CZ278883B6 - Process for preparing a vector for dna transfer - Google Patents
Process for preparing a vector for dna transfer Download PDFInfo
- Publication number
- CZ278883B6 CZ278883B6 CS806215A CS621580A CZ278883B6 CZ 278883 B6 CZ278883 B6 CZ 278883B6 CS 806215 A CS806215 A CS 806215A CS 621580 A CS621580 A CS 621580A CZ 278883 B6 CZ278883 B6 CZ 278883B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sequence
- proinsulin
- dna
- protein
- gene
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 8
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 55
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 24
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002480 thymidyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 124
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 67
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 18
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 64
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 52
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 33
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 30
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 26
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 26
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 25
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 24
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 24
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 11
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 11
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 7
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Natural products CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 5
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 3
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Natural products NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 2
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 2
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 2
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 2
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 2'-deoxyguanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N Adenosine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 1
- 101100434038 Hordeum vulgare ACL1.3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- CTCBPRXHVPZNHB-VQFZJOCSSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate;(2r,3r,4s,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O CTCBPRXHVPZNHB-VQFZJOCSSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-M hydrosulfide Chemical compound [SH-] RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000008384 membrane barrier Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu výroby vektoru pro přenos DNA pro použití při udržování a replikaci sledu desoxynukleotidů, který je kódem pro lidský preproinzulín nebo proinzulín.
Inzulín je hormon, který je produkován především buňkami B slinivky břišní. Je známo široké použití této látky v případě cukrovky. Přestože se na jatkách odebírají slinivky břišní skotu a vepřů jako zdroje inzulínu, vzniká nedostatek tohoto hormonu, protože stoupá na celém světě počet nemocných cukrovkou. Mimoto někteří tito nemocní trpí alergií na inzulín skotu a vepřů, takže by bylo velmi žádoucí získat lidský inzulín v množství, které by mohlo krýt alespoň nejnutnější část jeho spotřeby. Způsobem podle vynálezu je možno získat vektory, včlenitelné do mikroorganismů za účelem získání lidského preproinzulínu nebo proinzulínu.
Inzulín sestává ze dvou polypeptidových řetězců A a B, které jsou spojeny disulfidovými můstky. Řetězec A sestává z 21 aminokyselin a řetězec B z 30 aminokyselin. Tyto řetezce se in vivo nesyntetizují nezávisle, ale jsou odvozeny od prekursoru, kterým je proinzulín. Proinzulín je jednoduchý polypeptidový řetězec, který obsahuje C-peptid, který spojuje řetězce A a B, jak bylo uvedeno v publikaci D.F. Steiner a další, Science 157, 697 (1967). Tento C-peptid se odštěpuje v průběhu převodu inzulínu do granul buněk B slinivky břišní před jeho vylučováním, jak bylo popsáno v publikaci H. S. Tager a další, Ann. Rev. Biochem. 43, 509 (1974). Podle současného výkladu zajišťuje C-peptid pouze trojrozměrnou strukturu molekuly. Sled aminokyselin v lidském proinzulínu je uveden v následující tabulce 1. V této tabulce tvoří řetězec B aminokyseliny 1 až 30, C-peptid tvoří aminokyseliny 31 až 65 a řetězec A je tvořen aminokyselinami 66 až 86.
Tabulka 1
10
NH2 -Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu20 30
-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Try-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg40 -Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly50 60
-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln70 -Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr80 86 -Gln-Leu-Glu-Asn-Try-Cys-Asn
Chemická syntéza tohoto sledu 86 aminokyselin je běžným způsobem možná, i když je obtížná.
-1CZ 278883 B6
V pankreatických buňkách B není původním produktem vlastní proinzulín, avšak preproinzulín, který obsahuje ještě více než 20 dalších aminokyselin na tom konci proinzulínu, na němž se nachází aminoskupina, jak bylo popsáno v publikacích S. J. Cahn a další. Proč. Nat. Acad. Sci. USA 73, 1964 (1976) a P. T. Lomedico a další, Nucl. Acid. Res. 3, 381 (1976). Tento sled aminokyselin se nazývá signálním peptidem. V lidském preproinzulínu má signální peptid 24 aminokyselin. Jak je znázorněno také na obr. 2, jde o následující sled:
-24 -20 -10
NH2-Met-Ala-Leu-Trp-Met-Arg-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-1 -Leu-Trp-Gly-Pro-Asp-Pro-Ala-Ala-Ala.
Tento sled aminokyselin je patrně specifickým signálem pro přenos syntetizovaného polypeptidu do endoplazmatického retikula buněk Bav průběhu transportu vektorem se od proinzulínu odštěpuje, jak bylo popsáno v publikaci G. Blobel a další, J. Cell. Biol. 67, 835 (1975).
Je známa řada signálních peptidů u eukaryotických bílkovin, které je možno transportovat membránovými bariérami. V bezbuněčném systému byl objevem specifický enzym, který hydrolyzuje peptidovou vazbu mezi signálním peptidem a aktivní bílkovinou při průchodu buněčnou membránou, jak bylo popsáno v publikaci G. Blobel a další. Proč. Nat. Acad. Sci USA 75. 361 (1978).
Současné pokroky v biochemii, zejména pokud jde o DNA, umožnily syntézu specifických bílkovin za řízených podmínek, které jsou nezávislé na vyšším organismu, z něhož jsou běžně izolovány. Při této syntéze se užívá enzymů a subcelulárních složek živých buněk, které se obvykle účastní syntézy bílkovin, a to bud’ in vitřo v bezbuněčném systému, nebo in vivo v mikroorganismu. V obou případech je klíčovým stupněm získání desoxyribonukleové kyseliny (DNA) se specifickým sledem s obsahem informace, která je nutná pro získání požadovaného sledu aminokyselin. Tato specifická DNA je gen. Kódový vztah, tvořený sledem desoxynukleotidů, se užívá k vyjádření sledu aminokyselin v bílkovině a je založen na základním počtu principů, které jsou společné všem živým organismům.
Klonovaného genu je možno užít k určení sledu aminokyselin v bílkovinách in vitro. Systémy pro tuto syntézu jsou dobře známy a byly popsán například v publikaci G. Zubay, Ann. Rev. Genetics 7, 267 (1973). Mimoto je možno způsobit, aby DNA s jednoduchým řetězcem působila jako mRNA in vitro, čímž je možno dosáhnout velké přesnosti sledu DNA, jak bylo popsáno v publikaci J. Salaš, a další, J. Biol. Chem. 243, 1012 (1968). Mimoto je možno užít dalších známých způsobů ke zvýšení výtěžku výsledného produktu.
Vývoj tohoto oboru umožňuje izolovat specifické geny nebo jejich části z vyšších organismů, například člověka a dalších savců, a přenést tyto geny nebo jejich fragmenty do mikroorganismu, například bakterií nebo kvasinek. Tímto způsobem dochází k replikaci přeneseného genu a k jeho propagaci při replikaci
-2CZ 278883 B6 transformovaného mikroorganismu. Tímto způsobem může transformovaný mikroorganismus získat tu vlastnost, že produkuje bílkovinu, pro níž je kódem gen nebo jeho fragment, přičemž může jít o enzym, hormon, antigen, protilátku nebo o část těchto bílkovin. Mikroorganismus předává svou schopnost dalším generacím, takže ve skutečnosti vzniká nový kmen s požadovanou schopností, jak bylo popsáno například v publikacích Ullrich A. a další, Science 196, 1313 (1977), a Seegurg. P. H. a další, Nátuře 270, 486 (1977).
Základním faktem, který umožňuje použití této technologie pro praktické účely, je skutečnost, že DNA všech živých organismů od mikroorganismů až po člověka je chemicky podobná a skládá se ze čtyř stejných nukleotidů. Podstatný rozdíl spočívá pouze ve sledu těchto nukleotidů v polymerní molekule DNA. Tento sled nukleotidů je možno užít k vyjádření specifického sledu aminokyselin určité bílkoviny. Přestože se většina bílkovin různých organismů liší, kódové vztahy mezi sledem nukleotidů a sledem aminokyselin jsou v zásadě stejné pro všechny organismy. Například tentýž sled nukleotidů, který je kódem pro sled aminokyselin lidského růstového hormonu v hypofýze, po přenesení do mikroorganismu je kódem pro týž sled aminokyselin.
Používané zkratky jsou uvedeny v následující tabulce 2.
Tabulka 2
DNA - desoxyribonukleová kyselina
RNA - ribonukleová kyselina cDNA - komplementární DNA (enzymaticky systetizovaná ze sledu mRNA) mRNA - RNA pro přenos (poslíčkové RNA) dATP - desoxyadenosintrifosfát dGŤP - desoxyguanosintrifosfát dCTP - desoxycytidintrifosfát
A - Adenin
T - Thymin
G - Guanin
C - Cytosin
U - Uráčil
ATP - adenosintrifosfát
TTP - trymidintrifosfát
EDTA - kyselina ethylendiamintetraoctová
Kódové vztahy mezi sledem nukleotidů v DNA a sledem aminokyselin v bílkovině jsou souhrnně známy jako genetický kód a jsou uvedeny v následující tabulce 3.
Tabulka 3
Genetický kód fenylalanin (Phe) TTK leucin (Leu) XTY isoleucin (lle) ATM methionin (Met) ATG valin (Val) GTL serin (Ser) QRS
-3CZ 278883 B6
Tabulka 3 pokračování prolin (Pro) threonin (Thr)
Alanin (Ala)
Tyrosin (Tyr)
Terminační signál terminační signál histidin (His) glutamin (Gin)
Asparagin (Asn)
Lysin (Lys) kyselina asparagová (Asp) kyselina glutamová (Glu) cystein (Cys) tryptofan (Try)
Arginin (Arg)
Glycin (Gly)
CCL ACL GCL TAK TAJ TGA CAK CAJ AAK AAJ GAK GAJ TGK TGG WGZ GGL
Poznámka:
Každý triplet desoxynukleotidů o 3 písmenech odpovídá trinukleotidu mRNA se zakončením 5' na levé straně a zakončením 3' na pravé straně. Všechny uvedené sledy DNA jsou sledy, jejichž řetězec odpovídá sledu mRNA s tím rozdílem, že se uráčil nahradí thyminem. Písmena znamenají purinové a pyrimidinové báze řetězce.
A adenin
G guanin
C cytosin
T thymin
X T nebo C v případě, že Y znamená A nebo G
X C v případě, že Y znamená C nebo T
Y znamená A, G, C nebo T v případě, že X znamená C
Y A nebo G v případě, že X znamená T
W C nebo A v případě, že Z znamená A nebo G
W C v případě, že Z znamená C nebo T
Z A, G, C nebo T v případě, že W znamená C
Z A nebo G v případě, že W znamená A-QR TC v případě, že S znamená A, G, C nebo T
QR AG v případě, že S znamená T nebo C
S A, G, C nebo T v případě, že QR znamená TC
S T nebo C v případě, že QR znamená AG
J A nebo G
K T nebo C
L A, T, C nebo G
M A, C nebo T.
Důležitou vlastností kódu pro současné účely je skutečnost, že každá aminokyselina je určena sledem tří nukleotidů, který se také nazývá nukleotidový triptet. Fosfodiesterové vazby, které spojují sousední triplety, jsou chemicky nerozeznatelné od dalších vazeb mezi nukleotidy DNA. Z tohoto důvodu není možno odečíst sled nukleotidů jako kód pro některou aminokyselinu nebo pro sled aminokyselin bez další informace, která určuje začátek sledu a tedy i skupiny tripletů, které jsou užívány buňkou k rozeznání významu, který má mRNA pro řízení syntézy bílkovin.
-4CZ 278883 B6
Řada technik v chemii DNA užívá dvou tříd sloučenin, a to vektorů pro přenos a restrikčních enzymů. Vektor pro přenos je molekula DNA, která mimo jiné obsahuje genetickou informaci, která zajišťuje její vlastní replikaci při přenosu do hostitelského mikroorganismu. Příkladem vektorů pro přenos, tak jak se běžně užívají v genetice bakterií, jsou plasmidy a DNA některých bakteriofágů. Přestože plasmidy byly užity jako vektory pro způsob podle vynálezu, je zřejmé, že bylo možno užít i jiných typů vektorů, schopných přenosu. Plasmid je termín, který je užíván pro jakoukoliv jednotku DNA, schopnou automní replikace, kterou je možno najít v mikrobiální buňce a která je odlišná od vlastního genomu hostitelské buňky. Plasmid tedy není geneticky vázán na chromozom hostitelské buňky. DNA plasmidů existuje jako prstencovitá struktura s dvojitým řetězcem o molekulární hmotnosti řádu několik miliónů jednotek, přestože některé z nich mají molekulární hmotnost větší než 108 jednotek. Molekuly této velikosti obvykle představují jen malé procento celkového množství DNA v buňce. DNA, která je vektorem pro přenos, je obvykle oddělitelná od DNA hostitelské buňky vzhledem k velkému rozdílu ve velikosti obou molekul. Vektory nesou genetickou informaci, která dovoluje jejich replikaci v hostitelské buňce, a to ve většině případů nezávisle na rychlosti dělení hostitelských buněk. Některé plasmidy mají tu vlastnost, že jejich replikaci a rychlost této replikace je možno řídit změnami růstových podmínek. Plasmidová DNA existuje jako uzavřený kruh. Vhodným způsobem je však možno tento kruh otevřít, vložit fragment heterologní DNA a kruh opět uzavřít, čímž vzniká zvětšená molekula, která obsahuje včleněný fragment DNA. Například DNA bakteriofágu může nést segment heterologní DNA, který je zařazen v místě některých nepodstatných genů fágu. Vektor může tedy sloužit jako nosič včleněného fragmentu heterologní DNA.
Přenos.se uskutečňuje způsobem, který je znám jako transformace. V průběhu transformace se do bakteriálních buněk, smíšených s plasmidovou DNA, včleňuje celá molekula plasmidů. Přestože mechanismus tohoto způsobu zůstává neznám, je možno zvýšit na maximální množství podíl bakteriálních buněk, které jsou schopné přijmout plasmidovou DNA a tím se transformovat. Jakmile se do buňky včlení plasmid, dochází k jeho replikaci v buňce a k jeho distribuci do dceřiných buněk při dělení mateřské buňky. Jakákoliv genetická informace, která je přítomna ve sledu nukleotidů plasmidů, může být tedy zásadně replikována a dále přenášena hostitelskou buňkou. Transformovaná hostitelská buňka se tedy pozná podle vlastností, přenesených plasmidem. Touto vlastností může být například odolnost proti některému z antibiotik. Různé plasmidy je opět od sebe možno rozeznat rozdílnými schopnostmi nebo rozdílnou kombinací schopností, které předávají hostitelským buňkám, v nichž jsou obsaženy. Jakýkoliv daný plasmid je tedy možno získat ve větším množství tak, že se pěstuje čistá kultura buněk, které tento plasmid obsahují s následným izolováním plasmidové DNA z uvedených buněk.
Restrikční endonukleázy jsou hydrolytické enzymy, které jsou schopné katalyzovat štěpení molekulové DNA tak, že dochází k jejich štěpení na zcela určitém specifickém místě. Místo působení restrikční endonukleázy je určeno existencí specifického
-5CZ 278883 B6 sledu nukleotidů. Tento sled je nazván specifickým místem působení restrikční endonukleázy. Byly izolovány restrikční endonukleázy z různých zdrojů a charakterizovány, pokud jde o specifická místa jejich působení ve sledu nukleotidů. Některé restrikční endonukleázy hydrolyzují fosfodiesterové vazby v obou řetězcích v témž místě, čímž dochází k odpovídajícímu zakončení. Jiné enzymy katalyzují hydrolýzu vazeb, které jsou od sebe odděleny jen několika nukleotidy, čímž vznikají volné oblasti s jediným řetězcem na každém konci štěpené molekuly. Tyto části molekuly mohou být užity k novému spojení hydrolyzované DNA, protože se navzájem doplňují. Protože jakákoliv DNA, schopná štěpení uvedeným enzymem, musí obsahovat totéž místo působení, je možno získat naprosto stejná zakončení a tím je možno k sobě připojit heterologní sledy DNA po působení touž restrikční endonukleázou a dalšími podobně zpracovanými sledy nukleotidů, jak bylo popsáno v publikaci Roberts. H. J., Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976). Restrikční endonukleáza a restrikční místa jsou poměrně vzácná, avšak obecná použitelnost restrikčních endonukleáz byla široce rozšířena možností chemické syntézy oligonukleotidů s dvojím řetězcem a se zakončením, která odpovídají místu působení restrikční endonukleázy. Tímto způsobem je zásadně možno spojit jakýkoliv segment DNA s jakýmkoliv jiným segmentem prostým použitím příslušného zbytku po působení restrikční endonukleázy a jeho připojením na zakončení molekuly, které rovněž vzniklo působením restrikční endonukleázy, jak bylo popsáno v publikacích Heyneker H. L. a další, Nátuře 263, 748 (1976) a Scheller R. H. a další, Science 196, 177 (1977). Důležitou vlastností rozdělení specifických míst pro působení restrikčních endonukleáz je skutečnost, že tato místa jsou rozložena zcela náhodně vzhledem ke způsobu odečítání genetické informace. V důsledku toho může dojít ke štěpení restrikční endonukleázou mezi sousedními kodony nebo uvnitř jediného kodonu.
Jsou známy obecnější metody pro štěpení DNA a pro modifikaci koncového sledu. K náhodnému štěpení DNA je možno užít celou řadu nespecifických endonukleáz, jak bude dále uvedeno. Koncové sledy je možno modifikovat vytvořením oligonukleotidových zakončení dA na jednom konci a dT na druhém konci, nebo je možno vytvořit zakončení dG a dC a tak vytvořit restrikční místa bez nutnosti použití specifických sledů při spojení těchto zakončení.
Pojem exprese je užíván za současného vědomí, že organismus málokdy nebo nikdy využívá všech svých genetických schopností v daném okamžiku. I v poměrně jednoduchých organismech, například u bakterií, nedochází k syntéze celé řady bílkovin, které je buňka schopna vyrábět, avšak k jejich produkci může dojít za určitých zevních podmínek. V případě, že se bílkovina, jejímž kódem je daný gen, skutečně produkuje, dochází k tak zvané expresi genu. Jestliže se bílkovina neprodukuje, k expresi genu nedochází. Obvykle je řízena exprese genů v E. coli tak, jak bude dále popsáno, a to tak, že bílkoviny, jejichž funkce není užitečná v daném prostředí, nejsou produkovány a šetří se metabolická energie.
Způsob, jímž je řízena exprese genu u Escherichia coli, je poměrně znám v důsledku širokých výzkumů v posledních dvaceti letech, jak bylo popsáno v publikacích Heyes W., The Genetics of Bacteria And Their Viruses, 2. vydání, John Wiley a Sons, lne. ,
-6CZ 278883 B6
New York (1968) a Watson J. D. , The Molecular Biology of the Gene, 3. vydání, Benjamin, Menlo Park, California (1976). Tyto pokusy prokázaly, že některé geny, a to obvykle ty, které jsou kódy pro bílkoviny s příbuznou funkcí v buňce, jsou spojeny do kontinuálního sledu. Název pro tento sled je operon. Všechny geny operonu se odečítají v tomtéž sledu, přičemž se začíná od kodonu, který je kódem pro N-terminální aminokyselinu první bílkoviny a pokračuje se stále ve stejném směru až do C-terminálního zakončení poslední bílkoviny v operonu. Na začátku operonu, v blízkosti kodonu pro N-terminální aminokyselinu, existuje oblast DNA, která se nazývá kontrolní oblast, která obsahuje řadu řídicích prvků, a to operátor, promotor a sledy pro ribosomální místa vazby. Funkcí této oblasti je dovolit expresi svrchu uvedených genů v závislosti na potřebách organismu. Například geny, které jsou kódem pro enzymy, jichž je zapotřebí výlučně pro využití laktózy, se účastní exprese pouze tehdy, je-li přítomna laktóza nebo některý z jejích analogů v živném prostředí. Kontrolní oblast zajišťuje, aby docházelo k expresi pouze v tomto případě. V jiných případech nedochází ani k transkripci a k počátku translace. Exprese prvního genu ve sledu počíná počátkem transkripce a translace v poloze, která je kódem pro N-terminální aminokyselinu první bílkoviny v operonu. Současně dochází k expresi každého genu v daném směru od tohoto bodu alespoň tak dlouho, dokud sled neobsahuje terminační signál nebo jiný operon s vlastní řídicí oblastí, který je určen pro jiné zevní podmínky. Od tohoto schématu může docházet k různým odchylkám, důležitá je však skutečnost, že gen musí být například Escherichia coli zvláštním způsobem uvolněn vzhledem k řídicí oblasti, aby mohlo dojít k začátku transkripce a k translaci.
Bylo prokázáno, že je možno včlenit do operonu geny, které nejsou jeho běžnou částí, přičemž tyto geny pak mohou býť tímto operonem řízeny. Klasické stanovení bylo provedeno v publikaci Jacob. F. , a další, J. Mol. Biol. 13., 704 (1965). Při tomto pokusu byly přeneseny geny, které znamenaly kódy pro biosyntézu purinu, do oblasti, řízené operonem pro laktózu. Bylo pak možno pozorovat expresi enzymu pro biosyntézu purinu v přítomnosti laktózy a represi těchto enzymů v nepřítomnosti laktózy nebo jejího analogu, přičemž enzymy se nevyráběly ze-zevních podmínek, které normálně k jejich výrobě vedly.
Kromě operátorové oblasti, která řídí počátek transkripce u genu v příslušném směru, existují ještě kodony, které ukončují tento pochod a označují tedy C-terminální zakončení dané bílkoviny, jak bylo také uvedeno v tabulce 2. Tyto kodony jsou známy jako terminační signály, někdy se jim také říká nesmyslné kodony, protože nejsou kódem pro žádnou aminokyselinu. Při rozrušení terminačního signálu mezi jednotlivými geny téhož operonu vzniká souvislá oblast, v jejímž důsledku může dojít k syntéze chimérní bílkoviny, která sestává ze dvou sledů aminokyselin, jejichž kódem jsou sousední geny, tyto dva sledy jsou spojeny peptidovou vazbou. Výroba těchto chimérních bílkovin při spojení genů byla popsána v publikaci Benzer S. a Champe S. P. , Proč. Nat. Acad. Sci. USA 48., 114 (1962).
Jakmile dojde k tomu, že daný gen byl izolován, čištěn a vlečen do vektoru, označuje za výsledek tohoto postupu klonováním genu a závisí také na možnosti zajistit tuto látku v dosta
-7CZ 278883 B6 tečném množství. Klonovaný gen se přenese do vhodného mikroorganismu, kde dochází k replikaci genu při růstu mikroorganismu a jeho rozmnožování. Během těchto pochodů je možno kdykoliv získat gen zpět běžným způsobem. Tímto způsobem se získává zdroj genu pro další modifikace a přenosy do jiných vektorů nebo na jiná místa při použití téhož vektoru.
K expresi může dojít po přenosu klonovaného genu ve správném směru a po správném umístění do řídicí oblasti, takže při správném odečtení z prokaryotického genu dochází k syntéze chimérní bílkoviny, která obsahuje sled aminokyselin, jejímž kódem je klonovaný gen. Je možno užít řadu štěpení, specifického pro bílkoviny, k odštěpení chimérní bílkoviny v žádaném místě, takže je možno uvolnit žádaný sled aminokyselin a pak jej čistit běžným způsobem. Postupy pro získávání a expresi vektoru s klonovaným genem ve správné poloze vzhledem ke kontrolní oblasti byly popsány v publikacích Polisky B., a další, Proč. Nat. Acad. Sci USA 73, 3900 (1976), Itakura K. a další, Science 198, 1056 (1977), Villa-Komaroff, L. a další, Proč. Nat. Acad. Sci USA 75, 3727 (1978), Mercereau-Puijalon 0. a další, Nátuře 275, 505 (1978), Chang, A. C. Y. a další, Nátuře 275, 617 (1978) a v US přihlášce č. 933 035 (Rutter a další), část této přihlášky byla přejata pro vysvětlení do popisu.
Celkem je možno říci, že při produkci bílkoviny savců, například prekursoru lidského růstového hormonu pomocí DNA je nejprve zapotřebí klonovat lidský gen. Pro klonování je tento gen možno získat ve větším množství, dále modifikovat chemickým nebo enzymatickým způsobem a přenést do . plasmidů, schopného exprese. Klonovaný gen je také možno použít k izolaci příbuzných genů nebo v případě klonovaného fragmentu k získání celého genu při použití klonovaného genu k hybridizaci. Hybridizací je možno při použití klonovaného genu získat také příbuzné geny nebo prokázat totožnost homologů nebo nezávisle izolovaných materiálů. V důsledku povahy genetického kódu povede klonovaný gen po translaci ve správném směru pouze k produkci sledu aminokyselin, pro něž je kódem.
Základní práce na izolaci a byly provedeny, jak bylo popsáno A.
čištění,krysího proinzulínu již ve svrchu uvedených publikacích Ullricha a dalších a Villa-Komaroffa, L. a dalších. Tyto práce se týkají izolace a čištění genu pro krysí proinzulín a způsobu přenosu tohoto genu a jeho replikace v mikroorganismu. Ullrich a další izolovali několik rekombinantních plasmidů, které obsahovaly sled, který ke kódem pro proinzulín, nepřenesenou oblast 3' a část prepeptidu. je popsána v Villa-Komaroff a obsahoval kód, který je klíčem pro sled aminokyselin 4 až 86 proinzulínu. Tento sled proinzulínu byl oddělen až 182 penicilinázy (β-laktamázy) dů. Kód pro penicilinázu a proinzulín byl zpracován tak, k jeho expresi a ke vzniku popisují některé základní Nepopisují však izolaci a a preproinzulín.
Exprese krysí DNA s obsahem kódu pro inzulín britském patentovém spisu č. 2 031 434. další izolovali rekombinantní plasmid, který od aminokyselin 24 kódovým sledem pro šest glyciže došlo vázané bílkoviny. Uvedené publikace postupy, používané při výrobě DNA. čištění genu pro lidský proinzulín
-8CZ 278883 B6
Odlišný přístup k získání lidského inzulínu je popsán v publikaci R. Crea a další, Proč. Nat. Acad. Sci USA 75, 5765 (1978). Při tomto postupu dochází k chemické syntéze kódů pro řetězec A a pro řetězec B lidského inzulínu při použití kódů a Escherichia coli. Tyto dva sledy je pak možno včlenit do plasmidů, při jejichž expresi dochází k produkci řetězců A a B. Lidský inzulín je pak možno získat správnou vazbou disulfidovým můstkem mezi oběma bílkovinnými řetězci.
Klonovaný gen pro lidský preproinzulín je cenný pro různé účely. Je možno jej přenést do vektoru a tak získat syntetizovaný preproinzulín z mikroorganismu, který je transformován vektorem, obsahujícím klonovaný gen. Při růstu transformované buňky hostitele dochází k syntéze preproinzulínu jako části chimérní bílkoviny. V případě, že prokaryotická část vázané bílkoviny je signální částí vylučované bílkoviny, je možno dosáhnout sekrece této bílkoviny tak, že je usnadněna její stálost a čištění. Mimoto v případě, že prokaryotická část je krátká, je možno usnadnit celý postup v případě, že předběžný sled má stejnou funkci v prokaryotické buňce jako v eukaryotické buňce. Gen pro preproinzulín je možno užít také k získání genu pro proinzulín při použití techniky, která bude dále popsána.
Klonovaný gen pro preproinzulín je možno užít různým způsobem k produkci preproinzulínu. Preproinzulín sám o sobě je cenný, protože je možno jej převést na proinzulín známým enzymatickým a chemickým způsobem. Je možno například odstranit prepeptid, rozpustný enzymatickým preparátem, jak bylo popsáno v publikaci G. Blobela a dalších, jež j je svrchu uvedena, a specificky tak odstranit signální peptidy'. Klonovaný gen proinzulínu je pak možno různým způsobem užít pro výrobu proinzulínu. Proinzulín je cennou látkou, protože je možno jej převést na inzulín známým enzymatickým a chemickým způsobem, jak je popsáno v publikaci Kemmber W. a další, J. Biol. Chem. 242, 6786 (1971). Předmětem vynálezu je způsob výroby vektoru pro přenos DNA pro použití při udržování a replikaci sledu desoxynukleotidů, který je kódem pro lidský preproinzulín nebo proinzulín, vyznačený tím, že se uvede do reakce desoxynukleotidový sled, který je kódem pro lidský proinzulín nebo preproinzulín s obsahem -kladně značeného řetězce se sledy:
5'-ATG_24CGL_23X_22TY_22TGG_21ATG_20W_19GZ_lgX_igTY_18X_17TY_17
CCL
TY
-12X-11
TY_g tgg_8ggl_7ccl_6gak_5ccl_4ggl_3ggl_2-ocl_1ttk_1gtl2aak3caj4cak5x6 ty6tgk7ggl8qr9s9cak10x11ty11gtl12caj13gcl14x15ty15tak16x17ty17 GTL^ gTGK·^ gGCL^ qGA J £ 2^^ 2 2^^^2 3^^^24^^^2 5 TAK 2 6^^^27^^^2 3·^^·^ 2 9
ACL3 1GZ 3 3 2^2 3 ^GAJ 3 3GCL3 ^GAJ 3 5GAK3 θΧ 3 *7 TY 3 CAJ 3 gGTLg ^GGL^ θ CAJ η
caj54ccl55x56ty56gcl57x58ty58gaj59ggl60qr61s61x62ty62caj63aaj64w65
-9CZ 278883 B6 cz65ggl66atm67gtl68caj68caj70tgk71tgk72acl73qr74s74atm75tgk76qr77 S77X78TY78TAK79CAJ80X80TY81GAJ82AAK83TAK84TGK85AAK86TAG_3 ' kde
| A | znamená | desoxyadenyl, |
| G | znamená | dešoxyguanyl, |
| C | znamená | desocyxytoxyl, |
| T | znamená | thymidyl, |
| J | znamená | A nebo G, |
| K | znamená | T nebo C, |
| L | znamená | A, T, C nebo G, |
| M | znamená | A, C nebo T, |
| Xn | znamená | T nebo C v případě, že Yn znamená A, nebo G a C v případě, že Yn znamená C nebo T, |
| Yn | znamená | A, G, C nebo T v případě, že Xn znamená C, a A, nebo G v případě, že Xn znamená T, |
| Wn | znamená | C nebo A v případě, že Zn znamená G, nebo A, a C v případě, že Xn znamená C nebo T, |
| zn | znamená | A, G, C nebo T v případě, že Wn znamená C, a A nebo G, v případě, že Wn znamená A |
| QRn | znamená | TC v případě, že Sn znamená A, G, C nebo T, a AG v případě, že Sn znamená T nebo C, |
| sn | znamená | A, G, C nebo T v případě, že QRn znamená TC, a T nebo C v případě, že QRn znamená AG a |
| n | znamená | polohu aminokyseliny ve sledu lidského proinzulínu, jíž odpovídá triplet ve sledu nukleotidů podle genetického kódu, přičemž poloha aminokyseliny se čísluje od koncové aminoskupiny, |
s molekulou DNA, získanou štěpením pBR 322 působením restrikčního enzymu Pstl za vzniku plasmidu pcHI-1.
Jak již bylo uvedeno, bylo možno klonovat cDNA se sledem, který je kódem pro lidský preproinzulín a cDNA, která je kódem pro lidský proinzulín. Struktury těchto klonovaných cDNA byly ověřeny analýzou sledu nukleotidů.
Původním zdrojem genetického materiálu byl lidský inzulinom, nádor, který produkuje inzulín. Z jeho buněk byla izolována mRNA.
DNA, komplementární k izolované cRNA (cDNA), byla syntetizována při použití reverzní transkriptázy ve dvou reakčních cyklech, takže vznikla cDNA s dvojitým řetězcem. Nerozštěpená heterogenní cDNA s dvojím řetězcem byla pak zpracována tak, že na obou koncích byl získán sled oligonukleotidů k usnadnění včlenění tohoto fragmentu do místa působení stejného restrikčního enzymu ve vektoru pro přenos.
-10CZ 278883 B6
Pro klonování byl zvolen vektor s dobrou selekcí a stálou replikací. Zvolená cDNA byla včleněna do vektoru na předem zvoleném místě za vzniku rekombinantního vektoru běžným způsobem. Pomocí tohoto vektoru byl transformován hostitelský mikroorganismus. Transformanty byly podrobeny selekci podle běžných podmínek pro včlenění na předem stanovené místo. Jednotlivé kolonie, odvozené od jediné transformované buňky, byly odebírány a pěstovány v jednotlivých kulturách za účelem replikace uvedeného rekombinantního vektoru. Tento vektor pak byl sledován pokud jde o zachovaný inzulínový sled hybridizací kolonií. Kolonie, které poskytovaly rekombinantní vektor pro sled inzulínu, byly pěstovány ve větších kulturách, aby bylo možno vektor izolovat a podrobit jej analýze. Příslušné klony byly vybrány pro konečnou identifikaci sledu nukleolitů v klonovém genu pro preproinzulín a proinzulín a pro přenos do příslušných plasmidů, schopných exprese.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby sledu nukleolitů, který je kódem pro lidský proinzulín pro syntézu lidského inzulínu tak, že se hydrolyzuje zakončení 3' sledu desoxynukleotidů, který je kódem pro lidský preproinzulín a pak se provádí replikace způsobem podle vynálezu v několika cyklech, nebo se postupně užije T4 DNA polymerázy k natrávení za přítomnosti desoxynukleotidtrifosfátu, pak se hydrolyzuje zakončení 5' tohoto sledu pomocí nukleázy, specifické pro DNA s jednoduchým řetězcem se zakončením 5 ' .
Vynález se rovněž týká způsobu výroby lidského proinzulínu, jehož řetězce A a B jsou od sebe odděleny C-peptidem, a to tak, že se inkubuje mikroorganismus, transformovaný vektorem s obsahem sledu nukleotidů, který je kódem pro lidský proinzulín za podmínek, vhodných pro expresi tohoto sledu, takto získaný lidský proinzulín se čistí z živného prostředí nebo rozrušených buněk mikroorganismu.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby lidského inzulínu, a to tak, že se oxidují sulfhydrylové skupiny peptidů A a B lidského proinzulínu, připraveného svrchu uvedeným způsobem za vzniku disulfidové vazby mezi peptidy A__a B a pak se odštěpí C-peptid enzymaticky katalyzovanou hydrolýzou, specifickou pro vazby, které připojují C-peptid k peptidům A a B.
Předmětem vynálezu jsou tedy základní genetické prvky, jichž je zapotřebí k výrobě lidského inzulínu způsobem, který je možno přizpůsobit pro průmyslové účely. Je možno klonovat přirozeně se vyskytující strukturální geny a dosáhnout jejich exprese ve vhodné hostitelské buňce, čímž se získá bílkovina, kterou je možno převést na inzulín známými způsoby. Způsob podle vynálezu je založen na molekule proinzulínu a jeho výhoda spočívá v tom, že C-peptidová oblast proinzulínové molekuly způsobuje její samovolné zakřivení, takže řetězce A a B se dostávají do správné vzájemné polohy. Při této konfiguraci je předem zajištěno správné spojení sulfhydrylových skupin a tvorba bisulfidových příčných vazeb, tak jak je tomu v molekule účinného inzulínu. Odštěpení C-peptidu se provádí použitím trypsinu nebo enzymu s podobným účinkem společně s karboxypeptidázou B nebo katepsinem B pro odstranění C-terminálního albuminu na řetězci B, jak je známo z literatury.
-11CZ 278883 B6
Tímto způsobem je možno klonovat celou část genu pro lidský inzulín, která je kódem pro inzulín včetně části nepřenesené oblasti 5' prepeptidu. Je také možno klonovat kód pro sled B, C a A a pro nepřenesenou oblast 3'. Volba hostitelské buňky ovlivní také volbu části klonovaného genu. Celý kód pro preinzulín je možno použít k transformaci některých typů vyšších eukaryotických buněk, protože předběžný sled působí jako samostatný peptid a usnadňuje vylučování peptidu z buňky. Mimoto ty eukaryotické buňky, které jsou schopny produkovat signální peptid, budou také katalyzovat specifické odstraňování předběžného sledu při průchodu bílkoviny, buněčnou membránou. Tyto buňky budou také schopny trvale produkovat tento produkt i po odštěpení C-bílkoviny a vzniku správných disulfidových vazeb.
Při použití prokaryotických hostitelských buněk se dává přednost použití kódu pro proinzulín. Přeměna proinzulínu na inzulín se pak provádí známým způsobem. Jsou známy dva typy exprese, z nichž každý spočívá v tom, že se včlení kód pro proinzulín do oblasti vektoru, jehož exprese se řídí prokaryotickým promotorem. V některých případech dochází ke změně polohy části prokaryotického strukturálního genu a promotoru, takže výsledný produkt je bílkovina, jejíž N-terminální část sestává z N-terminální části prokaryotické bílkoviny a C-terminální částí je klonovaný sled, v tomto případě proinzulín. Exprese proinzulínu jako lidské bílkoviny má tu výhodu, že složená bílkovina je daleko stálejší v hostitelské buňce než vlastní proinzulín. Mimoto v případě, že prokaryotickou bílkovinou je bílkovina, která je běžně vylučována hostitelskou buňkou, může být složená bílkovina rovněž vylučována, čímž je snadnější čištění výsledného produktu. Užití složení bílkovin má tu nevýhodu, že je nutné je specificky štěpit k získání požadovaného produktu. V případě proinzulínu je možno použít zvláštní techniky, která využívá výhody sledu aminokyselin v bílkovině, takže je možno složenou bílkovinu specificky štěpit, jak bude popsáno v příkladu 2.
Klonovaný sled je možno rovněž podrobit expresi přímo v prokaryotické buňce tak, že se sled včlení v bezprostřední blízkosti promotoru. Výhodou tohoto postupu je, že specifické štěpení odpadá. Zásadní nevýhodou je však skutečnost, že výsledný produkt je nutno dále čistit.
Exprese lidských genů, včleněných do Excherichia coli, je možno v současné době dosáhnout včleněním v blízkosti promotorů lac, trp a promotoru pro β-laktamázu. Promotor lac je výhodný z toho důvodu, že jeho genetika je velmi dobře charakterizována. Jsou dvě možná místa včlenění, přičemž se dosahuje dlouhé a krátké prokaryotické části složené bílkoviny. Je možno získat velké množství genetických variant s různou úrovní endogenních represorů v závislosti na teplotě a podobně. Promotor trp má tu výhodu, že při jeho použití je možno dosáhnout vysoké úrovně exprese. Plasmidy, které mají místo včlenění v promotoru trp, je možno získat pro všechny tři způsoby odečítání. Promotor pro β-laktamázu poskytuje prokaryotickou signální bílkovinu, protože laktamáza je běžně vylučována. Výsledná složená bílkovina je rovněž vylučována, nebo je možno ji prokázat v periplasmatickém prostoru. V důsledku toho není zapotřebí většího čištění k získání čistého proinzulínu.
-12CZ 278883 B6
Způsob podle vynálezu využívá funkce C-peptidu proinzulínu zejména k usnadnění samovolného zakřivení molekuly proinzulínu tak, že se řetězce A a B dostávají do správné konfigurace a je pak možno dosáhnout tvorby správných příčných disulfidových vazeb, tak jak je tomu v přírodním inzulínu. Srovnání C-peptidů různých druhů ukazuje, že tento peptid není důsledně zachováván v průběhu vývoje. Z tohoto důvodu je možné různé aminokyseliny v tomto sledu nahradit jinými. Funkci tohoto peptidu je zřejmě pouze vznik řetězce aminokyselin správné délky tak, aby bylo dosaženo správné vzájemné polohy řetězců A a Β. V důsledku toho pravděpodobně by bylo možno včlenit na místo tohoto peptidu jakýkoliv jiný sled, aniž by došlo k podstatné změně jeho funkce. Použití přírodního C-peptidu však má určité výhody, například tu, že není zapotřebí úplně odstranit tento peptid z výsledného inzulínu, protože jde o přírodní složku inzulínových přípravků. Mimoto může tento peptid poskytovat určité výhody při štěpení enzymy.
Způsob podle vynálezu dále prokazuje univerzalitu genetického kódu. Kodony, kterým dávají přednost buňky savců, jsou velmi správně reprodukovány Escherichia coli. V některých případech je možno některé kodony, které jsou kódem pro tutéž aminokyselinu, nahradit bez ovlivnění sledu nebo funkce výsledné bílkoviny. Z toho vyplývá, že způsob podle vynálezu zahrnuje i všechny syntetické variace kódu, pokud je výsledkem lidský preproinzulín a lidský proinzulín.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
Klonovaný gen pro lidský preproinzulín
Lidský gen pro inzulín byl klonován z RNA, izolované z lidského inzulinomu způsobem podle svrchu uvedené Ullrichovy publikace pro izolaci RNA buněk ostrůvku. RNA, získaná po odstředění v 5,7 M CsCl s obsahem 100 mM EDTA, byla použita bez další frakcionace jako předloha pro syntézu cDNA při použití reverzní transkriptáty a S1 nukleázy, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené Ullrichově publikaci. Ze 130 mM nefrakcionované RNA bylo připraveno přibližně 40 ng cDNA s dvojitým řetězcem.
Nefrakciovaná cDNA byla zpracovávána působením terminální transferázy za přítomnosti dCTP za vzniku oligo-C zakončení na konci 3' molekuly cDNA. Podobně byl rozštěpen jako vektor plasmid pBR322 působením restrikční endonukleázy Pst I a byl zpracováván působením terminální transferázy za přítomnosti dGTP za vzniku oligo-dG zakončení na zakončení 3' lineární plasmidové DNA. DNA plasmidů po tomto zpracování nemůže vytvořit kruhovou DNA, protože zakončení nejsou komplementární. Zakončení oligo-dV zpracované cDNA však jsou komplementární se zakončením oligo-dG plasmidů a je tedy možno ji užít ke vzniku cirkulárního plasmidů, v jehož místě působení enzymu Pst I je včleněna cDNA. Mimoto tímto včleněním se regenerují obě zakončení míst pro působení Pst I a je tedy možno opět odštěpit včleněný sled, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikace Villa-Komarroffa a další.
-13CZ 278883 B6
Svrchu uvedený postup byl užit k získání plasmidu pBR322 s heterogenní skladbou cDNA v místě působení Pst I. Tyto plasmidy mohou být citlivé na ampicilin, protože místo pro působení enzymu se nachází v genu pro β-laktamázu, avšak zůstávají odolné proti tetracyklinu. Získaným materiálem byla transformována Escherichia coli kmen X1776. Bylo získáno 525 transformátů, odolných proti tetracyklinu. Tyto transformanty byly podrobeny replikaci a sledovány in šitu hybridizací kolonií na správný sled nukleotidů způsobem podle publikace Gruenstein a Hogness, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 7.2, 3961 (1975). Dříve klonované cDNA pro krysí preproinzulín podle svrchu uvedené Ullrichovi publikace bylo užito jako srovnání při hybridizací, přičemž tento materiál byl označen použitím DNA polymerázy I. Protože sled aminokyselin v lidském a krysím inzulínu je velmi podobný, inzulín je homologní na 92 % a proinzulín na 83 %, bylo předpokládáno, že dojde ke zkřížené hybridizací cDNA krysího původu se sledem pro lidský inzulín za daných podmínek. Autoradiografií bylo prokázáno, že pouze dvě z 525 kolonií obsahovaly materiál z této zkřížené hybridizace. Obě tyto kolonie byly citlivé na ampicilin. Plasmidy, izolované z kolonií, byly přibližně o 250 a 500 párů bází delší než vlastní pBR322. Delší plasmid byl označen pcHI-1.
Sled nukleotidů ve včleněném fragmentu cDNA plasmidu pcHI-1 byl stanoven způsobem, popsaným v publikaci Maxam a Gilbert, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977). Na obr. 1 je znázorněn schematický diagram včleněné části. Včleněná část obsahovala celý kód pro lidský preproinzulín spolu s částí 5'-nepřenesené oblasti, celou 3'-nepřenesenou oblast a část oblasti 3'-póly dA. Na obrázku 1 jsou rovněž znázorněna místa působení restrikčních enzymů, která umožňují odštěpení včleněné části. Je znázorněn rovněž směr sledu každého fragmentu.
Na obr. 2 je znázorněn sled mRNA, odvozený od sledu cDNA a sled aminokyselin, vyvozený na základě odečtení těchto sledů. Primární struktura lidského proinzulínu, stanovená tímto způsobem, přesně souhlasí se strukturou, získanou předchozím zjišťováním sledu aminokyselin, který byl popsán v publikaci M. D. Deyhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, £ Supp. 2, str. 127 až 130 (1976) a Suppl. 3, str. 150 až 151 (1978). Aminokyseliny proinzulínového sledu jsou číslovány 1 až 86, předběžného sledu -24 až -1. Na obr. 2 jsou rovněž znázorněna místa pro působení různých restrikčních enzymů pro konstrukci genu proinzulínu z pcHI-1. Je zřejmé, že sled cDNA v řetězci, získaném z pcHI-1, je týž jako v obr. 2 s tím rozdílem, že se místo uracilu U užije thyminu T.
Velká množství pcHI-1 a dalších plasmidů je možno získat transformací Escherichia coli HB-101. Kmen HB-101 je tedy výhodným hostitelem pro udržování a replikaci plasmidů, které mají svrchu popsané včleněné části.
Příklad 2
Získání vektoru pro přenos proinzulínu
Včleněná cDNA v plasmidu pcHI-1 obsahuje celý sled, který je kódem pro lidský preproinzulín. V některých případech, například
-14CZ 278883 B6 při přenosu do jiného druhu eukaryotických buněk, je možno očekávat, že bude odstraněn předběžný sled a C-peptid a tím se získá správná konfigurace účinného inzulínu. V jiných případech, jakým je například přenos do prokaryotických buněk jako bakterii může dojít k tomu, že produktem je neaktivní bílkovina. V tomto případě by byla výhodná konstrukce kódu pro proinzulín, protože proinzulín je možno snadno převést in vitro na činný inzulín známým způsobem, například způsobem podle publikace Kemmler W. a další, J. Biol. Chem. 242, 6786 (1971). Zásadně jsou zatím možné tři způsoby pro konstrukci sledu, který je kódem pro proinzulín. Vektor, který obsahuje pBR322 s včleněným uvedeným sledem se označuje pcHP-1.
A. Chemicky syntetizovaný sled, který je kódem pro řetězec B lidského inzulínu, byl popsán v publikaci Crea R. a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Syntetický sled nukleotidů se poněkud lisí od přírodně se vyskytujícího sledu, protože syntetický sled byl volen tak, aby byly zařazeny kodony, jejichž přítomnost je příznivější pro prokaryotického nositele, například Escherichia coli. Před první aminokyselinou, kterou je fenylalanin, byl také zařazen triplet, který je kódem pro methionin. Oba sledy jsou totožné, pokud jde o sled aminokyselin 13 až 14, tato oblast obsahuje pouze místo pro působení restrikčniho enzymu Alu I, které je společné oběma sledům. Umístění tohoto místa v přírodním sledu je znázorněno na obr. 2.
Syntetická DNA proinzulínu se zpracovává endonukleázou Alu I, čímž se získají dva fragmenty o 43 párech bází a 56 párech bází. Rovněž cDNA, včleněná do pcHI-1, s výhodou získaná štěpením enzymem Hha I, jak je popsáno v příkladu 2B, se štěpí částečnou hydrolýzou, katalyzovanou endonukleázou Alu I za vzniku fragmentů o 75, 90, 110, 135, 165, 200, 245, 275, 375 a 455 párech bází. Frakcionací elektroforézou na gelu se získá fragment o 375 párech bází, který vznikne štěpením v jediném místě, a to kodonu pro aminokyselinu 14.
Fragmenty, získané štěpením syntetického genu a fragment cDNA po 375 párech bází se spolu spojí. Správné spojení syntetického fragmentu o 46 párech bází s fragmentem o 375 párech bází na co nejvyšší míru se dosáhne tak, že se fragment cDNA o 375 párech bází užije v molárním přebytku. Možnost nesprávného spojení se rovněž sníží skutečností, že syntetické fragmenty mají zakončení s j,ediným řetězcem, která nejsou komplementární se zakončeními fragmentu cDNA o 375 párech bází.
Spojením vznikne syntetický sled, který obsahuje kód pro methionin, následovaný aminokyselinami 1 až 13 a přírodní sled, který je kódem pro aminokyseliny 14 až 86 pro proinzulín. Takto syntetozovaný sled, který je kódem pro proinzulín, je možno včlenit do jakéhokoli zvoleného plasmidu vyplněním nebo rozštěpením jednoduchých zakončení a následným spojením pomocí oligonukleotidů.
Expresí se získá složená bílkovina, kterou je možno rozštěpit na zbytku s obsahem methioninu působením bromkyanu za vzniku proinzulínu. Proinzulín se převede na inzulín způsobem, který je popsán ve svrchu uvedené publikaci Kemmlera a dalších.
-15CZ 278883 B6
B. Na obr. 2 je znázorněna cDNA, včleněná do pcHI-1, která má místo pro působení restrikčního enzymu Hha I ve sledu, který je kódem pro aminokyseliny 14 až 13. Mimoto vektor pBR322 pro přenos má místo pro štěpení toutéž endonukleázou ve vzdálenosti 22 páru bází od místa pro působení Pst I při zakončení 5' včleněné části. Je tedy možno znovu izolovat sled, který obsahuje celý proinzulínový sled ve vzdálenosti 22 párů bází od DNA pBR322 tak, že se působí na pcHI-1 endonukleázou Hha I. Tento způsob je výhodnější, než zpětné izolování včleněné části působením endonukleázy Pst I, protože uvedená část obsahuje uvnitř dvě místa pro působení enzymu Pst I a výtěžek neporušené včleněné části při použití Pst I je z tohoto důvodu velmi nízký. Sled, izolovaný působením Hha I, se rovněž hodí pro použití přikladu 2A a 2C.
V případě, že se na kterýkoliv z izolátů působí endonukleázou Hha I, odštěpí se přebytečný řetězec mezi aminokyselinami 14 až 13 předběžného sledu. Tento řetězec je definován jako řetězec, jehož sled nukleotidů odpovídá sledu mRNA. Řetězec, označený zápornými čísly, je řetězec, jehož sled je komplementární ke sledu mRNA. Zbývající předběžný sled je možno specificky odstranit tak, že se využije exonukleázové účinnosti T4 DNA polymerády vzhledem k zakončení 31 až 5' , protože tento enzym působí v záporně označeném řetězci předběžného sledu a na opačné straně kladně značeného řetězce. Exonukleolytickou reakci je možno zastavit u předem definovaného nukleotidu tak, že se do reakční směsi přidá tentýž nukleotid ve formě trifosfátu. Exonukleolytická účinnost je pak zastavena způsobem, který je popsán v publikaci Englund P. T. v J. Biol. Chem. 246, 3269 (1971) a v J. Mol. Biol. 66, 209 (1972).
Zbývající předmětný sled je možno specificky štěpit až do N-terminálního fenylalaninového kodonu aminokyseliny č. 1 třemi cykly působením T4 polymerázy. První cyklus se provádí za přítomnosti TTP, který ukončí štěpení proti A glycinového kodonu v poloze aminokyseliny -7. Cyklus 2 se provádí za přítomnosti dCTP, tímto způsobem se ukončí štěpení proti G v poloze kodonu -5 (Asp). Cyklus 3 se provádí za přítomnosti dATP, tímto způsobem se ukončí štěpení proti T, jde o první nukleotid v poloze 1 proinzulínu.
Po každém cyklu štěpení T4 polymerázou je zapotřebí odstranit trifosfát ukončeného cyklu a přidat trifosfát pro další štěpení. Pak se užijí minisloupce Sephadexu G-75 (Pharmacia lne., Uppsala, Švédsko) k odstranění trifosfátu z reakční směsi. Sloupce je možno uvést do rovnovážného stavu vhodným pufrem a vzorky se odebírají v pufru, který obsahuje trifosfát následujícího cyklu. Tímto způsobem je možno dosáhnout toho, že enzym, procházející současně s DNA, nerozštěpí DNA za následujícím zvoleným koncovým bodem. Aby bylo možno zabránit tomuto štěpení v nižší části sloupce po průchodu předcházejícím trifosfátem, provádí se chromatografie v chladnu, obvykle při teplotě 4 ’C a eluce se urychlý odstředěním. Je také možno inaktivovat enzym zahřátím na 65 °C před chromatografií. Následující cyklus pak začíná přidáním čerstvého, účinného enzymu. Výsledkem přímých cyklů štěpení T4 polymerázy se dosáhne toho, že se úplně odštěpí záporně značený řetězec DNA specificky až do prvního kodonu sledu, který je kódem pro proinzulín. Sled kladně značeného řetězce na opačné straně
-16CZ 278883 B6 molekuly, který rovněž má zakončení 3', je takový, že dojde pouze k odstranění několika málo nukleotidů.
Kladně značený řetězec v místě předběžného sledu se pak specificky štěpí exonukleázou Sl, která působí na zakončení s jediným řetězcem. Je nutno dbát toho, aby nedošlo k částečnému štěpení touto nukleázou za počátkem prvního kodonu. K tomuto štěpení může dojít vzhledem ke šnekovité struktuře nepárového řetězce DNA. K tomuto rozštěpení může dojít zvláště v oblastech, které jsou bohaté na A-T na koncích molekul DNA.Přechodně nepárová část na kodonu č. 1, bohatém na A-T, by mohla způsobit štěpení nukleázou Sl za místem, za nímž již nemá ke štěpení dojít. Tomu je možno zabránit nízkou teplotou, například teplotou místnosti a nižší a tím, že prostředí obsahuje větší množství solí, než se běžně užívá v pufru.
Vzorky DNA, získané v následujících stupních štěpení Sl, se klonují ve vhodném vektoru pro přenos známým způsobem. Analýza sledu nejmenšího fragmentu po štěpení enzymem Alu I v těchto klonech se užije ke kontrole klonů, které obsahují kód pro proinzulín a celý předběžný sled je odstraněn.
Velmi přitažlivým způsobem pro klonování cDNA, která je kódem pro proinzulín, je způsob, při němž se včlení zakončení oligo-A při použití terminální transferázy na zakončení 3' cDNA. Zakončéní oligo-T se vytvoří na zakončení 3' na vhodném místě vektoru pro přenos, například v místě pro působení EcoRl v genu v genu pro β-galaktosidázu plasmidu pTS-1, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené Ullrichově publikaci a US patentu č. 933 035. Včlenění cDNA, která je kódem pro proinzulín, svrchu uvedeným způsobem poskytuje správně orientovaný včleněný sled, který bude odečten ve správné fázi vzhledem ke genu pro β-galaktosidázu plasmidu s pravděpodobností 1:6. Exprese zakončení oligo-A má za následek včlenění lysinu těsně před počátek sledu pro proinzulín. Mírné štěpení trypsinem ve složené bílkovině vede ke získání proinzulínu, který se převádí na účinný inzulín, jak bylo dříve popsáno. Je také možno postupovat tak, že se působí na složenou bílkovinu kombinací trypsinu karboxypeptidázy B enbo kathepsinu B za vzniku účinného inzulínu ze složené bílkoviny v jediném reakčním stupni.
C. Sled, který je kódem pro proinzulín, se získá selektivním štěpením uvnitř sledu, který je kódem pro proinzulín, s následným navázáním chemicky syntetizovaného kódu pro tuto část proinzulínu, která byla odstraněna předchozím štěpením. Jako zdroj oblasti, která je kódem pro proinzulín, se užije plasmid pcHI-1, který se selektivně štěpí působením endonukleázy Pst I, nebo s výhodou působením endonukleázy Hha I, jak je popsáno v příkladu 2B.
Kterýkoliv z fragmentů se po izolaci štěpí alkalickou fosfatázou k odstranění 5' terminálních fosfátových skupin a pak se provádí štěpení restrikčních endonukleázou, která má jediné místo štěpení ve sledu, který je kódem pro proinzulín. Místo pro působení tohoto restrikčního enzymu je s výhodou uloženo v blízkosti některého zakončení sledu, který je kódem pro proinzulín. Místo pro působení enzymu Alu I v oblasti aminokyselin 13 až 14 je vhodným místem pro tento účel, jak je znázorněno na obr. 2. Fragment po působení Hha I plasmidu pcHI-1 se částečně rozštěpí endo-17CZ 278883 B6 nukleázou Alu I za vzniku dvou fragmentů o přibližně 76 párech bází a 375 párech bází. Tyto fragmenty se podrobí frakcionaci elektroforézou na gelu, jak je popsáno v příkladu 2B a izoluje se fragment o 375 párech bází.
Sled nukleotidů, který je kódem pro prvních 13 aminokyselin proinzulínu se zakončením 5' G na kladně označeném řetězci k doplnění kodonu pro alanin v poloze 14, se syntetizuje fosfotriesterovou metodou, která byla popsána v publikacích Itakura, K. a další, J. Biol. Chem. 250, 4592 (1975) a Itakura K., a další, J. Am. Chem. Soc. 97,. 7327 (1975). Kladně značený řetězec syntetické DNA má sled
3'-TTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAG-5' který odpovídá přírodnímu sledu. Je však možné syntetizovat jiné sledy, které jsou rovněž kódem pro tytéž aminokyseliny. Jeden ze sledů je možno vyjádřit
3'-TTKGTLAAKCAJCAKXTYTGKGGLQRSCAKXTYGTLCAJG-5'
Výsledný sled se naváže na fragment o 375 párech bází, vzniklý štěpením Hha I fragmentu pcHI-1. Protože uvedený fragment má 5' fosfát na zakončení, které má být spojeno, budou oba fragmenty spojeny ve správném pořadí. Syntetický fragment je správně navázán na větší fragment přibližně v 50 % reakcí.
DNA po působeni ligázy se pak klonuje na vhodný plasmid bud’ vznikem zakončení oligo-A, jak bylo popsáno v příkladu 2B, nebo vazbou krátkých včleněných částí, usnadňujících vazbu a včlenění do plasmidů ve správném směru. V případě zakončení oligo-A je možno pozorovat expresi proinzulínu přibližně v 1/12 klonů.
V případě přímého včlenění tam, kde je známo, že způsob včlenění byl správný, je možno pozorovat expresi přibližně v 50 % klonů.
Příklad 3
Exprese lidského preproinzulínu a proinzulínu
Klonované kódy pro preproinzulín z příkladu 1 nebo proinzulín z příkladu 2 se včlení do vektoru za účelem exprese. V případě, že ke včlenění dojde ve správné orientaci vzhledem k počátku translace v místě včlenění a včleněná část se nachází ve správné fázi vzhledem k promotoru a k ribozomu, syntetizuje se bílkovina, která je produktem klonovaného genu aktivní metabolizujícími buňkami hostitele, které byly transformovány vektorem. Bílkovinným produktem je složená bílkovina v případě, že vektor obsahuje část prokaryotického genu mezi promotorem a místem včlenění. Včlenění je však možno provést také v bezprostředním sousedství promotoru.
V těchto případech dochází přímo k produkci bílkoviny, pro níž je kódem včlenění sled. Oba tyto způsoby mají výhody i nevýhody. Složené bílkoviny mají tu výhodu, že dochází ke stabilizaci cizorodé bílkoviny, pro níž je kódem včlenění gen. Mimoto má složená bílkovina další požadované funkční vlastnosti, například snadné vyměšování z buňky hostitele jako druhé části složené bílkoviny, například β-laktamázy. Na druhé straně je čištění sledu v tomto případě komplikované, protože je obvykle nutno odstranit tu část
-18CZ 278883 B6 složené bílkoviny, která pochází z hostitelské buňky. Toto odstranění je možno provést známými způsoby, popsanými v příkladu 2A a 2B. Přímá syntéza požadované bílkoviny vylučuje nutnost specifického štěpení, ale obvykle také brání vylučování z buňky hostitele.
Plasmidy pro expresi byly vyvinuty všude tam, kde exprese je řízena lac promotorem, jak bylo popsáno v publikacích Itakura a další, Science 198, 1056 (1977), Ullrich A. a další, Excerpta Medica, (1979), trp promotorem, jak bylo popsáno v publikacích Martial a další, Science 205, 602 (1979) a promotorem pro β-laktamázu.
Expresi je možno prokázat měřením produktu, který má schopnost imunochemické vazby s protilátkami proti inzulínu nebo s protilátkami proti proinzulínu. Užívá se radioimunologických zkoušek, při nichž je protilátka radioaktivně značena a komplex antigenu a protilátky se sráží preparátem Staphylococcus aureus C, který byl usmrcen teplem, jak bylo popsáno v publikacích Morgan a Lazarow, Diabetes 12., 115 (1963) a Kessler, S, W. , J. . Immunol., 115, 1617 (1975). K detekci exprese v bakteriálních koloniích bylo rovněž užito radioimunologických zkoušek, popsaných v publikacích Erlich, J. A. a další, Cell 10., 681 (1978) a Broom S. a Gilbert W. , Proč. Nat. Acad. Sci. USA 75, 2746 (1978).
Složené bílkoviny, které jsou průkazem exprese, je možno prokázat srovnáním molekulové hmotnosti hostitelské bílkoviny na N-terminálni části složené bílkoviny v hostitelských buňkách, transformovaných plasmidy s včleněnou částí a bez této včleněné části. Výhodným způsobem je použít jako hostitele Escherichia coli kmen P678-54, který se vyznačuje minibuňkami. Radioaktivně značené aminokyseliny se včlení do bílkovin těchto buněk, takže je možno srovnat kmeny, transformované vektorem s včleněným sledem, který je kódem pro proinzulín a bez tohoto včleněného sledu. Získané bílkoviny se frakcionují elektroforézou na SDS-akryl-amidovém genu a poloha bílkovin se zjistuje autoradiograficky. Exprese proinzulínu se prokazuje přítomností značené bílkoviny, kterou je možno prokázat pouze v buňkách, transformovaných plasmidem s včleněným genem pro proinzulín. poloha elektroforetického pásu je mírou molekulové hmotnosti bílkoviny, k jejíž expresi dochází, a je v souhlasu se známou délkou včleněného genu a s délkou N-terminální prokaryotické části.
Odstranění prokaryotické části a přeměna proinzulínu na inzulín in vitro se provádí známým způsobem, jak bylo svrchu podrobně uvedeno.
Claims (1)
- PATENTOVÉ NÁROKYZpůsob výroby vektoru pro přenos DNA pro použití při udržování a replikaci sledu desoxynukleotidů, který je kódem pro lidský preproinzulín nebo proinzulín, vyznačující se tím, že se uvede do reakce desoxynukleotidový sled, který je kódem pro lidský proinzulín nebo preproinzulín s obsahem kladně značeného řetězce se sledy:CAJg 3 AAJg 4 Wg 5GZ g gGGLg g ATMg ?GTLg gGAJg gCAJ·? qTGK? jTGKy gACL-y 3QR7 4 S? 4 ATM75TGK7gQR77S77X78TY78TAK79CAJ80X81TY81GAJ82AAK83TAK84TGK85 AAKggTAG-3' kde
A G znamená desoxyadenyl, znamená desoxyguanyl, C znamená desoxycytoxyl, T znamená thymidyl, J znamená A nebo G, K znamená T nebo C, L znamená A, T, C nebo G, M znamená A, C nebo T, xn znamená T nebo C v případě, že Yn znamená A, nebo G a C v případě, že Yn znamená C nebo T,Yn znamená A, G, C nebo T v případě, že Xn znamená C, a A, nebo G v případě, že Xn znamená T,Wn znamená C nebo A v případě, ze Zn znamená G nebo A, a C v případě, že Xn znamená C nebo T,Zn znamená A, G, C nebo T v případě, že Wn znamená C, a A nebo G, v případě, že Wn znamená A-20CZ 278883 B6QRn znamená TC v případě, že Sn znamená A, G, C nebo T, a AG v případě, že Sn znamená T nebo C,Sn znamená A, G, C nebo T v případě, že QRn znamená TC, a T nebo C v případě, že QRn znamená AG a n znamená polohu aminokyseliny ve sledu lidského proinzulínu, jíž odpovídá triplet ve sledu nukleotidů podle genetického kódu, přičemž poloha aminokyseliny se čísluje od koncové aminoskupiny, s molekulou DNA, získanou štěpením pBR 322 působením restrikčního enzymu Pstl za vzniku plasmidů pcHI-1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7519279A | 1979-09-12 | 1979-09-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ621580A3 CZ621580A3 (en) | 1994-03-16 |
| CZ278883B6 true CZ278883B6 (en) | 1994-08-17 |
Family
ID=22124154
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS806215A CZ278883B6 (en) | 1979-09-12 | 1980-09-12 | Process for preparing a vector for dna transfer |
| CS845488A CZ548884A3 (en) | 1979-09-12 | 1984-07-16 | Process for preparing human proinsulin |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS845488A CZ548884A3 (en) | 1979-09-12 | 1984-07-16 | Process for preparing human proinsulin |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0026598A1 (cs) |
| JP (1) | JP2637393B2 (cs) |
| KR (1) | KR870000501B1 (cs) |
| AT (1) | AT377003B (cs) |
| AU (1) | AU538154B2 (cs) |
| BE (1) | BE885196A (cs) |
| BG (2) | BG41136A3 (cs) |
| CA (1) | CA1180289A (cs) |
| CZ (2) | CZ278883B6 (cs) |
| DD (3) | DD201693A5 (cs) |
| DK (1) | DK385980A (cs) |
| ES (3) | ES495030A0 (cs) |
| FI (1) | FI802837A7 (cs) |
| FR (1) | FR2464997B1 (cs) |
| GR (1) | GR70279B (cs) |
| IE (1) | IE52781B1 (cs) |
| IL (1) | IL61041A (cs) |
| IT (1) | IT1129250B (cs) |
| LU (1) | LU82757A1 (cs) |
| NZ (1) | NZ194786A (cs) |
| PH (1) | PH26475A (cs) |
| PL (1) | PL226725A1 (cs) |
| PT (1) | PT71790B (cs) |
| RO (1) | RO80005A (cs) |
| SK (1) | SK621580A3 (cs) |
| SU (1) | SU1491345A3 (cs) |
| YU (1) | YU233480A (cs) |
| ZA (1) | ZA805341B (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| DE3001928A1 (de) * | 1980-01-19 | 1981-08-06 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus |
| US4249952A (en) * | 1980-03-03 | 1981-02-10 | Pennsylvania Engineering Corporation | Method for producing cement clinker from cement kiln waste dust |
| AU545912B2 (en) * | 1980-03-10 | 1985-08-08 | Cetus Corporation | Cloned heterologous jive products in bacillies |
| US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| NZ199391A (en) * | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| ZA824218B (en) | 1981-06-29 | 1983-04-27 | Cetus Corp | Plasmid for producing human insulin |
| FI834213A0 (fi) * | 1982-03-31 | 1983-11-17 | Genetics Inst | Framstaellning av dna-sekvenser kodande foer prekursoren av modifierat proinsulin |
| NZ206534A (en) * | 1982-12-13 | 1988-05-30 | Florey Howard Inst | Molecular cloning and characterisation of gene sequence coding for human relaxin |
| US5023321A (en) * | 1982-12-13 | 1991-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology & Medicine | Molecular cloning and characterization of a further gene sequence coding for human relaxin |
| IL71991A (en) | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| ES2090006T3 (es) * | 1986-05-20 | 1996-10-16 | Gen Hospital Corp | Evaluacion de la expresion de preproinsulina, proinsulina o insulina. |
| EP0907746B1 (en) | 1996-04-05 | 2008-02-20 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
| AUPP655698A0 (en) * | 1998-10-16 | 1998-11-05 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Delivery system for porcine somatotropin |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ187300A (en) * | 1977-05-27 | 1982-08-17 | Univ California | Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism |
| IE47889B1 (en) * | 1977-11-08 | 1984-07-11 | Genentech Inc | Synthetic dna and process tehrefor |
| GB2007676B (en) * | 1977-11-08 | 1982-09-08 | Genentech Inc | Method and means for microbial polypeptide expression |
| US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| FI792481A7 (fi) * | 1978-08-11 | 1981-01-01 | The Regents Of The Univ Of | Enkaroyyttisen proteiinin synteesi mikro-organismia käyttäen. |
-
1980
- 1980-08-25 GR GR62740A patent/GR70279B/el unknown
- 1980-08-27 NZ NZ194786A patent/NZ194786A/en unknown
- 1980-08-28 ZA ZA00805341A patent/ZA805341B/xx unknown
- 1980-09-09 FR FR8019399A patent/FR2464997B1/fr not_active Expired
- 1980-09-10 FI FI802837A patent/FI802837A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1980-09-10 PT PT71790A patent/PT71790B/pt unknown
- 1980-09-10 IL IL61041A patent/IL61041A/xx not_active IP Right Cessation
- 1980-09-10 LU LU82757A patent/LU82757A1/fr unknown
- 1980-09-11 IT IT68405/80A patent/IT1129250B/it active
- 1980-09-11 DK DK385980A patent/DK385980A/da not_active Application Discontinuation
- 1980-09-11 CA CA000360565A patent/CA1180289A/en not_active Expired
- 1980-09-11 PH PH24566A patent/PH26475A/en unknown
- 1980-09-11 EP EP80303195A patent/EP0026598A1/en not_active Ceased
- 1980-09-11 AT AT0458580A patent/AT377003B/de not_active IP Right Cessation
- 1980-09-11 SU SU802994154A patent/SU1491345A3/ru active
- 1980-09-11 BE BE0/202074A patent/BE885196A/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-09-11 AU AU62324/80A patent/AU538154B2/en not_active Expired
- 1980-09-12 PL PL22672580A patent/PL226725A1/xx unknown
- 1980-09-12 DD DD80238569A patent/DD201693A5/de unknown
- 1980-09-12 DD DD80223873A patent/DD155004A5/de unknown
- 1980-09-12 ES ES495030A patent/ES495030A0/es active Granted
- 1980-09-12 JP JP55127043A patent/JP2637393B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1980-09-12 KR KR1019800003590A patent/KR870000501B1/ko not_active Expired
- 1980-09-12 BG BG049043A patent/BG41136A3/xx unknown
- 1980-09-12 BG BG057337A patent/BG41137A3/xx unknown
- 1980-09-12 IE IE1912/80A patent/IE52781B1/en unknown
- 1980-09-12 DD DD80238563A patent/DD208989A5/de unknown
- 1980-09-12 YU YU02334/80A patent/YU233480A/xx unknown
- 1980-09-12 CZ CS806215A patent/CZ278883B6/cs unknown
- 1980-09-12 SK SK6215-80A patent/SK621580A3/sk unknown
- 1980-09-12 RO RO80102151A patent/RO80005A/ro unknown
-
1981
- 1981-06-30 ES ES503568A patent/ES8300857A1/es not_active Expired
- 1981-06-30 ES ES503567A patent/ES8305420A1/es not_active Expired
-
1984
- 1984-07-16 CZ CS845488A patent/CZ548884A3/cs unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4431740A (en) | DNA Transfer vector and transformed microorganism containing human proinsulin and pre-proinsulin genes | |
| JP2694840B2 (ja) | ポリペプチドを微生物により発現させる方法 | |
| CA2033176C (en) | Growth hormone fusion proteins | |
| US4366246A (en) | Method for microbial polypeptide expression | |
| US4431739A (en) | Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein | |
| CS219257B2 (en) | Method of making the eukaryotic protein | |
| JPH0657154B2 (ja) | 所望のポリペプチドを発現させるためのクローニングビーイクル | |
| EP0020147B2 (en) | A dna transfer vector for human pre-growth hormone, a microorganism transformed thereby, and a method of cloning therefor | |
| CS250655B2 (en) | Method of microorganisme's viable culture's cultivation with means content for asexual regeneration | |
| JP2533470B2 (ja) | 豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法 | |
| CZ278883B6 (en) | Process for preparing a vector for dna transfer | |
| CZ280822B6 (cs) | Rekombinantní plasmid, způsob jeho přípravy a bakterie jím transformované | |
| US5254463A (en) | Method for expression of bovine growth hormone | |
| EP0046669B1 (en) | Somatostatin or somatostatin precursors | |
| WO1990001542A1 (en) | Luciferase, luciferase-coding gene, and process for preparing luciferase | |
| EP0300459A2 (en) | Human pancreatic secretory trypsin inhibitor | |
| IE57976B1 (en) | Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives | |
| CA1302321C (en) | Preparation of polypeptides | |
| HK1044566A1 (zh) | 胰羧肽酶原b、其同工型和突變蛋白的製備及應用 | |
| EP0192743A1 (en) | Modified insulin precursors products and processes | |
| JPH02257883A (ja) | シグナルペプチド、ｄｎａ配列、ベクター、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法 | |
| Wengenmayer | Synthesis of peptide hormones using Recombinant DNA techniques | |
| KR840002107B1 (ko) | 재조합 미생물 클로닝 베히클로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법 | |
| AU633099B2 (en) | Growth hormone fusion proteins | |
| CA1200774A (en) | Expression linkers |