CZ548884A3 - Process for preparing human proinsulin - Google Patents
Process for preparing human proinsulin Download PDFInfo
- Publication number
- CZ548884A3 CZ548884A3 CS845488A CS548884A CZ548884A3 CZ 548884 A3 CZ548884 A3 CZ 548884A3 CS 845488 A CS845488 A CS 845488A CS 548884 A CS548884 A CS 548884A CZ 548884 A3 CZ548884 A3 CZ 548884A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sequence
- proinsulin
- ggl
- gcl
- amino acid
- Prior art date
Links
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 125000002480 thymidyl group Chemical group 0.000 claims 2
- 101100121429 Arabidopsis thaliana GCL2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241001611408 Nebo Species 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 36
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 abstract description 20
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 19
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 67
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 67
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 52
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 38
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 33
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 33
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 33
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 23
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 20
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 20
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 16
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 16
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 16
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical class CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 14
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 12
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 11
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 11
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 11
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 3
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Natural products NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- -1 malt amino acid Chemical class 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 101100384273 Dictyostelium discoideum clua gene Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 2
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N Adenosine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 240000005369 Alstonia scholaris Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 1
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004225 Cathepsin B Human genes 0.000 description 1
- 108090000712 Cathepsin B Proteins 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CTCBPRXHVPZNHB-VQFZJOCSSA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate;(2r,3r,4s,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O.C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O CTCBPRXHVPZNHB-VQFZJOCSSA-N 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007630 basic procedure Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008384 membrane barrier Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu výroby lidského proinzulínu pomoci izolovaného a čištěného (dále klonovaného) lidského genu, který je kódem pro proinzulín a pro preproinzulín, a způsobu výroby a přenosu genu a jeho replikace v mikroorganismu. Klonované geny podléhají v hostitelském mikroorganismu expresi v případě, že jsou vázány na exprese schopný prokaryotický gen. Oba svrchu uvedené geny je možno užit k výrobě lidského inzulínu pro léčebně účely.
Dosavadní stav techniky
Inzulín je hormon, který je produkován především buňkami B slinivky břišní. Je známo Široké použiti této látky v případě cukrovky. Přestože se na jatkách odebírají slinivky břišní skotu a
- vepřům jakožto zdroj inzulínu, je nedostatek tohoto hormonu, protože šoupá na celém světě počet nemocných cukrovkou. Kromě toho někteří tito nemocní trpí alergií na inzulín skotu a vepřů, takže je velmi žádoucí získat lidský inzulín v množství, které by mohlo krýt alespoň nejnutnějši část jeho spotřeby. Způsobem podle vynálezu je možno získat geny, včlenitelné do mikroorganismů za účelem získáni lidského inzulínu.
Inzulín sestává ze dvou po 1ypeptidových řetězců A a B, které jsou spojeny disulfidickými můstky. Řetězec A sestává z 21 aminokyselin a řetězec B z 30 aminokyselin. Tyto řetězce se in vivo nesyntetizují nezávisle, ale jsou odvozeny od prekursoru, kterým je proinzulín, Proinzulín je jednoduchý po 1ypeptidový řetězec, který obsahuje C-peptid, který spojuje řetězce A a B (D.F. Steiner a kol., Science 157, str. 697, 1967). Tento C-peptid se odštěpuje v průběhu převodu inzulínu do granul buněk B slinivky břišní před jeho vylučováním, (H.S. Tager a kol., Ann. Rev. Biochem. 43, str. 509, 1974). Podle současného názoru zajištuje Cpeptid pouze trojrozměrnou strukturu molekuly. Sled aminokyselin v lidském proinzulínu je uveden v tabulce I. V této tabulce tvoří řetězec B aminokyseliny 1 až 30, C-peptid tvoří aminokyseliny 31 až 65 a řetězec A je tvořen aminokyselinami 66 až 86.
Ό
jí.:
«4Χί'^ν·... ·
K3t ězec A sestává z 21 aminokyselin a řetězec 3 z 30 aminokyselin. Tyto řetězce se in vivo nesyntetizují nezávisle, ale jsou odvozeny od prekursoru, kterým je proinzulin. Proinzulín ja jednoduchý polypaptido vý řetězec, který obsahuje C-peptid, který spojuje řetězce A a 3, jak bylo uvedeno v publikaci D.F. Steiner a další, Science 157. 697 (1567). Tento C-peptid se odštěpuje v průběhu převodu inzulínu do granul buněk B slinivky břišní před jeho vylučováním, jak bylo popsáno v publikaci H. S. Tagsr a další, Ann. Rev. Biochem. 12» 509 (1574). Podle současného názoru na funkci C-peptidu zajišťuje C-peptid pouze trojrozměrnou strukturu molekuly. Slad aminokyselin v lidském proinzulín.u je uveden v následující tabulce I. V této tabulce tvoří řetězec B aminokyselinu 1 až 30, C-peptid tvoří aminokyseliny 31 až 65 a řetězec A ja tvořen aminokyselinami 66 až S6„ r-Λ.·'· *«*:;· '
Tabulka 1
10 Ní^-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu20
-Val-Glu-Ala-Lau-Tyr-Lau-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly30
-Pha-Pha-Try-Thr-Pro-lys-Thx-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu40
-Asp-Lau-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Lau-Gly-Gly-Gly50
-Pro-Gly-Ala-Gly-Sar-lau-Gln-Pro-Lau-Ala-Lau-Glu60 70
-Gly-Sar-Lau-Gln-Lyg-Arg-Bly-Ila-Val-Glu-Gln-Cys80
-Cys-Thr-Ser-Ila-Cys-Sar-Lau-Tyr-Gln- Leu-Glu-Asn86
-Try-Cya-Asn rl
Chemická syntéza tohoto sladu 86 aminokyšaliny ja běžným způsobem možná, i když je obtížná,
V pankraatických buňkách B naní původním produktem vlastní proinzulín, avšak praproinzulín, ktsrý obsahuje .ještě více než 20 dalších aminokyselina na tom konci proinzulínu, na němž sa nachází aminoskupina, jak bylo popsáno v publikacích S. J. Cahn a další. Proč. Nat. Acad. Sci. USA 73, 1964 (1976) a P. T. lomadico a další, Nucl. Acid. Ras. 2» 381 (1976). Tento slad aminokyselin se nazývá signálním paptidam.
V lidském pra pro inzulínu má signální paptid 24 aminokyselin, jak ja znázorněno také na obr. 2, jda o následující slad:
-24 -20
NH2-Mat-Ala-leu-Trp-líet-Arg-Lsu-Lau-Pro-Leu-lau-1§> -1 -Ala-Iau-Lau-Ala-Leu-Trp-C-ly-Pro-Asp-Pro-Ala-Ala-Ala.
Tanto slad 24 aminokyselin ja patrně specifickým signálem pro přenos syntetizovaného polypeptidů do andopla zmat icicého retikula buněk Bav průběhu transportu vektorem sa od pro inzulínu odštěpuje, jak bylo popsáno v publikaci G. Blobal a další, J. Cell. Biol. 67, 835 (1975).
Je známa řada signálních psptidů u eukaryotických bílkovin, které je možno transportovat membránovými bariérami. V bezbuněčném systému byl objeven specifický enzym, který hydrolyzuje peptidovou vazbu mezi signálním -peptidem a aktivní bílkovinou při průchodu buněčnou membránou, jak bylo popsáno v publikaci G. Blobel a další. Proč. Hat. Acad. Sci USA 75. 361 (1978).
Současné pokroky v biochemii, zejména pokud jde o DNA umožnily syntézu specifických bílkovin za řízených podmínek, které jsou nezávislé na vyšším organismu, z něhož jsou běžně izolovány. Při této syntéze se užívá enzymů a subcelulárních složek živých buněk, které se obvykle účastní syntézy bílkovin, a to bud in vit ro v bezbuněčném systému nebo in vivo v mikroorganismu.
V obou případech je klíčovým stupněm získání desoxyribonukleové kyseliny (DNA) se specifickým sledem s obsahem informace, která je nutná pro získání požadovaného sladu aminokyselin. Tato specifická DNA je gen. Kodový vztah, tvořený sledem áasoxynukleotidů, se užívá k vyjádření sladu aminokyselin v bílkovině a je založen a
na základním počtu principů, které jsou společné všem živým organismům.
λ.......
Klonovaného genu je možno užít k určení sledu aminokyselin v bílkovinách in vitro. Systémy pro tuto syntézu jsou dobře známy a byly popsány například v publikaci G. Zubay, Ann. Rev. Genetics £, 267 (1573. Mimoto je-možno způsobit, aby DNA s jednoduchým řetězcem působila jako mRNA in vitro, čímž je možno dosáhnout velké přesnosti sledu DNA, jak bylo popsáno v publikaci J. Salaš, a další, J. Biol. Chem. 243> 1012 (1968). Mimoto je možno užít dalších známých způsobů ke zvýšení výtěžku výsledného produktu.
Vývoj tohoto oboru umožňuje izolovat specifické geny nebo jejich části z vyšších organismů, například člověka a dalších savců a přenést tyto geny nebo jejich fragmenty do mikroorganismu, například bakterií nebo kvasinek. Tímto způsobem dochází k replikaci přeneseného genu a k jeho propagaci při replikaci transformovaného mikroorganismu. Tí#mto způsobem může transformovaný mikroorganismus získat tu vlastnost, že produkuje bílkovinu, pro níž je kódem gen nebo jeho fragment, přičmež může jít o enzym, hormon, antigen, .protilátku nebo o část těchto bílkovin, Mikroorganismus předává svou schopnost dalším generacím, takže ve skutečnosti vzniká nový kmen s požadovanou
J» '
- 8 schopností, jak bylo popsáno například v publikacích Ullrich A. a další, Science 196, 1313 (1977), a Seeburg. Ρ. H. a další, Nátuře 270, 486 (1977). Základním faktem, který umožňuje použití této technologie pro praktické účely je skutečnost, ža DNA všech živých organismů od mikroorganismů až po Člověka je chemicky podobná a skládá se ze čtyř stejných nukleotidů, Pod= statný tozdil spočívá pouza ve sledu těchto nukleotidů *
v polymerní molekule DNA. Tento sled nukleotidů je možno užít k vyjádření specifického sledu aminokyselin určité bílkoviny. Přestože se většina bílkovin různých organismů liší, kódové vztahy mezi sledem nukleotidů a sledem aminokyselin jsou v zásadě stejné pro všechny organismy. Například tentýž sled nukleotidů, který je kódem pro sled aminokyselin lidského růstového hormonu v hypofýze po přenesení do mikroorganismu je kódem pro týž sled aminokyselin.
Používané zkratky jsou uvedeny v následující tabulce 2,
- 9 Tabulka 2
DNA - dasoxyribonukleová kyselina
SNA - ribonukleová kyselina cDNA - komplementární DNA (enzymaticky syntati zovaná ze sledu mSNA) mRNA - RNA pro přenos (poslíčkova RNA) dATP - desoxyadenosintrifosfát dGTP - dasoxyguanosintrifosfát dCTP - desoxycytidintrifosfát
A - Adenin
T - Tnymin
G - Guanin
C - Cytosin
U - Uráčil
ATP - adenosintrifosfát
TTP - trymidintrifosfát
SDTA - kyselina athylendiamintetraoctová
Kódové vztahy mezi sladem nukleotidů v DNA a sledem aminokyselin v bílkovině jsou souhrnně známy jako genetický kód a jsou uvedeny v následující tabulce 3.
Tabulka 3
| Genetický kod | |
| fenylalenin (Phe) | TTK |
| leucin (Leu) | ZTY |
| isoleucin (Ile) | ATM |
| methionin (Met) | ATG |
| valin (Val) | GTL |
| sarin (Ser) | QRS |
| prolin (Pro) | CCL |
| thraonin (Thr) | A CL |
| Alenin (Ala) | GCL |
| Tyrosin (Tyr) | TAK |
| Terminační signál | TAJ |
| terminační signál | TGA |
| histidin (His) | CAK |
| glutamin (Gin) | CAJ |
•'“yjRI*’· ’ί lJ7Í*Jř*’**^*·'
| Asparagin (Asn) | AAK |
| Lysin (Lys) | AAJ |
| kyselina asparagová (Asp) | GAK |
| kyselina glutamová (Glu) | GAJ |
| cystein (Cys) | TGK |
| tryptofan (Try) | TGG |
| Arginin (Arg) | WGZ |
| Glycin (Gly) | GGL |
Poznámka:
Každý triplet desoxynukleotidů o 3 písmenech odpovídá trinuklaotidu mSNA se zakončením 5' na levé straně a zakončením 3 na pravé straně. Všechny uvedené slady DMA jsou slady, jejichž řetězec ědpovídá sledu mHlTA s tím rozdílem, že se uráčil nahradí t/hyminem. Písmena znamenají purinové a pyrimidinové baze řetězce.
A adenin
G guanin
G cytosin /
- 12 T thymin χ T nebo C v případě, že Y znamená A nebo G χ C v případě, že Y znamená G nebo T γ znamená A, G, C nebo T v případě, že X znamená C γ A nebo G v případě, ža X znamená
T
W C nebo A v případě, že Z znamená
A nebo G
7/ C v případě, že Z znamená C nebo T
Z A, G, C nebo T v případě, že
7/ znamená C
Z A nebo G v případě, že W znamená A qr TC v případě, ža S znamená
A, G, C nebo T
- 13 AG v případě, že S znamená T nebo C
A, G, C nebo T, v případě, že QR znamená TC
T nebo C v případě, že QR znamená AG,
A nebo G
T nebo C
A, T, C nebo G
A, C n9bo T.
Důležitou vlastností kódu pro současné účely je skutečnost, že každá aminokyselina je určena sledem tří nukleotidů, který se také nazývá nukleotidový triplet. Posfodiesterové vazby, které spojují sousední triplety, jsou chemicky nerozeznatelné od dalších vazeb mezi nukleotidy LÍTÁ. Z tohoto důvodu není možno odečíst sled nukleotidů jako kod pro některou aminokyselinu nebo pro sled aminokyselin bez další informace, která určuje začátek sledu, a tedy
QR
S
S
J
K
L
M
«I .
- 14 i skupiny tripletů, která jsou užívány buňkou' k .rozeznání významu, který má mSHA pro řízení syntézy bílkovin.
Řada technik v chemii DNA užívá dvou tříd sloučenin, a to vektorů pro přenos a restrikčních enzymů. Vektor pro přenos je molekula DNA, která mimo jiné obsahuje genetickou informaci, která zajištuje její vlastní replikaci při přenosu do hostitelského mikroorganismu. Příkladem pro vektory pro přenos, tak jak se běžně užívají v genetice bakterií, jsou plasmidy a DNA některých bakteriofágů. Přestože plasmidy byly užity jako vektory pro způsob podle vynálezu, je zřejmé, že bylo možno užít i jiných typů vektorů, schopných přenosu. Plasmid je termín, který je užíván pro jakoukoliv jednotku DNA, schopnou autonomní replikace, kterou je možno najít v mikrobiální buňce a která je odlišná od vlastního genomu hostitelské buňky. Plazmid tedy není geneticky vázán na chromozom hostitelské buňky. DNA plazmidu existuje jako prstencovitá struktura s dvojitým řetězcem o molekulární hmotnosti řádu několik milionů daltonů, přestože některé z nich mají molekulární hmotnost větší než 10 daltonu. Molekuly této velikosti obvykle představují jen malé procento celkového množství DNA v baňce.
DNA, která je vektorem pro přenos, je obvykle oddělív telná od DMA hostitelské buňky vzhledem k velkému
- 15 rozdílu ve velikosti ódou molekul. Vektory nesou genetickou informaci, která dovoluje jejich replikaci v hostitelské buňce, a to ve většině případů nezávisle na rychlosti dělaní hostitelských buněk. Některé plazmidy mají tu vlastnost, že jejich replikaci a rychlost této replikace je možno řídit změnami růstových podmínek. Plazmidová DNA existuje jako uzavřený kruh. Vhodným způsobem je však možno tento kruh otevřít, vložit fragment heterologní DBA a kruh opět uzavřít, čímž vzniká zvětšená molekula, která obsahuje včleněný segment DBA. Například DBA nakteriofágu může nést segment heterologní DBA, který je zařazen v místě některých nepodstatných genů fágu. Vektor může tedy sloužit jako nosič včleněného fragmentu heterologní DBA·
Přenos se uskutečňuje způsobem, který je znám jaro transformace. V průběhu transformace se do bakteriálních buněk, smíšených s plazmidovou DBA, včleňuje celá molekula plazmidu. Přestože mechanismus tohoto způsobu zůstává na zhám, je možno zvýšit na maximální množství podíl bakteriálních buněk, které jsou schopná přijmout plazmidovou DBA a tím se transformovat. Jakmile se do buňky včlení plazmid, dochází k jeho replikaci v buňce a k jano distribuci do
dceřiných buněk při dělení mateřské buňky. Jakákoliv genetická informace, která je přítomna ve sledu nukleotidů plazmidu může tady být zásadně replikována a dále
V přenášena hostitelskou bunko.u. Transformovaná hostitelská buňka;se tedy pozná podle vlastností, přenesených plazmidem. Touto vlastností může být například odolnost proti některému z antibiotik. Různé plazmidy ja opět od sebe možno rozeznat rozdílnými schopnostmi nebo rozdílnou kombinací schopností, které předávají hostitelským buňkám, v nichž jsou obsaženy. Jakýkoliv daný plazmid je tedy možno získat ve větším množství tak, že se pěstuje čistá kultura buněk, které tento plazmid obsahují s následným izolováním plazmidové DUA z uvedených buněk.
Restrikční endonukleázy jsou hydrolytické enzymy, utere jsou schopné katalyzovat štěpení molekulové DRA tak, že dochází k jejich štěpení na zcela určitém specifickém místě. Místo působení restrikční endonukleázy je určeno existencí specifického sledu nukleotidů. Tento sled je nazván specifickým místem působení restrikční endonukleázy. Ryly izolovány restrikční endonukleázy z různých zdrojů a charakterizovány, pokud jde o specifická místa jejich.působení ve sledu nukleotidů. Nekteré restrikční endonukleázy
hydrolyzují íosfodiesterové vazby v obou řetězcích v témž místě, čímž dochází k odpovídajícím zakončením. Jiné enzymy katalyzují hydrolýzu vazeb, které jsou od sebe odděleny jen několika nukleotidy, čímž vznikají volné oblasti s jediným řetězcem na každém konci štěpené molekuly. Tyto části molekuly mohou být užity k novému spojení hydrolyžované LNA, protože se navzájem doplňují. Protože jakákoliv DNA, schopná štěpení uvedeným enzymem musí obsahovat totéž místo působení, je možno získat naprosto stejná zakončení a tím je možno k sobě připojit hetsrologní sledy DNA po působení touž restrikční endonukleázou a dalšími podobně zpracovanými sledy nukleotidů, jak bylo popsáno v publikaci Roberta H. J., Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (lS7o). ?.9strikční endonukleáza a restrikční místa jsou poměrně vzácná, avšak obecná použitelnost restrikčních endonukleáz byla široce rozšířena možností chemické syntézy oligonuklsotidů s dvojím řetězcem a se zakončením, která odpovídají místu pŮ3ob9ní restrikční endonukleázy. Tímto způsobem je zásadně možno spojit jakýkoliv segment DNA s jakýmkoliv jiným segmentem prostým použití příslušného zbytku po působení restrikční endonukleázy a jeho připojení za zakončení molekuly, které rovněž vzniklo
I
- 18 působením rastrikční endonukleázy, jak bylo popsáno v publikacích Haynaker H. L. a další, Nátuře 263s>
748 (1976) a Scheller R. H. a další, Science 19 6 a 177 (1977). Důležitou vlastností rozdělení specifických míst pro působení restrikčních endonukleáz je skutečnost, že tato místa jsou rozložena zcela náhodně vzhledem ke způsobu odečítání genetické informace. V důsledku toho může dojít ke štěpení restrikční endonukleázou mezi sousedními kodony nebo uvnitř jediného kodonu.
Jsou známy obecnější metody pro štěpení DNA a pro modifikaci koncového sledu. K náhodnému štěpení DNA je možno užít celou řadu nespecifických endonukleáz, jak bude dále uvedeno. Koncové sledy je mošno modifikovat vytvořením oligonukleotidových zakončení dA na jednom konci a dT na druhém konci nebo je možno vytvořit zakončení dG a dC a tak vytvořit restrikční místa bez nutnosti použití specifických sledů při spojení těchto zakončení·
Pojem exprese” je, užíván za současného vědomí, ža organismus málokdy nebo nikdy využívá všech svých genetických schopností v daném okamžiku. I v poměrně jednoduchých organismech, například u
- 19 bakterií nedochází k syntéze C9lé řady bílkovin, které je buňkq schopna vyrábět, avšak k jejich produkci může dojít za určitých zevních podmínek. 7 případě, že se bílkovina, jejímž kódem je daný gen, skutečně produkuje, dochází k tak zvané expresi genu. Jestliže se bílkovina neprodukuje,k expresi genu nedochází. Obvykla je řízena exprese genů. v E. coli tak, jak bude dále popsáno, a to tak, že bílkoviny, jejichž funkce není užitečná v daném prostředí, nejsou prodUr kovány a ušetří se metabolická energie.
Způsob, jímž je řízena exprese genu u Escherichia coli, je poměrně znám v důsledku širokých výzkumů v posledních dvaceti letech, jak bylo popsáno v publikacích Hoyes S., The Genetice of Bactsria and Their Yiruses, 2. vydáni, John Wiley a Sons, lne.,
New York (1968) a Watson J. D., The Molecular Biology of the Gene, 3. vydání, Benjamin, Manlo Park, California (1576). Tyto pokusy prokázaly, že některé geny, a to obvykle ty, které jsou kódy pro bílkoviny a příbuznou funkcí v buňce,jsou spojeny do kontinuálního sledu. Název pro.tento sled je operon. Všechny geny operonu so odečítají v tomtéž sledu, přičemž se začíná od kodonu, cterý ja kódem pro h-terminální aminokyse • I
- 20 linu první bílkoviny a pokračuje se*stála ve stejném směru až do C-terminálníbo zakončení poslední bílkoviny v operonu. Na začátku operonu, v blízkosti kodonu oro N-terminální aminokyselinu, existuje oblast DNA, která sa nazývá kontrolní oblast, která obsahuje řadu řídicích prvků a to operátor, promotor a sledy pro ribosomální místa vazby. Funkcí této oblasti je dovolit expresi svrchu uvedených &enů v závislosti na potřebách organismu. Například geny, které jsou kódem prc enzymy, jichž je zapotřebí Výlučně pro využití laktózy, se účastní exprese pouze tehdy, je-li přítomna laktóza nebo některý'z jejích analov gů v živném prostředí. Kontrolní oblast zajištuje, aby docházelo k expresi pouze v tomto případě.
V jiných případech nedochází ani k transkripci a k počátku translace. Exprese prvního genu ve sledu počíná počátkem transkripce a translace v poloze, která je kódem pro N-terminální aminokyselinu první bílkoviny v operonu. Současně dochází k expresi každého genu v daném směru od tohoto bodu alespoň tak dlouho, dokud sled neobsahuje terminační signál nebo jiný operon s vlastní řídicí oblastí, který je určen pro jiné zevní podmínky. Od tohoto schématu může docházet k různým odchylkám, důležitá je však skuteč’ ί
- 21 nost, že gen musí zvláštním způsobem aby mohlo dojít k být například Pscherichia coli uvolněn vzhledám k řídící oblasti začátku transkripce a k translaci.
Bylo prokázáno, že je možno včlenit do operonu geny, která nejsou jeho běžnou částí, přičemž tyto geny pak mohou být tímto operonem řízeny. Klasické stanovení bylo provedeno v publikaci Jacob P., a další, J. Mol. Biol. 13, 704 (1S65). Při tomto pokusu byly přeneseny geny, které znamenaly kódy pro bicsyntézu purinu do oblasti, řízené operonem pro laktózu. 3ylo pak možno pozorovat expresi enzymu pro biosyntézu purinu v přítomnosti laktózy a represi těchto enzymů v nepřítomnosti laktózy nebo jejího analogu, přičemž enzymy se nevyráběly za zevních podmínek, které normálně k jejich výrobě vedly.
Kromě operátorové oblasti, která řídí počátek transkripce u genu v příslušném směru existují ještě kodony, které ukončují tento pochod a označují tady C-treminální zakončení dané bílkoviny, jak bylo také uvedeno v tabulce 2. Tyto kodony jsou známy jako terminační signály, někdy se jim také říká nesmyslné kodony, protože nejsou kódem pro žádnou aminokyselinu
Při rozrušení terminačního sig-
- 22 nálu mezi jednotlivými geny téhož operonu vzniká souvislá oblast, v jejímž důsledku může dojít k syntéže chimérní bílkoviny, která sestává ze dvou sledu <
aminokyselin, jejichž kódem jsou sousední geny, tyto dva sledy jsou pak spojeny peptidovou vazbou. Výroba těchto chimérních bílkovin při spojení genů byla popsána v publikaci Benzer S. a Chazpe S. P., Proč.
Nat. Acad. Sci. USA £8, 114 (1962).
Jakmile dojde k tomu, že daný gen byl isolován, čištěn a včleněn do vektoru, označuje se výsledek tohoto postupu klonováním genu a závisí také na možnosti zajistit tuto látku v dostatečném množství. Klonovaný gen se přenese do vhodného mikroorganismu, kde dochází k replikaci'genu při růstu mikroorganismu a jeho rozmnožování, během těchto pochodů je možno kdykoliv získat gen zpět běžným způsobem. Tímto způsobem se získává zdroj genu pro další modifikace a přenosy do jiných vektorů nebo na jiná místa při použití téhož vektoru.
K expresi může dojít po přenosu klonovaného genu ve správném směru a po správném umístění do řídící oblasti, takže při správném odečtení z prokario- tického genu dochází k syntéza chimérní bílkoviny,
- 23 která obsahuje sled aminokyselin, jejímž kódem je klonovaný gen. J9 možno užít řadu štěpení, specifického pro bílkoviny k odštěpení chimérní bílkoviny v žádaném místě, takže je možno uvo-lnit žádaný sled aminokyselin a pak jej- čistit· běžným způsobem. Postupy pro získávání a expresi vektoru s klonovaným genem ve správné poloze vzhledem ke kontrolní oblasti byly popsány v publikacích Polisky B., a další. Proč. Kat. Acad. Sci USA 73, 3900 (1976), Itakura K. a další, Science 198, 1056 (1977), Villa-Xomaroff, L. a další, Proč. Mat. Acad.
Sci USA 75, 3727 (1978), ^esBreau-Puijalon 0. a další, Nátuře 273, 505 (1978), Chang, A. C. Y. a další,
Nátuře 275, 617 <1978) a v US přihlášce č. 933 035 (Eutter a další), část této přihlášky byla přejata pro vysvětlení do popisu.
Celkem ja možno říci, že při produkci bílkoviny savců, například prekursoru lidského růstového hormonu pomocí DNA, je nejprve zapotřebí klonovat lidský gen. Po klonování je tento gen možno získat ve větším množství, dále modifikovat chemickým nebo enzymatickým způsobem a přenést do plazmidu, schopného exprese. Klonovaný gen je také možno použít k izolaci příbuzných genů nebo v případě
- 24 klonovaného fragmentu k získání celého genu při použití klonovaného genu k hybridizací. Hybridizací je možno při použití klonovaného genu získat také příbuzné geny nebo prokázat totožnost homologů nebo nezávisle .izolovaných materiálů. V důsledku povahy genetického kódu povede klonovaný gen po translaci ve správném směru pouze k produkci sledu aminokyselin, pro něž je kódem·
Základní práce na izolaci a Čištění krysího pro inzulínu již byla provedena, jak bylo popsáno ve svrchu uvedených publikacích A. Ullricha a dalších a Villa-Xomaroffa, L a dalších. Tyto práce se týkají izolace a čištění genu pro krysí proinzulín a způsobu přenosu u tohoto genu a jeho replikace v mikroorganismu. ullrich a další izolovali několik rakombinařitních plasmidů, které obsahovaly sled, který je kódem pro proinzulín, nepřenesenou oblast j' a část prepeptidu. Represe krysí DHA s obsahem kódu pro inzulín je popsána v přihlášce č. 533 035. Villa-Koiaroff a další izolovali rekombinantní plazmid, který obsahoval kód, který je klíčem prq sled aminokyselin 4 až 86 proinzulínu. Tento sled proinzulínu byl oddělán od aminokyselin 24 až 182 penicilinázy (3-laktamázy)
- 25 kódovým sladem pro šest glycinů. Kod pro penicilinázu a proinzulín byl pracováván tak, že došlo, k jeho expresi a ka vzniku vázané bílkoviny. Uvedené publikace popisují některé základní postupy, používané, při výrobě LNA. Nepopisují však izolaci a čištění genu pro lidský proinzulín a preproinzulín.
Odlišný přístup k získání lidského inzulínu je popsán v publikaci R. Cres a další, Proč. Nat. Acad. Sci USA 22» 5765 (1978). Při tomto postupu dochází k chemické syntéze kódů. pro řetězec A a pro řetězec S lidského inzulínu při použití kódů a Rscherichia coli. Tyto dva sledy je pak možno včlenit do plazmidů, při jejichž expresi dochází k produkci řetězců A a B. Lidský inzulín je pak možno získat správnou vazbou disulfidovým můstkem mezi oběma bílkovinnými řetězci.
Klonovaný gen pro lidský preproinzulín je cenný pro různé účely, Je možno jej přenést do vektoru a tak získat syntetizovaný preproinzulín z mikroorganismu, který je transformován vektorem obsahujícím klonovaný gen. Při růstu transformované buňky hostitele dochází k syntéze preproinzulínu jako části chimérní bílkoviny. V případě, že
- 26 orokaryotická část vázané bílkoviny ja signální částí vylučované bílkoviny, je možnost dosáhnout sekrece této bílkoviny tak, že ja usnadněna jají stálost a čistění. Mimoto v případě, že prokaryotická část je krátká, ja -možno usnadnit celý postup v případě, že předběžný sled má stejnou funkci v prokaryotické buňce jako v eukaryotické buňce. Gen pro preproinzulín je možno užít také k získání genu pro proinzulín při použití techniky, která bude dále popsána.
Klonovaný gen pro preproinzulín je možno užít různým způsobem k produkci preproinzulínu. Preproinzulín sám o sobě je cenný, protože je možno jej převést na proinzulín známým enzymatickým a chemickým způsobem. Je možno například odstranit prapeptid rozpustný enzymatickým preparátem, jak bylo popsáno v publikaci G. Blobela a dalších, tak jak byla svrchu uvedena a specificky tak odstranit signální peptidy. Klonovaný gen proinzulínu je pak možno různým způsobem užít pro výrobu proinzulínu. Proinzulín ja cennou látkou, protože je možno jej převést na inzulín známým enzymatickým a chemickým způsobem, jak bylo popsáno v phblikaci Kemmber W. a další, J. Biol. Chem. 242, 6786 (1971).
Podstata vynálezu
Způsob výroby liského proinzulínu spočívá podle vynálezu v tom, že se pěstuje za podmínek vhodných pro expresi mikroorganismus, transformovaný vektorem pro expresi, obsahujícím sled desoxynukleotidů, který, je kódem pro liský proinzulín a popřípadě se získaná bílkovina po expresi čisti.
Jak již bylo uvedeno, bylo možno klonovat cDNA se sledem, který je kódem pro lidský preproinzulin a cDNA, která je kódem pro lidský proinzulín. Struktury těchto konovaných cDNA byly ověřeny analýzou sledu nukleotidů.
Původním zdrojem genetického materiálu byl liský inzulín, nádor, který produkuje inzulín. Z jeho buněk byla izolována mRNA.
DNA, komplementární k izolované mRNA (cDNA) byla syntetizována při použiti reverni transkriptázy ve dvou reakčních cyklech, takže vznikla cDNA s dvojitým řetězcem. Nerozštěpená heterogenní cDNA s dvojím řetězcem byla pak zpracována tak, že na obou koncích byl získán sled oligonukleotidů k usnadněni včleněni tohoto fragmentu do místa pro působeni stejného restrikčního enzymu ve vektoru pro přenos.
- 28 řS^
Pro klonování byl zvolán vektor s dobrou selekcí a stálou replikací. Zvolená cDNA byla volněna do vektoru na předem zvoleném miste za vzniku rekombinančního vektoru běážným způsobem. Pomocí tohoto vektoru byl transformován hostitelský mikroorganismus. Transoformanty byly podrobeny selekci podle běžných podmínek pro včlenění na předem stanovené miste Jednotlivé kolonie., odvozené od jediné transformované buňky byly odebírány a pěstovány v jednotlivých kulturách za účelem replikace uvedeného rekombinantního vektoru. Tento vektor byl pak sledován pokud jde o zachovaný inzulífaový sled hybridizací kolonií. Kolonie, které poskytovaly rekombinantní vektor pro sled inzulínu, byly pěstovány ve větších kulturách, aby bylo možno vektor izolovat a podrobit jej analýze· Příslušné kolony byly vybrány pro konečnou identifikaci sledu nukleotidů v klonovaném genu pro preproinzulín a proinzulín a pro přenos do příslušných plazmidů, schopných exprese.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby sledu nukleotidů, který je kódem pro lidský proinzulín pro syntézu lidského inzulínu tak, že 3β hydrolyzuje
- 29 zakončení 3'sladu dasoxynuklaotidů, který je kódem pro lidský prepro inzulín a pak se provádí replikace způsobem podle vynálezu v několika cyklech, nebo se postupně užije T4 DNA polymerázy k natrávení za přítomnosti desoxynukleotidtrifosfátu, pak se hydrolyzuje zakončení 5* tohoto sledu pomocí nukleázy, specifické pro DNA s jednoduchým řetězcem se zakončením 5 '.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby lidského proinzulínu, jehož řetězce A a B jsou od sebe odděleny C-peptidem, a to tak, že se inkubuje mikroorganismus, transformovaný vektorem s obsahem sledu nukleotidů, který je kódem pro lidský proinzulín za podmínek, vhodných pro sxprasi tohoto sladu, takto získaný lidský proinzulín se čistí z živného prostředí nebo rozrušených buněk mikroorganismu.
Vynález se rovněž týká způsobu výroby lidského inzulínu, a to tak, že s9 oxidují sulfhydrylové skupiny peptidů A a 3 lidského proinzulínu, připraveného svrchu uvedeným způsobem za vzniku disulfidové vazby mezi peptidy A a B a pak se odštěpí
<>
C-peptíd enzymaticky katalyzovanou hydrolýzou, specifickou pro vazby, které připojují C-p9ptid k peptid um A a B.
Předmětem vynálezu jsou tedy základní genetické prvky., jichž je zapotřebí k výrobě lidského inzulínu způsobem, který je možno přizpůsobit pro průmyslové účely. Je možno klonovat přirozeně se vyskytující strukturální geny a dosáhnout jejich v
exprese ve vhodné hostitelské ounce, čímž se získá bílkovina, kterou je možno převést na izulín známými způsoby. Způsob podle vynálezu je založen na molekule proinzulínu a jeho výhoda spočívá v tom, že C-peptidová oblast proinzulínové molekuly způsobuje její samovolné zakřigení, takže řetězce A a 3 se dostávají do správné vzájemné polohy. Při této konfiguraci je předem zajištěno správné spojení sulfhydrylových skupin a tvorba bisulfidových příčných vazeb, tak jak je tomu v molekula účinného inzulínuo Odštěpení C-paptidu se provádí použitím trypsinu nebo enzymu s podobným účinkem společné s karboxypeptidázou B nebo katepsinem B pro odstranění C-tarminál ního albuminu na řetězci B, jak je známo z literatury.
Tímto způsobem je možno klonovat celou část genu' pro lidský inzulín, která je kódem pro inzulín včetně části nepřenesené oblasti 5' pra03ptidu. Je také možno klonovat kód pro sled B, C a á a pro nepřenesenou oblast 3*. Volba hosv titelské buňky ovlivní také volbu části klonovaného genu. Celý kód pro prainzulín je možno použít k transformaci některých typů vyšších eukaryotických buněk, protože předběžný slad působí jako samostatv v ný peptid a usnadňuje vylučovaní peptidu z buňky. Mimoto ty euraryotické buňky, které jsou schopny produkovat signální peptid, budou taká katalyzovat specifické odstraňování předběžného sledu při průchodu bílkoviny buněčnou membránou. Tyto buňky budou také schopny trvale produkovat tento produkt i po odštěpení C-bílkoviny a vzniku správných disul fidových vazeb.
Při použití proxaryotických hostitelských
| buně | k se dává | přednost | použitý-kódu pro proinzulín. |
| Přsm | w iid f X 4..- | zulinu na | inzulín sa pak provádí zná- |
| mým | způsobem. | Jsou znám | y dva typy exprese, z nichž |
| ka z z | ý spočívá | v tom, že | se v.olaní kod pro proinzulín |
-ί do oblasti vektoru, jehož exprese se řídí prokaryotickým promotorem. V některých případech dochází ke změně polohy Části prokaryotického strukturálního genu a promotoru, takže výsledný produkt je bílkovina, jejíž N-terminální část sestává z B-termináln£ í
Části prokaryotické bílkoviny a C-terminální částí je klonovaný sled, v tomto případě pro inzulín,, Hxprese pro inzulínu jako lidské bílkoviny má tu výhodu, že složená bílkovina ja daleko stálejší v ho^telské buňce než vlastní pro inzulín. Mimoto v případě, že pro karyot ickou bílkovinou je bílkovina, která je běžně vylučována hostitelskou buňkou, může být složená bílkovina rovněž vylučována, čímž je snadnější čištění výsledného produktu. Užití složení bílkovin má tu nevýhodu, že je nutné je specificky štěpit k získání požadovaného produktu. V případě proinzulínu je možno použít zvláštní techniky, která využívá oýhody sledu aminokyselin v bílkovině, takže je možno složenou bílkovinu specificky štěpit, jak bude popsáno v příkladu 2.
Klonovaný sled je možno rovněž podrobit expresi přímo v prokaryotické buňce tak, že se
- 33 sled včlení v bezprostřední blízkosti promotoru. Výhodou tohoto postupu je, že 'specifické štěpení odpadá. Zásadní nevýhodou je však skutečnost, že výsledný produkt je nutno dále Čistit.
Pxprese lidských genů, včleněných do Sscherichia coli je možno v současné době dosáhnout včleněním v blízkosti promotorů lac, trp a promotoru pro β-laktamázu. Promotor lac je výhodný z toho důvodu, že jeho ge-netika je velmi dobře charakterizována. Jsou dvě možná místa včlenění, přičemž se dosahuje dlouhé a krátké prokaryotické části složené bílkoviny. Je možno získat velké množství genetických variant s různou úrovní endogenních represcrů v závislosti na teplotě a podobně. Promotor trp má tu výhodu, ža při jeho použití je možno dosáhnout vysoké úrovně exprese. Plazmidy, které mají místo včlenění v promotoru trp, je možno získat pro všechny tři způsoby odečítání. Promotor pro β-laktamázu poskytuje prokaryotickou signální vílkovinu, protože laktamáza je běžně vylučována nebo je možno ji prokázat v periplazmatickém prostoru. V důsledku toho není zapotřebí většího čištění k získání čistého oroinzulínu.
Způsob podle vynálezu využívá funkce C-peptidu proinzulínu zejména k usnadnění samovolného zakřivení molekuly proinzulínu tak, že se řetězce A a B dostávají do správné konfigurace a je pak možno dosáhnout tvorby správných příčných disulfidových vazeb, tak jak je tomu v přírodním inzulínu. Srovnání C-peptidu různých druhů ukazuje, že tento peptid není důsledně zachováván v průběhu vývoje. Z tohoto důvodu je možno různé aminokyseliny v tomto sledu nahradit jinými. Funkcí tohoto peptidu je zřejmě pouze vznik řetězce aminokyselin správné délky tak, aby bylo dosaženo správné vzájemné polohy řetězců A a B. V důsledku toho pravděpodobně by bylo možno včlenit na místo tohoto peptidu jakýkoliv jiný sled, aniž by došlo k podstatné změně jeho funkce. Použití přírodního C-peptidu vsak má určité výhody, například tu, že není zapotřebí úplně odstranit tento peptid z výsledného inzulínu, protože jde o přírodní složku inzulínových přípravků, iíimoto může tento captid poskytovat určité výhody při štěpení enzymy.
- 35 Způsob podle vynálezu dále prokazuje univerzalitu genetického kódu. Kodony, kterým dávají přednost buňky savců, jsou velmi správně reprodukovány Escherichia coli. V některých případech ja možno některé kodony, které jsou kódem pro tutéž aminokyse linu nahradit 'oez ovlivněni sledu nebo funkce výsledné bílkoviny. Z toho vyplývá, že způsob podle vynálezu zahrnuje ,i všechny syntetické variace kódu, pokud je výsledkem lidský preproinzulín a lidský proinzulín.
Vynález bude osvětlen následujícími příkla dy.
Příklad 1
Klonovaný gen pro lidský preproinzulín
Lidský gen pro inzulín byl klonován z RNA, izolované z lidského inzulinomu způsobem podle svrchu uvedené Ullrichovy publikace pro izolaci RNA buněk ostrůvků. RNA, získaná po odstředění v 5,7 M CaCl s obsahem 100 mM EDTA byla použita bez další frakcionace jako předloha
XS^ÍM '·«+—*c«s<p!. jwbw ’
-'-^szss-s -χχ .»-».·
- 36 Způsob podle vynálezu dále prokazuje univerzalitu genetického kódu. Kodony, kterým dávají přednost buňky svaců, jsou velmi správně reprodukovány Bscherichia coli. V některých případech je možno některé kodony, které jsou kódem pro tutéž aminokyselinu nahradit bez ovlivnění sledu nebo funkce výsledné bílkoviny. Z toho vyplývá, že způsob podle vynálezu zahrnuje i všechny syntetické variace kódu, pokud je.výsledkem lidský pra pro inzulín a lidský proinzulín.
Vynález bud9 osvětlen následujícími příklady.
Příklad 1
Klonovaný gen pro lidský preproinzulín
Lidský gen pro inzulín byl klonován z R1ÍA9 izolované z lidského inzulinomu způsobem podLle svrchu uvedené Ullrichovy publikace pro izolaci RNA buněk ostrůvků. SNA, získaná po odstředění v 5,7 M CaCl s obsahem 100 mM EDTA byla použita bez další frakcionace jako předloha pro syntézu cDřTA při
- 37 použití reverzní transkriptázy a 21 nukleázy, jak je popsáno ve svrchu uvedené Ullrichově publikaci.
Ze 130 πώίΐ nef rakc ionované RNA bylo připraveno přibližně 40 ng cDNA s dvojitým řetězcem.
Nefrakcionovaná cDNA byla zpracovávána působením terminální tran3ferázy za přítomnosti dCTP za vzniku oligo-C zakončení na konci 3'molekuly cDNA. Podobně byl rozštěpen jako vektor plazmid pBR322 působením resktrýkční endonukleázy Pst I a byl zpracováván působením terminální transferázy za přítomnosti dGTP za vzniku oligo-dG zakončení na zakončení 3* lineární plazmidové DNA. DNA plazmidu po tomto zpracování nemůže vytvořit kruhovou DNA, protože fcakončení nejsou komplementární. Zakončení oligo-dV zpracované cDNA však jsou komplementární se zakončeními oligo-dC plazmidů a je tedy možno ji užít ka vzniku cirkulárního plazmidů, v jehož místě působení enzymu Pst I je včleněna cDNA. Mimoto tímto včleněním sa regenerují obě zakončení míst pro působení Pst I a je tedy možno opět odštěpit včleněný sled, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Villa-Komarroffa a další.
'^-'♦DFfcWř '~
Tvatf-.^crs
- 38 Svrchu uvedený postup byl užit k získání plazmidu pBR322 s heterogenní skladbou cDIIA v místě působení Pst I. Tyto plasmidy mohou být citlivé na ampicilin, protože místo pro působení enzymu se nachází v genu pro β-laktamázu, avšak zůstávají odolné proti tetracyklinu. Získaným materiálem byla transformována Sscherichia coli kmen X1776. 3ylo získáno 525 transformantů, odolných proti tetracyklinu. Tyto transformanty byly podrobeny replikaci a sledovány in šitu hybridizací kolonií na správný slad nukleotidů způsobem podle publikace Srusnstein a Hogness, Proč. Hat. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975) Dříve klonovaná cLUA pro krysí prs pro insulin podle svrchu uvedené Ullrichovy publikace bylo užito jako srovnání při hybridizací, přičemž tento materiál byl označen použitím LHA polymerázy I. Protože sled aminokyselin v lidském a krysím inzulínu je velmi podob ný, inzulín je homologní na 92 % a proinzulín na 83 %, bylo předpokládáno, ža dojde ke zkřížené hybridizací cLUA krysího původu se sledem pro lidský inzulín za daných podmínek. Autorsdiografií bylo prokázáno, ža pouze dvě z 525 kolonií obsahovaly materiál z této zkřížené hybridizace. Obě tyto kolonie byly citlivé na ampicilin. Plazmidy, izolované
- 39 z kolonií. byly’ přibližně o 250 a 500 páru baží delší než vlastní pBR322. Další plazmid byl označen pcHX-1.
Slad nukleotidů ve včleněném fragmentu cDNA plazmidu pcHI-l-byl stanoven způsobem, popsaným v publikaci Maxam a Gilbert, Proč. Mat. Acad. Sci. USA 74« 560 (1977). Na obr. 1 je znázorněn schematický diagram včleněné Části. Včleněná část obsahovala celý kod pro lidský are pro inzulín spolu s částí 5 '-nepřenošené oblasti, celou J^-nepřenesenou oblast a část oblasti 3'-polydA. Na obr. 1 jsou rovněž znázorněna místa pro působení restrikčních enzymů, která umožňují odštěpení včleněné části. Je znázorněn rovněž směr sledu každého fragmentu.
N a obr. 2 je znázorněn sled mRNA, odvozený o'd sledu cDNA a sled aminokyselin, vyvo,zený na základě odečtení těchto sledů. Frimární struktura lidského proinzulínu, stanovená tímto způsobem přesně souhlasí se strukturou získanou předchozím zjištováním sledu aminokyselin, který byl popsán v publikaci M. D. Deyhoff, Atlas cf Protein
73?; -*a r^-wi '·&:''
- 40 Sequence and Structure, % Supp. 2, str. 127 až 130 (1276) a Suppl. 3, str. 150 až 151 (1578). Aminokyseliny pro inzulínového sledu jsou číslovány 1 až 86, předběžného sledu -24 až -1. Ra obr. 2 jsou rovněž znázorněna místa pro působení různých restrikčních enzymů pro konstrukci genu proinzulínu z pcHI-1. Je zřejmé, že sled cDNA v řetězci,' získaném z pcHI-1 je týž jako v obr. 2 s tím rozdílem^ že se místo uracilu U užije thyminu T.
Velká množství pcííl-l a dalších plazmidů je možno získat transformací Sscherichia coli HB-101. Kmen HB-101 je tedy výhodným hostitelem pro udržování a replikaci plazmidů, utere mají svrchu popsané včleněná části.
- 41 Příklad 2
Získání vektoru pro přenos proinzulínu
Včalšná cDNA v plazmidu pcHI-1 obsahuje celý slad, který je kódem pro lidský preproinzulín. V některých případech, například při přenosu do jiného druhu eukaryotických buněk je mošno očekávat, že bude odstraněn předběžný sled a C-paptid a tím se zísiá správná konfigurace účinného inzulínu. V jiných případech, jakým je například přenos do prokaryotických buněk jako bakterií může dojít k tomu, že produktem je nakktivní bílkovina. V tomto případě by byla výhod ná konstrukce kódu pro proinzulín, protože proinzulín je mošno snadno převést in vitro na účinný inzulín známým způsobem, například způsobem podle publikace Kemmler a další, J. Biol. Chem. 242, 6786 (1S71). Zásadně jsou zatím možné tři způsoby pro konstrukci sledu, který je kódem pro proinzulín. Vektor, který obsahuje p3E322 s včleněným uvedeným sledem sa označuje pcHP-1.
- 42 A. Chemicky syntetizovaný slad, který je kódem pro řetězec B lidského inzulínu, byl popsán v publikaci Crea R. a další, Proč. Nat. Acad. Scie USA 75., 5765 (1978). Syntetický sled nukleotidu se poněkud liší od přírodně se vyskytujícího sledu, protože syntetický sled byl volen tak, aby byly zařazeny kodony, jejichž přítomnost je příznivější pro prekaryotického hostitele, například Bscherichia coli. Před první aminokyselinou, kterou je fenylalanin, byl také zařazen triplet, který ja kódem pro methi onin. Oba sledy jsou totožné, pokud jde o sled aminokyselin 13 a 14, tato oblast obsahuje pouze místo pro působení restrikčního enzymu Alu I, které ja společné oběma sledům. Umístění tohoto místa v přírodním sledu je znázorněno na obr. 2.
Syntetická DNA proinzulínu se zpracovává endonukleázou Alu I, čímž se získají dva fragmenty o 43 párech baží a 56 párech baží. Rovněž cDHA, včleněná do pcHI-1, s výhodou získaná štěpeným enzymem Hha I, jak je popsáno v příkladu 2, se štěpí částečnou hydrolýzou, katalyzovanou endonukleázou Alu I za vzniku fragmentů o 75, 90, 110, 135,
165, 200, 245, 275, 375, a 455 párech baží.
- 43 Frakcionací elektroforězou na gelu se získá fragment o 375 párech baží, který vznikne štěpením v jediném místě, a to v kodonu pro aminokyselinu 14.
Fragmenty, získané Štěpením syntetického genu a· fragment cDNA po 375 párech baží se spojů spojí. Správné spojení syntetického fragmentu o 46 párech baží s fragmentem o 375 párech baží na co nejvyšší míru se dosáhne tak, že se fragment cDNA o 375 párech baží užije v molárním přebytku. Možnost nesprávného spojení sa rovněž sníží skutečností, že syntetické fragmenty mají' zakončení s jediným řetězcem, která nejsou komplementární se zakončeními fragmentu cDNA o 375 párech baží.
Spojením vznikne syntetický sled, který obsahuje kód pro methionin, následovaný aminokyselinami 1 až 13 a přírodní sled, který je kódem pro aminokyseliny -14 až 86 pro proinzulín. Takto syntetizovaný sled, který je kódem pro proinzulín, ja možno včlenit do jakéhokoli zvoleného plazmidu vyplněním nebo rozštěpením jednoduchých zakončení s následným spojením pomocí oligonukleotidů.
Bxpresí ae získá složená bílkovina, kterou je možno rozštěpit na zbytku a obsahem methioninu působením bromkyanu za vzniku proinzulínu. Proinzulín se převede na inzulín způsobem, který je popsán ve svrchu uvedené publikaci Kemmlera a dalších®
B. Na obr. 2 je znázorněna cDNA, včleněná do pcHI-1,'která má místo propůsobení restričního enzymu Hha X ve sledu, který je kódem pro aminokyseliny 14 a‘ž 13. Mimoto vektor pBR322 pro přenos má místo pro štěpení toutéž endonukleázou ve vzdálenosti 22 párů baží od místa pro působení Pst I při zakončení 5' včleněné části. Je tedy možno znovu izolovat sled, který obsahuje celý pro inzulínový sled ve vzdálenosti 22 párů baží od DNA pBR322 tak, ža se působí na pcHI-1 endonukleázou Rha I. Tento způsob je výhodnější naž zpětné izolování včleněné části působením endonukleázy Pst I, protože uvedená část obsahuje uvnitř dvě místa pro působení enzymu Pst I a výtěžek neporušené včleněné části při použití Pst I je z tohoto důvodu velmi nízké. Slad, izolovaný působením Hha I, sa rovněž hodí pro použití příkladu 2A a 2C.
- 45 V případě, že ae na kterýkoliv z izolátů působí endonukleázou Hha I, odštěpí se přebytečný řetězec mezi aminokyselinami 14 a 13 předběžného sledu. Tento řetězec je definován jako řetězec, jehož slad nukleotidů odpovídá sledu mRHA. Řetězec, označený zápornými čísly je řetězec, jehož sled je komplementární ke sledu mRNA. Zbývající předběžný sled ja možno specificky odstranit tak, že se využije exonuklaázové účinnosti 14 DNA polymerázy vzhle dem k zakončení 3* až 5* , protože tento enzym působí v záporně označeném řetězci předběžného sledu a na opačné straně kladně značného řetězce. Rxonukleolytickou reakci ja možno zastavit u předem definovaného nukleotidu tak, že se do reakční směsi přidá tentýž nukleotid ve formě trifosfátu. Sxonukleotyciká účinnost je pak zastavena způsobem, který ja popsán v publikaci Hngland P. T. v J. Biol. Chem.
2£, 3269 (1971) a v J. Mol. Biol. 66, 209 (1972).
Zbývající předmětný sled je možno specificky štěpit až do B-terminalního fenylalaninového kodonu aminokyseliny č. 1 třemi cyxly působením R4 polymerázy. První cyklus se provádí za přítomnosti
- 46 TTP, 'starý ukončí stepaní proti A glycinového kodonu v poloza aminokyseliny -7. Cyklu3 2 se provádí za přítomnosti dCTP, tímto způsobem se ukončí štěpení proti G v poloze kodonu -5 (Asp). Cyklus 3 se provádí za přítomnosti dATP, tímto způsobem se ukončí štěpení proti T, jde o první nukleotid v poloze 1 proinzulínu·
Po každém cyklu štěpení T4 polymerázou je zapotřebí odstranit trifosfát ukončeného cyklu a přidat trifosfát pro další štěpení. Pak sa užijí minislou ca Sephadexu G-75 (Pharmacia lne., Uppsala, Švédsko) k odstranění trifosfátu z reakční směsi. Sloupce je možno uvést do rovnovážného stavu vhodným pufrem a vzorky se odebírají v pufru, který obsahuje trifosfát následujícího cyklu. Tímto způsobem je možno dosáhnout toho, že enzym, procházející současně s DNA nerozštěpí DNA za následujícím zvolaným koncovým bodem. Aby bylo možno zabránit tomuto štěpení v nižší Části sloupce po průchodu předcházejícím trifosfátem, provádí se chromatografie v chladnu, obvykle při teplotě 4 °C a eluce sa urychlí odstředěním. Je také možno inaktivovat enzym zahřátím na 65 °C před chromatografiío Následující cyklus pak začíná přidáním čerstvého,
- 47 účinného enzymu. Výsledkem přímých cyklů štěpení T4 polymerázy se dosáhne toho, že se úplně odštěpí záporně značený řetězec DNA specificky až do prvního kodonu sledu, který je kódem pro proinzulín. Sled kladně značeného řetězce na opačné straně molekuly, který rovněž má zakončení 3' je takový, že dojde pouze k odstranění několika málo nukleotidů.
Kladně značený řetězec v místě předběžného sledu se pak specificky štěpí axonukleázou Sl, která působí na zakončení s jediným řetězcem. Je nutno dbát toho, aby nedošlo k částečnému štěpení touto nuklaázou za počátkem prvního kodonu. K tomto rozštěpení může dojít zvláště v oblastech, které jsou bohaté na A-T na koncích molekul DNA. Přechodně napárová část na kodonu č. 1, bohatém na A-T by mohlo způsobit štěpení nu^leázou £1 za místem, za nímž již nemá k9 štěpení dojít. Tomu je možno zabránit nízkou teplotou, například teplotou místnosti a nižší a tím, ža prostře dí obsahuje větší množství solí, než se běžně užívá v pufru.
Vzorky DNA, získané v následujících stupních štěpení Sl se klonují ve vmodném vektoru pro přenos
- 48 :híí ti
-- známým způsobem. Analýza sladu nejmenáího .fragmentu po štěpení enzymen Alu I v těchto klonech se užije ke kontrole klonů, které obsahují kód pro proinzulín a celý předběžný sled je odstraněn.
Velmi přitažlivým způsobem pro klonování cDNA, která je kódem pro proinzulín, je způsobs při němž ae včlení zakončení oligo-A při použití terminální transferázy na zakončení 3zcDNA. Zakončení oligo-T se vytvoří na zakončení 3* na vhodném místě ve.ctoru pro přenos, například v místě pro působení EcoRl v genu pro 3-galaktosidázu plazmidů piS-l, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené Ullriohově publikaci a US patentu č. S33 035. Včlenění cDNA, která je kódem pro proinzulín svrchu uvedeným způsobem poskytuje správně orientovaný včleněný sled, který bude odečten ve správné fázi vzhledem ka gahu pro 3-galaktosidázu plazmidů s pravděpodobností : 6. Exprese zakončení oligo-A má za následek včlenění lysinu těsně před počátek sledu pro proinzulín. Mírné štěpení trypsinem ve složené bílkovině vede k získání proinzulínu, který se převádí na účinný inzulín, jak bylá dříve popsáno. Je také možno postupovat tak, že sa působí na složenou bílkovinu kombinací trypsinu karboxypeptidázy 5 nebo kethspsinu 3 za vzniku účinného inzulínu ze složené bílkoviny v jediném reskčním stupni.
C. Sled, který ja kódem pro proinzulín, sá i
získé selektivním štěpením uvnitř sledu, který je kódem pro proinzulín, s následným navázáním chemicky syntetizovaného kódu pro tuto část proinzulínu, která byla odstraněna předchozím stepáním. Jako zdroj oblasti, která ja kódem pro proinzulín, se ušije plazmid pcHI-1, který ss selektivně štěpí působením endonukleázy Pst I nebo s výhodou působením endonukleázy Hha I, jak ja popsáno v příkladu 23.
Sz . Sr X soeoi
Kterýkoliv z fragmentů ss po izolaci alkalickou fosfatásou odstranění 5'-terminálních fosfátových skupin a pak se provádí štěpení restrikční endonukleázou, která má jediné místo stepaní
X ve sladu, který ja kódem pro proinzulín. Místo pro působení tohoto restrikčního enzymu je s výhodou uloženo v blízkosti některého zakončení sledu, který je kódem pro proinzulín. Místo pro působení enzymu Alu I v oblasti aminokyselin Ij až 14 je vhod£‘. 3HÍ7 .»4®f» o^»T7 ;.n»*«.wM« řeTTuv^w >
- 50 ným místem pro tento účel, jak je znázorněno na obr. 2. íragmant po působení Hha I plazmidu pcHI-1 se částečně rozštěpí endonukleázou Alu I za vzniku dvou fragmentů o přibližně 76 párech baží a 375 párech ba-zí. Tyto fragmenty se podrobí frakcionsci alaktroforázou na gelu, jak ja popsáno v příkladu 2B a izoluje se fragment o 375 párech baží.
Sled nukleotidů, který je kódem pro prvních 13 aminokyselin proinzulínu se zakončením 5 *G na kladně označeném řetězci k doplnění kodonu pro alanin v poloze 14 se syntetizuje fosfotrissterovou metodou, která byla popsána v publikacích Itakura, X. a další, J. Biol. Chem. 250, 4592 (1975) a Itakura K., a áalší, J. Am. Chas. Soc. 97,7327 (1575). Kladně značený řetězec syntetické DITA má sled '-TTTGTGAACCAACACCTGTGCGCCTCACACCTGGTGGAAG-5 kteiý odpovídá přírodnímu sledu. Ja však možno syntetizovat jiné slady, které jsou rovněž kódem oro tytéž aminokyseliny. Jeden ze sladů je možno vyjádřit
- 51 -TTXGTLAAKCAJCAXKTYTGHGGLQRSCAHXTYGTLCAJG
Výsledný sled se naváže na fragment o 375 párech baží, vzniklý štěpením Hha I fragmentu pc Ϊ3.Ι— i · Protože uvedený fragment má 5 * fosfát na zakončení, které má být spojeno, budou oba fragmenty spojeny ve správném pořadí. Syntetický fragment je správně navázán na vetší fragment přibližně v 50 % reakcí.
DNA po působení ligázy se pak klonuje na vhodný plazmid bud vznikem zakončení oligo-A, jak bylo popsáno v příkladu 2B nebo vazbou krátkých v
včleněných Částí, usnadňujících vazbu a včleněním do plazmidů ve správném směru. V případě za-roncení oligo-A je možno pozorovat expresi proinzulínu přibližně v 1/12 klonů. V případě přímého včlenění tam, kde je známo, že způsob včlenění byl správný je možno pozorovat expresi přibližně v 50 % klonů.
ses®» - ·?γ4*Κ**ίί** · - 52 Příklad 3
Exprese lidského preproinzulínu a proinzulínu
Klonované kódy pro preproinzulín z příkladu 1 nebo proinzulín z příkladu 2 ae včlení do vektoru za účelem exprese. V případě, že ke včlenění dojde ve správné orientaci vzhledem k počátku translace v místě včlenění a včleněná část se nachází ve správné fáze vzhledem k promotoru a k ribozomu, syntetizuje se bílkovina, kte rá je produktem klonovaného genu aktivní metabolizujícími buňkami hostitele, které byly transformovány V9ktor9m. Bílkovinným produktem je složená bílkovina v případe, ža vektor obsahuje část prokaryotického genu mezi promotorem a místem včlenění. Včlenění je však možno provést také v bezprostředním sousadství promotoru. V těchto případech dochází přímo k produkci bílkoviny, pro níž je kódem včleněný sled. Oba tyto způsoby mají výhody a nevýhody. Složené bílkoviny mají tu výhodu, ža dochází ke stabilizaci cizorodé bílkoviny, pro níž je kóder včleněný gen. mimoto má
V i
- 53 složená bílkovina další požadované funkční vlastnosti, například snadné vyměšování z buňky hostitele při použití bílkoviny hostitele jako druhé části složené bílkoviny, například 8-laktamázy. Na druhé straně je čištění sledu v tomto případě komplikované, protože je obvykle nutno odstranit tu část složení bílkoviny, která pochází z hostitelské buňky. Toto odstranění je možno provést známými způsoby popsanými v příkladu 2A a 2B. Přímá syntéza požadované bílkoviny vylučuje nutnost specifického štěpení, ale obvykla také brání vylučování z buňky hostitele.
Plazmidy pro expresi byly vivynuty všude tam, kde exprese je řízena lao promotorem, jak bylo popsáno v publikacích Itakura a další, Science 195, 1056
..(1977), Ullrich A. a další, excerpta ůiedica, (1979),
- trp promotorem jak bylo popsáno v publikaci Martial a další, Science 203, 602 (1979) a promotorem pro
3-laktamázu, jak bylo popsáno v US přihlášce č. 44 647.
Sxpresí je možno prokázat měřením produktu, který má schopnost imunochemické vazby s protilátΙ^ΐίΐ·ι·ιι ι .
- 54 kami proti proinzulínu. Užívá ae rádio/imunologických zkoušek, při nichž je protilátka radioaktivně značena a komplex antigenu a protilátky ae sráží preparátem Staphylococcua aureua C, který byl usmrcen teplem, jak bylo popsáno v publikacích .Jfíorgan a Lazarow, Diabetes 1?« 115 (1963) a
J
Kesslar, S.W., J. Immunol., 115« 1617 (1975). K detekci exprese v bakteriálních koloniích bylo rovněž užito radioimunologických zkoušek, popsaných v publi kacích Erlich, J. A. a další, Cell 10, 681 (1978) a Broom S. a Gilbert 7/., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 75, 2746 41978).
Složené bílkoviny, které jsou průkazem exprese je možno prokázat srovnáním molekulové hmotnosti hostitelské bílkoviny na a-terminální části složené bílkoviny v hostitelských buňkách transformovaných plazmidy s včleněnou částí a bez této včleněné části. Výhodným způsobem je použít jako hostitele Escherichia coli kmen P678-54, který se vyznačuji minibunkami. Radioaktivně značené aminokyseliny se vlčení do bílkovin těchto buněk, takže je možno srovnat kmeny, transformované vektorem s včleněným sledem, který je kódem pro proinzulín
a bez tohoto včleněného sledu. Získané b í rkbvfhýaefrakci o nu jí elektroforézou na SDS-akrylamidovém gelu a poloha bílkoviny se zjišťuje autoradiograficky. Exprese proinzulinu se prokazuje přítomností značené bílkoviny, kterou je možno prokázat pouze v buňkách, transformovaných plasmidem s včleněným genem pro proinzulin. Poloha elektroforetického pásu je mírou molekulové hmotnosti bílkoviny, k jejíž expresi dochází a je v souladu se známou délkou včleněného genu a s délkou N-terminálni prokaryotické Části.
Odstraněni prokaryotické části a přeměna proinzulinu na inzulín in vitro se provádí známým způsobem, jak bylo svrchu podrobně uvedeno.
Průmyslová využitelnost
Způsob výroby lidského proinzulinu, při kterém se pěstuje - za podmínek vhodných pro expresi mikroorganismus, transformovaný vektorem pro expresi, obsahujícím sled desoxynukleotidů, který je kódem pro liský proinzulin a popřípadě se získaná bílkovina po expresi čistí.
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby lidského proinzulínu, vyznačuj ící se tím, že se pěstuje za podmínek vhodných pro expresi mikroorganismus, transformovaný vektorem pro expresi, obsahujícím sled desoxynukleotidů, který je kódem pro liský proinzulín a popřípadě se získaná·bílkovina po expresi čistí.
- 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se použije vektoru pro expresi s obsahem následujícího sledu:5 »-ATG224GČL~3X„22TY_22TGG_21ATG_20W_19GZ_19X_1gTY_18 j x_17ty_17ccl_16x_15ty_15x_14ty^14gcl_13x_12ty_12x_11ty_11GCL-1()X_9TY_9TGG_8GGL_7CCL_6GAK_5CCL_4GCL_3GCL_2GCL_1TTK<iGTL2AAK3CAJ4CAK5XgTY6TGK7GGL8QR9S9CAK10X11TY11GTL12GAJ13 GCL14X15TYl5TAK16 X17TYl7GTL18TGK19GCL20GAJ2lW22GZ22GCL23 !ttk24ttk25tak26acl27ccl28aaj29acl30w31gz31w32gz32gaj33 ·GCL34GAJ35GAK3gX37TY37CAJ38GTL39GGL40CAJ41GTL42GAJ43X44 | ty44ggl45g9j,46ggl47ccl48ggl49gcl50ggl51qr52s52x53ty53caj54; CCL55X56TY56GCL57X58TY58GAJ59GGL60QR61S61X62TY62CAJ63AAJ64: W65GZ65GGL66A™67GTL68GAJ68CAJ70TGK71TGK72AfL73QR74S74 ATM75TGK7gQR77S77X78TY78TAK79CAJ80X81TY81GAJ82AAK£3TAK84 iTGK85AAKggTAG43* ' ’ kde znamená A deoxyadenyl,G deoxyguanyl,C deoxycytoxyl,T thymidyl,J A nebo G,K T nebo CL A, T, C nebo G,M A, C nebo T,Χπ T nebo C v případě, že Yn znamená A nebo G a C v případě, pádě, že. Xn znamená T,Wn C nebo A, v případě že Zn znamená G. nebo A a C v případě Xn znamená C nebo T,Zn A, G, C nebo T v případě že Wn znamená C a A nebo G v případě že Wn znamená A,QRn TC v případě, že Sn znamená A, G, C nebo T a AG, v přípapadě, že Sn znamená T nebo C,Sn A, G, C, nebo T v případě, že QRn znamená TC a T nebo C v případě, že QRn znamená AG, .n polohu aminokyseliny ve sledu lidského proinzulínu, již odpovídá triplet ve sledu nukleotidu podle genetického kódu, přičemž poloha aminokyseliny se čísluje od koncové ainokyseliny.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se použije vektoru pro expresi s obsahem následujícího sledu:GTL2AAX,CAJ4CAX5X6TY6TGX7GGL8QRgS9CAX10X11 ΤΥχι GTL1:9GAJ1 3 GC114Xí5T-15TA;<1SX17TY17CTL13TGK1SGCL20GAJ21M22G222GCI'23 ==-=24==^25====20=-==27===28=-=29=-==-30^31=^31^32==32==-=33 ===34=*=’=35==“=36Χ37==37==-=33===39===40='==41===42=-^=43Χ44 τϊ44σ-δΐ.45θ3^5ααι47^43οσι4θσοΕ.η5σι.,<23!5,3„χ.,τϊ„«ΐΓ5, '50 oP 52 52 53’*53CCL-_X--TY!.,GCL!_7X_flTY-aG-AJ_QGGL-nQRc. SC1 X.7TY--CAJ-,AAJ„ , □□ oo oo o7 03 o3 o9 60 SI 61 62 62 63 64 W65=^65===66=-=“67===63=='=68==-=70=='-=71==-=72='==73=^74=74 =-=75==-=76=47S77X78==7S=A-=79===80X81==81==-=32=-=-=83==-X34TGí- TAG-3’ o 0 O O kde znamená A deoxyadenyl,G deoxyguanyl,C deoxycytoxyl.Τ thymidyl,J A nebo G,K T nebo CL A, T, C nebo G,M A, C nebo T,Xn T nebo C v případě, že Yn znamená A nebo G a C v případě, že Yn znamená C nebo T,Yn A, G, C nebo T v případě, že Xn znamená C a A nebo G v při.. padl, že Xn znamená T, ,., x,, .-. -1,:.,.- - AízA:/· ^'í^naaiené' Č nebo Ty-·-·ί r--r - - --.·.·Zn A, G, C nebo T v případě že V„ znamená C a A nebo G v případě že Wn znamená A,QRn TC v případě, že Sn znamená A, G, C nebo T a AG, v připa, pádě, že Sn znamená T nebo C,Sn A, G, C, nebo T v případě, že QRn znamená TC a T nebo C v případě, že QRn znamená AG, n polohu aminokyseliny ve sledu lidského proinzulínu, již odpovídá triplet ve sledu nukleotidu podle genetického kódu, přičemž poloha aminokyseliny se čísluje od koncové ainokyseliny.
- 4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že se získaná bílkovina hydrolyzuje za vzniku proinzulínu.
- 5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se užije mikroorganismu transformovaného pcHI-1.
- 6. Způsob podle nároku 1 nebo 2.vyznačující se t í a, 2e se užije mikroorganismu transformovaného pcHP-1.
- 7. Způsob podle nároku 1 až 6,vyznačující se tím, že se užije mikroorganismu Escherichia coli.
- 8. Způsob podle nároku 1 až 7,vyznačující se tím, že se užije mikroorganismu Escherichia coli 1776 nebo Escherlchia coli HB-1O1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7519279A | 1979-09-12 | 1979-09-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ548884A3 true CZ548884A3 (en) | 1996-08-14 |
Family
ID=22124154
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS806215A CZ278883B6 (en) | 1979-09-12 | 1980-09-12 | Process for preparing a vector for dna transfer |
| CS845488A CZ548884A3 (en) | 1979-09-12 | 1984-07-16 | Process for preparing human proinsulin |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS806215A CZ278883B6 (en) | 1979-09-12 | 1980-09-12 | Process for preparing a vector for dna transfer |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0026598A1 (cs) |
| JP (1) | JP2637393B2 (cs) |
| KR (1) | KR870000501B1 (cs) |
| AT (1) | AT377003B (cs) |
| AU (1) | AU538154B2 (cs) |
| BE (1) | BE885196A (cs) |
| BG (2) | BG41136A3 (cs) |
| CA (1) | CA1180289A (cs) |
| CZ (2) | CZ278883B6 (cs) |
| DD (3) | DD201693A5 (cs) |
| DK (1) | DK385980A (cs) |
| ES (3) | ES495030A0 (cs) |
| FI (1) | FI802837A7 (cs) |
| FR (1) | FR2464997B1 (cs) |
| GR (1) | GR70279B (cs) |
| IE (1) | IE52781B1 (cs) |
| IL (1) | IL61041A (cs) |
| IT (1) | IT1129250B (cs) |
| LU (1) | LU82757A1 (cs) |
| NZ (1) | NZ194786A (cs) |
| PH (1) | PH26475A (cs) |
| PL (1) | PL226725A1 (cs) |
| PT (1) | PT71790B (cs) |
| RO (1) | RO80005A (cs) |
| SK (1) | SK621580A3 (cs) |
| SU (1) | SU1491345A3 (cs) |
| YU (1) | YU233480A (cs) |
| ZA (1) | ZA805341B (cs) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| DE3001928A1 (de) * | 1980-01-19 | 1981-08-06 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus |
| US4249952A (en) * | 1980-03-03 | 1981-02-10 | Pennsylvania Engineering Corporation | Method for producing cement clinker from cement kiln waste dust |
| AU545912B2 (en) * | 1980-03-10 | 1985-08-08 | Cetus Corporation | Cloned heterologous jive products in bacillies |
| US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| NZ199391A (en) * | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| ZA824218B (en) | 1981-06-29 | 1983-04-27 | Cetus Corp | Plasmid for producing human insulin |
| FI834213A0 (fi) * | 1982-03-31 | 1983-11-17 | Genetics Inst | Framstaellning av dna-sekvenser kodande foer prekursoren av modifierat proinsulin |
| NZ206534A (en) * | 1982-12-13 | 1988-05-30 | Florey Howard Inst | Molecular cloning and characterisation of gene sequence coding for human relaxin |
| US5023321A (en) * | 1982-12-13 | 1991-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology & Medicine | Molecular cloning and characterization of a further gene sequence coding for human relaxin |
| IL71991A (en) | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| ES2090006T3 (es) * | 1986-05-20 | 1996-10-16 | Gen Hospital Corp | Evaluacion de la expresion de preproinsulina, proinsulina o insulina. |
| EP0907746B1 (en) | 1996-04-05 | 2008-02-20 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
| AUPP655698A0 (en) * | 1998-10-16 | 1998-11-05 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Delivery system for porcine somatotropin |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ187300A (en) * | 1977-05-27 | 1982-08-17 | Univ California | Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism |
| IE47889B1 (en) * | 1977-11-08 | 1984-07-11 | Genentech Inc | Synthetic dna and process tehrefor |
| GB2007676B (en) * | 1977-11-08 | 1982-09-08 | Genentech Inc | Method and means for microbial polypeptide expression |
| US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| FI792481A7 (fi) * | 1978-08-11 | 1981-01-01 | The Regents Of The Univ Of | Enkaroyyttisen proteiinin synteesi mikro-organismia käyttäen. |
-
1980
- 1980-08-25 GR GR62740A patent/GR70279B/el unknown
- 1980-08-27 NZ NZ194786A patent/NZ194786A/en unknown
- 1980-08-28 ZA ZA00805341A patent/ZA805341B/xx unknown
- 1980-09-09 FR FR8019399A patent/FR2464997B1/fr not_active Expired
- 1980-09-10 FI FI802837A patent/FI802837A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1980-09-10 PT PT71790A patent/PT71790B/pt unknown
- 1980-09-10 IL IL61041A patent/IL61041A/xx not_active IP Right Cessation
- 1980-09-10 LU LU82757A patent/LU82757A1/fr unknown
- 1980-09-11 IT IT68405/80A patent/IT1129250B/it active
- 1980-09-11 DK DK385980A patent/DK385980A/da not_active Application Discontinuation
- 1980-09-11 CA CA000360565A patent/CA1180289A/en not_active Expired
- 1980-09-11 PH PH24566A patent/PH26475A/en unknown
- 1980-09-11 EP EP80303195A patent/EP0026598A1/en not_active Ceased
- 1980-09-11 AT AT0458580A patent/AT377003B/de not_active IP Right Cessation
- 1980-09-11 SU SU802994154A patent/SU1491345A3/ru active
- 1980-09-11 BE BE0/202074A patent/BE885196A/fr not_active IP Right Cessation
- 1980-09-11 AU AU62324/80A patent/AU538154B2/en not_active Expired
- 1980-09-12 PL PL22672580A patent/PL226725A1/xx unknown
- 1980-09-12 DD DD80238569A patent/DD201693A5/de unknown
- 1980-09-12 DD DD80223873A patent/DD155004A5/de unknown
- 1980-09-12 ES ES495030A patent/ES495030A0/es active Granted
- 1980-09-12 JP JP55127043A patent/JP2637393B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1980-09-12 KR KR1019800003590A patent/KR870000501B1/ko not_active Expired
- 1980-09-12 BG BG049043A patent/BG41136A3/xx unknown
- 1980-09-12 BG BG057337A patent/BG41137A3/xx unknown
- 1980-09-12 IE IE1912/80A patent/IE52781B1/en unknown
- 1980-09-12 DD DD80238563A patent/DD208989A5/de unknown
- 1980-09-12 YU YU02334/80A patent/YU233480A/xx unknown
- 1980-09-12 CZ CS806215A patent/CZ278883B6/cs unknown
- 1980-09-12 SK SK6215-80A patent/SK621580A3/sk unknown
- 1980-09-12 RO RO80102151A patent/RO80005A/ro unknown
-
1981
- 1981-06-30 ES ES503568A patent/ES8300857A1/es not_active Expired
- 1981-06-30 ES ES503567A patent/ES8305420A1/es not_active Expired
-
1984
- 1984-07-16 CZ CS845488A patent/CZ548884A3/cs unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4431740A (en) | DNA Transfer vector and transformed microorganism containing human proinsulin and pre-proinsulin genes | |
| US4366246A (en) | Method for microbial polypeptide expression | |
| US4425437A (en) | Microbial polypeptide expression vehicle | |
| EP0001929B1 (en) | Plasmid for transforming bacterial host to render it capable of polypeptide expression | |
| US4431739A (en) | Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein | |
| US4704362A (en) | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression | |
| US4356270A (en) | Recombinant DNA cloning vehicle | |
| CA2033176C (en) | Growth hormone fusion proteins | |
| US5583013A (en) | Method and means for microbial polypeptide expression | |
| CS219257B2 (en) | Method of making the eukaryotic protein | |
| KR101299417B1 (ko) | 카복시-말단 아미드화 펩티드를 제조하는 방법 | |
| CZ548884A3 (en) | Process for preparing human proinsulin | |
| EP0001931A2 (en) | Synthetic DNA, process for preparing it and recombinant microbial cloning vehicle containing such DNA | |
| JPH0657154B2 (ja) | 所望のポリペプチドを発現させるためのクローニングビーイクル | |
| SK171492A3 (en) | Polypeptide, method of its preparation its use and pharmaceutical agent | |
| HU196237B (en) | Process for producing human growth prehormone | |
| US4563424A (en) | Method and means for somatostatin protein conjugate expression | |
| US4571421A (en) | Mammalian gene for microbial expression | |
| KR100858008B1 (ko) | 하나 이상의 관심있는 폴리펩티드의 배출 형태를 생산하고 상당히 개량하기 위한 과정에서 과분비될 수 있는 펩티드의 용도 | |
| KR100659671B1 (ko) | 신규한 융합단백질로부터 재조합 인슐린을 제조하는 방법 | |
| EP0046669B1 (en) | Somatostatin or somatostatin precursors | |
| AU758633B2 (en) | Method for controlling cleavage by OmpT protease | |
| US4812554A (en) | Somatostatin peptide conjugate | |
| US5252482A (en) | Precursor of a C-terminal amidated calcitonin | |
| CA1302321C (en) | Preparation of polypeptides |