CZ280822B6 - Rekombinantní plasmid, způsob jeho přípravy a bakterie jím transformované - Google Patents

Abstract

Popisuje se rekombinantní plasmid vhodný pro transformaci bakteriálního hostitele, který obsahuje homologni a heterologní DNA, kde heterologní DNA koduje požadovaný funkční savčí polypeptid, kterým je enzym, popypeptid krevního séra, polypeptid s analgetickým účinkem nebo hormon, nebo jeho meziprodukt, přičemž tento savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt je nedegradovatelný endogenními proteolytickými emzymy, které předchází start-kodon a po níž následuje jeden nebo více terminačních nebo stop-kodonů a nepředchází ji a/nebo nenásleduje další protein, kde uvedená DNA je umístěna ve správném čtecím rámci s uvedeným homologním regulonem mezi uvedeným regulonem a terminačním kodonem nebo kodony, a při translaci transkripčního produktu heterologní DNA ve vhodné bakterii je výsledným produktem exprese uvedený požadovaný funkční savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt v získatelné formě. Dále se popisuje způsob vytváření takového plasmidu a bakterie, které jsou jím tranformované.ŕ

Description

Rekombinantní plasmid, způsob jeho přípravy a baterie jím transformované

Oblast techniky

Vynález se týká rekombinantního plasmidu vhodného pro transformaci bakteriálního hostitele, způsobu jeho přípravy a bakterií, které jsou jím transformované.

Dosavadní stav techniky

Genetická informace je uchovávána jako kód v desoxyribonukleové kyselině (DNA) s dvojitým řetězcem, takže kódující řetězec DNA má charakteristický opakující se sled nukleotidových složek. Přenesení kódované informace za vzniku polypeptidů je procesem, který sestává ze dvou částí. Vzhledem k tomu, že gen obsahuje určité řídící oblasti (regulony) je možno působením RNA-polymerázy vytvářet ribonukleovou kyselinu (RNA), která obsahuje tentýž kód (messenger RNA, mRNA). Tento proces se nazývá transkripce. V další části se převádí informace, přenesená pomocí mRNA, na polypeptidy. Informace přenesená pomocí mRNA z DNA obsahuje i signály pro začátek a konec translace na ribosomech, stejně jako pro totožnost a sled aminokyselin, které vytvářejí polypeptid. Kódující řetězce DNA obsahuje dlouhý sled nukleotidových tripletů, které se nazývají kodony kvůli charakteristickému sledu nukleotidů v každém tripletu, který je kódem pro specifickou část informace. Například 3 nukleotidy ATG (adenin, thymin a guanin) se přenášejí do mRNA jako signál, který označuje počátek translace, zatímco kodony TAG, TAA a TGA translaci ukončují. Mezi počátečními a koncovými kodony se nachází tak zvané strukturální geny, v nichž kodony definují sled aminokyselin uprostřed řetězce. Tato definice odpovídá ustálenému pojmu genetického kódu, tak jak je podán například v publikaci J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene W. A Benhamin lne., N. Y., 3. vydání 1976, v této publikaci se popisují kodony pro různé aminokyseliny. Tentýž genetický kód je charakteristický pro jedinou aminokyselinu, pro tutéž aminokyselinu však může existovat i více kodonů. Například všechny kodony TTT, TTC, TTA a TTG jsou kódem pro serin a pro žádanou jinou aminokyselinu. Při transkripci je nutno zachovat správný způsob čtení jednotlivých kodonů. Například v případě, že by v případě RNA polymerázy byly čteny různé báze na počátku kodonů ve sledu GCTGGTTGTAAG různým způsobem, a to

... GCT GGT TGT AAG ... G CTG GTT GTA AG . . . GC TGG TTG TAA G >

·>

>

Ala-Gly-Cys-Lys ... Leu-Vla-Leu ...

Trp-Leu-(TOP).

dojde ke vzniku různých řetězců aminokyselin. Je zřejmé, že vzniklý polypeptid závisí na vztahu strukturálního genu v prostoru vzhledem k regulonu.

Způsob přenosu genetické informace je možno lépe pochopit po definování některých složek genu:

Operon - jde o gen, který obsahuje strukturální gen nebo geny pro polypeptid, a řídící oblast, která řídí přenos.

-1CZ 280822 B6

Promotor - jde o gen, v oblasti regulonu, na nějž se musí vázat RNA polymeráza, aby mohla začít transkripce.

Operátor - jde o gen, na nějž se může vázat bílkovina, která tímto způsobem brání vazbě RNA polymerázy na sousední promotor.

Induktor - jde o látku, která působí deaktivaci shora uvedené bílkoviny, uvolňuje operátor a umožňuje vazbu RNA polymerázy na promotor, takže může dojít k transkripci.

Místo vazby bílkoviny, která je aktivátorem katabolitu je gen, který váže bílkovinu, která je aktivátorem katabolitu (CAP) a je vázána na cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) a která je podmínkou pro počátek transkripce. Místo této vazby někdy nemusí být přítomno. Například mutace operonu pro laktózu promotorem v případě fágu /1 plac UV5 nevyžaduje pro přenos CAP, cAMP jak je uvedeno v publikaci J. Beckwith a další J. Mol. Biol 69, ISS-160 (1972).

Systém promotor - operátor

Jde o řídící oblast operonu, a to ve vztahu k CAa nebo ke schopnosti kódu přenášet strukturu bílkoviny.

Dále je ještě nutno definovat následující pojmy.

Prostředek pro klonování

Jde o DNA s dvojitým řetězcem nechromozomálního typu, která obsahuje neporušený replikon, takže dochází k replikaci této DNA, v případě, že uvedena do jednobuněčného organismu, například mikrobu, čímž dochází k transformaci tohoto jednobuněčného organismu. Názvem pro takto transformovaný organismus je transformant.

Plasmid

Jde o určité klonující prostředky, odvozené od virů nebo bakterií, které se také nazývají bakteriálními plasmidy.

Komplementarita

Jde o vlastnost, týkající se sledu bází v DNA s jediným řetězcem, přičemž tato vlastnost dovoluje tvorbu DNA s dvojitým řetězcem vodíkovými vazbami mezi komplementárními bázemi jednotlivých řetězců. Adenin (A) je komplementární pro thymin (T), guanin (G) je komplementární pro cytosin (C).

V posledních letech bylo možno vytvářet klonující prostředky pro rekombinaci, takže bylo možno vytvořit plasmidy, které obsahují exogenní DNA. V některých případech může rekombinanta obsahovat heterologní DNA, to znamená, DNA, která je kódem pro polypeptidy, které se běžně v organismu schopném transformace uvedeným prostředkem neprodukují. Plasmidy je možno škrtit za vzniku lineárních řetězců DNA, jejichž zakončení jsou schopna další vazby. Tato zakončení se váží na exogenní gen, který má také zakončení, schopná vazby, takže vzniká biologická funkční skupina s neporušeným replikonem a se žádanými fenotypickými vlastnostmi. Tato rekombinační skupina se včlení do mikroorganismu transforma-2CZ 280822 B6 cí a vzniklé transformanty se izolují a klonují, takž je možno získat velké populace, schopné vytvářet a přenášet novou genetickou informaci. Způsoby a prostředky pro vytváření rekombinačních klonujících prostředků a pro transformaci organismů byly v literatuře podrobně popsány například v publikacích J. L. Reynecker a další, Nátuře 263, 748 až 752 (1976), Cohen a další, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972) a 70, 1293 (1973), 70, 3240 (1973), 71, 1030 (1974), Morrow a další Proč. Nat. Acad. Sci. USA 71. 1743), (1974), Novick, Bacteriological Rev. , 33 , 210 (1969), Hershfield a další, Proč. Soc. Naťl. Acad. Sci. USA 71, 3455 (1974) a Jackon a další, ibid. 69, 2904 (1972). Souhrnným článkem, týkajícím se této oblasti je publikace S. Cohen, Scientific Američan 233, 24 (1975). V tomto článku jsou také citovány všechny další publikace, které se uvedeného oboru týkají.

Pro rekombinaci DNA je k dispozici celá řada metod, v nichž je možno upravit zakončení jednotlivých fragmentů DNA tak, aby byla usnadněna jejich vazba. Jde zejména o tvorbu fosfodiesterových vazeb mezinukleotidy, velmi často působením enzymu T4 DNA ligáza. Tímto způsobem je možno přímo vázat zakončení, která by jinak nebyla schopná vazby. Je také možno postupovat tak, že fragmenty, obsahující komplementární jednotlivé řetězce se opatří vodíkovým můstkem, takže se dostanou příslušná zakončení do vzájemné blízkosti pro příští vazbu. Tyto řetězce, které mají tak zvané kohezivní zakončení je možno vytvářet tak, že se přidají nukleotidy k řetězci, jehož zakončení není schopno vazby použitím terminální transferázy a někdy prostě tak, že se z uvedeného zakončení odštěpí řetězec enzymem, například -exonukleázou. Nejčastěji je tímto enzymem restrikční endonukleáza, která štěpí fosfordiesterové vazby tak, že je možno odštěpit určité sledy nukleotidů o délce například 4 až 6 párů těchto zásad. Je známa řada restrikčních endonukleáz i místa, v nichž mohou působit. Velmi užívaná je například Eco RI endonukleáza. Restrikční endonukleáza, která štěpí DNA s dvojitým řetězcem na symetrické ”palindromy zanechává zakončení, která jsou schopna vazby. To znamená, že plasmid nebo jiný prostředek pro klonování je možno rozštěpit tak, že vzniká zakončení, které obsahuje polovinu místa, vhodného pro působení restrikční endonukleázy. Štěpný produkt exotermní DNA, získaný působením téže restrikční endonukleázy bude mít zakončení, které budou komplementární k zakončením shora uvedeného plasmidu. Je tedy možno získat syntetickou DNA, která obsahuje zakončení, kterými je možno tuto DNA včlenit do opětné vazby mezi oběma částmi rozštěpeného klonujícího prostředku je možno zakončení podrobit působení alkalické fosfatázy, čímž je možno provést molekulární selekci částí, které obsahují exogenní fragment. Včlenění fragmentu, který má správnou orientaci vzhledem k ostatním vlastnostem klonujícího prostředku je možno usnadnit v případě, že fragment a prostředek jsou štěpeny dvěma různými restrikčními endonukleázami, přičemž jedno ze zakončení představuje současně i polovinu místa, vhodného pro působení druhé endonukleázy.

Přes velké pracovní úsilí při rekombinaci DNA bylo v posledních letech možno dosáhnout jen několika málo výsledků, které by bylo možno užít okamžitě k praktickým účelům. Jde například o případ pokusů o vyjádření polypeptidů, které by byly kódovány syntetickou DNA, protože bylo nutno vázat na sebe nukleotid za nukleotidem a nebo řetězec získat reverzní transkripcí z izolova

-3CZ 280822 B6 né in RNA (Komplementární nebo cDNA). Bude popsán první produkt těchto snah, funkční polypeptid ze syntetického genu, který slibuje široké použití. Tento produkt byl pojmenován sematostatin (US patentový spis č. 3 904 594) a je inhibitorem sekrece růstového hormonu, inzulínu a glukagonu je možno jej užít k léčbě akromegalie, akutního zánětu slinivky břišní a cukrovky, závislé na inzulínu. (R. Guillemin a další, Annual Rev. Med. 27, 379 (1976). Na příkladu somatostatinu je možno prokázat použitelnost nových výsledků v různých oborech, jak bude zřejmé také z připojených výkresů a z podrobnějšího popisu vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je rekombinantní plasmid vhodný pro transformaci bakteriálního hostitele, obsahující homologní regulon a heterologní DNA, kde heterologní DNA kóduje požadovaný funkční savčí polypeptid, jako je enzym, polypeptid krevního séra, polypeptid s analgetickým účinkem nebo hormon, nebo jeho meziprodukt, přičemž tento savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt je nedegradovatelný endogenními proteolytickými enzymy, které předchází start-kodon a po níž následuje jeden nebo více terminačních nebo stop-kodonů a nepředchází ji a/nebo ji nenásleduje další protein, kde uvedená DNA je umístěna ve správném čtecím rámci s uvedeným homologním regulonem mezi uvedeným regulonem a terminačním kodonem nebo kodony, a při translaci transkripčního produktu heterologní DNA ve vhodné bakterii je výsledným produktem exprese uvedený požadovaný funkční savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt v získatelné formě.

Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy rekombinantního plasmidu, který zahrnuje zpracování dvojřetězcové DNA, obsahující intaktní replikon a v sekvenci a) regulon pro řízení transkripce a translace v bakteriálním hostiteli a b) místo rozpoznávané retrikční endonukleázou pomocí vhodné restrikční endonukleázy za vzniku DNA-fragmentu, který obsahuje replikon a regulon, a jeho ligaci ve správném čtecím rámci s uvedeným regulonem heterologní DNA, kódující shora definovaný funkční savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt, kde tento savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt nejsou degradovatelné endogenními proteolytickými enzymy, přičemž je předřazen start-kodon a bezprostředně následuje jeden nebo více terminačních nebo stop-kodonů a nepředchází jí a/nebo bezprostředně nenásleduje další protein, kde heterologní DNA má terminální nukleotidové seskupení připojitelné k uvedeném DNA-fragmentu, za poskytnutí uvedené rekombinantního plasmidu.

Popis obrázků

Vynález bude podrobněji popsán v souvislosti s připojenými výkresy, která se týkají produkce hormonu somatostatinu bakteriálními transformanty, které obsahují rekombinantní plasmidy, kde na obr. 1 je schematicky znázorněn průběh celého postupu. Gen pro somatostatin, vyrobený chemickou syntézou DNA, je včleněn do genu pro β-galaktosidázu v E. coli pomoci plasmidu pBR322. Po transformaci do E. coli rekombinantní plasmid řídi syntézu bílkovinného prekursoru, který je možno štěpit specificky in vitro bromkyanem na zbytcích methioninu, čímž se získá účinný polypeptidový hormon savců. Na výkrese znamenají symboly A, T, C a G báze, a to adenin, thymin, cytosin a guanin, tak jak je obsahují

-4CZ 280822 B6 desoxyribonukleotidy v kódujícím řetězci genu pro somatostatin, na obr. 2 je schematicky znázorněna struktura syntetického genu, jehož kódující řetězce, tj. horní řetězec obsahuje kodony pro sled aminokyselin v somatostatinu, na obr. 3 je schematicky znázorněna výhodná metoda pro konstrukci nukleotidových trimerů při výrobě syntetických genů. Při běžném způsobu znázornění nukleotidů na obr. 3 se nachází skupina OH v poloze 5' na levé straně a skupina OH v poloze 3' na pravé straně, například

B

na obr. 4 je schematicky znázorněna konstrukce rekombinačního plasmidu, například pSOMll-3, který je schopen produkovat somatostatin SOM, a to tak, že se začíná od původního plasmidu pBR322. Na obr. 4 je přibližná molekulární hmotnost každého plasmidu uvedena v daltonech d. Ap^r a Tr^r jsou geny pro resistenci proti ampicilinu a tetracyklinu, zatímco Tc^s znamená nedostatek odolnosti proti tetracyklinu, který vzniká v případě, že se z genu Tc^r vyjme určitá část. Relativní polohy různých míst, vhodný pro štěpení restrikční endonukleázy jsou v plasmidu také znázorněny. Jde například o enzym Eco RI, Bam I a podobně, na obr. 5A a 5B jsou znázorněny sledy nukleotidů v klíčových částech dvou plasmidů, tak jak jsou nutné pro transkripci mRNA, která začíná v poloze 5' kódujícími řetězci. Jsou znázorněna i místa pro působení restrikční endonukleázy. Každý znázorněný sled obsahuje řídicí elementy pro lacoperon (operon pro laktózu) a kodony pro vyjádření sledu aminokyselin v somatostatinu. Čísla pro sled aminokyselin pro β-galaktosidázu (β-gal) jsou uvedena v závorkách, na obr.

až 8 jsou znázorněny výsledky srovnávacích pokusů radiimunologických v nichž bylo možno prokázat somatostatinovou účinnost produktu, vyjádřeného rekombinančním plasmidem, na obr. 9 je znázorněna struktura syntetických genů, jejichž řetězce obsahují kodony pro sled aminokyselin v řetězcích A a B lidského insulinu a na obr. 10 je znázorněna výroba rekombinantního plasmidu, schopného exprese řetězce B lidského insulinu.

1. Způsob výroby genetických kódů pro heterologní polypeptid

DNA kódy pro jakýkoli polypeptid se známým sledem aminokyselin je možno získat tak, že se kódově volí podle genetického kódu. Aby bylo možno snadno provádět čištění, připravují se odděleně oligodesoxyribonukleotidové fragmenty například o 11 až 16 nukleotidech a tyto fragmenty se potom spojí na žádaný sled. To znamená, že se nejprve připraví první a druhá řada oligodesoxyribonukleotidových fragmentů vhodné velikosti. První řada, v případě, že se váže v příslušném sledu je DNA kódujícím řetězce pro polypeptid, jak je znázorněno například na obr. 2, fragmenty A, B, C a D. Drobná řada, v případě, že se také váže ve správném

-5CZ 280822 B6 sledu poskytuje řetězec, který je komplementární vzhledem ke kódujícímu řetězci, na obr. 2 jde například o fragmenty E, F, G a H. Fragmenty těchto řetězců se s výhodou překrývají, takže v důsledku jejich komplementarity dochází ke vzniku vodíkových vazeb na kohezivních zakončeních fragmentových bloků. Strukturální gen se doplní běžným způsobem.

Protože tutéž aminokyselinu je možno vyjádřit několika způsoby, je možno poměrně volně volit v genetickém kódu kodony pro daný sled aminokyselin. Volba těchto kodonů je vedena třemi hledisky. Podle prvního z těchto hledisek se kodony a fragmenty volí tak, aby došlo k jejich nežádoucí komplementaritě v případě přítomnosti jiného řetězce. Za druhé je nutno se vystříhat sledů bohatých na páry AT, zejména v případě, že by těchto párů mělo být pět nebo více, zejména tehdy, kdy předchází sled, bohatý na páry GC, protože v tomto případě by mohlo dojít k předčasnému ukončení transkripce. Za třetí by většina zvolených kodonů měly být ty kodony, které jsou pro vyjádření mikrobiálních genomů výhodné, jak je popsáno v publikaci W. Fiers a další, Nátuře 260, 500 (1976). Kodony, výhodné pro vyjádření mikrobiálních genomů jsou vyjádřeny v následující tabulce.

Tabulka I

Výhodné kodony

První poloha zakončení 5'	Druhá poloha	Třetí poloha 3 '
T	C	A	G
T	phe	—	—	cys	T
	phe	ser	tyr	---	c
	leu	—	Stop	Stop	A
	— — —	ser	Stop	trp	G
	leu	pro	his	arg	T
	leu	pro	his	arg	c
	leu	pro	gin	—	A
c	— — —	pro	gin	— — —	G
	ile	thr	asn	———	T
	ile	thr	asn	ser	c
	—	—	—	—	A
A	met	thr	lys	—	G

(start)

val	ala	asp	giy	T
	val	—	asp	—	c
	val	—	glu	—	A
G	val	ala	glu	— — —	G

V případě somatostatinu jsou vztahy mezi kodony pro aminokyseliny ve strukturálním vlivu následující:

gly (GGT), cys (TGT), lys (AAG), trp (TGG), ala (GCT, GCG), asn (AAT, AAC), phe (TTG, TTT), thr (ACT, ACG) a ser (TCG, TCG).

-6CZ 280822 B6

V případě, že strukturální gen žádaného polypeptidu má být včleněn do klonujícího prostředku jako takový, musí gen přecházet kodon, který zahajuje transkripci, například ATG a mimoto musí být gen následován jedním nebo více kodony, které transkripci ukončují, jak je znázorněno například na obr. 2. Jak již bylo popsáno, sled aminokyselin určitého polypeptidu může být vyjádřen tak, že jej předchází a/nebo jej následuje další bílkovina. V případě, že použití polypeptidu vyžaduje odštěpení této bílkoviny, je nutno včlenit příslušná místa štěpením těsně za polypeptidem, což znamená přidátné spojení kodonu k bílkovině. Na obr. 1 je znázorněn příklad, v němž bílkovina obsahuje jako prekursor somatostatin a mimoto převážnou část β-galaktosidázového polypeptidu. V tomto případě není nutno včlenit ATG pro počátek translace, protože ribosomální konstrukce přídatné β-gal bílkoviny se nachází v těsné blízkosti somatostatinového strukturálního genu. Včlenění signálu ATG však je kódem pro produkci methioninu, aminokyseliny, specificky štěpené bromkyanem, čímž je usnadněn převod prekursorové bílkoviny na žádaný polypeptid.

Na obr. 2 je znázorněna i další výhodná vlastnost heterologní DNA pro použití při rekombinaci, tj. vznik kohezivních zakončení, s výhodou obsahující jeden ze dvou řetězců s místem, vhodným pro působení restrikční endonukleázy. Ze shora uvedených důvodů jsou zakončení provedena tak, aby po rekombinaci vznikla různá místa pro působení enzymu.

Shora uvedený postup byl úspěšný v případě somatostatinu, takže je zřejmé, že při použití příslušných výchozích látek je možno získat kód pro heterologní DNA pro libovolný sled aminokyselin. Je tedy uvedeným způsobem možno získat polyaminokyseliny, například polyleucyn a polyalanin, enzymy, bílkoviny séra, polypeptidy s analgetickým účinkem, například β-endorfiny, které mění práh bolestivosti a podobně. S výhodou jsou získané polypeptidy hormony savců nebo meziprodukty pro jejich výrobu. Z těchto hormonů je možno uvést například somatostatin, lidský insulin, lidský a hovězí růstový hormon, luteinizačni hormon, ACTH, pankreatický polypeptid a podobně. Jako meziprodukty je možno uvést například lidský preproinsulin, lidský proinsulin, řetězce A a B lidského insulinu a podobně. Kromě DNA, vyrobené in vitro. může heterologní DNA obsahovat cDNA, která vznikla reverzní transkripcí z mRNA, jak bylo popsáno v publikaci Ulrich a další, Science 196, 1313 (1977).

2. Rekombinační kódování pro vyjádření bílkovinného prekursoru.

Při provádění způsobu, který je schematicky znázorněn na obr. 1 se získá bílkovinný prekursor, který obsahuje polypeptid, který je určován specifickým heterologním strukturálním genem, a mimoto bílkoviny, která obsahuje část enzymu β-galaktosidázy. Selektivní místo štěpení v bezprostřední blízkosti sledu aminokyselin v somatostatinu dovoluje odděleni žádaného polypeptidu od zbývající bílkoviny. Tento příklad je charakteristický pro celou řadu postupů, které jsou podle vynálezu umožněny.

Štěpení se obvykle provádí vně replikativní části plasmidu nebo jiného prostředku pro přenos, například po izolaci kultury mikroorganismu. Tímto způsobem je možno chránit dočasným spojením malých polypeptidů s přebytkem bílkoviny polypeptid in vivo proti

-7CZ 280822 B6 degradaci endogenními enzymy. Současně tato bílkoviny obvykle zbavuje účinku výsledný polypeptid, čímž se zvyšuje bezpečnost postupu. V některých případečh je však žádoucí uskutečnit štěpení v buňce. Je například možno vyrobit klonující prostředky s DNA kódem pro enzymy, které převádějí prekursory insulinu na účinnou formu, a to ve spojení s kódem, který zajišťuje produkci prekursoru.

Při výhodné provedení žádaný polypeptid neobsahuje vnitřní místa štěpení, která by odpovídala místům v bílkovině, která polypeptid doprovází, avšak i když se tato podmínka nedodrží, dojde ke kompetičním reakcím, při nichž přesto vzniká žádaný produkt, i když v nižším výtěžku. V případě, že žádaný produkt neobsahuje methionin, je možno snadno provést štěpení na methioninu, který se nachází v těsné blízkosti žádaného sledu. Stejným způsobem je možno odštěpit enzymaticky produkty bez obsahu argininu a lysinu například trypsinem nebo chymotrypsinem arg-arg, lys-lys apod v bezprostřední blízkosti žádaného sledu. V případě, že štěpení zanechává nežádoucí arginin, vázaný na výsledný produkt je možno jej odstranit karboxypeptidázou. V případě, že se užije k rozštěpení vazby arg-arg trypsinu, je možno nejprve chránit polypeptidy lysin, například anhydridem kyseliny maleinové nebo citrakonové.

Odštépitelná bílkovina může být vázána bud’ na C-zakončení, nebo na N-zakončení specifického polypeptidu nebo přímo na polypeptid, jako je tomu v případě sledu, kterým se odlišuje proinsulin a insulin. Užitý prostředek může být kódem pro bílkovinu, která obsahuje opakovaný sled žádaného polypeptidu, přičemž jednotlivé sledy jsou od sebe odděleny selektivními místy štěpení. Ve výhodném příkladě však jsou kodony pro balastní bílkovinu přenášeny před strukturálním genem výsledného produktu, jak je znázorněno na vyobrazeních, vždy je nutno udržet správný sled vzhledem k regulonu.

3. Exprese imunogenu.

Možnost experimentovat specifický polypeptid i balastní bílkovinu je cenným nástrojem pro výrobu imunogenních látek. Polypeptidové hapteny, tj. látky, které obsahují místa, specificky vázaná protilátkami, však obvykle s příliš malou molekulou k vyvolání imunologické odpovědi, je možno vyjádřit jako konjugáty s přídatnou bílkovinou, jejíž molekula je dostatečně veliká k vyvolání imunogenity. Konjugát β-gal-somatostatin, který je možno uvedeným způsobem získat, má dostatečně velkou molekulu a je možno očekávat, že vyvolá tvorbu protilátky, které se budou na hapten vázat. Všechny bílkoviny, které obsahují více než 100 aminokyselin, obvykle více než 200 aminokyselin mají imunogenní charakter .

Konjugáty, připravené shora uvedeným způsobem, je možno užít k vyvolání tvorby protilátek, použitelných při radioimunologických nebo jiných zkouškách na hapteny a také při výrobě vakcín. Dále bude popsán příklad použití k produkci vakcíny. Při štěpení bromkyanem nebo jiným štěpným produktem vzniknou z obalu viru oligopeptidy, které se váží na protilátky, vyvolané působením bílkoviny. Heterologní DNA vázanou na hapten je možno vyjádřit jako konjugát, který přenáší schopnost vyvolat imunitu. Použití

-8CZ 280822 B6 takových konjugátů jako vakcín by mohlo odstranit vedlejší reakce, vyvolané použitím vlastní bílkoviny obalu.

4. Řídicí elementy

Na obr. 1 je znázorněn způsob, při němž transformant produkuje polypeptid z heterologní DNA v důsledku přítomnosti regulonu, který je homologní pro organismus v netransformovaném stavu. To znamená, že chromozomální DNA, závislá na laktóze a obsažená v E. coli, obsahuje lac-operon, který zprostředkuje například vznik enzymu β-galaktosidázy. Ve znázorněném případě je možno získat řídicí elementy z bakteriofágu -plac 5, který je infektivní pro E.coli. Lac-operon fágu byl naopak odvozen z téhož bakteriálního vlivu a je proto homologní. Homologní regulony vhodné pro použití v uvedeném způsobu je možno odvodit i od DNA plasmidu, který pochází z organismu.

Jednoduchost a účinnost systému lac-promotor-operátor dovoluje použití tohoto systému a je příčinou jeho schopnosti být indukován IPTG (isopropylthio^-D-galaktosid). Je však možno užít i jiné operony nebo jejich části, například Λ -promotor-operátor, operon pro arabinózu (phi 80 dara) nebo kolicin El, galaktózový operon, operony pro alkalickou fosfatázu nebo pro tryptofan. Tento tryp-operon způsobuje patrně 100% represi při používání kyseliny indolakrylové.

5. Obecná konstrukce plasmidu

Detaily způsobu jsou schematicky znázorněny na obr. 4 a vyplývají z experimentální části. Je však možno podrobněji uvést způsoby, užívané pro konstrukci rekombinačního plasmidu.

Při klonování syntetického somatostatinu a genu pro tento hormon bylo použito i dvou plasmidů. Každý z těchto plasmidů měl místo pro působení Eco RI v odlišné části strukturálního genu pro β-galaktosidázu, jak je znázorněno na obr. 4 a 5. Včlenění syntetického somatostatinového DNA fragmentu do míst pro působení Eco RI tohoto plasmidu má za následek vyjádření genetické informace tohoto fragmentu podřízením lac operonu. Po včlenění somatostatinového fragmentu do těchto plasmidů je výsledkem translace polypetidsomatostatinu, před nímž je zařazeno 10 aminokyselin (pSOMl) nebo prakticky celá β-galaktosidázová strukturní podjednotka (pSOMll-3).

Konstrukce plasmidu počíná plasmidem pBR322, což je dobře charakterizovaný klonující prostředek. Včlenění lac elementů do tohoto plasmidu bylo provedeno tak, že byl včleněn fragment restrikční endonukleázy Hae III (203 nukleotidů) s obsahem lac promotoru, CAP vazebného místa, operátor, vazebného místa pro riboson a prvních 7 klonů pro aminokyseliny z β-galaktosidázového strukturálního genu. Fragment Hae III byl odvozen od plac 5

DNA. Plasmid pBR322, rozštěpený enzymem Eco RI se zakončeními, na něž bylo působeno T4 DNA polymerázou a desoxyribonukleotidtrifosfátem byl navázán na fragment Hae III, čímž vznikla v místech spojení místa, vhodná pro působení Eco RI. Navázání zakončení, vznikající z Hae III a Eco RI po shora uvedené úpravě mají za následek vznik míst pro působení Eco RI na každém zakončení, jak je zřejmé z obr. 4 a 5. Transformanty E. coli RRI po působení

-9CZ 280822 B6 této DNA byly zpracovány tak, že byla provedena selekce na odolnost proti tetracyklinu (Tc) a ampicilinu (Ap) na prostředí s 5-brom-4-chlorinkolylgalaktosid (prostředí X-gal). Na tomto indikátorovém prostředí je možno identifikovat kódy, které mohou syntetizovat β-galaktosidázu vzhledem ke zvýšenému množství represoru pro lac operátor, a to vzhledem k tomu, že tyto kolonie mají modrou barvu. Zásadně jsou nutné dvě orientace fragmentu Hae III, tyto orientace však je možno od sebe odlišit asymetrickým umístěním místa pro působení Hha v tomto fragmentu. Plasmid pBHlO byl dále modifikován tak, že bylo odstraněno místo pro působení Eco RI distálné od lac operonu (pBH20).

Jak je znázorněno na obr. 2, bylo 8 chemicky syntetizovaných oligodesoxyribonukleotidů značeno na zakončení 5' pomoci [³²P]Z -ATP působením polynukleotidázy, potom bylo provedeno spojení pomocí T4 DNA ligázy. Vzhledem ke tvorbě vodíkových můstků na jednotlivých fragmentech se vytváří gen pro somatostatin, popřípadě dochází k jeho polymerací na větší molekuly, vzhledem k přítomnosti kohezivních zakončení. Takto vzniklé produkty byly podrobeny působení restrikčních endonukleáz Eco RI a Bam HI za vzniku genu somatostatinu, tak je znázorněn na obr. 2.

Syntetický fragment somatostatinového genu se zakončeními po působení Eco RI a Bam HI byl navázán na plasmid pBH20 po předchozím působení restrikčních endonukleáz Eco RI a Bam HI a alkalické fosfatázy. Působení alkalické fosfatázy dochází k molekulární selekci plasmidů, které nesou včleněný fragment. Transformanty, odolné proti ampicilinu a získané působením této DNA byly sledovány na citlivost na tetracyklin a některé z nich byly zkoumány na včlenění Eco RI-Bam HI fragmentu příslušné velikosti.

Oba řetězce Eco RI-Bam HI-fragmentů plasmidů ze dvou klonů byly analyzovány na sled nukleotidů, počínaje od míst působení Bam HI a Eco RI. Tato analýza zasahovala až do lac-kontrolních elementů. Sled lac fragmentů byl neporušený a v jednom případě pSOMl byl nezávisle v obou řetězcích zkoumán sled nukleotidů, výsledky tohoto srovnáni jsou uvedeny na obr. 5A.

Eco Rl-Pst fragment plasmidů pSOMl s řídicím lac-elementem byl odstraněn a nahrazen Eco Rl-Pst fragmentem pBR322, čímž vznikl plasmid pSOMll. Eco RI fragment plac 5 nesoucí řídicí oblast lac operonu a většinu β-galaktosidázového strukturálního genu, byl včleněn na místo působení Eco RI v plasmidů pSOMll. Bylo očekáváno, že dojde ke dvojí orientaci Eco RI lac fragmentu plac 5. Jedna z těchto orientací odpovídá struktuře somatostatinového genu a druhá nikoli. Sledování nezávisle izolovaných klonů na somatostatinovou účinnost bylo možno identifikovat klony se správnou orientací genu, byl izolován klon, označený pSOmll-3-

6. Mikroorganismus

Pro transformaci byly navrhovány různé jednobuněčné mikroorganismy, například bakterie, houby a řady. Jde o to, nalézt jednobuněčné organismy, schopné pěstování v kultuře. Z tohoto důvodu je použití bakterií nejvýhodnější.

-10CZ 280822 B6

Z bakterií, na nichž je možno provést transformaci je možno uvést Enterobacteriaceae, například kmeny Escherichia coli a Salmonella, dále Bacillaceae, například Bacillus subtilis, Pneumococcus, Streptococcus a Haemophilus influenzae.

Pro experimentální práci byl zvolen mikroorganismus E. coli, kmen RR1 genotyp: Pro”Leu“Thi”R_B”M_B“ re”c A⁺ Str^r Lac y”. E. coli kmen RR1 je odvozen od E. coli HB101 (Η. N. Boyer a další, J. Mol. Biol. (1969) 41, 459 až 472) tak, že tento kmen byl uveden ve styk s E. coli K12 kmene KL16 jako donorem Hfr, jak je uvedeno v J. H. Miller Experimente in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Kmeny E. coli RR1 a E. coli RR1 (pBR322) byly uloženy v Američan Type Culture Collection a kmeny jsou přístupné pod čísly ATCC 31 343 a 31 344.

Ve veřejné sbírce byly uloženy také kmeny, schopné produkce somatostatinu pod číslem ATCC 31447.

V případě lidského insulinu byly geny pro řetězce A a B klonovány v E. coli K-12 kmen 294 (end A, thi^-, hsr“, hsm_k ⁺), pod číslem ATCC 31446 a organismus, který byl užit při expresi řetězce A, tj. E coli K-12 kmen 294 ve formě plasmidu pIAl pod číslem ATCC 31448. Řetězec B lidského insulinu byl poprvé podroben expresi v derivátu HB101, to jest E. coli K-12 kmen D1210 lac⁺ (iQo⁺z^ty⁺) a kmen, obsahující gen pro řetězec B byl také uložen pod číslem ATCC 31449 Gen pro řetězec B může být také včleněn a podroben expresi při použití shora uvedeného mikroorganismu, to jest kmene 294.

Pokusná část

I. Somatostatin

1. Konstrukce fragmentů somatostatinového genu

Na obr. 2 jsou pod písmeny A až H znázorněny oligodesoxyribonukleotidy, které byly konstruovány zásadně modifikovanou triesterovou metodou, popsanou v publikaci K. Itakura a další, J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975). Avšak v případě fragmentů C, E a H byl postup prováděn zdokonalenou metodou, při níž se postupuje tak, že se nejprve připraví plné chráněné trimery jako základní jednotky pro vybudování dalších oligodesoxyribonukleotidů s delším řetězcem. Tento zlepšený způsob je schematicky znázorněn na obr. 3, kde B znamená thymin, N-benzoylovaný adenin, N-benzoylovaný cytosin nebo N-isobutyrylguanin. Jak je znázorněno na obr. 3, při použiti dvou mmolů sloučeniny I a 1 mmolu sloučeniny II bylo možno úplně dokončit reakci v 60 minutách při použití výhodného činidla, kterým byly 4 mmoly 2,4,6-triisopropyíbenzensulfonyltetrazolidu (TPSTe). Po odstranění ochranné skupiny v poloze 5’ působením 2% roztoku kyseliny benzensulfonové bylo možno oddělit 5’-hydroxylovaný dimer vzorce V z přebytku 3'-fosfodiesterového monomeru vzorce IV jednoduchou extrakcí rozpouštědlem, a to směsí vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a chloroformu. Plně chráněný lac trimeru byl připravován postupné z 5'-hydroxylovaného dimeru vzorce V, 2 mmolů sloučeniny vzorce

-11CZ 280822 B6

I a ze 4 mmolů TPSTe s následnou izolací chromatografií na silikagelu způsobem podle publikace B. T. Hunt a další, Chem. a Ind. 1967, 1868 (1967). Výtěžky trimerů, získané shora uvedeným a zlepšeným způsobem jsou uvedeny v tabulce II, přičemž a a b odpovídají použitým blokujícím reakčním činidlům, tak jak jsou uvedena na obr. 3.

Tabulka II

Výtěžek plně chráněných trimerů

Sled	Výtěžek %	Sled	Výtěžěk %
TTT	81	ATG	69
TTT	75	GCC	61
GGA	41	CCA	72
AGA	49	GAA	72
ATC	71	TTA	71
CCT	61	CAT	52
ACA	63	CCC	73
ACC	65	AAC	59
CGT	51	GAT	60

Všech 8 oligodesoxyribonukleotidů bylo po odstranění všech ochranných skupin čištěno vysokotlakou kapalinovou chromatografií na přípravku Permaphase AAX způsobem podle publikace R. A. Henry a další, J. Chrom. Sci. II, 358 (1973). Čistota každého oligomerů byla kontrolována homochromatografií na tenké vrstvě DEAE-celulózy a také elektroforézou na 20% akrylamidovém gelu po značení oligomerů [³²P]- -ATP za přítomnosti polynukleotidkinázy. Z každého fragmentu DNA byl získán jeden hlavní značený produkt.

2. Vazba somatostatinové DNA a její analýza na akrylamidovém gelu

Skupiny OH v poloze 5' chemicky syntetizovaných fragmentů A a H byly odděleně fosforylovány pomocí T4 polynukleotidkinázy. Při fosforylaci byl užit [³²P]-^* -ATP, takže reakční produkty mohly být sledovány autoradiografíčky, přestože bylo stejně dobře možno užít neznačeného ATP. Těsně před reakcí s kinázou bylo odpařeno 25 μθί [³²P]- -ATP, což je přibližně 5,55. 10¹³ S-l/mmol způsobem podle publikace Maxam a Gilbert, Proč. Nat. Acad. Sci. USA 74, 1507 (1977) dosucha v Eppendorfových zkumavkách o objemu 0,5 ml. 5 mikrogramů fragmentu bylo inkubováno se 2 jednotkami T4 DNA kinázy (hydroxylapatitová frakce, 2 500 jednotek/ml, 27) v 70 mmolech trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,6 a 10 mmoly MgCl₂, 5 mmoly dithiothreitolu při celkovém objemu 150 μΐ po dobu 20 minut při teplotě 37 °C. K zajištění maximální fosforylace fragmentů pro vazebné účely bylo přidáno 10 μΐ směsi, sestávající ze 70 molů trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,6, 10 mmolů MgCl_2/ 5 mmolů dithiothreitolu, 0,5 mmolů ATP a 2 jednotek DNA kinázy, byla potom směs inkubována dalších 20 minut při teplotě 37 °C. Fragmenty (250 ng/μΐ) byly skladovány při teplotě -20 °C bez dalšího předchozího zpracování. Takto zpracované fragmenty A, B, E a F, každý v množství 1,25 μg byly podrobeny vazbě na celkovém množství chlorovodíkovou o pH 7,6 s 10 mmoly

-12CZ 280822 B6

Mg Cl₂, 10 mmoly dithiothreitolu, 0,5 mmoly ATP a 2 jednotkami T4 DNA ligázy (hydroxylapatitová frakce, 400 jednotek ml, 27) po dobu 16 hodin při teplotě 4 ’C. Fragmenty C, D, G a H byly vázány za podobných podmínek. Byly odebrány vzorky o objemu 2 mikrolitrů pro analýzu elektroforézou na 10% polyakrylamidovém gelu s následnou autoradiografií způsobem podle publikace H. L. Heyneker a další Nátuře 263, 748 (1976), při této elektroforéze nezreagované fragmenty DNA jsou rychle se pohybující složkou, přičemž monomerní forma vázaných fragmentů se pohybuje společně s bromfenolovou modří. K dimerizaci také dochází vzhledem k přítomnosti kohezivních zakončení na vázaných fragmentech A, B a F i na vázaných fragmentech C, D, G a H. Tyto dimery jsou nejpomaleji se pohybujícím materiálem a je možno je rozštěpit restrikčními endonukleázami Eco Rl a Bam HI.

Poloviny molekul (vázané fragmenty A+ B+E+ Fa vázané fragmenty C + D + G + H) byly spolu spojeny další vazbou, která byla prováděna v konečném objemu 150 μΐ při teplotě 4 ’C po dobu 16 hodin. 1 mikrolitr byl odejmut k analytickým účelům. Reakčni směs byla zahřívána na 15 minut na teplotu 65 °C k inaktivaci T4 DNA ligázy. Zpracování teplem neovlivňuje pohyblivost směsi DNA. Potom bylo přidáno k reakčni směsi dostatečné množství restrikční endonukleázy Bam HI k rozštěpení multimerních forem somatostatinové DNA po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Po přidání chloridu sodného do koncentrace 100 mmolů byla DNA podrobena působení endonukleázy Eco Rl. Působení restrikční endonukleázou bylo ukončeno tak, že DNA byla extrahována směsí fenolu a chloroformu. Somatostatinový fragment DNA byl čištěn od nezreagovaných a částečně vázaných fragmentů DNA preparativní elektroforézou na 10% polyakrylamidovém gelu. Pás, který obsahoval fragment somatostatinové DNA byl vyříznut z gelu a DNA byla vymývána rozřezáním gelu na malé kousky s následnou extrakcí pufrem, sestávajícím z 0,5 M octanu amonného, 10 mmolů MgCl₂, 0,1 mmolu EDTA, 0,1 % SDS přes noc při teplotě 65 °C. Potom byla DNA vysrážena dvěma objemy ethanolu po odstředění byla znovu rozpuštěna ve 200 μΐ trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,6 a dialyzována proti témuž pufru, čímž byla získána DNA somatostatinu v koncentraci 4 μg/ml.

3. Konstrukce rekombinantních plasmidů

Na obr. 4 je schematicky znázorněn získat rekombinantni plasmidy s obsahem Plasmid byl získán následujícím způsobem.

způsob, kterým je možno somatostatinového genu.

A. Původní plasmid pBR322

Plasmid, zvolený pro experimentální klonování v případě somatostatinu byl pBR322, jde o malý plasmid s molekulární hmotností přibližně 2,6 megajednotek nesoucích geny odolnosti proti antibiotikům ampicilinu (Ap) a tetracyklinu (Tc). Jak je znázorněno na obr. 4, gen pro resistenci proti ampicilinu obsahuje místo, vhodné pro působení restrikční endonukleázy Pst I, gen pro odolnost proti tetracyklinu obsahuje podobné místo pro působení restrikční endonukleázy Bam HI a Místo pro působení Eco Rl je

-13CZ 280822 B6 umístěno mezi geny AP^ra Tc^r. Plasmid pBR322 je odvozen od plasmidu s molekulární hmotností 5,8 megadaltonů Ap^rTc^rCol^inun, který byl popsán v publikaci R. L. Rodriquez a další, ICN/UCLA Symposia onMolecular and Cellular Biology 5, 471 až 477 (1976), R.L. Rodriquez a další, Construction and Characterization of Cloning Vehicles, in Molecular Mechanismus in the Control of Gene Expression, str. 471 až 477, Academie Press, lne. (1976). Plasmid pBR322 je charakterizován včetně způsobu svého odvození v publikaci F. Bolivar a další, Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning Systém, Gene (listopad 1977).

B. Konstrukce plasmidu pBHlO

DNA bylo podrobeno působení 10 RI ve 100 mmolech trispufru se 100 mmoly NaCl, 6 30 minut. Reakce se

Potom se DNA vysráží suspenzi v 50 mmoly, ukončí přidámikro, «auuxe 768 (1969)] se podrobí působení 3 jedrestrikční endonukleázy Hae III po dobu 1 hodiny při teplo°C v 6 mmolech trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 6 mmoly MgCl₂ a 6 mmoly β-merkaptoethanolu v konečném objeμΐ. Reakce se zastaví zahříváním po dobu 10 minut na teplo°C. DNa po působení pBR322 se smísí s /| plac 5 DNA po pů5 mikrogramů plasmidu pBR322 jednotek restrikční endonukleázy Eco s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,6 MgCl₂ při teplotě 37 “C po dobu extrakcí směsí chloroformu a fenolu, ním 2,5 objemu ethanolu a znovu se uvede v litrech T4 DNA polymerázy v pufru (67 mmol trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8,8 s 6,7 mmoly MgCl₂, 17,7 mmoly (NH₄)₂SO₄, 167 μg/ml sérového albuminu skotu a 50 mikromoly každého z dNTP. Tento způsob byl popsán v publikaci A. Panet a další, Biochem. 12, 5045 (1973). Reakce začíná přidáním 2 jednotek T4 DNA polymerázy. Směs se inkubuje po dobu 30 minut při teplotě 37 °C, potom se reakce ukončí přidáním směsi fenolu a chloroformu k extrakci DNA, která se potom vysráží ethanolem. 3 μ9 plac 5 DNA [Shapiro a další, Nátuře 224, 768 (1969)] se podrobí působení 3 jednotek tě 37 7,6 s mu 20 tu 65 sobení Hae III a vazba se provádí v koncovém objemu 30 μΐ působením 1,2 shora pufru mmoly tě 12 ru s transformaci E. podle své plotnách s obsahem 40 μg/ml (prostředí X-gal) podle publikace J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Kolonie, schopné syntetizovat β-galaktosidázu je možno identifikovat podle modré barvy. Bylo sledováno 45 nezávisle izolovaných modrých kolonií, tři z nich obsahovaly DNA plasmidy, obsahující dvě místa pro působení enzymu Eco RI, oddělená od sebe přibližně 200 páry bází. Poloha asymetricky umístěného fragmentu Hha I v řídicím fragmentu lac Hae III s 203 páry bází (W. Gilbert a další v Protein-Ligand Interactions, H. Sand A g. Blauer, Eds. (De Gruyter, Berlin, (1975), str. 193 až 210) dovoluje provést stanovení orientace fragmentu Hae III, který se v těchto plasmidech stává jednotek T4 DNA ligázy (hydroxylapatitová frakce, podle uvedené publikace A. Paneta a dalších) ve 20 mmolech triss kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,6 s 10 mmoly MgCl₂, 10 dithiothreitolu a 0,5 mmoly ATP po dobu 12 hodin při teplo°C. Směs DNA se po vazbě dialyzuje proti 10 mmolům trispufkyselinou chlorovodíkovou o pH 7,6 a potom se užije pro coli, kmene RR1. Transformanty se podrobí selekci resistence proti tetracyklinu a ampicilinu na mikroobsahem 40 μg/ml 5-brom-5-chlorindolylgalaktosidu X-gal)

-14CZ 280822 B6 fragmentem Eco RI. Jak bylo prokázáno nese plasmid pBHlO fragment žádané orientace, tj. fragment pro plac transkripci, přecházející do Tc^r genu plasmidu.

C. Konstrukce plasmidu pBH20

Plasmid pHBIO byl modifikován tak, aby bylo odstraněno místo pro působení Eco RI distálně od lac operátoru. Tato modifikace byla provedena tak, že štěpení bylo uskutečněno endonukleázou Eco RI pouze v distálním místě, vhodném pro štěpení tímto enzymem za současného částečného chránění druhého místa, vhodného pro štěpení enzymem Eco RI RNA polymerázou. Toto místo je uloženo mezi Tc^r a lac promotorem, které jsou od sebe vzdáleny pouze 40 párů bází. Po navázání RNA polymerázy se 5 μg DNA podrobí působení 1 jednotky enzymu Eco RI v konečném objemu 10 μΐ po dobu 10 minut při teplotě 37 ’C. Reakce se zastaví zahříváním na teplotu 65 ’C po dobu 10 minut. Kohezivní zakončení po štěpení Eco RI se podrobí působení S1 nukleázy ve 25 mmolech octanu sodného o pH 4,5, 300 mmolů NaCl a 1 mmol ZnCl₂ při teplotě 25 °C na dobu 5 minut. Reakce se zastaví přidáním kyseliny ethylendiamintetraoctové do koncentrace 10 mmolů a trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 8 do výsledné koncentrace 50 mmolů. DNA se potom extrahuje směsí fenolu a chloroformu, vysráží se ethanolem a znovu se uvede v suspenzi ve 100 μΐ pufru pro vazbu T4 DNA. Potom se přidá 1 μΐ T4 DNA ligázy a směs se inkubuje 12 hodin při teplotě 12 °C. Vázaná DNA se transformuje do E. coli kmene RR1 a transformanty Rp^r Tc^r se podrobí selekci na X-gal-prostředí. Modré kolonie se izolují a analýza DNA se provede na 10 koloniích, čímž je možno prokázat, že tyto klony nesou DNa plasmidu s 1 místem působení Eco RI. Sedm z těchto kolonií má místo pro působení Eco RI uloženo mezi promotory lac a Tc^r promotory. Sled nukleotidů z místa působení pro enzym Eco RI v řídicí lac-oblasti byl potvrzen pro plasmid pBH20. Tento plasmid byl potom použit pro klonování somatostatinového genu.

D. Konstrukce plasmidu pSCMl mikrogramú plasmidu pBH20 se podrobí působení restrikčních endonukleáz Eco RI a Bam HI v konečném objemu 50 μΐ. Potom se přidá bakteriální alkalická fosfatáza (0,1 jednotky Worthingttn BAPF) a směs se inkubuje 10 minut při teplotě 65 °C. Reakce se ukončí extrakcí směsi fenolu a chloroformu a DNA se vysráží 2 objemy ethanolu, odstředí a rozpustí v 50 μΐ 10 mmolů trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,6 s 1 mmolem EDTA. Působení alkalickou fosfatázou účinně bráni samovolnou vazbu p-BH20 DNA po působení enzymů Eco RI a Bam HI, stále však je možná tvorba cirkulárních rekombinantních plasmidů s obsahem DNA somatostatinu. Protože E. coli kmen RR1 je transformován lineárním plasmidem DNA s velmi malou účinností, převážná většina transformantů bude obsahovat rekombinantní plasmidy. 50 μΐ DNA somatostatinu o koncentraci 4 μg/ml se podrobí vazbě působením 25 μΐ enzymu BAM HI a Eco RI s pBH20 DNA po působení alkalické fosfatázy v celkovém objemu 50 μΐ s obsahem 20 mmolů trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,6 s 10 mmoly MgCl₂, 10 mmoly dithiothrei

-15CZ 280822 B6 tolu, 0,5 mmoly ATP a 4 jednotkami T4 DNA ligázy při teplotě 22 C. Po 10, 20 a 30 minutách se přidá dalších 40 mg DNA somatostatinu k reakční směsi, protože postupné přidávání DNA somatostatinu může příznivě ovlivnit vazbu na plasmid přes samovolnou vazbu. Reakce probíhá ještě hodinu, potom se směs podrobí dialýze proti 10 mmolům trispufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH, 7,6.

V kontrolním pokuse se Bam HI a Eco RI, pBH20 po působení alkalické fosfatázy váže nepřítomnosti DNa somatostatinu za podobných podmínek. Oba materiály se užijí bez dalšího předběžného zpracování pro transformaci E. coli, kmene RR1. Transformace byla prováděna v zařízení P3. (National Institutes of Health, USA, Recombinant DNA Research Guidelines, 1976). Transformanty byly podrobeny selekci na mikroplotnách s obsahem 20 μg/ml Ap a 40 úg/ml X-gal. Bylo izolováno 10 transformantů, z nichž všechny byly citlivé na Tc. Tyto transformanty byly označeny pSOMl, pSOM2.... až pSOMlO. V kontrolním pokusu nebyly získány žádné transformanty. 4 z 10 transformantů obsahovaly plasmidy s místem působení pro Eco RI i pro Bam HI. Rozměr malého fragmentu Eco RI a Bam HI v těchto rekomginantních plasmidech byl ve všech čtyřech případech podobný velikosti DNA somatostatinu, připravené in vitro. Analýza sledu zásad byla provedena způsobem podle publikace Maxam a Gilbert Proč. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977) a prokázala, že plasmid pSOMl obsahuje žádaný DNA fragment somatostatinu.

Analýza sledu DNA v klonu, který nese plasmid pSOMl předpovídá, že by měl vzniknout peptid, který odpovídá somatostatinu.

V extraktech supernatantu koltury však nebylo možno radioimunologickým způsobem zjistit žádný somatostatin, ani nebylo možno prokázat somatostatin v případě, že se rostoucí kultura přímo přidá k 70% kyselině mravenčí s bromkyanem. Extrakty E. coli kmene RR1 velmi rychle degradují exogenní somatostatiny. Nepřítomnost somatostatinové účinnosti v klonech, nesoucích plasmid pSOMl může být způsobena nitrobuněčnou degradací endogenními proteolytickými enzymy. Plasmid pSOMl byl užit ke konstrukci plasmidového kódu pro bílkovinu, která je prekursorem somatostatinu a je dostatečně veliká, aby mohla odolat proteolytickému štěpení.

E. Konstrukce plasmidů pSOMll a pSOMll-3

Byl zkonstruován plasmid, v němž somatostatinový gen může být uložen na C-zakončení genu pro β-galaktosidázu, přičemž celá struktura tohoto genu je zachována. Protože gen obsahuje v blízkosti uvedeného zakončení místo, vhodné pro působení enzymu Eco RI a vzhledem ke sledu aminokyselin v této bílkovině, (B. Polisky a další. Proč. Nat. Acad. Sci. USA 73, 3900 (1976), A. V. Fowlar a další, Id, a 74, 1507 (1976), A. I. Bukhari a další, Nátuře New Biology 243, 238 (1973) a K. E. Langley, J. Biol. Chem. 250, 2587 (1975) bylo možno včlenit somatostatinový gen se zakončeními z míst pro působení enzymů. Eco RI Bam HI do místa pro působeni enzymu Eco RI, přičemž současně bylo možno udržet žádaný sled struktur. Při konstrukci tohoto plasmidu bylo podrobeno 50 mikrogramů p-SOMl DNA působení restrikčních enzymů Eco RI a Pst I v konečném objemu 100 mikrolitrů. K oddělení velkých fragmentů Pst-Eco RI se somatostatinovým genem od malých fragmentů s lac řídícími elementy bylo užito 5% polyakrylamidového gelu. Široký pás byl z gelu vyříznut a DNA byla vymyta nařezáním gelu na malé kousky s následnou extrakcí DNA přes noc při teplotě 65 °C, Podobným způsobem bylo 50 mikrogramů plasmidu pBR322 podrobeno pů

-16CZ 280822 B6 sobení restrikčních endonukleáz Pst I a Eco RI a oba výsledné fragmenty DNA byly čištěny preparativní elektroforézou na 5% polyakrylamidovém gelu. Potom bylo malé množství (1 mikrogram) malých fragmentů Pst I-Eco RI z pBR322 vázáno s 5 mikrogramy velkého fragmentu Pst I-Eco RI z pSOMl v konečném objemu 50 mikrolitrů za přítomnosti 1 jednotky T4 DNA ligázy při teplotě 12 ’C po dobu 12 hodin. Směs po vazbě byla použita pro transformaci E. coli RRI a transformanty byly analyzovány na svou odolnost proti ampicilinu na prostředí X-gal. Jak bylo možno očekávat, téměř všechny Ap^r transformanty (95 %) poskytovaly bílé kolonie na prostředí X-gal, čímž byla prokázána nepřítomnost lac operátoru. Výsledný plasmid pSOMll byl určen pro konstrukci plasmidu pSOMll-3. Směs 5 mikrogramů pSOMll DNA a 5 mikrogramů plac⁵ DNA byla podrobena působení 10 jednotek enzymu Eco RI po dobu 30 minut při teplotě 37 ’C. Působení restrikční endonukleázy bylo ukončeno extrakci, která byla prováděna směsí fenolu a chloroformu. DNA potom byla vysrážena ethanolem a znovu uvedena v suspenzi v 50 mikrolitrech pufru, vhodného pro působení T4 DNA ligázy. Potom bylo ke směsi přidáno 1 jednotka T4 DNA ligázy a směs byla inkubována 12 hodin při teplotě 12 °C. Po provedené vazbě byla směs dialyzována proti 10 mmolům Tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou o pH 7,6 a bylo použito k transformaci E. coli RRI. Transformanty byly analyzovány na Ap^r na prostředí X-gal s obsahem ampicilinu a byly také zkoumány na možnost produkce β-galaktosidázy. Přibližně 2 % kolonií mělo modrou barvu (pSOMll-1, 11-2 atd). Analýza plasmidové DNA, získané z těchto klonů restrikčními enzymy prokázala, že všechny plasmidy obsahovaly nový Eco RI fragment s přibližně 4,4 megadaltony, tento fragment obsahoval většinu genů pro β-galaktosidázu a místo pro působeni lac operonu. Zásadné jsou možné dvě orientace fragmentu Eco RI, takže bylo užito asymetrického uložení místa pro působení restrikční endonukleázy Hind III pro stanovení kolonií, které obsahovaly fragment Eco RI odpovídající somatostatinovému genu. Po působení enzymů Hind III a Bam Hl bylo prokázáno, že pouze klony, obsahující plasmidy pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6 a pSOMll-7 obsahovaly fragment Eco RI v uvedené orientaci.

4. Radioimunologické zkoušky na účinnost somatostatinu

Standardní radioimunologické zkoušky (RIA) na somatostatin popsané v publikaci A. Arimuta a další, Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975) byly modifikovány snížením objemu a použitím fosfátového pufru. Tyr¹¹ somatostatin byl jodován při použití chloraminu T. Při provádění zkoušek na somatostatin byl vzorek, obvykle v roztoku v 70% kyselině mravenčí s obsahem 5 mg/ml bromkyanu vysušen v kónické polypropylenové zkumavce o obsahu 0,7 ml (Sarstedt) nad KOH ve vakuu. Potom bylo přidáno 30 mikrolitrů pufru PBSA (75 mmolů NaCl, 75 mmolů fosforečnanu sodného o pH 7,3, 1 mg/ml sérového albuminu skotu, a 0,2 mg/ml ažidu sodíku) a potom bylo přidáno ještě 40 mikrolitrů¹²⁵I-somatostatinu a 20 mikrolitrů 1 000 násobného zředění králičího imunního séra S39 proti somatostatinu v pufru PBSA (Vale a další Metabolism 25, 1491 (1976). Značený ¹²⁵I-somatostatin obsahoval v 1 ml pufru PBSA 250 mikrogramů normálního králičího gamaglobulinu (Antibodies, lne.), 1 500 jednotek inhibitoru proteázy (Tasylol, Cal

-17CZ 280822 B6 biochem) a přibližně 100 000 impulzů ¹²⁵I-Tyr^lx-somatostatinu. Po alespoň 16 hodinách stání při teplotě místnosti bylo přidáno do zkumavek 0,333 ml kozího gamaglobulinu, imunního proti králičímu séru (Antibodies, lne., p=0,03) a směs byla inkubována 2 hodiny při teplotě 37 C, potom byla zchlazena na 5 •Ca odstředěna při 10 000 ob/min po dobu 5 minut. Supermatant byl odstraněn a radioaktivita segmentu byla stanovena na počítači pro gama zářeni. Při použitém množství antiséra bylo vysráženo 20 % radioaktivní látky a žádný neznačený somatostatin. Pozadí při použití 20 mg somatostatinu bylo obvykle 3 %. Polovina maximální kompetice byla stanovena při použití 10 pg somatostatinu. Počáteční pokusy s extrakty E. coli RR1 ukazovali, že je možno snadno zjistit i méně než 10 pg somatostatinu za přítomnosti 16 mikrogramů nebo většího množství bakteriální bílkoviny po zpracování bromkyanu. Více než 2 mikrogramy bílkoviny z bakteriálního extraktu po působení kyseliny mravenčí je poněkud na závadu v tom smyslu, že se zvýší pozadí, tato nevýhoda je však do značné míry odstraněna štěpením bromkyanem. Další pokusy prokázaly, že v extraktech po působení bromkyanu je somatostatin stálý.

A. Kompetice s bakteriálními extrakty

Kmeny E. coli RR1 (pSOMll-5) a E. coli RR1 (pSOMll-4) byly pěstovány při teplotě 37 °C v prostředí Luria broth do koncentrace 5 x 10⁸ buněk/ml. Potom byl přidán IPTG do koncentrace 1 mmol a kmeny byly pěstovány další 2 hodiny. Potom byly vzorky o obsahu 1 ml odstředěny několik vteřin a segmenty byly znovu uvedeny v suspenzi v 500 mikrolitrech 70% kyseliny mravenčí s obsahem 5 mg/ml bromkyanu. Po stáni 24 hodin při teplotě místnosti byly vzorky lOx zředěny vodou a objemy, znázorněné na obr. 6A byly analyzovány na somatostatin. Každá zkouška byla prováděna třikrát. Na obr. 6A znamená poměr B/Βθ poměr ¹²⁵I-somatostatinu vázaného za přítomnosti vzorku k somatostatinu, který se váže v nepřítomnosti somatostatinu, který je příčinou kompetice. Každý bod je průměrem ze tří stanovení. Obsah bílkoviny v nezředéném vzorku byl 2,2 mg/ml pro E. coli RR1 (pSOMll-5) a 1,5 mg/ml pro E.coli RR1 (pSOM-4).

B. Počáteční analýza klonů pSOMll na somatostatin

Extrakty z 11 klonů (pSOMll-2, pSOMll-3, atd) po působení bromkyanu byly připraveny shora uvedeným způsobem, tak jak je znázorněno na obr. 6A. Potom bylo z každého extraktu odebráno 30 mikrolitrů pro trojnásobnou radioimunologickou zkoušku. Jejich výsledky jsou zřejmé z obr. 6B. Je také znázorněna oblast jednotlivých bodů. Hodnoty pro somatostatin v pg je možno odečíst ze standardní křivky, získané v průběhu téhož pokusu.

Výsledky shora popsaných radioimunologických zkoušek je možno shrnout následujícím způsobem. Oproti výsledkům, dosaženým při použití pSOMl bylo zjištěno, že čtyři (klony pSOMll-3, 11-5, 11-6 a 11-7) obsahují snadno prokazatelnou radioimunologickou účinnost, kterou je nutno připsat přítomnosti značeného somatostatinu, jak je zřejmé z obr. 6. Analýza fragmentů po působení restrikčních endonukleáz prokázala, že klony pSOMll-3-, pSOMll-5, pSOMll-6 a pSOMll-7 mají požadovanou orientaci lac ope

-18CZ 280822 B6 ronu, zatímco klony pSOMll-2 a 11-4 mají orientaci opačnou. Existuje tedy shoda mezi správnou orientací lac operonu a produkcí somatostatinu při radioimunologických zkouškách.

C. Vliv indukce IPTG a štěpení bromkyanem na pozitivní a negativní klony.

Struktura somatostatinového plasmidu předpokládá, že syntéza somatostatinu bude řízena lac operonem. Gen lac represoru není v plasmidu obsažen a kmen E. coli RRI obsahuje divoký typ chromozomálního genu s obsahem lac represoru, který produkuje pouze 10 až 20 molekul represoru v jedné buňce (15). Počet lac operátorů je přibližně 20 až 30 v jedné buňce, takže úplná deprese je nemožná. Jak je znázorněno v následující tabulce III, byla účinnost somatostatinu v E. coli RRI (pSOMll-3) zvýšena IPTG, induktorem lac operonu. Jak bylo možno očekávat, úroveň indukce byla nízká, 2,4 až 7 násobná. V pokusu 7 a tabulky III je zřejmé, že a-aktivita, která je závislá na prvních 92 aminokyselinách β-galaktosidázy byla také dvakrát indukována. V některých pokusech nebylo možno prokázat žádnou radioimunologickou účinnost pro somatostatin před štěpením bromkyanem. Protože antisérum, užité v radioimunologickém pokusu, tj antisérum S-39 vyžaduje volný N-terminální alanin, nebylo ani možno očekávat účinnost před štěpením bromkyanem.

Tabulka III

Specifická radioimunologická aktivita somatostatinu Čísla Kmen Prostředí IPTG CNBr pg SS/mikrogramy pokusu 1 mM 5 mg/ml bílkoviny

1	11-2	LB	+	+	< 0,1
	11-3	LB	+	+	12
	11-4	LB	+	+	< 0,4
	11-5	LB	+	+	15
2	11-3	LB	+	+	12
	11-3	LB	+	—	< 0,1
3	11-3	LB	+	+	61
	11-3	LB	+	+	8
	11-3	LB	+	—	< 0,1
4	11-3	LB	+	+	71
	11-3	VB+glycerol*	+	+	62
5	11-3	LB+glycerol	+	+	250
6	11-3	LB	+	+	320
	11-2	LB	+	+	< 0,1
7	11-3	LB	+	+	24
	11-3	LB	—	+	10
*	Vogel-Bonnerovo minimální	prostředí	s	glycerolem.

-19CZ 280822 B6

Zkratky:

LB - živné prostředí Luria broth IPTG - isopropylthiogalaktosid CNBr - bromkyan

SS - somatostatin

Bílkovina byla stanovena metodou, popsanou v publikaci Bradford, Anal. Biochem. 72., 248 (1976).

D. Filtrace extraktů, zpracovaných působením bromkyanu na gelu

Extrakty pozitivních klonů (pSOMll-3, 11-5, 11-6 a 11-7) po působení kyseliny mravenčí a bromkyanu se slijí na celkový objem 250 mikrolitrů, vysuší se a znovu se uvede v suspenzi v 0,1 ml 50% kyseliny octové, přidá se ³H-elucin a vzorek se nanese na sloupec o rozměrech 0,7 x 47 cm s obsahem Sephadexu G-50 v 50% kyselině octové. Z frakcí se odebírají vzorky o 50 mikrolitrech a tyto vzorky se analyzují na somatostatin. Stejným způsobem se zpracovávají extrakty, slité z negativních klonů (11-2, 11-4 a 11-11). Výsledky jsou uvedeny na obr. 5C. Z obr. 5C, se na tomtéž sloupci zachycuje i známý somatostatin (Beckman Corp.)· V tomto systému se somatostatin dobře izoluje od velkých peptidů a malých molekul. Pouze extrakty klonů, pozitivních na somatostatin měly radioimunologickou účinnost a tato aktivita byla vymývána v téže poloze sloupce jako chemicky syntetizovaný somatostatin.

Souhrn

Údaje o syntéze polypeptidu, který obsahuje sled aminokyselin, typický pro somatostatin je možno shrnout následujícím způsobem:

1) Radioimunulogickou aktivitu pro somatostatin je možno prokázat v buňkách E. coli s obsahem plasmidu pSOMll-3, který obsahuje somatostatinový gen se správným sledem a má správnou orientaci fragmentu lac Eco RI DNA. Buňky příbuzného plasmidu pSOMll-2, který obsahuje tentýž somatostatinový gen, avšak obrácenou orientaci fragmentu lac Eco RI neprodukují zjistitelný somatostatin.

2) Jak je možno předpokládat, není možno prokázat radioimunologickou aktivitu pro somatostatin před zpracováním buněčného extraktu bromkyanem.

3) Aktivita pro somatostatin je řízena lac operonem, jak je možno prokázat indukci IPTG, který je induktorem lac operonu.

4) Aktivita pro somatostatin v současné prováděných chromátogramech s použitím známého somatostatinu na Sephadexu G-50.

5) Sled DNA v klonovaném somatostatinovém genu je správný. V případě, že se translace neprovede ve správné fázi, je výsledkem peptid, který je odlišný od somatostatinu ve všech polohách. Rádioimunologická aktivita prokazuje přítomnost peptidu, blízce příbuzného somatostatinu, přičemž translace musí být provedena ve

-20CZ 280822 B6 fázi. V tomto případě vzhledem ke genetickému kódu musí dojít k produkci peptidu s přesným sledem pro somatostatin.

6) Shora uvedené vzorky extraktu E. coli RR1 (pSOMll-3) inhibují uvolňování růstového hormonu z podvésku mozkového u krys, zatímco vzorky extraktů E. coli RR1 (pSOMll-2) nemají v téže koncentraci žádný vliv na uvolňování růstového hormonu.

Stálost, výtěžek a čištění somatostatinu

Kmeny, nesoucí fragment Eco RI lac operonu (pSOMll-2, p-SOMll-3 atd) se rozlišují podle plasmidového fenotypu. Například po 15 generacích přibližně polovina kultur E. coli RR1 (pSOMll-3) byla schopna produkovat β-galaktosidázu, to znamená, že obsahovala lac operátor a z těchto kultur byla polovina odolná proti ampicilinu. Kmeny, pozitivní (pSOMll-3) a negativní (p-SOMll-2) na somatostatin jsou nestálé, tato růstová nestálost patrně spočívá v příliš vysoké produkci velkých molekul neúplné a neúčinné galaktosidázy. Výtěžek somatostatinu se měnil v rozmezí 0,001 až 0,03 % celkové buněčné bílkoviny, jak je zřejmé z tabulky 1, pravděpodobně v důsledku selekce buněk v kultuře na základě plasmidů a porušenou lac oblastí. Nejvyšší výtěžky somatostatinu byly získány z linií, v nichž bylo zahájeno pěstování z jediné kolonie, odolné proti ampicilinu. I v těchto případech bylo možno pozorovat ve 30 % buněk při izolaci poruchy v lac oblasti. Skladováním ve zmrzlém stavu (lyofilizaci) a růstem z jediné kolonie bylo možno prokázat správnost uvedených předpokladů. Výtěžky je možno zvýšit například použitím bakteriálních kmenů, které mají velmi vysokou produkci lac represoru, jinak je také možno postupovat tak, že se užije tryptofan nebo jiný systém operátor-promotor, který je běžně úplně potlačen, jak již bylo uvedeno shora.

V surovém extraktu, který se získá po rozrušení buněk (například v přístroji Eaton Press) je bílkovina, která je prekursorem pro somatostatin a obsahuje β-galaktosidázu nerozpustná a je možno ji nalézt v prvním sedimentu při nejvyšší rychlosti odstřelování. Bílkovinu je možno rozpustit v 70% kyselině mravenčí, 6 M guanidinium hydrochloridu nebo 2% dodecylsíranu sodném. S výhodou se surový extrakt extrahuje 8 M močovinou a zbytek po extrakci se štěpí bromkyanem. V počátečních pokusech bylo možno zvýšit aktivitu somatostatinu, získanou z E. coli RR1 (pSOMll-3) přibližně 100X tak, že byl produkt odštěpný extrahován alkoholem a chromatografován na přípravku Sephadex G-50 s 50% kyselinou octovou. Při další chromatografii výsledného produktu na Sephadexu G-50 s následnou vysokotlakou kapalinovou chromatografií bylo možno získat v podstatě čistý somatostatin.

II. Lidský inzulín

Shora popsaný postup byl aplikován na výrobu lidského insulinu. Byly identifikovány geny pro řetězec B insulinu (104 páry baží) a pro řetězec A insulinu (77 párů baží). Tyto skutečnosti byly zjištěny ze sledů aminokyselin v polypeptidech lidského původu, z nichž každý měl místa, vhodná pro působení restrikčnich endonukleáz Eco RI a Bam HI a každý z nich byl určen odděleně pro včlenění do plasmidů pBR322. Syntetické fragmenty, a to dekanukleotidy až pentadekanukleotidy byly syntetizovány fosfotrieste

-21CZ 280822 B6 rovou metodou, přičemž jako stavební kameny byly užity trinukleotidy, čištění bylo prováděno kapalinovou chromatografií za vysokého tlaku. (HPLC). Řetězce A a B lidského insulinu, a to jejich syntetické geny potom byly odděleně klonovány v plasmidech pBR322. Klonované syntetické geny byly spojeny s β-galaktosidázovým genem E. coli shora uvedeným způsobem, čímž bylo dosaženo účinné transkripce, translace a vzniku stálého prekursoru bílkoviny. Peptidy insulinu byly odštěpeny od β-galaktosidázového prekursoru, stanoveny rádioimunologickým způsobem a dále čištěny. Aktivita insulinu byla stanovena radioimunologickými metodami ve směsi produktů z E. coli.

1) Struktura o syntéze genů lidského insulinu

Geny lidského insulinu jsou znázorněny na obr. 9 Struktura genů řetězců B a A lidského insulinu byla stanovena ze sledů aminokyselin v polypeptidech lidského původu. Zakončení každého genu v poloze 5' obsahuje zakončení pro působení enzymu Eco RI a Bam HI s jednoduchým řetězce, aby bylo možno správně včlenit každý gen do plasmidu pBR322. Do střední části genu pro řetězec B bylo včleněno místo pro působení endonukleázy Hind III, a to v úseku pro sled aminokyselin Glu-Ala tak, aby bylo možno ověřit každou polovinu genu odděleně před konstrukcí celého genu pro řetězec B. Geny pro řetězec B a pro řetězec A byly vytvořeny z 29 různých oligodesoxyribonukleotidů, a to z dekamerů až pentadekamerů. Každá šipka znázorňuje fragment, syntetizovaný zlepšeným fosfotriesterovým způsobem, a to H1 až H8 a B1 až B12 pro řetězec B a Al až All pro řetězec A.

2) Lidská syntéza oligodesoxyribonukleotidů

Bylo užito materiálů a metod pro syntézu oligodesoxyribonukleotidů, popsaných v publikacích Itakura, K. a další (1975) J. Biol. Chem. 250, 4592 a Itakura, K. a další (1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327 až na tyto modifikace.

a) Plně chráněné mononukleotidy, 5¹-O-dimethoxytrityl-3'-p-chlorofenyl^-kyanoethylfosfáty byly syntetizovány z nukleosidových derivátů při použití monofunkčního fosforylačního činidla p-chlorfenyl-6~kyanoethylfosfochloridu (1,5 molárního ekvivalentu) v acetonitrilu za přítomnosti 1-methylimidazolu způsobem podle publikace Van Boom, J. H. a další (1975) Tetrahedron 21, 2953. Produkty byly izolovány ve větším množství (100 až 300 g) preparativní kapalinovou chromatografií. (Prep 500 LC, Waters Associates).

b) Bifunkční trimery byly syntetizovány při použití extrakce rozpouštědlem [Hirose, T. a další (1978) Tetrahedron Letters, 2449] v množství 5 až 10 mmolů, dalších 13 trimerů, 3 tetramery a 4 dimery jako koncové bloky v poloze 3' byly syntetizovány v množství 1 mmol. Homogenita plně chráněných trimerů byla kontrolována chromatografii na tenké vrstvě silikagelu ve dvou směsích methanolu a chloroformu. Rozpouštědlo a) obsahovalo 5 % methanolu a rozpouštědlo b) obsahovalo 10 objemových % methanolu, jak je uvedeno v tabulce IV. Tímto způsobem bylo syntetizováno 29 oligodesoxyribonukleotidů s definovaným sledem, z toho 18 pro řetězec B a 11 pro řetězec A.

-22CZ 280822 B6

Základními jednotkami pro konstrukci polynukleotidů byly dva typy trimerních bloků, tj bifunkční bloky trimerů z tabulky IV a odpovídající 3' terminální trimery, chráněné zbytkem kyseliny anisolové na hydroxyskupiné v poloze 3’. Bifunkční trimer byl hydrolyzován na odpovídající 3’-fosfodiesterovou složku směsí pyridinu, triethylaminu a vody v objemové poměru 3:1:1 a také na odpovídající 5'-hydroxylovou složku působením 2% roztoku kyseliny benzensulfonové. Shora uvedený 3'-terminální blok byl zpracován působením 2% roztoku kyseliny benzensulfonové za vzniku odpovídajícího 5’-hydroxylového zakončení. Reakce 1,5 molárních ekvivalentů, tj. přebytku 3¹-fosfodiesterového trimeru s 1 molárním ekvivalentem 5'-hydroxylové složky za přítomnosti 3 až 4 ekvivalentů 2,4,6-triisopropylbenzensulfonyltetrazolidu (TPSTe) byla téměř ukončena v průběhu 3 hodin. Aby bylo možno odstranit přebytek 3'-fosfodiesterové složky, byla reakční směs uvedena na vrchol krátkého silikagelového sloupce, uloženého na syntrovaném skleněném filtru. Sloupec byl promýván nejprve chloroformem k vymytí některých vedlejších produktů a reakčního činidla a potom směsí chloroformu a methanolu v objemovém poměru 95:5, čímž došlo k vymytí téměř veškerého plně chráněného oligomeru. Za těchto podmínek zůstává 3'-fosfodiesterová složka, nesoucí náboj ve sloupci. Podobným způsobem byly prováděny další syntézy tak dlouho, až bylo dosaženo žádané délky oligomeru. Výsledky jsou znázorněny v následující tabulce IV.

Tabulka IV

Syntéza trimerních bloků

Číslo	Sloučenina*	Výtěžek**	Rf		i. , . *** Čistota	Na obr. 9 obsažena v
		W	a.	b.	(*)
1	AAG	47	0,15	0,40	93	Bl, B6
2	AAT	49	0,25	0,52	95	Hl, AI, A6
3	AAG	52	0,28	0,55	93	H5, B6, A2, A8 B4, B5, A6
4	ACT	43	0,27	0,53	91
5	ACC	56	0,33	0,60	96	B7
6	ACG	39	0,18	0,45	90	H5, B7
7	AGG	45	0,10	0,26	89	H6, B7, B9
8	AGT	33	0,14	0,40	96	B9, A2, All
9	AGC	50	0,19	0,48	92	H8, Bl, A5, A10
10	AGA	48	0,24	0,50	91	A9
11	TTC	44	0,26	0,52	95	B4, B7, A3
12	TTC	49	0,11	0,31	94	B3, B5, A2, A3, A5
13	TCT	58	0,24	0,49	96	A4
14	TCA	45	0,28	0,53	92	Bl, B2, H4, AI
15	TCG	39	0,12	0,34	91	A2
16	TGG	32	0,10	0,28	87	H3, AI, A10
17	TGC	51	0,18	0,47	93	H6, B2, A4, A7, A8
18	TGA	46	0,12	0,37	94	B7
19	TAC	61	0,22	0,50	90	B4, All
20	TAA	55	0,17	0,44	95	B5, A10
21	CCT	53	0,30	0,55	97	H3, B4, BIO
22	CAC	47	0,25	0,51	92	A3
23	CAA	58	0,25	0,51	93	H2, B6, H8, A7
24	CTT	41	0,28	0,54	92	B2, B9, A4
25	CGA	40	0,27	0,52	93	A7
26	CGT	75	0,25	0,50	89	B2, B4, B3, Bl

-23CZ 280822 B6

Tabulka IV - pokračování

27	GGT	35	0,09	0,26	90	B3
28	GTT	46	0,18	0,45	93	B2
29	GTA	38	0,25	0,50	95	B6, B8,	A6
30	GAA	39	0,15	0,39	88	H7, B3, BIO, A9	B8, A5
31	GAT	52	0,22	0,49	89
32	GCA	42	0,14	0,39	93	A9

* plné chráněné tridesoxynukleotidy, 5-09-dimethoxytrityl-3'-p-chlorfenyl-p-kyanoethylfosfát ** Celkový výtěžek, vypočítaný z 5'-hydroxylmonomerů *** HPLC analýza

V průběhu syntézy oligonukleotidů bylo užito vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) pro

a) analýzu každého trimerního a tetramerního bloku,

b) analýzu meziproduktů, a to hexamerů, dekamerů a nonamerů,

c) analýzu průběhu reakce a k

d) čištění výsledných produktů.

Vysokotlaká kapalinová chromatografie se provádí při použití přístroje Spectra-Physics 3500B. Po odstranění všech chráněných skupin koncentrovaným amoniakem při teplotě 50 °C po dobu 6 hodin a AcOH při teplotě místnosti po dobu 15 minut byly výsledné sloučeniny analyzovány na sloupci přípravku Permaphase AAX (DuPont) [Van Boom, J. a další (1977) J. Chromatography 131, 169] (1 mX 2 mm) při použití lineárního gradientu rozpouštědla B, které sestává z 0,05 molu KH₂PO₄ a 1,0 molu KC1 při pH 4,5 v rozpouštědle A, které sestává z 0,01 molu KH₂PO₄ o pH 4,5. Gradient byl vytvořen tak, že nejprve bylo užito rozpouštědla A a potom byla přidávána 3 % rozpouštědla B za minutu. Eluce byla prováděna při teplotě 60 °C při průtokové rychlosti 2 ml za minutu. Čištění 29 výsledných oligonukleotidů bylo také prováděno na prostředku Permaphase AAX za týchž shora uvedených podmínek. Žádané frakce byly slity, soli byly odstraněny dialýzou a frakce byly lyofilizovány. Po označení 5’-zakončení pomocí ( Q* -³²P)ATP při použití T₄ polynukleotidkinázy byla homogenita každého oligonukleotidů kontrolována elektroforézou na 20% polyakrylamidovém gelu.

3) Konečná vazba a klonování řetězců A a B genu

Gen pro řetězec B insulinu má místo pro působení enzymu Eco RI na levém konci, místo pro působení enzymu Hind III ve střední části a místo pro působení enzymu Bam Hl na pravém konci. Obě poloviny, levá polovina Eco RI-Hind III (BH) a pravá polovina Hind III-Bam Hl (BB) byly odděleně klonovány na vhodném plasmidu pBR322 a po ověření svého sledu byly obě poloviny spojeny na úplný gen pro řetězec B, jak je znázorněno na obr. 10. Polovina BB byla sestavena z 10 oligodesoxyribonukleotidů, které jsou na obr. 9 označeny B1 až BIO a byly získány fosfotriesterovým způsobem. B1 až BIO nebyly fosforylovány, čímž byla vyloučena nežádoucí polymerace těchto fragmentů na kohezivních zakončeních Hind III a Bam Hl. Po čištění preparativní elektroforézou na akryl

-24CZ 280822 B6 amidovém gelu s elucí nejširšího pruhu DNA, fragment BB se včlení do plasmidu pBR322 po štěpení enzymy Hind III a Bam HI. Přibližně 50 % kolonií, odolných proti ampicilinu a odvozených od uvedené DNA bylo citlivých na tetracyklin, což znamená včlenění neplasmidového fragmentu Hind III-Bam HI. Malé fragmenty Hind III-Bam Hi z 4 těchto kolonií pBBlOl až pBB104 byly analyzovány a bylo zjištěno, že mají správný sled.

Fragment BH byl připraven podobným způsobem a byl také včleněn do plasmidu pBR322 po rozštěpení restrikčními endonukleázami Eco RI a Hind III. Byly analyzovány plasmidy ze tří transformantů pBHl až pBH3, které byly rezistentní proti ampicilinu a citlivé na tetracyklin. Malé fragmenty Eco RI-Hind III měly očekávaný sled nukleotidů.

Řetězec A byl sestaven ze tří částí, 4 oligonukleotidy z levé části, 4 oligonukleotidy z pravé části a 4 střední oligonukleotidy byly vázány odděleně a potom byly vázány navzájem, tak jak je znázorněno na obr. 9. Oligonukleotidy AI a A12 nebyly fosforylovány. Sestavený gen pro řetězec A byl fosforylován, čištěn elektroforézou na gelu a klonován na pBR322 v úseku Eco RI-Bam HI. Úseky Eco RI-Bam HI z dvou klonů ρΑΙΟ, pAll, odolných proti ampicilinu a citlivých na tetracyklin obsahovaly žádaný sled genů pro řetězec A.

4) Konstrukce plasmidů pro expresy genů řetězců A a B lidského insulinu

Na obr. 10 je znázorněna konstrukce plasmidu lac-insulinu B (pIBl) plasmidy pBHl a pBBlOl byly podrobení působení endonukleáz Eco R¹ a Hind III. Malé BH fragmenty plasmidu pBHl a velké fragmenty plasmidu pBBlOl, obsahující fragmenty BB a většinu plasmidu pBR322 byly čištěny elektroforézou na gelu, smíseny a vázány z přítomnosti plac 5 po štěpení Eco RI. Velký fragment Eco RI Λ plac 5 obsahuje lac-řidicí oblast a většinu β-galaktosidázového strukturálního genu. Konfigurace míst pro působení restrikčních endonukleáz zajišťuje správnou vazbu fragmentů B^H a BB. Fragment lac Eco RI může být včleněn ve dvou orientacích. Z toho důvodu pravděpodobně pouze jedna polovina klonů, získaných po transformaci by měla mít žádanou orientaci. Orinetace 10 klonů, odolných proti ampicilinu a schopných produkovat β-galaktosidázu byla analyzována pomocí restrikčních endonukleáz. Pět z těchto kolonií obsahovalo celý sled pro gen řetězce B a správný sled na přechodu β-galaktosidázového genu do genu pro řetězec B. Jeden z těchto klonů pIBl byl zvolen pro další pokusy.

Při podobném pokusu byl 4,4 megadaltonový fragment lac z Λ plac 5 včleněn do plasmidu pAll v místě Eco RI za vzniku pIAl. pIAl je identický s pIBl až na to, že fragment genu pro řetězec A je umístěn místo fragmentu pro řetězec B. Při analýze sledu DNA bylo prokázáno, že oba plasmidy pIAl a pIBl mají správný sled nukleotidů pro řetězec A a B.

5) Exprese

Kmeny, které obsahují geny insulinu ve správné vazbě na gen β-galaktosidázy produkují velká množství bílkoviny rozměru β-ga

-25CZ 280822 B6 laktosidázy. Přibližně 20 % celkové buněčné bílkoviny je hybrid řetězce A a B s β-galaktosidázou. Hybridní bílkoviny jsou nerozpustné a je možno je oddělit již při odstředění nízkou rychlostí, kdy tvoří 50 % veškeré oddělené bílkoviny.

K detekci exprese řetězců A a B lidského insulinu bylo užito radioimunologických metod, založených na rekonstituci úplného insulinu z oddělených řetězců. Insulin byl rekonstituován způsobem podle publikace Katsoyannis a další (1967) Biochemistry 6, 2642 až 2655, který byl adaptován na objem 27 mikrolitrů, čímž byla získána velmi vhodná metoda. Aktivitu insulinu je možno snadno prokázat po smísení a rekonstituci S-sulfonových derivátů insulinových řetězců. Oddělené S-sulfonované řetězce inzulínu nereagují významně po redukci a oxidaci s použitou protilátkou proti insulinu.

Pro použití v pokusu na rekonstituci bylo nutno částečně čistit bílkovinu, která je hybridem řetězce A nebo řetězce B insulinu s β-galaktosidázou, potom bylo prováděno štěpení bromkyanem a nakonec byly syntetizovány S-sulfonované deriváty.

Skutečnost, že bylo dosaženo správné exprese z chemicky syntetizovaných genů lidského insulinu je možno prokázat následujícími způsoby:

a) Pro oba řetězce bylo možno prokázat aktivitu při radioimunologickém sledování.

b) Sledy DNA, získané po klonování a po konstrukci plasmidu bylo možno přímo ověřit a prokázat jejich správnost. Protože při radioimunologických zkouškách je možno prokázat aktivitu, translace musí být ve fázi. To znamená, že podle genetického kódu jsou produkovány peptidy se sledem, který odpovídá lidskému insulinu.

c) Produkty z E. coli se chovají jako řetězce insulinu po štěpení bromkyanem ve třech různých chromatografických systémech, jimiž se provádí dělení na odlišném principu, a to při filtraci na gelu, při chromatografli na iontoměniči a při vysokotlaké chromatografli.

d) Řetězec A, produkovaný E. coli byl čištěn v malém měřítku vysokotlakou kapalinovou chromatografli a bylo prokázáno, že má správný sled aminokyselin.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní plasmid vhodný pro transformaci bakteriálního hostitele, obsahující homologní regulon a heterologní DNA, kde heterologní DNA kóduje požadovaný funkční savčí polypeptid, kterým je enzym, polypeptid krevního séra, polypeptid s analgetickým účinkem nebo hormon, nebo jeho meziprodukt, přičemž tento savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt je nedegradovatelný endogenními proteolytickými enzymy, které předchází start-kodon a po níž následuje jeden nebo více terminačních nebo stop-kodonů a nepředchází ji a/nebo ji nenásleduje další protein, kde uvedená DNA je umístěna ve správném čtecím rámci s uvedeným homologním regulonem mezi uvedeným regulonem a terminačním kodonem nebo kodony, a při translaci transkripčního produktu heterologní DNA ve vhodné bakterii je výsledným produktem exprese uvedený požadovaný funkční savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt v získatelné formě.
2. 2. Rekombinantní plasmid podle nároku 1, kde regulon je v podstatě identický s regulonem obvykle přítomným v chromosomální DNA bakteriálního hostitele.
3. 3. Rekombinantní plasmid podle nároků 1 nebo 2, kde uvedená heterologní DNA zahrnuje cDNA.
4. 4. Rekombinantní plasmid podle nároků 1 nebo 2, kde uvedená heterologní DNA zahrnuje DNA získanou organickou syntézou.
5. 5. Rekombinantní plasmid podle nároků 1 až 4, kterým je bakteriální plasmid.
6. 6. Rekombinantní plasmid podle nároků 1 až 5, kde regulon zahrnuje Escherichia coli lac nebo Escherichia coli tryptofan promotor-operátor systém.
7. 7. Rekombinantní plasmid podle nároků 1 až 6, kde heterologní DNA kóduje shora definovaný funkční savčí polypeptid jako takový a této heterologní DNA kódující uvedený savčí polypeptid bezprostředné přechází translační start-kodon.
8. 8. Rekombinantní plasmid podle nároků 1 až 6, kde savčím polypeptidem je savčí hormon nebo jeho meziprodukt.
9. 9. Způsob přípravy rekombinantního plasmidu podle nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že zahrnuje zpracování dvojřetězcové DNA, obsahující intaktní replikon a v sekvenci a) regulon pro řízení transkripce a translace v bakteriálním hostiteli a b) místo rozpoznávané restrikční endonukleázou, pomocí restrikční endonukleázy za vzniku DNA-fragmentu, který obsahuje replikon a regulon, a jeho ligaci ve správném čtecím rámci s uvedeným regulonem heterologní DNA, kódující shora definovaný funkční savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt, kde tento savčí polypeptid nebo jeho meziprodukt nejsou degradovatelné endogenními proteolytickými enzymy, přičemž je předřazen start-kodon a bezprostředně následuje jeden nebo více termi-27CZ 280822 B6 načních nebo stop-kodonů a nepředchází ji a/nebo bezprostředně nenásleduje další protein, kde heterologní DNA má terminální nukleotidové seskupení připojitelné k uvedenému DNA-fragmentu, za poskytnutí uvedeného rekombinantního plasmidů.
10. 10. Bakterie, transformovaná rekombinantním plasmidem podle nároků 1 až 8.
11. 11. Bakteriální kultura, vyznačující se tím, že obsahuje transformované bakterie podle nároku 10.
12. 12. Způsob bakteriální produkce shora definovaného funkčního savčího polypeptidu nebo jeho meziproduktu, vyznačuj í c í se tím, že se kultivuje bakteriální kultura podle nároku 11 k vyvolání exprese uvedeného polypeptidu nebo meziproduktu v získatelné formě a uvedený polypeptid nebo meziprodukt se izoluje.