CZ548884A3 - Process for preparing human proinsulin - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby lidského proinzulínu pomoci izolovaného a čištěného (dále klonovaného) lidského genu, který je kódem pro proinzulín a pro preproinzulín, a způsobu výroby a přenosu genu a jeho replikace v mikroorganismu. Klonované geny podléhají v hostitelském mikroorganismu expresi v případě, že jsou vázány na exprese schopný prokaryotický gen. Oba svrchu uvedené geny je možno užit k výrobě lidského inzulínu pro léčebně účely.

Dosavadní stav techniky

Inzulín je hormon, který je produkován především buňkami B slinivky břišní. Je známo Široké použiti této látky v případě cukrovky. Přestože se na jatkách odebírají slinivky břišní skotu a

- vepřům jakožto zdroj inzulínu, je nedostatek tohoto hormonu, protože šoupá na celém světě počet nemocných cukrovkou. Kromě toho někteří tito nemocní trpí alergií na inzulín skotu a vepřů, takže je velmi žádoucí získat lidský inzulín v množství, které by mohlo krýt alespoň nejnutnějši část jeho spotřeby. Způsobem podle vynálezu je možno získat geny, včlenitelné do mikroorganismů za účelem získáni lidského inzulínu.

Inzulín sestává ze dvou po 1ypeptidových řetězců A a B, které jsou spojeny disulfidickými můstky. Řetězec A sestává z 21 aminokyselin a řetězec B z 30 aminokyselin. Tyto řetězce se in vivo nesyntetizují nezávisle, ale jsou odvozeny od prekursoru, kterým je proinzulín, Proinzulín je jednoduchý po 1ypeptidový řetězec, který obsahuje C-peptid, který spojuje řetězce A a B (D.F. Steiner a kol., Science 157, str. 697, 1967). Tento C-peptid se odštěpuje v průběhu převodu inzulínu do granul buněk B slinivky břišní před jeho vylučováním, (H.S. Tager a kol., Ann. Rev. Biochem. 43, str. 509, 1974). Podle současného názoru zajištuje Cpeptid pouze trojrozměrnou strukturu molekuly. Sled aminokyselin v lidském proinzulínu je uveden v tabulce I. V této tabulce tvoří řetězec B aminokyseliny 1 až 30, C-peptid tvoří aminokyseliny 31 až 65 a řetězec A je tvořen aminokyselinami 66 až 86.

Ό

jí.:

«4Χί'^ν·... ·

K3t ězec A sestává z 21 aminokyselin a řetězec 3 z 30 aminokyselin. Tyto řetězce se in vivo nesyntetizují nezávisle, ale jsou odvozeny od prekursoru, kterým je proinzulin. Proinzulín ja jednoduchý polypaptido vý řetězec, který obsahuje C-peptid, který spojuje řetězce A a 3, jak bylo uvedeno v publikaci D.F. Steiner a další, Science 157. 697 (1567). Tento C-peptid se odštěpuje v průběhu převodu inzulínu do granul buněk B slinivky břišní před jeho vylučováním, jak bylo popsáno v publikaci H. S. Tagsr a další, Ann. Rev. Biochem. 12» 509 (1574). Podle současného názoru na funkci C-peptidu zajišťuje C-peptid pouze trojrozměrnou strukturu molekuly. Slad aminokyselin v lidském proinzulín.u je uveden v následující tabulce I. V této tabulce tvoří řetězec B aminokyselinu 1 až 30, C-peptid tvoří aminokyseliny 31 až 65 a řetězec A ja tvořen aminokyselinami 66 až S6„ r-Λ.·'· *«*:;· '

Tabulka 1

10 Ní^-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu20

-Val-Glu-Ala-Lau-Tyr-Lau-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly30

-Pha-Pha-Try-Thr-Pro-lys-Thx-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu40

-Asp-Lau-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Lau-Gly-Gly-Gly50

-Pro-Gly-Ala-Gly-Sar-lau-Gln-Pro-Lau-Ala-Lau-Glu60 70

-Gly-Sar-Lau-Gln-Lyg-Arg-Bly-Ila-Val-Glu-Gln-Cys80

-Cys-Thr-Ser-Ila-Cys-Sar-Lau-Tyr-Gln- Leu-Glu-Asn86

-Try-Cya-Asn rl

Chemická syntéza tohoto sladu 86 aminokyšaliny ja běžným způsobem možná, i když je obtížná,

V pankraatických buňkách B naní původním produktem vlastní proinzulín, avšak praproinzulín, ktsrý obsahuje .ještě více než 20 dalších aminokyselina na tom konci proinzulínu, na němž sa nachází aminoskupina, jak bylo popsáno v publikacích S. J. Cahn a další. Proč. Nat. Acad. Sci. USA 73, 1964 (1976) a P. T. lomadico a další, Nucl. Acid. Ras. 2» 381 (1976). Tento slad aminokyselin se nazývá signálním paptidam.

V lidském pra pro inzulínu má signální paptid 24 aminokyselin, jak ja znázorněno také na obr. 2, jda o následující slad:

-24 -20

NH₂-Mat-Ala-leu-Trp-líet-Arg-Lsu-Lau-Pro-Leu-lau-1§> -1 -Ala-Iau-Lau-Ala-Leu-Trp-C-ly-Pro-Asp-Pro-Ala-Ala-Ala.

Tanto slad 24 aminokyselin ja patrně specifickým signálem pro přenos syntetizovaného polypeptidů do andopla zmat icicého retikula buněk Bav průběhu transportu vektorem sa od pro inzulínu odštěpuje, jak bylo popsáno v publikaci G. Blobal a další, J. Cell. Biol. 67, 835 (1975).

Je známa řada signálních psptidů u eukaryotických bílkovin, které je možno transportovat membránovými bariérami. V bezbuněčném systému byl objeven specifický enzym, který hydrolyzuje peptidovou vazbu mezi signálním -peptidem a aktivní bílkovinou při průchodu buněčnou membránou, jak bylo popsáno v publikaci G. Blobel a další. Proč. Hat. Acad. Sci USA 75. 361 (1978).

Současné pokroky v biochemii, zejména pokud jde o DNA umožnily syntézu specifických bílkovin za řízených podmínek, které jsou nezávislé na vyšším organismu, z něhož jsou běžně izolovány. Při této syntéze se užívá enzymů a subcelulárních složek živých buněk, které se obvykle účastní syntézy bílkovin, a to bud in vit ro v bezbuněčném systému nebo in vivo v mikroorganismu.

V obou případech je klíčovým stupněm získání desoxyribonukleové kyseliny (DNA) se specifickým sledem s obsahem informace, která je nutná pro získání požadovaného sladu aminokyselin. Tato specifická DNA je gen. Kodový vztah, tvořený sledem áasoxynukleotidů, se užívá k vyjádření sladu aminokyselin v bílkovině a je založen a

na základním počtu principů, které jsou společné všem živým organismům.

^λ.......

Klonovaného genu je možno užít k určení sledu aminokyselin v bílkovinách in vitro. Systémy pro tuto syntézu jsou dobře známy a byly popsány například v publikaci G. Zubay, Ann. Rev. Genetics £, 267 (1573. Mimoto je-možno způsobit, aby DNA s jednoduchým řetězcem působila jako mRNA in vitro, čímž je možno dosáhnout velké přesnosti sledu DNA, jak bylo popsáno v publikaci J. Salaš, a další, J. Biol. Chem. 243> 1012 (1968). Mimoto je možno užít dalších známých způsobů ke zvýšení výtěžku výsledného produktu.

Vývoj tohoto oboru umožňuje izolovat specifické geny nebo jejich části z vyšších organismů, například člověka a dalších savců a přenést tyto geny nebo jejich fragmenty do mikroorganismu, například bakterií nebo kvasinek. Tímto způsobem dochází k replikaci přeneseného genu a k jeho propagaci při replikaci transformovaného mikroorganismu. Tí#mto způsobem může transformovaný mikroorganismus získat tu vlastnost, že produkuje bílkovinu, pro níž je kódem gen nebo jeho fragment, přičmež může jít o enzym, hormon, antigen, .protilátku nebo o část těchto bílkovin, Mikroorganismus předává svou schopnost dalším generacím, takže ve skutečnosti vzniká nový kmen s požadovanou

J» '

- 8 schopností, jak bylo popsáno například v publikacích Ullrich A. a další, Science 196, 1313 (1977), a Seeburg. Ρ. H. a další, Nátuře 270, 486 (1977). Základním faktem, který umožňuje použití této technologie pro praktické účely je skutečnost, ža DNA všech živých organismů od mikroorganismů až po Člověka je chemicky podobná a skládá se ze čtyř stejných nukleotidů, Pod= statný tozdil spočívá pouza ve sledu těchto nukleotidů *

v polymerní molekule DNA. Tento sled nukleotidů je možno užít k vyjádření specifického sledu aminokyselin určité bílkoviny. Přestože se většina bílkovin různých organismů liší, kódové vztahy mezi sledem nukleotidů a sledem aminokyselin jsou v zásadě stejné pro všechny organismy. Například tentýž sled nukleotidů, který je kódem pro sled aminokyselin lidského růstového hormonu v hypofýze po přenesení do mikroorganismu je kódem pro týž sled aminokyselin.

Používané zkratky jsou uvedeny v následující tabulce 2,

- 9 Tabulka 2

DNA - dasoxyribonukleová kyselina

SNA - ribonukleová kyselina cDNA - komplementární DNA (enzymaticky syntati zovaná ze sledu mSNA) mRNA - RNA pro přenos (poslíčkova RNA) dATP - desoxyadenosintrifosfát dGTP - dasoxyguanosintrifosfát dCTP - desoxycytidintrifosfát

A - Adenin

T - Tnymin

G - Guanin

C - Cytosin

U - Uráčil

ATP - adenosintrifosfát

TTP - trymidintrifosfát

SDTA - kyselina athylendiamintetraoctová

Kódové vztahy mezi sladem nukleotidů v DNA a sledem aminokyselin v bílkovině jsou souhrnně známy jako genetický kód a jsou uvedeny v následující tabulce 3.

Tabulka 3

Genetický kod
fenylalenin (Phe)	TTK
leucin (Leu)	ZTY
isoleucin (Ile)	ATM
methionin (Met)	ATG
valin (Val)	GTL
sarin (Ser)	QRS
prolin (Pro)	CCL
thraonin (Thr)	A CL
Alenin (Ala)	GCL
Tyrosin (Tyr)	TAK
Terminační signál	TAJ
terminační signál	TGA
histidin (His)	CAK
glutamin (Gin)	CAJ

•'“yjRI*’· ’ί l^J7Í*Jř*’**^*·'

Asparagin (Asn)	AAK
Lysin (Lys)	AAJ
kyselina asparagová (Asp)	GAK
kyselina glutamová (Glu)	GAJ
cystein (Cys)	TGK
tryptofan (Try)	TGG
Arginin (Arg)	WGZ
Glycin (Gly)	GGL

Poznámka:

Každý triplet desoxynukleotidů o 3 písmenech odpovídá trinuklaotidu mSNA se zakončením 5' na levé straně a zakončením 3 na pravé straně. Všechny uvedené slady DMA jsou slady, jejichž řetězec ědpovídá sledu mHlTA s tím rozdílem, že se uráčil nahradí t/hyminem. Písmena znamenají purinové a pyrimidinové baze řetězce.

A adenin

G guanin

G cytosin /

- 12 T thymin χ T nebo C v případě, že Y znamená A nebo G χ C v případě, že Y znamená G nebo T γ znamená A, G, C nebo T v případě, že X znamená C γ A nebo G v případě, ža X znamená

T

W C nebo A v případě, že Z znamená

A nebo G

7/ C v případě, že Z znamená C nebo T

Z A, G, C nebo T v případě, že

7/ znamená C

Z A nebo G v případě, že W znamená A qr TC v případě, ža S znamená

A, G, C nebo T

- 13 AG v případě, že S znamená T nebo C

A, G, C nebo T, v případě, že QR znamená TC

T nebo C v případě, že QR znamená AG,

A nebo G

T nebo C

A, T, C nebo G

A, C n9bo T.

Důležitou vlastností kódu pro současné účely je skutečnost, že každá aminokyselina je určena sledem tří nukleotidů, který se také nazývá nukleotidový triplet. Posfodiesterové vazby, které spojují sousední triplety, jsou chemicky nerozeznatelné od dalších vazeb mezi nukleotidy LÍTÁ. Z tohoto důvodu není možno odečíst sled nukleotidů jako kod pro některou aminokyselinu nebo pro sled aminokyselin bez další informace, která určuje začátek sledu, a tedy

QR

S

S

J

K

L

M

«I .

- 14 i skupiny tripletů, která jsou užívány buňkou' k .rozeznání významu, který má mSHA pro řízení syntézy bílkovin.

Řada technik v chemii DNA užívá dvou tříd sloučenin, a to vektorů pro přenos a restrikčních enzymů. Vektor pro přenos je molekula DNA, která mimo jiné obsahuje genetickou informaci, která zajištuje její vlastní replikaci při přenosu do hostitelského mikroorganismu. Příkladem pro vektory pro přenos, tak jak se běžně užívají v genetice bakterií, jsou plasmidy a DNA některých bakteriofágů. Přestože plasmidy byly užity jako vektory pro způsob podle vynálezu, je zřejmé, že bylo možno užít i jiných typů vektorů, schopných přenosu. Plasmid je termín, který je užíván pro jakoukoliv jednotku DNA, schopnou autonomní replikace, kterou je možno najít v mikrobiální buňce a která je odlišná od vlastního genomu hostitelské buňky. Plazmid tedy není geneticky vázán na chromozom hostitelské buňky. DNA plazmidu existuje jako prstencovitá struktura s dvojitým řetězcem o molekulární hmotnosti řádu několik milionů daltonů, přestože některé z nich mají molekulární hmotnost větší než 10 daltonu. Molekuly této velikosti obvykle představují jen malé procento celkového množství DNA v baňce.

DNA, která je vektorem pro přenos, je obvykle oddělív telná od DMA hostitelské buňky vzhledem k velkému

- 15 rozdílu ve velikosti ódou molekul. Vektory nesou genetickou informaci, která dovoluje jejich replikaci v hostitelské buňce, a to ve většině případů nezávisle na rychlosti dělaní hostitelských buněk. Některé plazmidy mají tu vlastnost, že jejich replikaci a rychlost této replikace je možno řídit změnami růstových podmínek. Plazmidová DNA existuje jako uzavřený kruh. Vhodným způsobem je však možno tento kruh otevřít, vložit fragment heterologní DBA a kruh opět uzavřít, čímž vzniká zvětšená molekula, která obsahuje včleněný segment DBA. Například DBA nakteriofágu může nést segment heterologní DBA, který je zařazen v místě některých nepodstatných genů fágu. Vektor může tedy sloužit jako nosič včleněného fragmentu heterologní DBA·

Přenos se uskutečňuje způsobem, který je znám jaro transformace. V průběhu transformace se do bakteriálních buněk, smíšených s plazmidovou DBA, včleňuje celá molekula plazmidu. Přestože mechanismus tohoto způsobu zůstává na zhám, je možno zvýšit na maximální množství podíl bakteriálních buněk, které jsou schopná přijmout plazmidovou DBA a tím se transformovat. Jakmile se do buňky včlení plazmid, dochází k jeho replikaci v buňce a k jano distribuci do

dceřiných buněk při dělení mateřské buňky. Jakákoliv genetická informace, která je přítomna ve sledu nukleotidů plazmidu může tady být zásadně replikována a dále

V přenášena hostitelskou bunko.u. Transformovaná hostitelská buňka;se tedy pozná podle vlastností, přenesených plazmidem. Touto vlastností může být například odolnost proti některému z antibiotik. Různé plazmidy ja opět od sebe možno rozeznat rozdílnými schopnostmi nebo rozdílnou kombinací schopností, které předávají hostitelským buňkám, v nichž jsou obsaženy. Jakýkoliv daný plazmid je tedy možno získat ve větším množství tak, že se pěstuje čistá kultura buněk, které tento plazmid obsahují s následným izolováním plazmidové DUA z uvedených buněk.

Restrikční endonukleázy jsou hydrolytické enzymy, utere jsou schopné katalyzovat štěpení molekulové DRA tak, že dochází k jejich štěpení na zcela určitém specifickém místě. Místo působení restrikční endonukleázy je určeno existencí specifického sledu nukleotidů. Tento sled je nazván specifickým místem působení restrikční endonukleázy. Ryly izolovány restrikční endonukleázy z různých zdrojů a charakterizovány, pokud jde o specifická místa jejich.působení ve sledu nukleotidů. Nekteré restrikční endonukleázy

hydrolyzují íosfodiesterové vazby v obou řetězcích v témž místě, čímž dochází k odpovídajícím zakončením. Jiné enzymy katalyzují hydrolýzu vazeb, které jsou od sebe odděleny jen několika nukleotidy, čímž vznikají volné oblasti s jediným řetězcem na každém konci štěpené molekuly. Tyto části molekuly mohou být užity k novému spojení hydrolyžované LNA, protože se navzájem doplňují. Protože jakákoliv DNA, schopná štěpení uvedeným enzymem musí obsahovat totéž místo působení, je možno získat naprosto stejná zakončení a tím je možno k sobě připojit hetsrologní sledy DNA po působení touž restrikční endonukleázou a dalšími podobně zpracovanými sledy nukleotidů, jak bylo popsáno v publikaci Roberta H. J., Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (lS7o). ?.9strikční endonukleáza a restrikční místa jsou poměrně vzácná, avšak obecná použitelnost restrikčních endonukleáz byla široce rozšířena možností chemické syntézy oligonuklsotidů s dvojím řetězcem a se zakončením, která odpovídají místu pŮ3ob9ní restrikční endonukleázy. Tímto způsobem je zásadně možno spojit jakýkoliv segment DNA s jakýmkoliv jiným segmentem prostým použití příslušného zbytku po působení restrikční endonukleázy a jeho připojení za zakončení molekuly, které rovněž vzniklo

I

- 18 působením rastrikční endonukleázy, jak bylo popsáno v publikacích Haynaker H. L. a další, Nátuře 263s>

748 (1976) a Scheller R. H. a další, Science 19 6 _a 177 (1977). Důležitou vlastností rozdělení specifických míst pro působení restrikčních endonukleáz je skutečnost, že tato místa jsou rozložena zcela náhodně vzhledem ke způsobu odečítání genetické informace. V důsledku toho může dojít ke štěpení restrikční endonukleázou mezi sousedními kodony nebo uvnitř jediného kodonu.

Jsou známy obecnější metody pro štěpení DNA a pro modifikaci koncového sledu. K náhodnému štěpení DNA je možno užít celou řadu nespecifických endonukleáz, jak bude dále uvedeno. Koncové sledy je mošno modifikovat vytvořením oligonukleotidových zakončení dA na jednom konci a dT na druhém konci nebo je možno vytvořit zakončení dG a dC a tak vytvořit restrikční místa bez nutnosti použití specifických sledů při spojení těchto zakončení·

Pojem exprese” je, užíván za současného vědomí, ža organismus málokdy nebo nikdy využívá všech svých genetických schopností v daném okamžiku. I v poměrně jednoduchých organismech, například u

- 19 bakterií nedochází k syntéze C9lé řady bílkovin, které je buňkq schopna vyrábět, avšak k jejich produkci může dojít za určitých zevních podmínek. 7 případě, že se bílkovina, jejímž kódem je daný gen, skutečně produkuje, dochází k tak zvané expresi genu. Jestliže se bílkovina neprodukuje,k expresi genu nedochází. Obvykla je řízena exprese genů. v E. coli tak, jak bude dále popsáno, a to tak, že bílkoviny, jejichž funkce není užitečná v daném prostředí, nejsou prodUr kovány a ušetří se metabolická energie.

Způsob, jímž je řízena exprese genu u Escherichia coli, je poměrně znám v důsledku širokých výzkumů v posledních dvaceti letech, jak bylo popsáno v publikacích Hoyes S., The Genetice of Bactsria and Their Yiruses, 2. vydáni, John Wiley a Sons, lne.,

New York (1968) a Watson J. D., The Molecular Biology of the Gene, 3. vydání, Benjamin, Manlo Park, California (1576). Tyto pokusy prokázaly, že některé geny, a to obvykle ty, které jsou kódy pro bílkoviny a příbuznou funkcí v buňce,jsou spojeny do kontinuálního sledu. Název pro.tento sled je operon. Všechny geny operonu so odečítají v tomtéž sledu, přičemž se začíná od kodonu, cterý ja kódem pro h-terminální aminokyse • I

- 20 linu první bílkoviny a pokračuje se*stála ve stejném směru až do C-terminálníbo zakončení poslední bílkoviny v operonu. Na začátku operonu, v blízkosti kodonu oro N-terminální aminokyselinu, existuje oblast DNA, která sa nazývá kontrolní oblast, která obsahuje řadu řídicích prvků a to operátor, promotor a sledy pro ribosomální místa vazby. Funkcí této oblasti je dovolit expresi svrchu uvedených &enů v závislosti na potřebách organismu. Například geny, které jsou kódem prc enzymy, jichž je zapotřebí Výlučně pro využití laktózy, se účastní exprese pouze tehdy, je-li přítomna laktóza nebo některý'z jejích analov gů v živném prostředí. Kontrolní oblast zajištuje, aby docházelo k expresi pouze v tomto případě.

V jiných případech nedochází ani k transkripci a k počátku translace. Exprese prvního genu ve sledu počíná počátkem transkripce a translace v poloze, která je kódem pro N-terminální aminokyselinu první bílkoviny v operonu. Současně dochází k expresi každého genu v daném směru od tohoto bodu alespoň tak dlouho, dokud sled neobsahuje terminační signál nebo jiný operon s vlastní řídicí oblastí, který je určen pro jiné zevní podmínky. Od tohoto schématu může docházet k různým odchylkám, důležitá je však skuteč’ ί

- 21 nost, že gen musí zvláštním způsobem aby mohlo dojít k být například Pscherichia coli uvolněn vzhledám k řídící oblasti začátku transkripce a k translaci.

Bylo prokázáno, že je možno včlenit do operonu geny, která nejsou jeho běžnou částí, přičemž tyto geny pak mohou být tímto operonem řízeny. Klasické stanovení bylo provedeno v publikaci Jacob P., a další, J. Mol. Biol. 13, 704 (1S65). Při tomto pokusu byly přeneseny geny, které znamenaly kódy pro bicsyntézu purinu do oblasti, řízené operonem pro laktózu. 3ylo pak možno pozorovat expresi enzymu pro biosyntézu purinu v přítomnosti laktózy a represi těchto enzymů v nepřítomnosti laktózy nebo jejího analogu, přičemž enzymy se nevyráběly za zevních podmínek, které normálně k jejich výrobě vedly.

Kromě operátorové oblasti, která řídí počátek transkripce u genu v příslušném směru existují ještě kodony, které ukončují tento pochod a označují tady C-treminální zakončení dané bílkoviny, jak bylo také uvedeno v tabulce 2. Tyto kodony jsou známy jako terminační signály, někdy se jim také říká nesmyslné kodony, protože nejsou kódem pro žádnou aminokyselinu

Při rozrušení terminačního sig-

- 22 nálu mezi jednotlivými geny téhož operonu vzniká souvislá oblast, v jejímž důsledku může dojít k syntéže chimérní bílkoviny, která sestává ze dvou sledu <

aminokyselin, jejichž kódem jsou sousední geny, tyto dva sledy jsou pak spojeny peptidovou vazbou. Výroba těchto chimérních bílkovin při spojení genů byla popsána v publikaci Benzer S. a Chazpe S. P., Proč.

Nat. Acad. Sci. USA £8, 114 (1962).

Jakmile dojde k tomu, že daný gen byl isolován, čištěn a včleněn do vektoru, označuje se výsledek tohoto postupu klonováním genu a závisí také na možnosti zajistit tuto látku v dostatečném množství. Klonovaný gen se přenese do vhodného mikroorganismu, kde dochází k replikaci'genu při růstu mikroorganismu a jeho rozmnožování, během těchto pochodů je možno kdykoliv získat gen zpět běžným způsobem. Tímto způsobem se získává zdroj genu pro další modifikace a přenosy do jiných vektorů nebo na jiná místa při použití téhož vektoru.

K expresi může dojít po přenosu klonovaného genu ve správném směru a po správném umístění do řídící oblasti, takže při správném odečtení z prokario- tického genu dochází k syntéza chimérní bílkoviny,

- 23 která obsahuje sled aminokyselin, jejímž kódem je klonovaný gen. J9 možno užít řadu štěpení, specifického pro bílkoviny k odštěpení chimérní bílkoviny v žádaném místě, takže je možno uvo-lnit žádaný sled aminokyselin a pak jej- čistit· běžným způsobem. Postupy pro získávání a expresi vektoru s klonovaným genem ve správné poloze vzhledem ke kontrolní oblasti byly popsány v publikacích Polisky B., a další. Proč. Kat. Acad. Sci USA 73, 3900 (1976), Itakura K. a další, Science 198, 1056 (1977), Villa-Xomaroff, L. a další, Proč. Mat. Acad.

Sci USA 75, 3727 (1978), ^esBreau-Puijalon 0. a další, Nátuře 273, 505 (1978), Chang, A. C. Y. a další,

Nátuře 275, 617 <1978) a v US přihlášce č. 933 035 (Eutter a další), část této přihlášky byla přejata pro vysvětlení do popisu.

Celkem ja možno říci, že při produkci bílkoviny savců, například prekursoru lidského růstového hormonu pomocí DNA, je nejprve zapotřebí klonovat lidský gen. Po klonování je tento gen možno získat ve větším množství, dále modifikovat chemickým nebo enzymatickým způsobem a přenést do plazmidu, schopného exprese. Klonovaný gen je také možno použít k izolaci příbuzných genů nebo v případě

- 24 klonovaného fragmentu k získání celého genu při použití klonovaného genu k hybridizací. Hybridizací je možno při použití klonovaného genu získat také příbuzné geny nebo prokázat totožnost homologů nebo nezávisle .izolovaných materiálů. V důsledku povahy genetického kódu povede klonovaný gen po translaci ve správném směru pouze k produkci sledu aminokyselin, pro něž je kódem·

Základní práce na izolaci a Čištění krysího pro inzulínu již byla provedena, jak bylo popsáno ve svrchu uvedených publikacích A. Ullricha a dalších a Villa-Xomaroffa, L a dalších. Tyto práce se týkají izolace a čištění genu pro krysí proinzulín a způsobu přenosu u tohoto genu a jeho replikace v mikroorganismu. ullrich a další izolovali několik rakombinařitních plasmidů, které obsahovaly sled, který je kódem pro proinzulín, nepřenesenou oblast j' a část prepeptidu. Represe krysí DHA s obsahem kódu pro inzulín je popsána v přihlášce č. 533 035. Villa-Koiaroff a další izolovali rekombinantní plazmid, který obsahoval kód, který je klíčem prq sled aminokyselin 4 až 86 proinzulínu. Tento sled proinzulínu byl oddělán od aminokyselin 24 až 182 penicilinázy (3-laktamázy)

- 25 kódovým sladem pro šest glycinů. Kod pro penicilinázu a proinzulín byl pracováván tak, že došlo, k jeho expresi a ka vzniku vázané bílkoviny. Uvedené publikace popisují některé základní postupy, používané, při výrobě LNA. Nepopisují však izolaci a čištění genu pro lidský proinzulín a preproinzulín.

Odlišný přístup k získání lidského inzulínu je popsán v publikaci R. Cres a další, Proč. Nat. Acad. Sci USA 22» 5765 (1978). Při tomto postupu dochází k chemické syntéze kódů. pro řetězec A a pro řetězec S lidského inzulínu při použití kódů a Rscherichia coli. Tyto dva sledy je pak možno včlenit do plazmidů, při jejichž expresi dochází k produkci řetězců A a B. Lidský inzulín je pak možno získat správnou vazbou disulfidovým můstkem mezi oběma bílkovinnými řetězci.

Klonovaný gen pro lidský preproinzulín je cenný pro různé účely, Je možno jej přenést do vektoru a tak získat syntetizovaný preproinzulín z mikroorganismu, který je transformován vektorem obsahujícím klonovaný gen. Při růstu transformované buňky hostitele dochází k syntéze preproinzulínu jako části chimérní bílkoviny. V případě, že

- 26 orokaryotická část vázané bílkoviny ja signální částí vylučované bílkoviny, je možnost dosáhnout sekrece této bílkoviny tak, že ja usnadněna jají stálost a čistění. Mimoto v případě, že prokaryotická část je krátká, ja -možno usnadnit celý postup v případě, že předběžný sled má stejnou funkci v prokaryotické buňce jako v eukaryotické buňce. Gen pro preproinzulín je možno užít také k získání genu pro proinzulín při použití techniky, která bude dále popsána.

Klonovaný gen pro preproinzulín je možno užít různým způsobem k produkci preproinzulínu. Preproinzulín sám o sobě je cenný, protože je možno jej převést na proinzulín známým enzymatickým a chemickým způsobem. Je možno například odstranit prapeptid rozpustný enzymatickým preparátem, jak bylo popsáno v publikaci G. Blobela a dalších, tak jak byla svrchu uvedena a specificky tak odstranit signální peptidy. Klonovaný gen proinzulínu je pak možno různým způsobem užít pro výrobu proinzulínu. Proinzulín ja cennou látkou, protože je možno jej převést na inzulín známým enzymatickým a chemickým způsobem, jak bylo popsáno v phblikaci Kemmber W. a další, J. Biol. Chem. 242, 6786 (1971).

Podstata vynálezu

Způsob výroby liského proinzulínu spočívá podle vynálezu v tom, že se pěstuje za podmínek vhodných pro expresi mikroorganismus, transformovaný vektorem pro expresi, obsahujícím sled desoxynukleotidů, který, je kódem pro liský proinzulín a popřípadě se získaná bílkovina po expresi čisti.

Jak již bylo uvedeno, bylo možno klonovat cDNA se sledem, který je kódem pro lidský preproinzulin a cDNA, která je kódem pro lidský proinzulín. Struktury těchto konovaných cDNA byly ověřeny analýzou sledu nukleotidů.

Původním zdrojem genetického materiálu byl liský inzulín, nádor, který produkuje inzulín. Z jeho buněk byla izolována mRNA.

DNA, komplementární k izolované mRNA (cDNA) byla syntetizována při použiti reverni transkriptázy ve dvou reakčních cyklech, takže vznikla cDNA s dvojitým řetězcem. Nerozštěpená heterogenní cDNA s dvojím řetězcem byla pak zpracována tak, že na obou koncích byl získán sled oligonukleotidů k usnadněni včleněni tohoto fragmentu do místa pro působeni stejného restrikčního enzymu ve vektoru pro přenos.

- 28 řS^

Pro klonování byl zvolán vektor s dobrou selekcí a stálou replikací. Zvolená cDNA byla volněna do vektoru na předem zvoleném miste za vzniku rekombinančního vektoru běážným způsobem. Pomocí tohoto vektoru byl transformován hostitelský mikroorganismus. Transoformanty byly podrobeny selekci podle běžných podmínek pro včlenění na předem stanovené miste Jednotlivé kolonie., odvozené od jediné transformované buňky byly odebírány a pěstovány v jednotlivých kulturách za účelem replikace uvedeného rekombinantního vektoru. Tento vektor byl pak sledován pokud jde o zachovaný inzulífaový sled hybridizací kolonií. Kolonie, které poskytovaly rekombinantní vektor pro sled inzulínu, byly pěstovány ve větších kulturách, aby bylo možno vektor izolovat a podrobit jej analýze· Příslušné kolony byly vybrány pro konečnou identifikaci sledu nukleotidů v klonovaném genu pro preproinzulín a proinzulín a pro přenos do příslušných plazmidů, schopných exprese.

Vynález se rovněž týká způsobu výroby sledu nukleotidů, který je kódem pro lidský proinzulín pro syntézu lidského inzulínu tak, že 3β hydrolyzuje

- 29 zakončení 3'sladu dasoxynuklaotidů, který je kódem pro lidský prepro inzulín a pak se provádí replikace způsobem podle vynálezu v několika cyklech, nebo se postupně užije T4 DNA polymerázy k natrávení za přítomnosti desoxynukleotidtrifosfátu, pak se hydrolyzuje zakončení 5* tohoto sledu pomocí nukleázy, specifické pro DNA s jednoduchým řetězcem se zakončením 5 '.

Vynález se rovněž týká způsobu výroby lidského proinzulínu, jehož řetězce A a B jsou od sebe odděleny C-peptidem, a to tak, že se inkubuje mikroorganismus, transformovaný vektorem s obsahem sledu nukleotidů, který je kódem pro lidský proinzulín za podmínek, vhodných pro sxprasi tohoto sladu, takto získaný lidský proinzulín se čistí z živného prostředí nebo rozrušených buněk mikroorganismu.

Vynález se rovněž týká způsobu výroby lidského inzulínu, a to tak, že s9 oxidují sulfhydrylové skupiny peptidů A a 3 lidského proinzulínu, připraveného svrchu uvedeným způsobem za vzniku disulfidové vazby mezi peptidy A a B a pak se odštěpí

<>

C-peptíd enzymaticky katalyzovanou hydrolýzou, specifickou pro vazby, které připojují C-p9ptid k peptid um A a B.

Předmětem vynálezu jsou tedy základní genetické prvky., jichž je zapotřebí k výrobě lidského inzulínu způsobem, který je možno přizpůsobit pro průmyslové účely. Je možno klonovat přirozeně se vyskytující strukturální geny a dosáhnout jejich v

exprese ve vhodné hostitelské ounce, čímž se získá bílkovina, kterou je možno převést na izulín známými způsoby. Způsob podle vynálezu je založen na molekule proinzulínu a jeho výhoda spočívá v tom, že C-peptidová oblast proinzulínové molekuly způsobuje její samovolné zakřigení, takže řetězce A a 3 se dostávají do správné vzájemné polohy. Při této konfiguraci je předem zajištěno správné spojení sulfhydrylových skupin a tvorba bisulfidových příčných vazeb, tak jak je tomu v molekula účinného inzulínu_o Odštěpení C-paptidu se provádí použitím trypsinu nebo enzymu s podobným účinkem společné s karboxypeptidázou B nebo katepsinem B pro odstranění C-tarminál ního albuminu na řetězci B, jak je známo z literatury.

Tímto způsobem je možno klonovat celou část genu' pro lidský inzulín, která je kódem pro inzulín včetně části nepřenesené oblasti 5' pra03ptidu. Je také možno klonovat kód pro sled B, C a á a pro nepřenesenou oblast 3*. Volba hosv titelské buňky ovlivní také volbu části klonovaného genu. Celý kód pro prainzulín je možno použít k transformaci některých typů vyšších eukaryotických buněk, protože předběžný slad působí jako samostatv v ný peptid a usnadňuje vylučovaní peptidu z buňky. Mimoto ty euraryotické buňky, které jsou schopny produkovat signální peptid, budou taká katalyzovat specifické odstraňování předběžného sledu při průchodu bílkoviny buněčnou membránou. Tyto buňky budou také schopny trvale produkovat tento produkt i po odštěpení C-bílkoviny a vzniku správných disul fidových vazeb.

Při použití proxaryotických hostitelských

buně	k se dává	přednost	použitý-kódu pro proinzulín.
Přsm	w iid f X 4..-	zulinu na	inzulín sa pak provádí zná-
mým	způsobem.	Jsou znám	y dva typy exprese, z nichž
ka z z	ý spočívá	v tom, že	se v.olaní kod pro proinzulín

-ί do oblasti vektoru, jehož exprese se řídí prokaryotickým promotorem. V některých případech dochází ke změně polohy Části prokaryotického strukturálního genu a promotoru, takže výsledný produkt je bílkovina, jejíž N-terminální část sestává z B-termináln£ í

Části prokaryotické bílkoviny a C-terminální částí je klonovaný sled, v tomto případě pro inzulín,, Hxprese pro inzulínu jako lidské bílkoviny má tu výhodu, že složená bílkovina ja daleko stálejší v ho^telské buňce než vlastní pro inzulín. Mimoto v případě, že pro karyot ickou bílkovinou je bílkovina, která je běžně vylučována hostitelskou buňkou, může být složená bílkovina rovněž vylučována, čímž je snadnější čištění výsledného produktu. Užití složení bílkovin má tu nevýhodu, že je nutné je specificky štěpit k získání požadovaného produktu. V případě proinzulínu je možno použít zvláštní techniky, která využívá oýhody sledu aminokyselin v bílkovině, takže je možno složenou bílkovinu specificky štěpit, jak bude popsáno v příkladu 2.

Klonovaný sled je možno rovněž podrobit expresi přímo v prokaryotické buňce tak, že se

- 33 sled včlení v bezprostřední blízkosti promotoru. Výhodou tohoto postupu je, že 'specifické štěpení odpadá. Zásadní nevýhodou je však skutečnost, že výsledný produkt je nutno dále Čistit.

Pxprese lidských genů, včleněných do Sscherichia coli je možno v současné době dosáhnout včleněním v blízkosti promotorů lac, trp a promotoru pro β-laktamázu. Promotor lac je výhodný z toho důvodu, že jeho ge-netika je velmi dobře charakterizována. Jsou dvě možná místa včlenění, přičemž se dosahuje dlouhé a krátké prokaryotické části složené bílkoviny. Je možno získat velké množství genetických variant s různou úrovní endogenních represcrů v závislosti na teplotě a podobně. Promotor trp má tu výhodu, ža při jeho použití je možno dosáhnout vysoké úrovně exprese. Plazmidy, které mají místo včlenění v promotoru trp, je možno získat pro všechny tři způsoby odečítání. Promotor pro β-laktamázu poskytuje prokaryotickou signální vílkovinu, protože laktamáza je běžně vylučována nebo je možno ji prokázat v periplazmatickém prostoru. V důsledku toho není zapotřebí většího čištění k získání čistého oroinzulínu.

Způsob podle vynálezu využívá funkce C-peptidu proinzulínu zejména k usnadnění samovolného zakřivení molekuly proinzulínu tak, že se řetězce A a B dostávají do správné konfigurace a je pak možno dosáhnout tvorby správných příčných disulfidových vazeb, tak jak je tomu v přírodním inzulínu. Srovnání C-peptidu různých druhů ukazuje, že tento peptid není důsledně zachováván v průběhu vývoje. Z tohoto důvodu je možno různé aminokyseliny v tomto sledu nahradit jinými. Funkcí tohoto peptidu je zřejmě pouze vznik řetězce aminokyselin správné délky tak, aby bylo dosaženo správné vzájemné polohy řetězců A a B. V důsledku toho pravděpodobně by bylo možno včlenit na místo tohoto peptidu jakýkoliv jiný sled, aniž by došlo k podstatné změně jeho funkce. Použití přírodního C-peptidu vsak má určité výhody, například tu, že není zapotřebí úplně odstranit tento peptid z výsledného inzulínu, protože jde o přírodní složku inzulínových přípravků, iíimoto může tento captid poskytovat určité výhody při štěpení enzymy.

- 35 Způsob podle vynálezu dále prokazuje univerzalitu genetického kódu. Kodony, kterým dávají přednost buňky savců, jsou velmi správně reprodukovány Escherichia coli. V některých případech ja možno některé kodony, které jsou kódem pro tutéž aminokyse linu nahradit 'oez ovlivněni sledu nebo funkce výsledné bílkoviny. Z toho vyplývá, že způsob podle vynálezu zahrnuje ,i všechny syntetické variace kódu, pokud je výsledkem lidský preproinzulín a lidský proinzulín.

Vynález bude osvětlen následujícími příkla dy.

Příklad 1

Klonovaný gen pro lidský preproinzulín

Lidský gen pro inzulín byl klonován z RNA, izolované z lidského inzulinomu způsobem podle svrchu uvedené Ullrichovy publikace pro izolaci RNA buněk ostrůvků. RNA, získaná po odstředění v 5,7 M CaCl s obsahem 100 mM EDTA byla použita bez další frakcionace jako předloha

XS^ÍM '·«+—*c«s<p!. jwbw ’

-'-^szss-s -χχ .»-».·

- 36 Způsob podle vynálezu dále prokazuje univerzalitu genetického kódu. Kodony, kterým dávají přednost buňky svaců, jsou velmi správně reprodukovány Bscherichia coli. V některých případech je možno některé kodony, které jsou kódem pro tutéž aminokyselinu nahradit bez ovlivnění sledu nebo funkce výsledné bílkoviny. Z toho vyplývá, že způsob podle vynálezu zahrnuje i všechny syntetické variace kódu, pokud je.výsledkem lidský pra pro inzulín a lidský proinzulín.

Vynález bud9 osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

Klonovaný gen pro lidský preproinzulín

Lidský gen pro inzulín byl klonován z R1ÍA₉ izolované z lidského inzulinomu způsobem podLle svrchu uvedené Ullrichovy publikace pro izolaci RNA buněk ostrůvků. SNA, získaná po odstředění v 5,7 M CaCl s obsahem 100 mM EDTA byla použita bez další frakcionace jako předloha pro syntézu cDřTA při

- 37 použití reverzní transkriptázy a 21 nukleázy, jak je popsáno ve svrchu uvedené Ullrichově publikaci.

Ze 130 πώίΐ nef rakc ionované RNA bylo připraveno přibližně 40 ng cDNA s dvojitým řetězcem.

Nefrakcionovaná cDNA byla zpracovávána působením terminální tran3ferázy za přítomnosti dCTP za vzniku oligo-C zakončení na konci 3'molekuly cDNA. Podobně byl rozštěpen jako vektor plazmid pBR322 působením resktrýkční endonukleázy Pst I a byl zpracováván působením terminální transferázy za přítomnosti dGTP za vzniku oligo-dG zakončení na zakončení 3* lineární plazmidové DNA. DNA plazmidu po tomto zpracování nemůže vytvořit kruhovou DNA, protože fcakončení nejsou komplementární. Zakončení oligo-dV zpracované cDNA však jsou komplementární se zakončeními oligo-dC plazmidů a je tedy možno ji užít ka vzniku cirkulárního plazmidů, v jehož místě působení enzymu Pst I je včleněna cDNA. Mimoto tímto včleněním sa regenerují obě zakončení míst pro působení Pst I a je tedy možno opět odštěpit včleněný sled, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Villa-Komarroffa a další.

'^-'♦DFfcWř '~

Tvatf-.^crs

- 38 Svrchu uvedený postup byl užit k získání plazmidu pBR322 s heterogenní skladbou cDIIA v místě působení Pst I. Tyto plasmidy mohou být citlivé na ampicilin, protože místo pro působení enzymu se nachází v genu pro β-laktamázu, avšak zůstávají odolné proti tetracyklinu. Získaným materiálem byla transformována Sscherichia coli kmen X1776. 3ylo získáno 525 transformantů, odolných proti tetracyklinu. Tyto transformanty byly podrobeny replikaci a sledovány in šitu hybridizací kolonií na správný slad nukleotidů způsobem podle publikace Srusnstein a Hogness, Proč. Hat. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975) Dříve klonovaná cLUA pro krysí prs pro insulin podle svrchu uvedené Ullrichovy publikace bylo užito jako srovnání při hybridizací, přičemž tento materiál byl označen použitím LHA polymerázy I. Protože sled aminokyselin v lidském a krysím inzulínu je velmi podob ný, inzulín je homologní na 92 % a proinzulín na 83 %, bylo předpokládáno, ža dojde ke zkřížené hybridizací cLUA krysího původu se sledem pro lidský inzulín za daných podmínek. Autorsdiografií bylo prokázáno, ža pouze dvě z 525 kolonií obsahovaly materiál z této zkřížené hybridizace. Obě tyto kolonie byly citlivé na ampicilin. Plazmidy, izolované

- 39 z kolonií. byly’ přibližně o 250 a 500 páru baží delší než vlastní pBR322. Další plazmid byl označen pcHX-1.

Slad nukleotidů ve včleněném fragmentu cDNA plazmidu pcHI-l-byl stanoven způsobem, popsaným v publikaci Maxam a Gilbert, Proč. Mat. Acad. Sci. USA 74« 560 (1977). Na obr. 1 je znázorněn schematický diagram včleněné Části. Včleněná část obsahovala celý kod pro lidský are pro inzulín spolu s částí 5 '-nepřenošené oblasti, celou J^-nepřenesenou oblast a část oblasti 3'-polydA. Na obr. 1 jsou rovněž znázorněna místa pro působení restrikčních enzymů, která umožňují odštěpení včleněné části. Je znázorněn rovněž směr sledu každého fragmentu.

N a obr. 2 je znázorněn sled mRNA, odvozený o'd sledu cDNA a sled aminokyselin, vyvo,zený na základě odečtení těchto sledů. Frimární struktura lidského proinzulínu, stanovená tímto způsobem přesně souhlasí se strukturou získanou předchozím zjištováním sledu aminokyselin, který byl popsán v publikaci M. D. Deyhoff, Atlas cf Protein

73?; -*a r^-wi '·&:''

- 40 Sequence and Structure, % Supp. 2, str. 127 až 130 (1276) a Suppl. 3, str. 150 až 151 (1578). Aminokyseliny pro inzulínového sledu jsou číslovány 1 až 86, předběžného sledu -24 až -1. Ra obr. 2 jsou rovněž znázorněna místa pro působení různých restrikčních enzymů pro konstrukci genu proinzulínu z pcHI-1. Je zřejmé, že sled cDNA v řetězci,' získaném z pcHI-1 je týž jako v obr. 2 s tím rozdílem^ že se místo uracilu U užije thyminu T.

Velká množství pcííl-l a dalších plazmidů je možno získat transformací Sscherichia coli HB-101. Kmen HB-101 je tedy výhodným hostitelem pro udržování a replikaci plazmidů, utere mají svrchu popsané včleněná části.

- 41 Příklad 2

Získání vektoru pro přenos proinzulínu

Včalšná cDNA v plazmidu pcHI-1 obsahuje celý slad, který je kódem pro lidský preproinzulín. V některých případech, například při přenosu do jiného druhu eukaryotických buněk je mošno očekávat, že bude odstraněn předběžný sled a C-paptid a tím se zísiá správná konfigurace účinného inzulínu. V jiných případech, jakým je například přenos do prokaryotických buněk jako bakterií může dojít k tomu, že produktem je nakktivní bílkovina. V tomto případě by byla výhod ná konstrukce kódu pro proinzulín, protože proinzulín je mošno snadno převést in vitro na účinný inzulín známým způsobem, například způsobem podle publikace Kemmler a další, J. Biol. Chem. 242, 6786 (1S71). Zásadně jsou zatím možné tři způsoby pro konstrukci sledu, který je kódem pro proinzulín. Vektor, který obsahuje p3E322 s včleněným uvedeným sledem sa označuje pcHP-1.

- 42 A. Chemicky syntetizovaný slad, který je kódem pro řetězec B lidského inzulínu, byl popsán v publikaci Crea R. a další, Proč. Nat. Acad. Sci_e USA 75., 5765 (1978). Syntetický sled nukleotidu se poněkud liší od přírodně se vyskytujícího sledu, protože syntetický sled byl volen tak, aby byly zařazeny kodony, jejichž přítomnost je příznivější pro prekaryotického hostitele, například Bscherichia coli. Před první aminokyselinou, kterou je fenylalanin, byl také zařazen triplet, který ja kódem pro methi onin. Oba sledy jsou totožné, pokud jde o sled aminokyselin 13 a 14, tato oblast obsahuje pouze místo pro působení restrikčního enzymu Alu I, které ja společné oběma sledům. Umístění tohoto místa v přírodním sledu je znázorněno na obr. 2.

Syntetická DNA proinzulínu se zpracovává endonukleázou Alu I, čímž se získají dva fragmenty o 43 párech baží a 56 párech baží. Rovněž cDHA, včleněná do pcHI-1, s výhodou získaná štěpeným enzymem Hha I, jak je popsáno v příkladu 2, se štěpí částečnou hydrolýzou, katalyzovanou endonukleázou Alu I za vzniku fragmentů o 75, 90, 110, 135,

165, 200, 245, 275, 375, a 455 párech baží.

- 43 Frakcionací elektroforězou na gelu se získá fragment o 375 párech baží, který vznikne štěpením v jediném místě, a to v kodonu pro aminokyselinu 14.

Fragmenty, získané Štěpením syntetického genu a· fragment cDNA po 375 párech baží se spojů spojí. Správné spojení syntetického fragmentu o 46 párech baží s fragmentem o 375 párech baží na co nejvyšší míru se dosáhne tak, že se fragment cDNA o 375 párech baží užije v molárním přebytku. Možnost nesprávného spojení sa rovněž sníží skutečností, že syntetické fragmenty mají' zakončení s jediným řetězcem, která nejsou komplementární se zakončeními fragmentu cDNA o 375 párech baží.

Spojením vznikne syntetický sled, který obsahuje kód pro methionin, následovaný aminokyselinami 1 až 13 a přírodní sled, který je kódem pro aminokyseliny -14 až 86 pro proinzulín. Takto syntetizovaný sled, který je kódem pro proinzulín, ja možno včlenit do jakéhokoli zvoleného plazmidu vyplněním nebo rozštěpením jednoduchých zakončení s následným spojením pomocí oligonukleotidů.

Bxpresí ae získá složená bílkovina, kterou je možno rozštěpit na zbytku a obsahem methioninu působením bromkyanu za vzniku proinzulínu. Proinzulín se převede na inzulín způsobem, který je popsán ve svrchu uvedené publikaci Kemmlera a dalších®

B. Na obr. 2 je znázorněna cDNA, včleněná do pcHI-1,'která má místo propůsobení restričního enzymu Hha X ve sledu, který je kódem pro aminokyseliny 14 a‘ž 13. Mimoto vektor pBR322 pro přenos má místo pro štěpení toutéž endonukleázou ve vzdálenosti 22 párů baží od místa pro působení Pst I při zakončení 5' včleněné části. Je tedy možno znovu izolovat sled, který obsahuje celý pro inzulínový sled ve vzdálenosti 22 párů baží od DNA pBR322 tak, ža se působí na pcHI-1 endonukleázou Rha I. Tento způsob je výhodnější naž zpětné izolování včleněné části působením endonukleázy Pst I, protože uvedená část obsahuje uvnitř dvě místa pro působení enzymu Pst I a výtěžek neporušené včleněné části při použití Pst I je z tohoto důvodu velmi nízké. Slad, izolovaný působením Hha I, sa rovněž hodí pro použití příkladu 2A a 2C.

- 45 V případě, že ae na kterýkoliv z izolátů působí endonukleázou Hha I, odštěpí se přebytečný řetězec mezi aminokyselinami 14 a 13 předběžného sledu. Tento řetězec je definován jako řetězec, jehož slad nukleotidů odpovídá sledu mRHA. Řetězec, označený zápornými čísly je řetězec, jehož sled je komplementární ke sledu mRNA. Zbývající předběžný sled ja možno specificky odstranit tak, že se využije exonuklaázové účinnosti 14 DNA polymerázy vzhle dem k zakončení 3* až 5* , protože tento enzym působí v záporně označeném řetězci předběžného sledu a na opačné straně kladně značného řetězce. Rxonukleolytickou reakci ja možno zastavit u předem definovaného nukleotidu tak, že se do reakční směsi přidá tentýž nukleotid ve formě trifosfátu. Sxonukleotyciká účinnost je pak zastavena způsobem, který ja popsán v publikaci Hngland P. T. v J. Biol. Chem.

2£, 3269 (1971) a v J. Mol. Biol. 66, 209 (1972).

Zbývající předmětný sled je možno specificky štěpit až do B-terminalního fenylalaninového kodonu aminokyseliny č. 1 třemi cyxly působením R4 polymerázy. První cyklus se provádí za přítomnosti

- 46 TTP, 'starý ukončí stepaní proti A glycinového kodonu v poloza aminokyseliny -7. Cyklu3 2 se provádí za přítomnosti dCTP, tímto způsobem se ukončí štěpení proti G v poloze kodonu -5 (Asp). Cyklus 3 se provádí za přítomnosti dATP, tímto způsobem se ukončí štěpení proti T, jde o první nukleotid v poloze 1 proinzulínu·

Po každém cyklu štěpení T4 polymerázou je zapotřebí odstranit trifosfát ukončeného cyklu a přidat trifosfát pro další štěpení. Pak sa užijí minislou ca Sephadexu G-75 (Pharmacia lne., Uppsala, Švédsko) k odstranění trifosfátu z reakční směsi. Sloupce je možno uvést do rovnovážného stavu vhodným pufrem a vzorky se odebírají v pufru, který obsahuje trifosfát následujícího cyklu. Tímto způsobem je možno dosáhnout toho, že enzym, procházející současně s DNA nerozštěpí DNA za následujícím zvolaným koncovým bodem. Aby bylo možno zabránit tomuto štěpení v nižší Části sloupce po průchodu předcházejícím trifosfátem, provádí se chromatografie v chladnu, obvykle při teplotě 4 °C a eluce sa urychlí odstředěním. Je také možno inaktivovat enzym zahřátím na 65 °C před chromatografií_o Následující cyklus pak začíná přidáním čerstvého,

- 47 účinného enzymu. Výsledkem přímých cyklů štěpení T4 polymerázy se dosáhne toho, že se úplně odštěpí záporně značený řetězec DNA specificky až do prvního kodonu sledu, který je kódem pro proinzulín. Sled kladně značeného řetězce na opačné straně molekuly, který rovněž má zakončení 3' je takový, že dojde pouze k odstranění několika málo nukleotidů.

Kladně značený řetězec v místě předběžného sledu se pak specificky štěpí axonukleázou Sl, která působí na zakončení s jediným řetězcem. Je nutno dbát toho, aby nedošlo k částečnému štěpení touto nuklaázou za počátkem prvního kodonu. K tomto rozštěpení může dojít zvláště v oblastech, které jsou bohaté na A-T na koncích molekul DNA. Přechodně napárová část na kodonu č. 1, bohatém na A-T by mohlo způsobit štěpení nu^leázou £1 za místem, za nímž již nemá k9 štěpení dojít. Tomu je možno zabránit nízkou teplotou, například teplotou místnosti a nižší a tím, ža prostře dí obsahuje větší množství solí, než se běžně užívá v pufru.

Vzorky DNA, získané v následujících stupních štěpení Sl se klonují ve vmodném vektoru pro přenos

- 48 :híí ti

-- známým způsobem. Analýza sladu nejmenáího .fragmentu po štěpení enzymen Alu I v těchto klonech se užije ke kontrole klonů, které obsahují kód pro proinzulín a celý předběžný sled je odstraněn.

Velmi přitažlivým způsobem pro klonování cDNA, která je kódem pro proinzulín, je způsob_s při němž ae včlení zakončení oligo-A při použití terminální transferázy na zakončení 3^zcDNA. Zakončení oligo-T se vytvoří na zakončení 3* na vhodném místě ve.ctoru pro přenos, například v místě pro působení EcoRl v genu pro 3-galaktosidázu plazmidů piS-l, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené Ullriohově publikaci a US patentu č. S33 035. Včlenění cDNA, která je kódem pro proinzulín svrchu uvedeným způsobem poskytuje správně orientovaný včleněný sled, který bude odečten ve správné fázi vzhledem ka gahu pro 3-galaktosidázu plazmidů s pravděpodobností : 6. Exprese zakončení oligo-A má za následek včlenění lysinu těsně před počátek sledu pro proinzulín. Mírné štěpení trypsinem ve složené bílkovině vede k získání proinzulínu, který se převádí na účinný inzulín, jak bylá dříve popsáno. Je také možno postupovat tak, že sa působí na složenou bílkovinu kombinací trypsinu karboxypeptidázy 5 nebo kethspsinu 3 za vzniku účinného inzulínu ze složené bílkoviny v jediném reskčním stupni.

C. Sled, který ja kódem pro proinzulín, sá i

získé selektivním štěpením uvnitř sledu, který je kódem pro proinzulín, s následným navázáním chemicky syntetizovaného kódu pro tuto část proinzulínu, která byla odstraněna předchozím stepáním. Jako zdroj oblasti, která ja kódem pro proinzulín, se ušije plazmid pcHI-1, který ss selektivně štěpí působením endonukleázy Pst I nebo s výhodou působením endonukleázy Hha I, jak ja popsáno v příkladu 23.

Sz . Sr X soeoi

Kterýkoliv z fragmentů ss po izolaci alkalickou fosfatásou odstranění 5'-terminálních fosfátových skupin a pak se provádí štěpení restrikční endonukleázou, která má jediné místo stepaní

X ve sladu, který ja kódem pro proinzulín. Místo pro působení tohoto restrikčního enzymu je s výhodou uloženo v blízkosti některého zakončení sledu, který je kódem pro proinzulín. Místo pro působení enzymu Alu I v oblasti aminokyselin Ij až 14 je vhod£‘. 3HÍ7 .»4®f» o^»T7 ;.n»*«.wM« řeTTuv^w >

- 50 ným místem pro tento účel, jak je znázorněno na obr. 2. íragmant po působení Hha I plazmidu pcHI-1 se částečně rozštěpí endonukleázou Alu I za vzniku dvou fragmentů o přibližně 76 párech baží a 375 párech ba-zí. Tyto fragmenty se podrobí frakcionsci alaktroforázou na gelu, jak ja popsáno v příkladu 2B a izoluje se fragment o 375 párech baží.

Sled nukleotidů, který je kódem pro prvních 13 aminokyselin proinzulínu se zakončením 5 *G na kladně označeném řetězci k doplnění kodonu pro alanin v poloze 14 se syntetizuje fosfotrissterovou metodou, která byla popsána v publikacích Itakura, X. a další, J. Biol. Chem. 250, 4592 (1975) a Itakura K., a áalší, J. Am. Chas. Soc. 97,7327 (1575). Kladně značený řetězec syntetické DITA má sled '-TTTGTGAACCAACACCTGTGCGCCTCACACCTGGTGGAAG-5 kteiý odpovídá přírodnímu sledu. Ja však možno syntetizovat jiné slady, které jsou rovněž kódem oro tytéž aminokyseliny. Jeden ze sladů je možno vyjádřit

- 51 -TTXGTLAAKCAJCAXKTYTGHGGLQRSCAHXTYGTLCAJG

Výsledný sled se naváže na fragment o 375 párech baží, vzniklý štěpením Hha I fragmentu pc Ϊ3.Ι— i · Protože uvedený fragment má 5 * fosfát na zakončení, které má být spojeno, budou oba fragmenty spojeny ve správném pořadí. Syntetický fragment je správně navázán na vetší fragment přibližně v 50 % reakcí.

DNA po působení ligázy se pak klonuje na vhodný plazmid bud vznikem zakončení oligo-A, jak bylo popsáno v příkladu 2B nebo vazbou krátkých v

včleněných Částí, usnadňujících vazbu a včleněním do plazmidů ve správném směru. V případě za-roncení oligo-A je možno pozorovat expresi proinzulínu přibližně v 1/12 klonů. V případě přímého včlenění tam, kde je známo, že způsob včlenění byl správný je možno pozorovat expresi přibližně v 50 % klonů.

ses®» - ·?γ4*Κ**ίί** · - 52 Příklad 3

Exprese lidského preproinzulínu a proinzulínu

Klonované kódy pro preproinzulín z příkladu 1 nebo proinzulín z příkladu 2 ae včlení do vektoru za účelem exprese. V případě, že ke včlenění dojde ve správné orientaci vzhledem k počátku translace v místě včlenění a včleněná část se nachází ve správné fáze vzhledem k promotoru a k ribozomu, syntetizuje se bílkovina, kte rá je produktem klonovaného genu aktivní metabolizujícími buňkami hostitele, které byly transformovány V9ktor9m. Bílkovinným produktem je složená bílkovina v případe, ža vektor obsahuje část prokaryotického genu mezi promotorem a místem včlenění. Včlenění je však možno provést také v bezprostředním sousadství promotoru. V těchto případech dochází přímo k produkci bílkoviny, pro níž je kódem včleněný sled. Oba tyto způsoby mají výhody a nevýhody. Složené bílkoviny mají tu výhodu, ža dochází ke stabilizaci cizorodé bílkoviny, pro níž je kóder včleněný gen. mimoto má

V i

- 53 složená bílkovina další požadované funkční vlastnosti, například snadné vyměšování z buňky hostitele při použití bílkoviny hostitele jako druhé části složené bílkoviny, například 8-laktamázy. Na druhé straně je čištění sledu v tomto případě komplikované, protože je obvykle nutno odstranit tu část složení bílkoviny, která pochází z hostitelské buňky. Toto odstranění je možno provést známými způsoby popsanými v příkladu 2A a 2B. Přímá syntéza požadované bílkoviny vylučuje nutnost specifického štěpení, ale obvykla také brání vylučování z buňky hostitele.

Plazmidy pro expresi byly vivynuty všude tam, kde exprese je řízena lao promotorem, jak bylo popsáno v publikacích Itakura a další, Science 195, 1056

..(1977), Ullrich A. a další, excerpta ůiedica, (1979),

- trp promotorem jak bylo popsáno v publikaci Martial a další, Science 203, 602 (1979) a promotorem pro

3-laktamázu, jak bylo popsáno v US přihlášce č. 44 647.

Sxpresí je možno prokázat měřením produktu, který má schopnost imunochemické vazby s protilátΙ^ΐίΐ·ι·ιι ι .

- 54 kami proti proinzulínu. Užívá ae rádio/imunologických zkoušek, při nichž je protilátka radioaktivně značena a komplex antigenu a protilátky ae sráží preparátem Staphylococcua aureua C, který byl usmrcen teplem, jak bylo popsáno v publikacích .Jfíorgan a Lazarow, Diabetes 1?« 115 (1963) a

J

Kesslar, S.W., J. Immunol., 115« 1617 (1975). K detekci exprese v bakteriálních koloniích bylo rovněž užito radioimunologických zkoušek, popsaných v publi kacích Erlich, J. A. a další, Cell 10, 681 (1978) a Broom S. a Gilbert 7/., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 75, 2746 41978).

Složené bílkoviny, které jsou průkazem exprese je možno prokázat srovnáním molekulové hmotnosti hostitelské bílkoviny na a-terminální části složené bílkoviny v hostitelských buňkách transformovaných plazmidy s včleněnou částí a bez této včleněné části. Výhodným způsobem je použít jako hostitele Escherichia coli kmen P678-54, který se vyznačuji minibunkami. Radioaktivně značené aminokyseliny se vlčení do bílkovin těchto buněk, takže je možno srovnat kmeny, transformované vektorem s včleněným sledem, který je kódem pro proinzulín

a bez tohoto včleněného sledu. Získané b í rkbvfhýaefrakci o nu jí elektroforézou na SDS-akrylamidovém gelu a poloha bílkoviny se zjišťuje autoradiograficky. Exprese proinzulinu se prokazuje přítomností značené bílkoviny, kterou je možno prokázat pouze v buňkách, transformovaných plasmidem s včleněným genem pro proinzulin. Poloha elektroforetického pásu je mírou molekulové hmotnosti bílkoviny, k jejíž expresi dochází a je v souladu se známou délkou včleněného genu a s délkou N-terminálni prokaryotické Části.

Odstraněni prokaryotické části a přeměna proinzulinu na inzulín in vitro se provádí známým způsobem, jak bylo svrchu podrobně uvedeno.

Průmyslová využitelnost

Způsob výroby lidského proinzulinu, při kterém se pěstuje - za podmínek vhodných pro expresi mikroorganismus, transformovaný vektorem pro expresi, obsahujícím sled desoxynukleotidů, který je kódem pro liský proinzulin a popřípadě se získaná bílkovina po expresi čistí.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby lidského proinzulínu, vyznačuj ící se tím, že se pěstuje za podmínek vhodných pro expresi mikroorganismus, transformovaný vektorem pro expresi, obsahujícím sled desoxynukleotidů, který je kódem pro liský proinzulín a popřípadě se získaná·bílkovina po expresi čistí.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se použije vektoru pro expresi s obsahem následujícího sledu:

   5 »-ATG2₂₄GČL~₃X„₂₂TY_₂₂TGG_₂₁ATG_₂₀W_₁₉GZ_₁₉X_₁gTY_₁₈ j x_₁₇ty_₁₇ccl_₁₆x_₁₅ty_₁₅x_₁₄ty^₁₄gcl_₁₃x_₁₂ty_₁₂x_₁₁ty_₁₁

   GCL_-1()X_₉TY_₉TGG_₈GGL_₇CCL_₆GAK_₅CCL_₄GCL_₃GCL_₂GCL_₁TTK_<i

   GTL₂AAK₃CAJ₄CAK₅XgTY₆TGK₇GGL₈QR₉S₉CAK₁₀X₁₁TY₁₁GTL₁₂GAJ₁₃ ^GCL14X₁5^TYl5^TAK₁₆ ^X17^TYl7^GTL18^TGK19^GCL20^GAJ2l^W22GZ22GCL23 !

   ttk₂₄ttk₂₅tak₂₆acl₂₇ccl₂₈aaj₂₉acl₃₀w₃₁gz₃₁w₃₂gz₃₂gaj₃₃ ·

   GCL₃₄GAJ₃₅GAK₃gX₃₇TY₃₇CAJ₃₈GTL₃₉GGL₄₀CAJ₄₁GTL₄₂GAJ₄₃X₄₄ | ty₄₄ggl₄₅g9j,₄₆ggl₄₇ccl₄₈ggl₄₉gcl₅₀ggl₅₁qr₅₂s₅₂x₅₃ty₅₃caj₅₄; ^CCL55^X56^TY56^GCL57^X58^TY58^GAJ59^GGL60^QR61^S61^X62^TY62^CAJ63^AAJ64: ^W65^GZ65^GGL66^A™67^GTL68^GAJ68^CAJ70^TGK71^TGK72^Af^L73^QR74^S74 ATM₇₅TGK₇gQR₇₇S₇₇X₇₈TY₇₈TAK₇₉CAJ₈₀X₈₁TY₈₁GAJ₈₂AAK_£3TAK₈₄ i

   TGK₈₅AAKggTAG43* ' ’ kde znamená A deoxyadenyl,

   G deoxyguanyl,

   C deoxycytoxyl,

   T thymidyl,

   J A nebo G,

   K T nebo C

   L A, T, C nebo G,

   M A, C nebo T,

   Χ_π T nebo C v případě, že Y_n znamená A nebo G a C v případě, pádě, že. X_n znamená T,

   W_n C nebo A, v případě že Z_n znamená G. nebo A a C v případě X_n znamená C nebo T,

   Z_n A, G, C nebo T v případě že W_n znamená C a A nebo G v případě že W_n znamená A,

   QR_n TC v případě, že S_n znamená A, G, C nebo T a AG, v přípapadě, že S_n znamená T nebo C,

   S_n A, G, C, nebo T v případě, že QR_n znamená TC a T nebo C v případě, že QR_n znamená AG, .

   n polohu aminokyseliny ve sledu lidského proinzulínu, již odpovídá triplet ve sledu nukleotidu podle genetického kódu, přičemž poloha aminokyseliny se čísluje od koncové ainokyseliny.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se použije vektoru pro expresi s obsahem následujícího sledu:

   GTL₂AAX,CAJ₄CAX₅X₆TY₆TGX₇GGL₈QR_gS₉CAX₁₀X₁₁ ΤΥ_χι GTL₁:₉GAJ_{1 3} ^GC114^Xí5^T-15^TA;<1S^X17^TY17^CTL13^TGK1S^GCL20^GAJ21^M22^G222^GCI'23 ==-=24==^25====20=-==27===28=-=29=-==-30^31=^31^32==32==-=33 ===34=*=’=35==“=36^Χ37==37==-=33===39===40='==41===42=-^=43^Χ44 τϊ₄₄σ-δΐ.₄₅θ3^₅ααι₄7^4₃οσι_4θσοΕ._η5σι.,<23!₅,3„χ.,τϊ„«ΐΓ₅, '50 oP 52 52 53’*53

   CCL-_X--TY_!.,GCL_!_₇X__flTY-_aG-AJ__QGGL-_nQR_c. S_C1 X.₇TY--CAJ-,AAJ„ , □□ oo oo o7 03 o3 o9 60 SI 61 62 62 63 64 ^W65=^65===66=-=“67===63=='=68==-=70=='-=71==-=72='==73=^74=74 =-=75==-=76=47^S77^X78==7S=^A-=79===80^X81==81==-=32=-=-=83==-^X34

   TGí- TAG-3’ o 0 O O kde znamená A deoxyadenyl,

   G deoxyguanyl,

   C deoxycytoxyl.

   Τ thymidyl,

   J A nebo G,

   K T nebo C

   L A, T, C nebo G,

   M A, C nebo T,

   X_n T nebo C v případě, že Y_n znamená A nebo G a C v případě, že Y_n znamená C nebo T,

   Y_n A, G, C nebo T v případě, že X_n znamená C a A nebo G v při.. padl, že Xn znamená T, ,., x,, .-. -1,:.,.- - AízA:/· ^'í^naaiené' Č nebo Ty-·-·ί r--r - - --.·.·

   Z_n A, G, C nebo T v případě že V„ znamená C a A nebo G v případě že W_n znamená A,

   QR_n TC v případě, že S_n znamená A, G, C nebo T a AG, v připa, pádě, že S_n znamená T nebo C,

   S_n A, G, C, nebo T v případě, že QR_n znamená TC a T nebo C v případě, že QR_n znamená AG, n polohu aminokyseliny ve sledu lidského proinzulínu, již odpovídá triplet ve sledu nukleotidu podle genetického kódu, přičemž poloha aminokyseliny se čísluje od koncové ainokyseliny.
4. 4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že se získaná bílkovina hydrolyzuje za vzniku proinzulínu.
5. 5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se užije mikroorganismu transformovaného pcHI-1.
6. 6. Způsob podle nároku 1 nebo 2.vyznačující se t í a, 2e se užije mikroorganismu transformovaného pcHP-1.
7. 7. Způsob podle nároku 1 až 6,vyznačující se tím, že se užije mikroorganismu Escherichia coli.
8. 8. Způsob podle nároku 1 až 7,vyznačující se tím, že se užije mikroorganismu Escherichia coli 1776 nebo Escherlchia coli HB-1O1.