na druhém znamenají

O OO

II IIII

Η, OT, -ST, -NHT, O-C-T, S-C-T, -NH-C-T,

O O OO

-O-P-OT, -O-S-OT, -S-OT, -P-OT, -T

I II IIII

OT 0 00 přičemž

T znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující nejvýše 10 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů, fenylovou skupinu nebo tetrahydropyranylovou skupinu, nebo

R² a R³, popřípadě R⁴ a R' vždy společně znamenají atom kyslíku karbonylové skupiny,

X znamená jednoduchou vazbu nebo skupinu obecného vzorce III

-[-(N)_s-A-N-C-(CH₂)_q-C-]_r-N-(B)_t(III),

L²

L³ ve kterém

A znamená alkylový řetězec obsahující 2 až 12, výhodně 2 až 6, uhlíkových atomů, přičemž tento řetězec je rozvětvený nebo nerozvětvený a může být případně přerušen skupinou -O-, skupinou -S- nebo fenylovou skupinou, kde připojení fenylové skupiny může být provedeno v následujících polohách

B znamená alkylový řetězec obsahující 2 až 18, výhodně 2 až 12 uhlíkových atomů, přičemž tento řetězec je rozvětvený nebo nerozvětvený a může být případně přerušen skupinou -O-, skupinou -S- nebo fenylovou skupinou, kde připojení fenylové skupiny může být provedeno v následujících polohách

-4CZ 285104 B6

L¹, L² a L³, které jsou stejné nebo odlišné, mají význam L, přičemž zejména znamenají atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo benzylovou skupinu, q znamená 0 až 5, r znamená 0 nebo1, s znamená 0 nebo1 a t znamená 0 nebo1, a

Z znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující nejvýše 20 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů nebo fenylovou skupinu, přičemž uvedené skupiny obsahují 3 nebo 4 zbytky -C(=O)-NH-, přes které jsou uvedené skupiny vázány k X, přičemž konec -C(=O)- těchto zbytků je vázán k uvedeným skupinám a konec -NH- těchto zbytků je vázán k X, a uvedené skupiny mohou být substituovány například amino-skupinou, nitro-skupinou nebo alkylovou skupinou obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy, výhodně methylovou nebo fenylovou skupinou.

Předmětem vynálezu je také léčivo, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje derivát kyseliny žlučové obecného vzorce la nebo Ib.

Předmětem vynálezu je také derivát kyseliny žlučové obecného vzorce la nebo Ib pro použití jako léčivo pro léčení hyperlipidemie.

Deriváty kyseliny žlučové obecného vzorce la nebo Ib mohou být připraveny tak, že uvede v reakci aktivovaný derivát karboxylové kyseliny s příslušným aminem za vzniku amidové vazby. Použité oligokarboxylové kyseliny jsou buď známé z odborné literatury, nebo se připraví adicí hydroxy-sloučenin na akrylonitril a následným zmýdelněním nitrilové funkce.

Oligokarboxylové kyseliny, vhodné jako centrální stavební kámen, se aktivují například převedením na anhydrid nebo chlorid kyseliny. Další příkladné možnosti spočívají v aktivizaci za použití směsi dicyklohexylkarbodiimidu a hydroxybenzotriazolu (DCC/HOBT), 2-ethoxy-lethoxykarbonyl-l,2-dihydroisochinolinu (EEDQ) nebo O-/(kyanethoxykarbonylmethylen)amino/-N,N,N’,N’-tetramethyluroniumtetrafluorborátu (TOTU).

Reakce s částečně chráněným derivátem kyseliny aminožlučové se v závislosti na reaktivitě reakčních složek provádí v teplotním rozmezí od -15 do 75 °C v inertním rozpouštědle, jakým je tetrahydrofuran, dichlormethan, dimethylformamid nebo ethylacetát.

Získané estery obecného vzorce I se potom obvyklým postupem bazicky (v případě benzylesterů hydrogenolyticky) zmýdelní a získané produkty mohou být potom převedeny na soli alkalických kovů.

Za účelem přípravy sloučenin s různými zbytky na centrální můstkové skupině může být uvedená reakční sekvence „aktivace“ a „kondenzace“ provedena několikrát s různými deriváty kyseliny aminožlučové, například tak, že se provede a) tvorba anhydridu nebo chloridu kyseliny, b) první kondenzace, c) aktivace zbylých volných karboxylových skupin za použití DCC/HOBT a d) druhá kondenzace.

Sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I mají vysokou afinitu ke specifickému transportnímu systému žlučových kyselin v tenkém střevu a koncentračně-závisle a kompetitivně inhibují zpětnou resorpci žlučových kyselin.

Sloučeniny obecného vzorce I nejsou samy o sobě resorbovány a nepřicházejí tudíž do krevního oběhu. Reversibilní inhibicí může být do enterohepatického krevního oběhu zasaženo podstatně

-5 CZ 285104 B6 selektivněji. Nedochází kavitaminóze ani ke kvalitativní změně složení žlučových kyselin ve žluči. Pomocí sloučenin podle vynálezu může být dosaženo cíleného snížení hladiny cholesterolu v krevním séru, aniž by přitom docházelo ke známým vedlejším účinkům. Sloučeniny podle vynálezu mohou být dále použity k léčení jater trpících cholostází, poněvadž se tak dosáhne omezení recirkulace žlučových kyselin, způsobené přerušením enterohepatického krevního oběhu, přičemž tato recirkulace, ke které při cholostázi dochází, je zodpovědná za hepatocelulámí poškození a nekrózu jater.

Vzhledem k vysoké afinitě sloučenin podle vynálezu k transportnímu systému žlučových kyselin je možné tyto sloučeniny podávat v mnohem menších denních dávkách, než jaké se používají v případě podání komerčně dostupných polymerů. To má za následek, že sloučeniny podle vynálezu jsou jak pro pacienta, tak i pro lékaře mnohem více akceptovatelné.

Uvedené sloučeniny podle vynálezu mají tedy cenné farmakologické vlastnosti a mohou být proto použity zejména jako hypolipidemika.

Vynález se proto také týká léčiva na bázi sloučenin obecného vzorce I, jakož i těchto sloučenin pro použití jako léčiv, zejména ke snížení hladiny cholesterolu.

Ověření biologických účinků sloučenin podle vynálezu se provádí stanovením inhibice absorpce /³H/-taurocholátu v buněčné membráně s kartáčkovým lemem králičího kyčelníku. Inhibiční test se provádí následujícím způsobem:

1. Příprava buněčné membrány s kartáčkovým lemem z králičího kyčelníku.

Příprava buněčné membrány s kartáčkovým lemem z buněk tenkého střeva se provádí tzv. Mg²⁺precipitační metodou. Králičí samečkové (Neuseeland, tělesná hmotnost 2 až 2,5 kg) se usmrtí intravenózní injekcí 0,5 ml vodného roztoku 2,5 mg Tetracain-HCl, 100 T 61^R a 25 mg Mebezoniumjodidu. Vyjme se tenké střevo, načež se promyje ledově chladným fyziologickým roztokem. K přípravě buněčné membrány s kartáčkovým lemem se použije koncových sedm desetin tenkého střeva (měřeno v orálně-rektálním směru, tzn. koncový kyčelník, který obsahuje Na⁺-závislý transportní systém žlučových kyselin). Vyjmutá střeva se v sáčcích z umělé hmoty zmrazí pod atmosférou dusíku na teplotu -80 °C. Za účelem přípravy membránových vesikul se zmražená střeva nechají roztát ve vodní lázni o teplotě 30 °C. Seškrábe se sliznice a takto oddělená sliznice se suspenduje v 60 ml ledově chladného 12 mM Tris-HCl-pufru (pH 7,1), obsahujícího 300 mM manitu, 5 mM EGTA, 10 mgPl fenylmethylsulfonylfluoridu, 1 mg/1 trypsinového inhibitoru ze sójových bobů (32 U/mg), 0,5 mg/1 trypsinového inhibitoru z hovězích plic (193 U/mg) a 5 mg/1 Bacitracinu. Po zředění ledově chladnou destilovanou vodou na objem 300 ml se směs homogenizuje za chlazení ledem v zařízení Ultraturrax (18-Stab, IKA Werk Stuafen, SRN) po dobu 3 minut při 75 % z maximálního výkonu zařízení. Po přidání 3 ml 1M roztoku chloridu hořečnatého (finální koncentrace 10 mM) se homogenizovaná směs ponechá stát při teplotě 0 °C přesně po dobu jedné minuty. Přídavek iontů Mg²⁺ má za následek agregaci a precipitaci buněčných membrán, s výjimkou buněčných membrán s kartáčkovým lemem. Po 15 minutovém odstřeďování při 3000 x g (5000 otáček za minutu, rotor SS-34) se usazená peleta zavede do odpadu a supematant, který obsahuje buněčné membrány s kartáčkovým lemem, se odstřeďuje po dobu 30 minut při 267 000 x g (15 000 otáček za minutu, rotor SS-34). Supematant se odstraní a usazená peleta se opětovně homogenizuje v Potter Elvejhernově homogenizátoru (Braun, Melsungen, 900 otáček za minutu, 10 zdvihů) v 60 ml 12 mM Tris-HCl-pufru (pH 7,1) obsahujícího 60 mM manitu a 5 mM EGTA. Po přidání 0,1 ml 1M roztoku chloridu hořečnatého a 15 minutové inkubační době při teplotě 0 °C se směs znovu odstřeďuje při 3000 x g. Supematant se potom ještě odstřeďuje po dobu 30 minut při 46 000 x g (15 000 otáček za minutu, rotor SS-34). Usazená peleta se vyjme 30 ml 10 mM Tris/Hepes-pufru (pH 7,4) obsahujícího 300 mM manitu a resuspenduje 20 zdvihy v Potter Elvejhemově homogenizátoru při 1000 otáčkách za minutu. Po 30 minutovém odstře

-6CZ 285104 B6 ďování při 48 000 x g (20 000 otáček za minutu, rotor SS-34) se usazená peleta vyjme 0,5 až 2 ml Tris/Hepes-pufru (pH 7,4) obsahujícího 280 mM manitu (finální koncentrace 20 mg/ml) a resuspenduje pomocí tuberkulínové stříkačky s jehlou kalibru 27. Získané vesikuly membrán s kartáčkovým lemem se buď bezprostředně po jejich získání použijí k inhibičnímu testu, anebo se přechovávají při teplotě -196 °C pod kapalným dusíkem ve 4 mg porcích.

2. Inhibice na Na⁺-závislé absorpce /³H/-taurocholátu ve vesikulách membrány s kartáčkovým lemem kyčelníku

Absorpce substrátů ve výše popsaných vesikulách membrán s kartáčkovým lemem se stanoví tzv. membránofiltrační technikou. 10 μΐ vesikulámí suspenze (100 pg proteinu) se odpipetuje ve formě kapky na stěnu polystyrénové inkubační trubičky (11 x 70 mm), která obsahuje inkubační prostředí (90 μΐ) s odpovídajícími ligandy. Toto inkubační prostředí obsahuje 0,75 μΐ (= 0,75 pCi /³H(G)/-taurocholátu (specifická aktivita 2,1 Ci/mMol), 0,5 μΐ 10 mM taurocholátu, 8,75 μΐ Natrium-transport-pufru (10 mM Tris/Hepes (pH 7,4), 100 mM manitu, 100 mM NaCl) (Na-T-P), popřípadě 8,75 μ! Kalium-transport-pufru (10 mM Tris/Hepes (pH 7,4), 100 mM manitu, 100 mM KC1) (K-T-P) a 80 μ příslušného inhibičního roztoku, ve kterém je inhibitor rozpuštěn podle charakteru experimentu vNa-T-pufru, popřípadě K-T-pufru. Toto inkubační prostředí se zfiltruje přes polyvinylidefluoridový membránový filtr (SYHV LO 4NS, 0,45 pm, 4 mm 0, Millipore, Eschbom SRN). Smíšením vesikul s inkubačním prostředím je zahájeno měření transportu. Koncentrace taurocholátu na počátku inkubace činí 50 μΜ. Po uplynutí požadované inkubační doby (obvykle 1 minuta) se transport zastaví přidáním 1 ml ledově chladného přerušovacího roztoku (10 mM Tris/Hepes (pH 7,4), 150 mM KC1). Vzniklá směs se rychle odsaje za vakua 2,5 až 3,5 kPa přes membránový filtr z nitrátu celulózy (ME 25, 0,45 pm, 25 mm průměr, Schleicher U. Schuell, Dassell, SRN). Filtr se potom promyje 5 ml ledově chladného přerušovacího roztoku.

Za účelem změření absorpce radioaktivně značeného taurocholátu se membránový filtr rozpustí ve 4 ml scintilátoru Quickszint 361 (Zinsser Analytik GmbH, Frankfurt, SRN) a radioaktivita se změří kapalinově-scintilační měření v měřícím přístroji TriCarb 2500 (Canberra Packard GmbH, Frankfurt, SRN). Naměřené hodnoty se po kalibraci přístroje pomocí standardních vzorků a po korekci na případnou chemiluminiscenci získají jako rpm (rozpady za minutu).

Kontrolní hodnoty se stanoví jak v Na-T-P, tak i v K-T-P. Rozdíl mezi absorpcí v Na-T-P a K-T-P odpovídá Na⁺-závislému podílu transportu. Jako hodnota IC₅₀Na' se označuje taková koncentrace inhibitoru, která má za následek snížení Na⁺-závislého transportního podílu o 50 %, vztaženo na kontrolní hodnoty.

V následující tabulce jsou uvedeny naměřené hodnoty inhibice absorpce /³H/-taurocholátu ve vesikulách membrán s kartáčkovým lemem králičího kyčelníku. V tabulce jsou uvedeny podíly hodnota IC₅o, popřípadě IC₅o_Na, získané pro taurochenodesoxycholát (TCDC), který zde byl použit jako standardní inhibitor, a pro jednotlivé testované sloučeniny podle vynálezu.

-7CZ 285104 B6

Sloučenina z příkladu	IC50 (TCDC)	ICsoNa (TCDC)
IC5o (sloučenina)	ICíONa (sloučenina)
7	0,29	0,34
10	0,24	0,26
11	0,29	0,36
16	0,37	0,31
18	0,85	0,76
20	0,43	0,86
21	0,29	0,59
31	1,26	0,93
33	0,77	1,04
45	0,32	0,23
47	0,24	0,23

Vynález se dále týká použití sloučenin podle vynálezu pro výrobu léčiva. Za tímto účelem se sloučeniny obecného vzorce I rozpustí nebo suspendují ve farmakologicky přijatelných rozpouštědlech, jakými jsou jedno- nebo vícesytné alkoholy, jako například ethanol nebo glycerol, vtriacetinu, olejích, jakými jsou například slunečnicový olej, rybí tuk, etherech, například v diethylenglykoldimethyletheru, nebo také v polyetherech, například v polyethylenglykolu, nebo také v přítomnosti dalších farmakologicky přijatelných polymemích nosičů, například polyvinylpyrrolidonu, nebo dalších farmaceuticky přijatelných přísad, jakými jsou škroby, cyklodextrin nebo polysacharidy. Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podávány v kombinaci s jinými léčivy.

Sloučeniny obecného vzorce I se podávají v různých dávkovačích formách, výhodně perorálně ve formě tablet, kapslí nebo kapalin. Denní dávka se v závislosti na tělesné hmotnosti a konstituci pacienta pohybuje v rozmezí od 3 mg do 5000 mg, výhodně však v rozmezí od 10 do 1000 mg.

Příklady provedení vynálezu

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn na konkrétních příkladech jeho provedení, které však mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků.

Příklad 1

H₃C-C(-CH₂-O-(CH2)3-OH)3 H₃C-C(-CH₂-O-(CH₂)2-CN)3

K suspenzi 8,0 g (27,2 mmolů) l,l,l-tris-(3-hydroxypropoxymethyl)ethanu ve 40 ml dioxinu a 0,4 g 40% vodného roztoku hydroxidu draselného se při okolní teplotě pomalu po kapkách přidá 14,5 ml (220 mmolů) akrylonitrilu. Po jedné hodině při teplotě 40 °C se přidá ještě 1,0 g 40% vodného roztoku KOH a směs se míchá po dobu 2 hodin při teplotě 70 °C. Po ukončení reakce se přidá 5 ml 2M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, nerozpuštěný podíl se odfiltruje a filtrát se zahustí. Zbytek se rozpustí v methylenchloridu, vysuší nad síranem hořečnatým a znovu zahustí. Zbytek se chromatografuje na silikagelu, přičemž se jako eluční soustava použije směs cyklohexanu a ethylacetátu v objemovém poměru 1:2. Zodpovídající frakce eluátu se potom získá požadovaná sloučenina.

-8CZ 285104 B6

Výtěžek: 7,4 g (60 %, 16,3 mmolu),

C₂₃H₃₉N₃O₆ (453), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl):460(M+Li⁺).

H₃C-C-(-CH₂-O-(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-CN)₃ H₃C-C(-CH₂-O-(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-COOCH₃)₃

5,2 g (11,5 mmolu) sloučeniny z příkladu 1 se rozpustí v 60 ml methanolového roztoku chlorovodíku a získaný roztok se potom zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem po dobu 3 hodin. Vyloučená sraženina se odfiltruje a filtrát se zahustí. Získaný zbytek se potom zahřívá v 50 ml toluenu na teplotu varu pod zpětným chladičem s odlučovačem vody po dobu 3 hodin. Reakční směs se potom zahustí za vakua, přičemž se získá požadovaná sloučenina.

Výtěžek: 4,0 g (63 %, 7,2 mmolu),

C₂6H₄₈0i₂ (552), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3.NBA/L1C1): 559 (M+Li⁺).

Příklad 3

H₃C-C(-CH₂-0-(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-C00CH₃)₃ H₃C-C(-CH₂-O-(CH₂)₃-O-(CH₂)₂-C00H)₃

4,0 g (7,2 mmolu) sloučeniny z příkladu 2 se zmýdelní ve 40 ml 2M vodného roztoku NaOH při okolní teplotě. Reakční směs se okyselí 2M kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje kyselinou octovou. Po vysušení a zahuštění organické fáze se získaný zbytek chromatografuje na krátkém sloupci silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí chloroformu a methanolu v objemovém poměru 4:1. Z odpovídající frakce eluátu se potom získá požadovaný produkt.

Výtěžek: 3,0 g (5,9 mmolu, 82 %),

C₂₃H₄₂O,₂ (510), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 517 (M+Li⁺).

Příklad 4

C-(CH₂-OH)₄ C(-CH₂-O-(CH₂)₂-CN)4

218 g (1,56 molu) pentaerythritu a 5,3 g (0,13 molu) hydroxidu sodného se rozpustí ve 250 ml vody. K získanému roztoku se pomalu po kapkách přidá 525 ml (8 molu) akrylonitrilu. Reakční směs se potom míchá při teplotě 50 °C po dobu 12 hodin. Směs se potom neutralizuje kyselinou chlorovodíkovou a chromatografuje na silikagelu za použití elučního činidla tvořeného ethylacetátem.

Výtěžek: 345 g (0,99 molu, 63 %).

C_I7H₂₄N₄O₄ (348), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 355 (M+Li⁺).

Příklad 5

C(-CH₂-O-(CH₂)2-CN)4 -+ C(-CH₂-O-(CH2)₂-COOH)4

100 g (287 mmolu) sloučeniny z příkladu 4 se zahřívá v 500 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové po dobu jedné hodiny na teplotu varu pod zpětným chladičem. Po chlazení se

-9CZ 285104 B6 reakční směs nasytí chloridem sodným a extrahuje ethylacetátem. Po vysušení a zahuštění organické fáze se získaný zbytek chromatografuje na silikagelu za použití elučního činidla tvořeného ethylacetátem.

Výtěžek: 83,5 g (197 mmolu, 69 %),

C₁₇H₂₈O₁₂ (424), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 431 (M+Li⁺).

Příklad 6

Ke 200 mg (0,72 mmolu) tris-(2-karboxyethyl)nitromethanu ve 20 ml tetrahydrofuranu se při teplotě 0 °C nejdříve přidá 0,59 ml (4,3 mmolu) triethylaminu a potom 0,2 ml (2,1 mmolu) ethylesteru kyseliny chlormravenčí. Po 30 minutách při teplotě 0 °C se přidá 1,16 g (2,1 mmolu) benzylesteru kyseliny 3beta-(2-aminoethyoxy)-7alfa,12alfa-dihydroxycholanové. Po dalších 3 hodinách při teplotě 0 °C a 2 hodinách při okolní teplotě se reakční směs zahustí a zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí methylenchloridu a methanolu v objemovém poměru 9:1.

Výtěžek: 780 mg (0,42 mmolu, 59 %).

C,09H₁₆₂N₄O₂₀ (1847), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 1854 (M+Li⁺).

-10CZ 285104 B6

Příklad 7

200 mg (0,108 mmolu) sloučeniny z příkladu 6 v 15 ml methanolu se hydrogenuje za normálního tlaku v přítomnosti 10 mg paladia na uhlí. Hydrogenační katalyzátor se potom odfiltruje a filtrát se zahustí, přičemž se získá 150 mg (0,095 mmolu, 88 %) požadovaného produktu.

C₈₈H₁₄₄N₄O₂₂ (1577), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 1584(M+Li⁺).

Příklad 8

Ke 300 mg (0,59 mmolu) l,l,l-tris-(2-karboxyethoxymethyl)ethanu ve 30 ml tetrahydrofuranu při teplotě 0 °C se přidá 0,56 ml (4,0 mmoly) triethylaminu a 0,26 ml (2,72 mmolu) ethylesteru kyseliny chlormravenčí. Po 15 minutách při teplotě 0 °C se při teplotě -10 °C přidá 1,8 g (3,52 mmolu) methylesteru kyseliny 3beta-amino-7alfa,12alfa-dihydroxycholanové v 10 ml tetrahydrofuranu a takto získaná směs se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě -10 °C a po dobu 30 minut při okolní teplotě. Po zahuštění reakční směsi se získaný zbytek chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsi ethylacetátu, methanolu a triethylaminu v objemovém poměru 5:1:1.

Výtěžek: 900 mg (5,23 mmolu, 89 %).

C₈₉H₁₄₇N₃O_I8 (1546), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 1553(M+Li⁺).

- 11 CZ 285104 B6

Příklad 9

500 mg (0,29 mmolu) sloučeniny z příkladu 8 se zmýdelní 2 ml 1M vodného roztoku hydroxidu sodného v 10 ml ethanolu. Přidá se voda a ethanol se oddestiluje, zbytek se okyselí kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje ethylacetátem. Po vysušení a zahuštění rozpouštědla se získaný zbytek chromatografuje za použití eluční soustavy tvořené směsí chloroformu a methanolu nejdříve v poměru 4:1 a potom v poměru 1:1).

Výtěžek: 260 mg (0,15 mmolu, 53 %),

CeóHuiNjOig (1504), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCI): 1511 (M+Li⁺).

Příklad 10

Požadovaný produkt byl získán z l,l,l-tris-2-karboxyethoxymethyl)ethanu a methylesteru kyseliny 3beta-(2-aminoethoxy)-7alfa,12alfa-dihydroxycholanové postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladech 8 a 9.

C₉₂H₁₅3O₂₁ (1636), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 1643 (M+Li⁺).

- 12CZ 285104 B6

Příklad 11

Požadovaný produkt se získá ze sloučeniny z příkladu 3 a kyseliny 3beta-amino-3a,7adihydroxycholanové postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladech 8 a 9.

C₉₅H₁₅₉N₃O₂₁(1678), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): (M+Li⁺).

Příklad 12

Požadovaný produkt se získá ze sloučeniny z příkladu 3 a methylesteru kyseliny 3beta-(2aminoethyoxy)-7alfa,12ala-dihydroxycholanové postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladech 8 a 9.

C₁₀₁H_l71N₃O₂₄ (1810), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 1817 (M+Li⁺).

-13 CZ 285104 B6

Příklad 13

K roztoku 0,5 g (1,12 mmolů) sloučeniny z příkladu 5 a 3,0 g (6,45 mmolů) methylesteru kyseliny 3beta-(2-aminoethoxy)-7alfa,12alfa-cholanové ve 20 ml bezvodého ethylacetátu se přidá 1,36 g (5,50 mmolů) 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolinu a získaná směs se zahřívá po dobu 20 minut pod zpětným chladičem. Po ukončení reakce se rozpouštědlo odpaří a zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené směsí chloroformu a methanolu v objemovém poměru 10:1. Zodpovídající frakce eluátu se potom získá 1,40 g (0,63 mmolů, 54 %) požadovaného produktu.

C₁₂₅H₂₀₈N₄O₂₈(2213), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 2220 (M+Li⁺).

Příklad 14

Sloučenina z příkladu 13 se zmýdelní postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 9. Přečištění produktu se provádí chromatografií na silikagelu RP-8 za použití elučního činidla tvořeného směsí methanolu a vody v objemovém poměru 85:5.

C₁₂₁H₂₀N₄O₂₈ (2157), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCI): 2164 (M+Li⁺).

- 14CZ 285104 B6

Příklad 15

(<)

K roztoku 2,58 g (0,01 molu) Kempový trikyseliny (a), 16,5 g (0,03 molu) aminu (b) a 4,46 g (0,033 molu) hydroxybenzotriazolu (HOBT) ve 300 ml tetrahyrofuranu se při teplotě 0 °C přidá

6.8 g (0,033 molu) dicyklohexylkarbodiimidu (DCC). Získaný roztok se míchá 30 minut při teplotě 0 °C a potom 20 hodin při okolní teplotě. Za účelem ukončení reakce se k reakční směsi přidá 1,12 g HOBT a 1,7 g DCC, načež se reakční směs znovu míchá po dobu 20 hodin. Vyloučená sraženina se potom odfiltruje, filtrát se zahustí, zbytek se vyjme ethylacetátem a získaný roztok se potom postupně promyje 2N kyselinou citrónovou, vodou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nakonec vodou. Zbytek získaný po vysušení a zahuštění se přečistí chromatografii na silikagelu za použití eluční soustavy, tvořené směsí ethylacetátu a methanolu v objemovém poměru 10:1. Z odpovídající frakce eluátu se potom získá

16.8 g (95 %) požadovaného produktu (c).

C₁₀₅H_]77N₃O₁₈ (1768), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, 3-NBA/LiCl): 1775 (M+Li⁺).

-15 CZ 285104 B6

Příklad 16

16,8 g sloučeniny z příkladu 15 se rozpustí ve 200 ml dioxanu, načež se k získanému roztoku při teplotě 0 °C přidá 100 ml polokoncentrovaného louhu sodného. Po 2 hodinovém míchání při okolní teplotě se k reakční směsi přidá 300 ml vody a získaná směs se míchá přes noc při okolní teplotě. Po ukončení reakce se reakční směs zředí dalšími 500 ml vody, okyselí zředěnou kyselinou chlorovodíkovou a míchá na ledu po dobu jedné hodiny. Vyloučená sraženina se odsaje, promyje vodou, rekrystalizuje ze směsi ethanolu a vody a vysuší za vakua, přičemž se získá 15,1 g (92 %) požadované sloučeniny v mikrokiystalické formě.

C₁₀₂H_l7lN₃O₁₈ (1727), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, AcOH, NBA): 1728 (M+H⁺), teplota tání: 168°C.

Příklad 17

- 16CZ 285104 B6

345 mg (0,2 mmolu) sloučeniny z příkladu 16 se rozpustí v 5 ml bezvodého methanolu a k takto získanému roztoku se přidá 1 ml 0,2 N methanolického louhu sodného. Sodná sůl se potom vysráží přidáním 50 ml bezvodého etheru a 1 hodinovým mícháním při teplotě 0 °C, odsaje, promyje studeným etherem a vysuší za vakua, přičemž se získá 310 mg požadovaného produktu (87 %).

C₁₀₂H₁₆₈N₃O₁₈ (1792), hmotové spektrum (ionizace rychlými atomy, NBA): 1728 (M-3Na⁺ +4Η⁺), teplota tání: 201 až 203 °C.

Postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladech 15 a 16, se zodpovídajících karboxylových kyselin a aminů připraví sloučeniny uvedené v následujících příkladech. Symbol FAB v těchto příkladech znamená ionizaci rychlými atomy (Fast Atom Bombardment).

Příklad 18

C₈₇H₁₃₅N₃O₁₅ (1462, MS (FAB, 3-NBA): 1463 (M + H⁺)

Příklad 19

C₈₇H₁₃₅N₃O,₈ (1510), MS (FAB, 3-NBA): 1511 (M+H⁺)

-17CZ 285104 B6

Příklad 20

C₉6Hi53N₃O₁₈ (1636), MS (FAB, 3-NBA): 1637 (M + H⁺)

Příklad 21

C₉₉H_I59N₃Oi₈ (1678), MS (FAB, 3-NBA): 1679 (M+íT)

Příklad 22

Ci₆₅H₂₆4N₆O24 (2714), MS (FAB, 3-NBA, AcOH): 2737 (M +Na')

- 18Příklad 23 cz 285104 B6

r)

C,H,.,N,O„(146S),MS(FAB , 3-NBA): 1469 (M +

Příklad 24

^,^0,,05.3)^5^,3-^):.5.7^)

Přiklad 25

^Ο,.Ο^ΜβσΑΒ^ΝΒΑΡ^ίΜ^)

-19CZ 285104 B6

Příklad 26

R R I I o - c c = o /V 0 = R C - 0

I I

R R

C₁₁₂H_Ig2N₄0₂o (1903), MS (FAB, 3-NBA): 1904 (M + Ff)

Příklad 27

Ci28H₂₁₄N₄O₂4 (2192), MS (FAB, 3-NBA): 2193 (M + H⁺)

-20CZ 285104 B6

Příklad 29

C₉oHu7N30₁₅(1510),MS(FAB,3-NBA): 1511 (M + FF)

Příklad 30

C₉₀H₁₄7N3Oi₈ (1558), MS (FAB, 3-NBA): 1559 (Μ + H⁺)

Příklad 31

R

n - 4

C₉₉H₁₆₅N3O₁₈ (1684), MS (FAB, 3-NBA): 1685 (M + FF)

-21 CZ 285104 B6

Příklad 32

R

C9oH₁₄7N₃Oi₅ (1510), MS (FAB, 3-NBA): 1511 (M + FT)

Příklad 33

C₈₄H₁₃₅N₃O₁₅ (1426), MS (FAB, 3-NBA): 1427 (M + FT)

-22CZ 285104 B6

Příklad 34 io

C₉₆H₁₅₉N₃O₂i (1690), MS (FAB, 3-NBA): 1713 (M + Na⁺)

Přiklad 35

R c - o \ R

Ci02Hi7iN₃O₂₄(1822), MS (FAB, 3-NBA): 1823 (M + H⁺)

-23 CZ 285104 B6

Příklad 36

C₁₀2H₁₆₈N₆O₁₈ (1765), MS (FAB, 3-NBA): 1766 (M + FT)

Příklad 37

Cio₂Hi7iN₃0_]8 (1726), MS (FAB, 3-NBA): 1727 (M + H⁺)

-24CZ 285104 B6

Příklad 38

-(ch₂ ),

K 5,18 g (0,02 molu) derivátu kyseliny (a) v 350 ml bezvodého dichlormethanu s obsahem 6 ml triethylaminu se za chlazení ledem přidá 21 g (0,04 molu) aminu (b) (rozpouštěného ve 150 ml dichlormethanu), načež se směs po ukončení tohoto přídavku míchá po dobu 6 hodin při okolní teplotě. Vytvořená sůl se odfiltruje, několikrát vytřepe do 2N kyseliny citrónové a vody a zbytek 10 po vysušení a zahuštění se přečistí chromatografií na silikagelu. Z odpovídající frakce eluátu se potom získá 15,9 g (63 %) požadovaného produktu.

C74H124N2O14 (1265), hmotové spektrum (FAB, 3-NBA): 1266 (Μ + 1T).

-25 CZ 285104 B6

Příklad 39

RNHOC RNHOC

CONHR CONHR

(CH₂)

633 mg (0,5 mmolu) sloučeniny z příkladu 38 se rozpustí ve 30 ml tetrahydrofuranu a aktivuje mg (0,52 mmolu) hydroxybenzotriazolu a 110 mg (0,53 mmolu) dicyklohexylkarbodiimidu. K. získané směsi se potom přidá 243 mg (0,52 mmolu) aminu (a) a směs se míchá přes noc při okolní teplotě. Reakční směs se potom zpracuje stejně jako v příkladu 15. Po chromatografickém přečištění se získá 582 mg (68 %) produktu (b).

C₁₀iH₁₆₉N₃O₁₈ (1712), hmotové spektrum (FAB, 3-NBA), 1713 (M + H’).

Příklad 40

-26CZ 285104 B6

Požadovaný produkt se připraví alkalickým zmýdelněním sloučeniny z příkladu 39 postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 16.

C₉₈H₁₆₃N₃O₁₈(1670), hmotové spektrum (FAB, 3-NBA): 1671 (Μ + FT).

Příklad 41

R = jako v příkladu 40

Požadovaný produkt se připraví postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladu 40 za použití dimemího aminu s odpovídajícím R¹.

C132H222N4O22 (2216), hmotové spektrum (FAB, 3-NBA): 2217 (Μ + H ).

Produkty uvedené v následujících dvou příkladech se připraví postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladech 15 a 16 za použití odpovídajících oligokarboxylových kyselin a aminů.

Příklad 42

Cii2Hi₈oN₄0₂4 (1965), MS (FAB, 3-NBA): 1966 (Μ + H*)

-27CZ 285104 B6

Příklad 43

n 5

C128H212N₄O₂4 (2190), MS (FAB, 3-NBA): 2191 (Μ + H*)

Příklad 44

V případě, že se při konverzi kyseliny ε-truxilové na kyselinu trans,trans,trans-cyklobutan1,2,3,4-tetrakarboxylovou (Chem. Ber. 83, 2521 (1960)) včas přeruší ozonolýza, potom se po zpracování reakční směsi získá směsný produkt, který může být chromatograficky rozdělen na silikagelu za použití eluční soustavy tvořené chloroformem a methanolem v objemovém poměru 6:1. Jako první frakce se získá nová kyselina 4-fenylcyklobutan-l,2,3-trikarboxylová (a) s hmotovým spektrem (FAB, 3-NBA) pro C₁₃H|₂O₆ (264): 265 (M + Li⁺) a jako druhá frakce se získá kyselina cyklobutan-l,2,3,4-tetrakarboxylová (b).

Sloučeniny uvedené v následujících příkladech se připraví z odpovídajících oligokarboxylových kyselin a aminů postupem, který je analogický s postupem popsaným v příkladech 15 a 16.

-28CZ 285104 B6

Příklad 45

C₉₁H₁₄1N₃O₁₈ (1564), MS (FAB, 3-NBA): 1565 (Μ + 1Γ)

Příklad 46

Ci₀₃H₁₆5N₃Oi8 (1732), MS (FAB, 3-NBA), 1733 (M + H')

Příklad 47

R R

I I

HO

C_H2H_lg0N₄O₂₄ (1965), MS (FAB, 3-NBA): 1966 (M + H‘)

-29CZ 285104 B6

Příklad 48

Ci₂₈H_2I2N₄O₂₄ (2190), MS (FAB, 3-NBA): 2191 (Μ + Η*)

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY (la) _t

   -30CZ 285104 B6 ve kterých

   E znamená jednoduchou vazbu, atom kyslíku nebo skupinu NH,

   Y znamená skupinu -OL, skupinu -NHL, skupinu -NL₂, aminokyselinu zvolenou z množiny, zahrnující alanin, glycin, prolin, cystein, histidin, glutamin, kyselinu asparagovou, isoleucin, arginin, kyselinu glutamovou, lysin, serin, fenylalanin, leucin, threonin, tryptofan, methionin, valin, tyrosin, asparagin, nebo aminosulfonovou kyselinu zvolenou z množiny zahrnující

   -NHCH₂-CO₂H, -NH-CH₂CH₂-SO₃H, -N-CH₂CH₂-SO₃H, -N-CH₂-CO₂H, ch₃ ch₃

   -nh-chco₂h

   I

   R⁶ a jejich alkylestery, ve kterých alkylový zbytek obsahuje 1 až 4 uhlíkové atomy, a soli alkalických kovů a kovů alkalických zemin, -OKa, kde Ka znamená kation, jako například kation alkalického kovu nebo kovu alkalických zemin, nebo také kvartémí amoniový ion, přičemž

   L znamená atom vodíku, alkylový nebo alkylenový zbytek obsahující nejvýše 10 uhlíkových atomů, který je přímý nebo rozvětvený, cykloalkylový zbytek obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů, fenylový zbytek obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů, fenylový zbytek, který je nesubstituován nebo jednou až třikrát substituován atomem fluoru, atomem bromu, alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo alkoxy-skupinou obsahující 1 až

   -31 CZ 285104 B6

   4 uhlíkové atomy, benzylový zbytek, který je nesubstituován nebo jednou až třikrát substituován atomem fluoru, atomem chloru, atomem bromu, alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo alkoxy-skupinou obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, a

   R⁶ znamená methylovou skupinu, isopropylovou skupinu, isobutylovou skupinu, 2-butylovou skupinu, benzylovou skupinu, 4-hydroxybenzylovou skupinu, hydroxymethylovou skupinu, 1-hydroxyethylovou skupinu, skupinu H3CSCH2CH2-, skupinu HO₂CCH₂-, skupinu HOCCH₂CH₂-, nebo

   Y znamená skupinu obecného vzorce II (II) ,

   R² až R⁵ nezávisle jeden na druhém znamenají

   OOO

   Η, OT, -ST, -NHT, O-C-T, -S-C-T, -NH-C-T,

   O OOO

   -O-P-OT, -O-S-OT, -S-OT, -P-OT-T

   I II II II

   OT 000 přičemž

   T znamená atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující nejvýše 10 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů, fenylovou skupinu nebo tetrahydropyranylovou skupinu, nebo

   R² a R³, popřípadě R⁴ a R⁵ vždy společně znamenají atom kyslíku karbonylové skupiny,

   X znamená jednoduchou vazbu nebo skupinu obecného vzorce III

   O O

   II II _[_(N)_s-A-N-C-(CH₂)_q-C-]_r-N-(B>- (ΙΠ),

   -32CZ 285104 B6 ve kterém

   A znamená alkylenový řetězec obsahující 2 až 12, výhodně 2 až 6, uhlíkových atomů, přičemž tento řetězec je rozvětvený nebo nerozvětvený a může být případně přerušen skupinou -O-, skupinou -S- nebo fenylenovou skupinou, kde připojení fenylénové skupiny může být provedeno v následujících polohách

   B znamená alkylenový řetězec obsahující 2 až 18, výhodně 2 až 12 uhlíkových atomů, přičemž tento řetězec je rozvětvený nebo nerozvětvený a může být případně přerušen skupinou -O-, skupinou -S- nebo fenylenovou skupinou, kde připojení fenylénové skupiny může být provedeno v následujících polohách

   L¹, L² a L³, které jsou stejné nebo odlišné, mají význam L, přičemž zejména znamenají atom vodíku, alkylovou skupinu obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy nebo benzylovou skupinu, q znamená 0 až 5, r znamená 0 nebo 1, s znamená 0 nebo 1 a t znamená 0 nebo 1, a

   Z znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující nejvýše 20 uhlíkových atomů, cykloalkylovou skupinu obsahující 3 až 8 uhlíkových atomů nebo fenylovou skupinu, přičemž uvedené skupiny obsahují 3 nebo 4 zbytky -C(=O)-NH-, přes které jsou uvedené skupiny vázány k X, přičemž konec -C(=O)- těchto zbytků je vázán k uvedeným skupinám a konec -NH- těchto zbytků je vázán k X, a uvedené skupiny mohou být substituovány například amino-skupinou, nitro-skupinou nebo alkylovou skupinou obsahující 1 až 3 uhlíkové atomy, výhodně methylovou nebo fenylovou skupinou.
2. 2. Léčivo, vyznačené tím, že obsahuje derivát kyseliny žlučové obecného vzorce Ia nebo Ib podle nároku 1.
3. 3. Derivát kyseliny žlučové obecného vzorce Ia nebo Ib podle nároku 1 pro použití jako léčivo pro léčení hyperlipidemie.