SK278170B6 - Recombinant plasmid, method of its preparation and bacteria transformed by them - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka rekombinantného plazmidu vhodného na transformáciu bakteriálneho hostiteľa, spôsobu jeho prípravy a baktérií, ktoré sú ním transformované.

Doterajší stav techniky

Genetická informácia je uchovávaná ako kód v dezoxyribonukleovej kyseline (DNA) s dvojitým reťazcom, takže kódujúci reťazec DNA má charakteristickú opakujúcu sa sekvenciu nukleotidových zložiek. Prenesenie kódovanej informácie za vzniku polypeptidu je procesom, ktorý pozostáva z dvoch častí. Vzhľadom na to, že gén obsahuje určité riadiace oblasti (regulóny), je možné pôsobením RNA-polymerázy vytvárať ribonukíeovú kyselinu (RNA), ktorá obsahuje ten istý kód (messenger RNA, mRNA). Tento proces sa nazýva transkripcia. V ďalšej časti sa prevádza informácia, prenesená pomocou mRNA, na polypeptidy. Informácia prenesená pomocou mRNA z DNA obsahuje i signály pre začiatok a koniec translácie na ribozómoch, rovnako ako pre totožnosť a sekvenciu aminokyselín, ktoré vytvárajú polypeptid. Kódujúci reťazec DNA obsahuje dlhú sekvenciu nukleotidových tripletov, ktoré sa nazývajú kodónmi vzhľadom na charakteristickú sekvenciu nukleotidov v každom triplete, ktorý je kódom pre špecifickú časť informácie. Napríklad 3 nukleotidy ATG (adenín, týmto a guanín) sa prenášajú do mRNA ako signál, ktorý označuje začiatok translácie, zatiaľ čo kodóny TAG, TAA a TGA transláciu ukončujú. Medzi počiatočnými a koncovými kodónmi sa nachádzajú takzvané štrukturálne gény, v ktorých kodóny definujú sekvenciu aminokyselín uprostred reťazca. Táto definícia zodpovedá ustálenému pojmu genetického kódu, tak ako je to uvedené napríklad v publikácii J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W. A. Benhamin Inc., N. Y., 3 vydanie 1976; v tejto publikácii saopisujú kodóny pre rôzne aminokyseliny. Ten istý genetický kód je charakteristický pre jedinú aminokyselinu, pre tú istú aminokyselinu však môže existovať i viac kodónov. Napríklad všetky kodóny TTT, TTC. TTA a TTG sú kódom pre serín a pre žiadanú inú aminokyselinu. Pri transkripcii je potrebné zachovať správny spôsob čítania jednotlivých kodónov. Napríklad v prípade, že by sa pri RNA polymeráze čítali rôzne zásady na začiatku kodónu v sekvencii GCTGGTTGTAAG rôznym spôsobom, a to ...GCT GGT TGT AAG... Ala-Gly-Cys-Lys...

...G CTG GTT GTA AG... ->...Leu-Val-Leu... ...GC TGG TTG TAA G... -»...Trp-Leu-(TOP). dôjde ku vzniku rôznych reťazcov aminokyselín. Je zrejmé, že vzniknutý polypeptid závisí od vzťahu štrukturálneho génu v priestore vzhľadom na regulón.

Spôsob prenosu genetickej informácie sa dá lepšie pochopiť po definovaní niektorých zložiek génu:

Operón - ide o gén, ktorý obsahuje štrukturálny gén alebo gény pre polypeptid a riadiacu oblasť, ktorá riadi prenos.

Promótor - ide o gén, v oblasti regulónu, na ktorý sa musí viazať RNA polymeráza, aby sa mohla začať transkripcia.

Operátor - ide o gén na ktorý sa môže viazať bielkovina, ktorá týmto spôsobom bráni väzbe RNA polymerázy na susedný promótor.

Induktor - ide o látku, ktorá spôsobuje dezaktiváciu vyššie uvedenej bielkoviny, uvoľňuje operátor a umožňuje väzbu RNA polymerázy na promótor, takže môže dôjsť ku transkripcii.

Miestom väzby bielkoviny, ktorá je aktivátorom katabolitu, je gén viažuci bielkovinu, ktorá je aktivátorom katabolitu (CAP) a je viazaná na cyklický adenozínmonofosfát (cAMP), a ktorá je podmienkou pre začiatok transkripcie. Miesto tejto väzby niekedy nemusí byť prítomné. Napríklad mutácie operónu pre laktózu promótorom v prípade fágu plač UV5 nevyžaduje pre prenos CAP, cAMP ako je uvedené v publikácii

J. Beckwith a ďalší, J. Mol. Biol. 69, ISS-160 (1972). Systém promótor - operátor

Jde o riadiacu oblasť operónu, a to vo vzťahu k CAa alebo ku schopnosti génu prenášať štruktúru bielkoviny.

Ďalej je ešte potrebné definovať nasledujúce pojmy.

Prostriedok na klonovanie

Ide o DNA s dvojitým reťazcom nechromozomálneho typu, ktorá obsahuje neporušený replikón, takže nastáva replikácia tejto DNA, v prípade, že je uvedená do jednobunkového organizmu, napríklad mikróbu, čím dochádza k transformácii tohto jednobunkového organizmu. Názov pre takto transformovaný organizmus je transformant”.

Plazmid

Ide o určité klonujúce prostriedky, odvodené od vírusov alebo baktérií, ktoré sa tiež nazývajú bakteriálnymi plazmidmi.

Komplementarita

Ide o vlastnosť, týkajúcu sa sekvencie zásad v DNA s jedným reťazcom, pričom táto vlastnosť umožňuje tvorbu DNA s dvojitým reťazcom vodíkovými väzbami medzi komplementárnymi zásadami jednotlivých reťazcov. Adenín (A) je komplementárny pre tymin (T), guanín (G) je komplementárny pre cytozín (C).

V posledných rokoch bolo možné vytvárať klonujúce prostriedky pre rekombináciu, takže bolo možné vytvoriť plazmidy, ktoré obsahujú exogénnu DNA. V niektorých prípadoch môže rekombinant obsahovať heterogénnu DNA, to znamená, DNA, ktorá je kódom pre polypeptidy, ktoré sa bežne v organizme schopnom transformácie uvedeným prostriedkom neprodukujú. Plazmidy je možné škrtiť za vzniku lineárnych reťazcov DNA, ktorých zakončenia sa viažu na exogénny gén, ktorý má taktiež zakončenia schopné väzby, takže vzniká biologická funkčná skupina s neporušeným replikónom a s požadovanými fenotypickými vlastnosťami. Táto rekombinantná skupina sa včlení do mikroorganizmu transformáciou a vzniknuté transformanty sa izolujú a klonujú, takže sa dajú získať veľké populácie, schopné vytvárať a prenášať novú genetickú informáciu. Spôsoby a prostriedky na vytváranie rekombinantných klonujúcich prostriedkov a na transformáciu organizmov boli v literatúre podrobne opísané napríklad v publikáciách J. L. Reyneckera a kol., Náture 263, 748 - 752 (1976), Cohen a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972) a 70, 1293 (1973), 70, 3240 (1973), 71, 1030 (1974), Morrow a kol. Proc. Nat. Acad. Sci USA 71, 1743, (1974), Novick, Bacteriological Rev. 33, 210 (1969), Hershfield a kol., Proc. Soc. Nat. Acad. Sci USA 71, 3455, (1974) a lackon a kol., ibid 60, 2904 (1972). Súhrnným článkom, týkajúcim sa tejto oblasti je publikácia S. Cohen, Scientific Američan 233, 24 (1975). V tomto článku sú tiež citované všetky ďalšie publikácie, ktoré sa uvedeného odboru týkajú.

Pre rekombinovanie DNA je k dispozícii celý rad metód, v ktorých je možné upraviť zakončenie jednot livých fragmentov DNA tak, aby sa uľahčila ich väzba. Ide predovšetkým o tvorbu fosfodiesterových väzieb medzi nukleotidmi, veľmi často pôsobením enzýmu T4 DNA ligáza. Týmto spôsobom sa môžu priamo viazať zakončenia, ktoré by inak neboli schopné väzby. Je tiež možné postupovať tak, že fragmenty obsahujúce komplementárne jednotlivé reťazce sa vybavia vodíkovým mostíkom, takže sa príslušné zakončenia dostanú do vzájomnej blízkosti pre budúcu väzbu. Tieto reťazce, ktoré majú takzvané kohézne zakončenie, sa môžu vytvárať tak, že sa pridajú nuklcotidy k reťazcu, ktorého zakončenie nie je schopné väzby použitím terminálnej transferázy a niekedy jednoducho tak, že sa z uvedeného zakončenia odštiepi reťazec enzýmom, napríklad - exonukleázou. Najčastejšie je týmto enzýmom reštrikčná endonukleáza, ktorá štiepi fosfodiesterové väzby tak, že je možné odštiepiť určité sekvencie nukleotidov s dĺžkou napríklad 4 až 6 párov týchto zásad. Je známy rad reštrikčných endonukleáz i miesta, v ktorých môžu pôsobiť. Veľmi používaná je napríklad Eco RI endonukleáza. Reštrikčná endonukleáza, ktorá štiepi DNA s dvojitým reťazcom na symetrické palindrómy zanecháva zakončenia, ktoré sú schopné väzby. To znamená, že plazmid alebo iný prostriedok na klonovanie sa dá rozštiepiť tak, že vzniká zakončenie, ktoré obsahuje polovicu miesta vhodného na pôsobenie reštrikčnej endonukleázy. Štiepny produkt exotermnej DNA, získaný pôsobením tej istej reštrikčnej endonukleázy bude mať zakončenia, ktoré budú komplementárne k zakončeniu vyššie uvedeného plazmidu. Je teda možné získať syntetickú DNA, ktorá obsahuje zakončenia, ktorými je možné túto DNA včleniť do opätovnej väzby medzi obidvoma časťami rozštiepeného klonujúceho prostriedku, je možné zakončenie podrobiť pôsobeniu alkalickej fosfatázy, čím sa dá uskutočniť molekulárna selekcia častí, ktoré obsahujú exogénny fragment. Včlenenie fragmentu, ktorý má správnu orientáciu vzhľadom na ostatné vlastnosti klonujúceho prostriedku, sa dá uľahčiť v prípade, že fragment a prostriedok sa štiepia dvoma rôznymi reštrikčnými endonukleázami, pričom jedno zo zakončení predstavuje súčasne i polovicu miesta, vhodného pre pôsobenie druhej endonukleázy.

Napriek veľkému pracovnému úsiliu pri rekonštrukcii DNA bolo možné v posledných rokoch dosiahnuť len niekoľko málo výsledkov, ktoré by sa dali okamžite využiť na praktické účely. Ide napríklad o prípad pokusov o vyjadrenie polypeptidov, ktoré by boli kódované syntetickou DNA, pretože bolo potrebné viazať na seba nukleotid za nukleotidom, alebo reťazec získať reverznou transkripciou z izolovanej in RNA (komplementárnej alebo cDNA). V prihláške bude opísaný prvý produkt týchto snáh, funkčný polypeptid zo syntetického génu, ktorý sľubuje široké použitie. Tento produkt bol pomenovaný somatostatín (US patentový spis č. 3 904 594) a je inhibítorom sekrécie rastového hormónu, inzulínu a glukagónu a je možné ho použiť na liečbu akromegálie, akútneho zápalu podžalúdkovej žľazy a cukrovky závislej od inzulínu. [R. Guillemin a kol., Annual Rev. Med. 27, 379 (1976)]. Na príklade somatostatínu sa dá dokázať použiteľnosť nových výsledkov v rôznych odboroch, ako bude zrejmé tiež z priložených výkresov a z podrobnejšieho opisu vynálezu.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je rekombinantný plazmid vhodný na transformáciu bakteriálneho hostiteľa, obsahujúci homológny regulón a heterológnu DNA, ktorá kóduje požadovaný funkčný cicavčí polypeptid, ako je enzým, polypeptid krvného séra, polypeptid s analgetickým účinkom alebo hormón, alebo jeho medziprodukt, pričom tento cicavčí polypeptid alebo jeho medziprodukt je nedegradovateľný endogénnymi proteolytickými enzýmami, ktoré predchádzajú štart-kodón, a po ktorej nasleduje jeden alebo viac terminačných alebo stop-kodónov a nepredchádzajú a/alebo nenasleduje ju ďalší proteín, kde uvedená DNA je umiestnená v správnom čítacom rámci s uvedeným homológnym regulónom medzi uvedeným regulónom a terminačným kodónom alebo kodónmi, a pri translácii transkripčného produktu heterológnej DNA vo vhodnej baktérii je výsledným produktom expresie uvedený požadovaný cicavčí polypeptid alebo jeho medziprodukt v získateľnej forme.

Ďalej je predmetom vynálezu spôsob prípravy rekombinantného plazmidu, ktorý zahrňuje spracovanie dvojreťazcovej DNA, obsahujúcej intaktný replikón a v sekvencii a) regulón pre riadenie transkripcie a translácie v bakteriálnom hostiteľovi a b) miesto rozpoznávané reštrikčnou endonukleázou pomocou vhodnej reštrikčnej endonukleázy za vzniku DNA-fragmentu, ktorý obsahuje replikón a regulón, a jeho ligáciu v správnom čítacom rámci s uvedeným regulónom heterológnej DNA, kódujúcej vyššie definovaný funkčný cicavčí polypeptid alebo jeho medziprodukt, kde tento cicavčí polypeptid alebo jeho medziprodukt nie sú degradovateľné endogénnymi proteolytickými enzýmami, pričom je predradený štart-kodón a bezprostredne nasleduje jeden alebo viac terminačných alebo stop-kodónov a nepredchádza ju a/alebo bezprostredne nenasleduje ďalší proteín, pričom heterológna DNA má terminálne nukleotidové zoskupenie pripoj iteľné k uvedenému DNAfragmentu, pri poskytnutí uvedeného rekombinantného plazmidu.

Vynález bude podrobnejšie opísaný v súvislosti s priloženými vyobrazeniami, ktoré sa týkajú produkcie hormónu somatostatínu bakteriálnymi transformantmi, ktoré obsahujú rekombinantné plazmidy.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1

Na obr. 1 je schematicky znázornený priebeh celého postupu. Gén pre somatostatín, vyrobený chemickou syntézou DNA je včlenený do génu pre β-galaktozidázu v E. coli pomocou plazmidu pBR322. Po transformácii do E. coli rekombinantný plazmid riadi syntézu bielkovinového prekurzora, ktorý sa môže štiepiť špecificky in vitro brómkyánom na zvyškoch metionínu, čím sa získa účinný polypeptidový hormón cicavcov. Na výkrese znamenajú A, T, C a G zásady, a to adenín, tymín, cytozín a guanín, tak ako ich obsahujú dezoxyribonukleotidy v kódujúcom reťazci génu pre somatostatín.

Obr. 2

Na obr. 2 je schematicky znázornená štruktúra syntetického génu, ktorého kódujúci reťazec, t. j. horný reťazec obsahuje kodóny na sekvenciu aminokyselín v somatostatíne.

SK 278170 Β6

Obr. 3

Na obr. 3 je schematicky znázornená metóda pre konštrukciu nukleotidových trimérov pri výrobe syntetických génov. Pri bežnom spôsobe znázornenia nukleotidov na obr. 3 sa nachádza skupina OH v polohe 5' na ľavej strane a skupina OH v polohe 3' na pravej strane, napríklad

B

5- 3·

OH

Obr. 4

Na obr. 4 je schematicky znázornená konštrukcia rekombinačného plazmidu, napríklad pSOMll-3, ktorý je schopný produkovať somatostatín SOM, a to tak, že sa začína od pôvodného plazmidu pBR322. Na obr. 4 je približná molekulárna hmotnosť každého plazmidu uvedená v daltonoch d. Ap^ľ a Tc' sú gény pre rezistenciu proti ampicilínu a tetracyklínu, zatiaľ čo Tc⁵ znamená nedostatok odolnosti proti tetracyklínu, ktorý vzniká v prípade, že sa z génu Tc^r vyberie určitá časť. Relatívne polohy rôznych miest, vhodné na štiepenie reštrikčnej endonukleázy, sú v plazmide taktiež znázornené. Ide napríklad o enzým Eco RI, Bam I a podobne.

Obr. 5Aa5B

Na obr. 5A a 5B sú znázornené sekvencie nukleotidov v kľúčových častiach dvoch plazmidov, tak ako sú potrebné na transkripciu mRNA, ktorá začína v polohe 5' kódujúcimi reťazcami. Znázornené sú i miesta pre pôsobenie reštričnej endonukleázy. Každá znázornená sekvencia obsahuje riadiace elementy pre lac-operón (operón pre laktózu) a kodóny na vyjadrenie sekvencie aminokyselín v somatostatíne. Čísla pre sekvenciu aminokyselín, zodpovedajúce β-galaktozidáze (β-gal) sú uvedené v zátvorkách.

Obr. 6 až 8

Na obr. 6 až 8 sú znázornené výsledky porovnania rádioimunologických analýz, v ktorých bolo možné dokázať somatostatínovú účinnosť produktu, vyjadreného rekombinantným plazmidom.

Na obr. 6 je na osi úsečiek uvedený objem v mikrolitroch, na osi poradníc pomer ^l25I-somatostatínu, viazaného v prítomnosti vzorky k somatostatínu, ktorý sa viaže v neprítomnosti somatostatínu, ktorý je príčinou kompetície.

Na obr. 7 je na osi úsečiek uvedené číslo klonu (pSOMll-), na osi poradníc vľavo % kompetície pri rádioimunologickej analýze, vpravo zodpovedajúce množstvo somatostatínu v pg.

Na obr. 8 sú na osi úsečiek nanesené čísla frakcií, na osi poradníc vpravo množstvo somatostatínu v pg, vľavo zodpovedajúci počet impulzov za minútu x 10’². Prvý vrchol krivky zodpovedá materiálu zo zmesi klonov vo frakcii 25, druhý leucínu, značenému tríciom.

Na obr. 9 je znázornená štruktúra syntetických génov, ktorých reťazce obsahujú kodóny pre sekvenciu aminokyselín v reťazcoch A a B ľudského inzulínu.

Na obr. 10 je znázornená výroba rekombinantého plazmidu, schopného zabezpečiť expresiu reťazca B ľudského inzulínu.

1. Spôsob výroby genetických kódov pre heterológny polypeptid.

DNA kódy pre akýkoľvek polypeptid so známou sekvenciou aminokyselín sa dá získať tak, že sa jednotlivé kodóny volia podľa genetického kódu. Aby sa mohlo vykonávať čistenie, pripravujú sa oddelene oligodezoxyribonukleotidové fragmenty napríklad s 11 až 16 nukleotidmi, a tieto fragmenty sa potom spoja na požadovanú sekvenciu. Znamená to, že sa najskôr pripraví prvý a druhý rad oligodezoxyribonukleotidových fragmentov vhodnej veľkosti. Prvý rad, v prípade, že sa viaže v príslušnej sekvencii, je DNA kódujúcim reťazcom pre polypeptid, ako je znázornené napríklad na obr. 2, fragmenty A, B, C a D. Druhý rad, v prípade, že sa rovnako viaže v správnej sekvencii, poskytuje reťazec, ktorý je komplementárny vzhľadom na kódujúci reťazec, na obr. 2 ide napríklad o fragmenty E, F, G a H. Fragmenty týchto reťazcov sa výhodne prekrývajú, takže v dôsledku ich komplementarity dochádza ku vzniku vodíkových väzieb na kohezívnych zakončeniach fragmentových blokov. Štrukturálny gén sa doplní bežným spôsobom.

Pretože tá istá aminokyselina sa dá vyjadriť niekoľkými spôsobmi, je možné pomerne voľne voliť v genetickom kóde kodóny pre danú sekvenciu aminokyselín. Voľba týchto kodónov pre danú sekvenciu aminokyselín sa posudzuje tromi hľadiskami. Podľa prvého z týchto hľadísk sa kodóny a fragmenty volia tak, aby došlo k ich nežiaducej komplementarite v prípade prítomnosti iného reťazca. Po druhé, je nutné sa vystríhať sekvencii bohatých na páry AT, predovšetkým v prípade, že by týchto párov malo byť päť a viac, predovšetkým vtedy, keď predchádza sekvenciu, bohatú na páry GC, pretože v tomto prípade by mohlo dôjsť k predčasnému ukončeniu transkripcie. Po tretie by väčšina zvolených kodónov mali byť tie kodóny, ktoré sú pre vyjadrenie mikrobiálnych genómov výhodné, ako je opísané v publikácii W. Fiers a kol., Náture 260, 500 (1976). Kodóny, výhodné pre vyjadrenie mikrobiálnych genómov, sú vyjadrené v nasledujúcej tabuľke.

Tabuľka I

Výhodné kodóny

Prvi poloha Druhá poloha Tretie poloha zakončenia zakončenia

5·	T	c	λ	G	3'
T	phe			cys	T
	phs	ser	tyr	—	C
	leu	—	Stop	Stop	A
	—	ser	Stop	trp	G

	leu leu	pro pro	híe hie	arg arg	T c
C	leu	pro	gin		A
		pro	gin	—	G

	Íle	thr	asn	—	T
	íle	thr	asn	ser	C
A	—	—	—	—	A
	set	thr	iy«	—	G

(štart)

val	ala	asp	gly	T
	val	—	acp	—	c
	val	—	glu	—	λ
G	val	ala	glu		G

V prípade somatostatínu sú vzťahy medzi kodónmi pre aminokyseliny v štrukturálnom vplyve nasledujúce: gly (GGT), cys (TGT), lyz (AAG), trp (TGG), ala (GCT, GCG), asn (AAT, AAC), phe (TTC, TTT), thr (ACT, ACG) a ser (TCC, TCG).

V prípade, že štrukturálny gén požadovaného polypeptidu má byť včlenený do klonujúceho prostriedku samotný, musí génu predchádzať kodón, ktorý začína transkripciu, napríklad ATG, a okrem toho musí byť gén nasledovaný jedným alebo viacerými kodónmi, ktoré transkripciu ukončujú, ako je znázornené napríklad na obr. 2. Ako už bolo uvedené, sekvencia aminokyselín určitého polypeptidu môže byť vyjadrená tak, že ju predchádza a/alebo ju nasleduje ďalšia bielkovina. V prípade, že použitie polypeptidu vyžaduje odštiepenie tejto bielkoviny, je potrebné včleniť príslušné miesta štiepením tesne za polypeptidom, Čo znamená prídavné spojenie kodónu k bielkovine. Na obr. 1 je znázornený príklad, v ktorom bielkovina obsahuje ako prekurzor somatostatín, a okrem toho prevažnú časť β-galak-tozidázového polypeptidu. V tomto prípade nie je nutné včleniť ATG pre začiatok translácie, pretože ribozomálna konštrukcia prídavnej β-gal bielkoviny sa nachádza v tesnej blízkosti somatostatínového štrukturálneho génu. Včlenenie signálu ATG je však kódom pre produkciu metionínu, aminokyseliny, špecificky štiepenej brómkyánom, čím sa uľahčí prevod prekurzovej bielkoviny na požadovaný polypeptid.

Na obr. 2 je znázornená i ďalšia výhodná vlastnosť heterológnej DNA pre použitie pri rekombinácii, t. j. vznik kohezívnych zakončení, výhodne obsahujúcich jeden z dvoch reťazcov s miestom, vhodným pre pôsobenie reštrikčnej endonukleázy. Z vyššie uvedených dôvodov sú zakončenia uspôsobené tak, aby po rekombinácii vznikli rôzne miesta na pôsobenie enzýmu.

Vyššie uvedený postup bol úspešný v prípade somatostatínu, takže je zrejmé, že pri použití príslušných vý chodiskových látok je možné získať kód pre heterológnu DNA pre ľubovoľnú sekvenciu aminokyselín. Uvedeným spôsobom je teda možné získať polyaminokyseliny, napríklad polyleucín a polyalanín, enzýmy, bielkoviny, séra, polypeptidy s analgetickým účinkom, napríklad β-endorfíny, ktoré menia prah bolestivosti a podobne. Výhodne sa získajú polypeptidy hormónov cicavcov alebo medziprodukt)' na ich výrobu. Z týchto hormónov je možné uviesť napríklad somatostatín, ľudský inzulín, ľudský a hovädzí rastový hormón, luteinizačný hormón, ACTH, pankreatický polypeptid a podobne. Ako medziprodukty je možné uviesť napríklad ľudský preproinzulín, ľudský proinzulín, reťazce A a B ľudského inzulínu a podobne. Okrem DNA, vyrobenej in vitro môže heterológna DNA obsahovať cDNA, ktorá vznikla reverznou transkripciou mRNA, ako bolo opísané v publikácii Ulrich a kol., Science 196, 1313 (1977).

2. Rekombinantné kódovanie pre vyjadrenie bielkovinového prekurzora.

Pri uskutočňovaní spôsobu, ktorý je schematicky znázornený na obr. 1, sa získa bielkovinný prekurzor, ktorý obsahuje polypeptid, určovaný špecifickým heterológnym štrukturálnym génom, a okrem toho bielkovinu, ktorá obsahuje časť enzýmu β-galaktozidázy. Selektívne miesto štiepenia v bezprostrednej blízkosti sekvencie aminokyselín v somatostatíne umožňuje oddelenie požadovaného polypeptidu od zostatkovej bielkoviny. Tento príklad je charakteristický pre celý rad postupov, ktoré vynález umožňuje.

Štiepenie sa zvyčajne uskutočňuje vo vnútri replikatívnej časti plazmidu alebo iného prostriedku na prenos, napríklad po izolácii kultúry mikroorganizmu. Týmto spôsobom je možné chrániť dočasným spojením malých polypeptidov s prebytkom bielkoviny polypeptid in vivo proti degradácii endogénnymi enzýmami. Súčasne táto bielkovina zvyčajne zbavuje účinku výsledný polypeptid, čím sa zvyšuje bezpečnosť postupu.

V niektorých prípadoch je však žiaduce uskutočniť štiepenie v bunke. Je napríklad možné vyrobiť klonujúce prostriedky s DNA kódom pre enzýmy, ktoré transformujú prekurzory inzulínu na účinnú formu, a to v spojení s kódom, ktorý zabezpečuje produkciu prekurzora.

Pri výhodnom uskutočnení požadovaný polypeptid neobsahuje vnútorné miesta štiepenia, ktoré by zodpovedali miestam v bielkovine, ktorá polypeptid sprevádza, avšak i keď sa táto podmienka nedodrží, príde ku kompetičným reakciám, pri ktorých napriek tomu vzniká požadovaný produkt, i keď v nižšom výťažku. V prípade, že požadovaný produkt neobsahuje metionín, dá sa ľahko uskutočniť štiepenie na metioníne, ktorý sa nachádza v tesnej blízkosti požadovanej sekvencie. Rovnakým spôsobom je možné odštiepiť enzymatické produkty bez obsahu argininu a lyzínu napríklad trypsínom alebo chymotrypsínom arg-arg, lyz-lyz a podobne, v bezprostrednej blízkosti požadovanej sekvencie.

V prípade, že Štiepenie zanecháva nežiaduci arginín viazaný na výsledný produkt, je možné ho odstrániť karboxypeptidázou. V prípade, že sa na rozštiepenie väzby arg-arg použije trypsín, je možné najskôr chrániť lyzín polypeptidmi, napríklad anhydridom kyseliny maleinovej alebo citrakónovej.

Odštiepiteľná bielkovina môže byť viazaná buď na C-zakončenia alebo na N-zakončenia špecifického polypeptidu alebo priamo na polypeptid, ako je to v prí

SK 278170 Β6 páde sekvencie, ktorou sa odlišuje proinzulín a inzulín. Použitý prostriedok môže byť kódom pre bielkovinu, ktorá obsahuje opakovanú sekvenciu požadovaného polypeptidu, pričom jednotlivé sekvencie sú od seba oddelené selektívnymi miestami štiepenia. Vo výhodnom príklade sa však kodóny pre balastnú bielkovinu prenášajú pred štrukturálnym génom výsledného produktu, ako je znázornené na vyobrazeniach, vždy je potrebné udržať správnu sekvenciu vzhľadom na regulón.

3. Vyjadrenie imunogénu.

Možnosť vyjadriť špecifický polypeptid i balastnú bielkovinu je cenným nástrojom pre výrobu imunogénnych látok. Polypeptidové haptény, t. j. látky, ktoré obsahujú miesta, špecificky viazané protilátkami, avšak zvyčajne s príliš malou molekulou na vyvolanie imunologickej odozvy, sa dajú vyjadriť ako konjugáty s prídavnou bielkovinou, ktorej molekula je dostatočne veľká na vyvolanie imunogenity. Konjugát β-gal-somatostatín, ktorý sa dá uvedeným spôsobom získať, má dostatočne veľkú molekulu a dá sa očakávať, že vyvolá tvorbu protilátky, ktorá sa bude na haptén viazať. Všetky bielkoviny, ktoré obsahujú viac ako 100 aminokyselín, zvyčajne viac ako 200 aminokyselín, majú imunogénny charakter.

Konjugáty, pripravené vyššie uvedeným spôsobom, sa dajú použiť na vyvolanie tvorby protilátok, využiteľných pri rádioimunologických alebo iných skúškach na haptény a tiež pri výrobe vakcín. Ďalej bude opísaný príklad použitia pri produkcii vakcíny. Pri štiepení brómkyánom alebo iným štiepnym produktom vzniknú z obalu vírusu oligopeptidy, ktoré sa viažu na protilátky, vyvolané pôsobením bielkoviny. Heterológna DNA viazaná na haptén sa dá vyjadriť ako konjugát, ktorý prenáša schopnosť vyvolať imunitu. Použitie takýchto konjugátov ako vakcín by mohlo odstrániť vedľajšie reakcie, vyvolané použitím vlastnej bielkoviny obalu.

4. Riadiace elementy.

Na obr. 1 je znázornený spôsob, pri ktorom transformant produkuje polypeptid z heterológnej DNA v dôsledku prítomnosti regulónu, ktorý je homológny pre organizmus v netransformovanom stave. To znamená, že chromozomálna DNA, závislá od laktózy a obsiahnutá v E. coli obsahuje lac-operón, ktorý sprostredkuje napríklad vznik enzýmu β-galaktozidázy. V znázornenom prípade je možné získať riadiace elementy z bakteriofágu λ-plac 5, ktorý je efektívny pre E. coli. Lacoperón bol však naopak odvodený z toho istého bakteriálneho vplyvu a je preto homológny. Homológne regulóny vhodné na použitie v uvedenom spôsobe sa dajú odvodiť i od DNA plazmidu, ktorý pochádza z organizmu.

Jednoduchosť a účinnosť systému lac-promótoroperátor umožňuje použitie tohto systému a je príčinou jeho schopnosti byť indukovaný IPTG (izopropyltio-βD-galaktozid). Je však možné použiť aj iné operóny alebo ich časti, napríklad λ-promótor-operátor, operón pre arabinózu (phi BC dara) alebo kolicín El, galaktózový operón, operóny pre alkalickú fosfatázu alebo pre tryptofán. Tento tryp-operón spôsobuje zrejme 100 % represiu pri použití kyseliny indolakrylovej.

5. Všeobecná konštrukcia plazmidu.

Detaily spôsobu sú schematicky znázornené na obr. 4 a vyplývajú z experimentálnej časti. Je možné však podrobnejšie uviesť spôsoby, používané pre konštrukciu rekombinatného plazmidu.

Pri klonovaní syntetického somatostatínu a génu pre tento hormón sa použili i dva plazmidy. Každý z týchto plazmidov mal miesto pre pôsobenie Eco RI v odlišnej časti štrukturálneho génu pre β-galaktozidázu, ako je znázornené na obr. 4 a 5. Včlenenie syntetického somatostatínového DNA fragmentu do miest pre pôsobenie Eco RI tohto plazmidu má za následok vyjadrenie genetickej informácie tohto fragmentu podriadením lac-operónu. Po včlenení somatostatínového fragmentu do týchto plazmidov je výsledkom translácia polypeptidosomatostatínu, pred ktorým je zaradených 10 aminokyselín (pSOMl) alebo prakticky celá β-galaktozidázová štruktúrna podjednotka (pSOMl 1-3).

Konštrukcia plazmidu začína plazmidom pBR322, čo je dobre charakterizovaný klonujúci prostriedok. Včlenenie lac elementov do tohto plazmidu sa uskutočnilo tak, že bol včlenený fragment reštrikčnej endonukleázy Hae III (203 nukleotidov) s obsahom lac promótora, CAP väzbového miesta, operátor, väzbového miesta pre ribozóm a prvých 7 klonov pre aminokyseliny z β-galaktozidázového štrukturálneho génu. Fragment Hae III bol odvodený od λ plač 5 DNA. Plazmid pBR322, rozštiepený enzýmom Eco RI so zakončeniami, na ktoré sa pôsobilo B4 DNA polymerázou a dezoxyribonukleotidtrifosfátom bol naviazaný na fragment Hae III, čím vznikli v miestach spojenia miesta vhodné pre pôsobenie Eco RI. Naviazanie zakončenia, vznikajúceho z Hae 111 a Eco RI po vyššie uvedenej úprave majú za následok vznik miest pre pôsobenie Eco RI na každom zakončení, ako je zrejmé z obr. 4 a 5. Transformanty E. coli RI po pôsobení tejto DNA boli spracované tak, že sa uskutočnila selekcia na odolnosť proti tetracyklínu (Tc) a ampicilínu (Ap) na prostredí s 5-bróm-4-chlórinkolylgalaktozid (prostredia K-gal). Na tomto indikátorovom prostredí sa dajú identifikovať kódy, ktoré môžu syntetizovať βgalaktozidázu vzhľadom na zvýšené množstvo represora pre lac operátor, a to vzhľadom na to, že tieto kolónie majú modrú farbu. Zásadne sú potrebné dve orientácie fragmentu Hae III, tieto orientácie sa však dajú od seba odlíšiť asymterickým umiestnením miesta pre pôsobenie Hha v tomto fragmente. Plazmid pBHlO sa ďalej modifikoval tak, že sa odstránilo miesto pre pôsobenie Eco RI distálne od lac operónu (pBH20).

Ako je znázornené na obr. 2, bolo 8 chemicky syntetizovaných oligodezoxyribonukleotidov označených na zakončení 5' pomocou [³²P]-t-ATP pôsobením polynukleotidázy, potom sa uskutočnilo spojenie pomocou T4 DNA ligázy. V dôsledku tvorby vodíkových mostíkov na jednotlivých fragmentoch sa vytvára gén pre somatostatin, prípadne dochádza k jeho polymerizácii na väčšie molekuly, spôsobenej prítomnosťou kohezívnych zakončení. Takto vzniknuté produkty sa podrobili pôsobeniu reštrikčných endonukleáz Eco RI a Bam Hl za vzniku génu somatostatínu, tak ako je znázornené na obr. 2.

Syntetický fragment somatostatínového génu so zakončeniami po pôsobení Eco RI a Bam Hl bol naviazaný na plazmid pBH20 po predchádzajúcom pôsobení reštrikčných endonukleáz Eco RI a Bam Hl a alkalickej fosfatázy. Pôsobením alkalickej fosfatázy nastáva molekulárna selekcia plazmidov, ktoré nesú včlenený fragment. Transformanty, odolné proti ampicilínu a získané pôsobením tejto DNA sa sledovali na citlivosť na tetracyklín a niektoré z nich sa skúmali na včlenenie Eco RI - Bam Hl fragmentu príslušnej veľkosti.

Obidva reťazce Eco RI - Bam Hl fragmentov plaz midov z dvoch klonov sa analyzovali na sekvenciu nukleotidov, počínajúc od miest pôsobenia Bam Hl a Eco RI. Táto analýza zasahovala až do lac-kontrolných elementov. Sled lac framentu bol neporušený a v jednom prípade pSOMl sa nezávisle v oboch reťazcoch skúmala sekvencia nukleotidov, výsledky tohto porovnania sú uvedené na obr. 5A.

Eco RI - Pat fragment plazmidu pSOMl s riadiacim lac-elementom sa odstránil a nahradil Eco RI Pst fragmentom pBR322, čím vznikol plazmid pSOMl 1. Eco RI fragment plač 5, nesúci riadiacu oblasť lac opcrónu a väčšina β-galaktozidázového štrukturálneho génu sa včlenil na miesto pôsobenia Eco RI v plazmide pSOMl 1. Očakávalo sa, že nastane dvojitá orientácia Eco RI lac fragmentu λ plač 5. Jedna z týchto orientácií zodpovedá štruktúre somatostatínového génu a druhá nie. Sledovanie nezávisle izolovaných klonov na somatostatínovú účinnosť umožnilo identifikovať klony so správnou orientáciou génu, bol izolovaný kloň označený pSOMl 1-3.

6. Mikroorganizmus.

Pre transformáciu boli navrhované rôzne jednobunkové mikroorganizmy, napríklad baktérie, huby a riasy. Ide o to, nájsť jednobunkové organizmy, schopné pestovania v kultúre. Z tohto dôvodu je použitie baktérií najvýhodnejšie. Z baktérií, na ktorých je možné uskutočniť transformáciu, je možné uviesť napríklad kmene Escherichia coli a Salmonella, ďalej Bacillaceae, napríklad Bacillus subtilis, Pneumococcus, Streptococcus a Haemophilus influenzae.

Pre experimentálnu prácu sa zvolil mikroorganizmus

E. coli, kmeň RR1 genotyp: Pro‘Leu'Thi‘R_B'M_B‘rec A⁺ Str^r Lac y’. E. coli kmeň RR1 je odvodený od E. coli HB1O1 (H. W. Boyer a kol., I. Mol. Biol. (1989) 41, 459 až 472) tak, že tento kmeň bol uvedený do styku s E. coli K.12 kmeňa KL16 ako donorom Hfr, ako je uvedené v J. H. Miller Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Kmene E. coli KR1 a E. coli RR1 (pBR322) boli uložené v Američan Type Culture Collection a kmene sú voľne prístupné pod číslami ATCC 31 343 a 31 344.

Vo verejnej zbierke boli uložené tiež kmene schopné produkovať somatostatín pod číslom ATCC 31 447.

V prípade ľudského inzulínu boli gény pre reťazce A a B klonovanč v E. coli K-12 kmeň 294 (end A, thi’, hať, hsm/) pod číslom ATCC 31 446 a organizmus, ktorý sa použil pri expresii reťazca A, t. j. E. coli K-12 kmeň 294 vo forme plazmidu pIAl pod číslom ATCC 31 448. Reťazec B ľudského inzulínu bol po prvý raz podrobený expresii v deriváte HB101, t. j. E. coli K-12 kmeň D1210 lac (i^Qo*zy⁺) a kmeň, obsahujúci gén pre reťazec B bol taktiež uložený pod číslom ATCC 31 449. Gén pre reťazec B môže byť taktiež včlenený a podrobený expresii pri použití vyššie uvedeného mikroorganizmu, t. j. kmeňa 294.

Príklady uskutočnenia vynálezu

I Somatostatín.

1. Konštrukcia fragmentov somatostatínového génu.

Na obr. 2 sú pod písmenami A až H znázornené oligodezoxyribonukleotidy, ktoré boli konštruované zásadne modifikovanou triesterovou metódou opísanou v publikácii K. Itakura a kol., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975). Avšak v prípade fragmentov C, E a H sa postup vykonával zdokonalenou metódou, pri ktorej sa postupuje tak, že sa najskôr pripravia plne chránené triméry ako základné jednotky pre vybudovanie ďalších oligodezoxyribonukleotidov s dlhším reťazcom. Tento zlepšený spôsob je schematicky znázornený na obr. 3, kde B znamená tymín, N-benzoylovaný adenín, N-benzoylovaný cytozín alebo N-izobutyrylguanín. Ako je znázornené na obr. 3, pri použití dvoch mmólov zlúčeniny I a 1 mmol zlúčeniny II sa kompletne dala ukončiť reakcia v priebehu 60 minút pri použití výhodného činidla, ktorým boli 4 mmol 2,4,6-triizopropylbenzénsulfonyltetrazolidu (TPSTe). Po odstránení ochrannej skupiny v polohe 5’ pôsobením 2 % roztoku kyseliny benzénsulfónovej bolo možné oddeliť 5'-hydroxylovaný dimér vzorca V z prebytku 3'-fosfodiesterového monoméru vzorca IV jednoduchou extrakciou rozpúšťadlom, a to zmesou vodného roztoku hydrogénuhličitanu sodného a chloroformu. Plne chránený lac-trimér sa pripravil postupne z 5'-hydroxylovaného diméru vzorca V, 2 mmol zlúčeniny vzorca I a zo 4 mmol TPSTe s následnou izoláciou chromatografiou na silikagéli spôsobom podľa publikácie B. T. Hunta a kol., Chem. Ind. 1967, 1868 (1967). Výťažky trimérov, získané vyššie uvedeným a zlepšeným spôsobom sú uvedené v tabuľke II, pričom a a b zodpovedajú použitým blokujúcim reakčným činidlám, tak ako sú uvedené na obr. 3.

Tabuľka II

Výťažok plne chránených trimérov.

sekvencia	Výťažok 1	Sekvencia	Výťažok
TTT (b)	ai	ATG (b)	69
TTT (a)	75	GCC (a)	61
GGA (a)	41	CCA (a)	72
AGA (a)	49	CAA (a)	72
ATC ( )	71	TTA (a)	71
CCT < )	61	CAT (a)	52
ACA ( )	63	CCC (a)	73
ACC ( )	65	AAC (a)	59
CGT ( )	51	GAT (a)	60

Všetkých 8 oligodezoxyribonukleotidov sa po odstránení všetkých ochranných skupín prečistilo vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou (flash) na prípravku Permaphase AAX spôsobom podľa publikácie R. A. Henry a kol., J. Chróm. Sci. JJ, 358 (1973). Čistota každého oligoméru sa kontrolovala homochromatografiou na tenkej vrstve DEAE-celulózy a tiež elektroforézou na 20 % akrylamidovom géli po značení oligoméru [³²P]-t-ATP v prítomnosti polynukleotidázy. Z každého fragmentu DNA sa získal jeden hlavný značený produkt.

2. Väzba somatostatínovej DNA a jej analýzy na akrylamidovom géli.

Skupiny OH v polohe 5' chemicky syntetizovaných fragmentov A a H sa oddelene fosforylovali pomocou T4 polynukleotidkinázy. Pri fosforylácii sa použil [³²P]-t-ATP, takže reakčné produkty sa mohli sledovať autorádiograficky, napriek tomu, že sa rovnako dobre dal použiť neznačený ATP. Bezprostredne pred reakciou s kinázou sa odparilo 25 pCl [³²PJ- τ-ΑΤΡ, čo predstavuje približne 5,55 . 10” s'¹ /mmol spôsobom podľa publikácie Makam a Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 1507 (1977) do sucha v Eppendorfových skúmavkách s objemom 0,5 ml. 5 mikrogramov frag mentov sa inkubovalo s 2 jednotkami T4 DNA kinázy (hydroxylapatínová frakcia, 2500 jednotiek/ml, 27) v 70 mmol trispufru s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6 a 10 mmol MgCl₂, 5 mmol ditiotreitolu pri celkovom objeme 150 μΐ počas 20 minút pri teplote 37°C. Pre zabezpečenie maximálnej fosforylácie fragmentov na väzbové účely sa pridalo 10 μΐ zmesi pozostávajúcej zo 70 mol trispufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6, 10 mmol MgCl₂, 5 mmol ditiotreitolu. 0,5 mmol ATP a 2 jednotiek DNA kinázy, zmes sa potom inkubovala ďalších 20 minút pri teplote 37°C. Fragmenty (250 ng/μΐ) sa skladovali pri teplote -20°C bez ďalšieho predchádzajúceho spracovania. Takto spracované fragmenty A, B, E a F, každý v množstve 1,25 pg sa podrobili väzbe na celkovom množstve 50 μΙ v 20 mmol trispufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6 a 10 mmol MgCl₂, 10 mmol ditiotreitolu, 0,5 mmol ATP a 2 jednotkami T4 DNA ligázy (hydroxylapatitová frakcia, 400 jednotiek/ml, 27) počas 16 hodín pri teplote 4°C. Fragmenty C, D, G a H boli viazané pri podobných podmienkach. Odobrali sa vzorky s objemom 2 mikrolitrov pre analýzu elektroforézou na 10 % polyakrylamidovom géli s následnou autorádiografíou spôsobom podľa publikácie H. L. Heykenera a kol., Náture 263, 748 (1976), pri tejto elektroforéze nezreagované fragmenty DNA sú rýchle sa pohybujúcou zložkou, pričom monoméma forma viazaných fragmentov sa pohybuje spoločne s brómfenolovou modrou. Dimerizácia taktiež nastáva vzhľadom na prítomnosť kohezívnych zakončení na viazaných fragmentoch A, B a F 1 na viazaných fragmentoch C, D, G a H. Tieto diméry sú najpomalšie sa pohybujúcim materiálom a dajú sa rozštiepiť reštrikčnými endonukleázami Eco RI a Bam Hl.

Polovice molekúl (viazané fragmenty A + B + E + F a viazané fragmenty C + D + G + H) boli spolu spojené ďalšou väzbou, ktorá sa uskutočňovala v konečnom objeme 150 μΐ pri teplote 4°C počas 16 hodín. 1 mikroliter sa odobral na analytické účely. Reakčná zmes sa zahrievala počas 15 minút pri teplote 65°C pre inaktiváciu T4 NDA ligázy. Spracovanie teplom neovplyvňuje pohyblivosť zmesi DNA. Potom sa k reakčnej zmesi pridalo dostatočné množstvo reštrikčnej endonukleázy Bam Hl pre rozštiepenie multimémych foriem somatostatínovej DNA počas 30 minút pri teplote 37°C. Po pridaní chloridu sodného na koncentráciu 100 mmólov sa DNA podrobila pôsobeniu endonukleázy Eco RI. Pôsobenie reštrikčnej endonukleázy sa ukončilo tak, že DNA sa extrahovala zmesou fenolu a chloroformu. Somatostatínový fragment DNA sa čistil od nezreagovaných a čiastočne viazaných fragmentov DNA preparatívnou elektroforézou na 10 % polyakrylamidovom géli. Pás, ktorý obsahoval fragment somatostatínovej DNA sa vyrezal z gélu a DNA sa vymývala rozrezaním gélu na malé kúsky a následnou extrakciou pufrom, pozostávajúcim z 0,5 M octanu amónneho, 10 mmólov MgCl₂, 0,1 mmol EDTA, 0,1 % SDS cez noc pri teplote 65°C. Potom sa DNA vyzrážala dvoma objemami etanolu, po odstredení sa znova rozpustila v 200 μΐ trispufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6 a dialyzovala voči tomu istému pufru, čím sa získala DNA somatostatínu s koncentráciou 4 pg/ml.

3. Konštrukcia rekombinantných plazmidov.

Na obr. 4 je schematicky znázornený spôsob, ktorým sa dajú získať rekombinantné plazmidy s obsahom somatostatínového génu. Plazmid sa získal nasledujúcim spôsobom.

A. Pôvodný plazmid pBR322.

Plazmid, zvolený pre experimentálne klonovanie v prípade somatostatínu bol pBR322, ide o malý plazmid s molekulovou hmotnosťou približne 2,6 megajednotiek, nesúcich gény odolnosti proti antibiotikám ampicilínu (Ap) a tetracyklínu (Tc). Ako je znázornené na obr. 4, gén pre reštrikciu ampicilínu obsahuje miesto, vhodné pre pôsobenie reštrikčnej endonukleázy Pst I, gén pre odolnosť proti tetracyklínu obsahuje podobné miesto pre pôsobenie reštrikčnej endonukleázy Bam Hl a miesto pre pôsobenie Eco RI je umiestnené medzi génmi Ap^r a Tc^r. Plazmid pBR322 je odvodený od plazmidu s molekulovou hmotnosťou 5,8 megadaltonov Ap^r Tc^r Coľ^mm, ktorý bol opísaný v publikácii R. L. Rodroqueza a kol., ICM/UCLA Symposis on Molecular and Cellular Biology, J, 471 až 477 (1976), R. L. Rodriquez a kol., Construction and Characterization of Cleaning Vehicles, in Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, 471 až 477, Academic Press, Inc. (1976). Plazmid pBR322 je charakterizovaný, vrátane spôsobu jeho odvodenia, v publikácii F. Bolivara a kol., Construction and Characterization of New Clonig Vehicles II. Λ Multipurpose Cloning Systém, Gene (november 1977).

B. Konštrukcia plazmidu pBHlO.

mikrogramov plazmidu pBR322 DNA sa podrobilo pôsobeniu 10 jednotiek reštrikčnej endonukleázy Eco RI v 100 mmol trispufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6, so 100 mmol NaCl, 6 mmol MgClj pri teplote 37°C počas 30 minút. Reakcia sa ukončí extrakciou zmesou chloroformu a fenolu. Potom sa DNA vyzráža pridaním 2,5 objemu etanolu a znova sa zavedie do suspenzie v 50 mikrolitroch T4 DNA polymerázy v pufre (67 mmol trispufru s kyselinou chlorovodíkovou s pH 8,8 a 6,7 mmol MgCl₂, 17,7 mmol (NH₄)₂SO4, 167pg/ml sérového albumínu hovädzieho dobytka a 50 mmol každého z dNTP. Tento spôsob bol opísaný v publikácii A Paneta a kol., Biochem 12, 5045 (1973). Reakcia začína pridaním 2 jednotiek T4 DNA polymerázy, Zmes sa inkubuje počas 30 minút pri teplote 37°C, potom sa reakcia ukončí pridaním zmesi fenolu a chloroformu pre extrakciu DNA, ktorá sa potom vyzráža etanolom. 3 pg λ plač 5 DNA [Shapiro a kol., Náture 224, 768 (1969)] sa podrobí pôsobeniu 3 jednotiek reštrikčnej endonukleázy Hae III počas 1 hodiny pri teplote 37°C v 6 mmol trispufru s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6 so 6 mmol MgCl₂ a 6 mmol βmerkatoetanolu v konečnom objeme 20 μΐ. Reakcia sa zastaví zahrievaním počas 10 minút pri teplote 65°C. DNA po pôsobení pBR322 sa zmieša s λ plač 5 DNA po pôsobení Hae III a väzba sa uskutočňuje v koncovom objeme 30 μΐ pôsobením 1,2 jednotiek T4 DNA ligázy (hydroxylapatitovej frakcie, podľa vyššie uvedenej publikácie A. Paneta a kol.) v 20 mmol trispufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6 a 10 mmol MgCl₂, 10 mmol ditiotreitolu a 0,5 mmol ATP počas 12 hodín pri teplote 12°C. Zmes DNA sa po väzbe dialyzuje oproti 10 mmol trispufra s kyselinou chlorovodíkou s pH 7,6 a potom sa použije pre transformáciu E. coli, kmeňa RR1. Transformanty sa podrobia selekcii podľa svojej rezistencie voči tetracyklínu a ampicilínu na mikroplatniach s obsahom 40 pg/ml 5-bróm-5chlórindolgalaktozidu (prostredie X-gal) podľa publikácie J. H. Millera, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Kolónie schopné syntetizovať β-galaktozidázu sa dajú identifi

SK 278170 Β6 kovať podľa modrej farby. Sledovalo sa 45 nezávisle izolovaných modrých kolónií, tri z nich obsahovali DNA plazmidy, obsahujúce dve miesta pre pôsobenie enzýmu Eco RI, oddelené od seba približne 200 pármi zásob. Poloha asymetricky umiestneného fragmentu Hha I v riadiacom fragmente lac Hae III s 203 pármi zásad (W. Gilbert a kol. v Protein-Ligand Interactions, H. Sand a G. Blauer, Ed. (De Gruyter, Berlin, (1975), str. 193 až 210) umožňuje vykonať stanovenie orientácie fragmentu Hae III, ktorý sa v týchto plazmidoch stáva fragmentom Eco RI. Ako bolo dokázané, nesie plazmid pBHlO fragment požadovanej orientácie, t. j. fragment pre plač transkripciu, prechádzajúci do Tc^r génu plazmidu.

C. Konštrukcia plazmidu pBH20.

Plazmid pBHlO bol modifikovaný tak, aby sa odstránilo miesto pre pôsobenie Eco RI distálne od lac operátora. Táto modifikácia sa uskutočnila tak, že štiepenie sa vykonalo endonukleázou Eco RI iba v distálnom mieste, vhodnom pre štiepenie týmto enzýmom pri súčasnom čiastočnom chránení druhého miesta, vhodného pre štiepenie enzýmom Eco RI RNA polymerázou. Toto miesto je uložené medzi Tc a lac promótorom, ktoré sú od seba vzdialené iba 40 párov báz. Po naviazaní RNA polymerázy sa 5 pg DNA podrobí pôsobeniu 1 jednotky enzýmu Eco RI v konečnom objeme 10 μΐ počas 10 minút pri teplote 37°C. Reakcia sa zastaví zahrievaním pri teplote 65°C počas 10 minút. Kohezívne zakončenie pre štiepenie Eco RI sa podrobí pôsobeniu Sl nukleázy v 25 mmol octanu sodného s pH 4,5, 300 mmol NaCl a 1 mmol ZnCl₂ pri teplote 25°C počas 5 minút. Reakcia sa zastaví pridaním kyseliny etyléndiamíntetraoctovej po koncentráciu 10 mmol a trispufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH 8 po výslednú koncentráciu 50 mmol. DNA sa potom extrahuje zmesou fenolu a chloroformu, vyzráža sa etanolom a znova sa zavedie do suspenzie v 100 μΐ pufra pre väzbu T4 DNA. Potom sa pridá 1 μΐ T4 DNA ligázy a zmes sa inkubuje počas 12 hodín pri teplote 12°C. Viazaná DNA sa transformuje do E. coli kmeňa RR1 a transformanty Ap' Tc' sa podrobia selekcii na Xgal-prostredí. Modré kolónie sa izolujú a analýza DNA sa uskutoční na 10 kolóniách, čím sa dá dokázať, že tieto klony nesú DNA plazmidu s 1 miestom pôsobenia Eco RI. Sedem z týchto kolónií má miesto pre pôsobenie Eco RI uložené medzi promótormi lac a Tri promótormi. Sled nukleotidov z miesta pôsobenia pre enzým Eco RI v riadiacej lac-oblasti bol potvrdený pre plazmid pBH20. Tento plazmid sa potom použil na klonovanie somatostatínového génu.

D. Konštrukcia plazmidu pSOMl.

mikroorganizmov plazmidu pBH20 sa podrobí pôsobeniu reštrikčných endonukleáz Eco RI a Bam Hl v konečnom objeme 50 μΐ. Potom sa pridá bakteriálna alkalická fosfatáza (0,1 jednotky Vorthington BAPP) a zmes sa inkubuje 10 minút pri teplote 65°C. Reakcia sa ukončí extrakciou zmesou fenolu a chloroformu a DNA sa vyzráža 2 objemami etanolu, odstredí a rozpustí v 50 μΐ 10 mmol trispufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH

7,6 s 1 mmol EDTA. Pôsobenie alkalickou fosfatázou účinne zabraňuje samovoľnej väzbe p-BH20 DNA po pôsobení enzýmov Eco RI a Bam Hl, stále je však možná tvorba cirkulámych rekombinantných plazmidov s obsahom DNA somatostatínu. Pretože E. coli kmeň RR1 sa transformuje lineárnym plazmidom DNA s veľmi malou účinnosťou, prevažná väčšina transformantov bude obsahovať rekombinantné plazmidy. 50 μΐ DNA somatos tatínu s koncentráciou 4 μg/ml sa podrobí väzbe pôsobením 25 μΐ enzýmu Bam Hl a Eco RI s pBH20 DNA po pôsobení alkalickej fosfatázy v celkovom objeme 50 μΙ s obsahom 20 mmol trispufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6 a 10 mmol MgCl₂, 10 mmol ditiotrietolu, 0,5 mmol ATP a 4 jednotkami T4 DNA ligázy pri teplote 22°C. Po 10, 20 a 30 minútach sa pridá ďalších 40 ng DNA somatostatínu k reakčnej zmesi, pretože postupné pridávanie DNA somatostatínu môže priaznivo ovplyvniť väzbu na plazmid cez samovoľnú väzbu. Reakcia prebieha ešte jednu hodinu, potom sa zmes podrobí dialýze voči 10 mmol trispufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6. V kontrolnom pokuse sa Bam Hl a Eco Rl, pBH20 po pôsobení alkalickej fosfatázy viaže v neprítomnosti DNA somatostatínu pri podobných podmienkach. Obidva materiály sa použijú bez ďalšieho predbežného spracovania na transformáciu E. coli, kmeňa RR1. Transformácia sa uskutočnila v zariadení P3 (National Institutes of Health, USA, Recombinant Research Quidelines, 1976). Transformanty sa podrobili selekcii na mikroplatniach s obsahom 20 pg/ml Ap a 40 pg/ml X-gél. Izolovalo sa 10 transformantov, z ktorých všetky boli citlivé na Tc. Tieto transformanty sa označili pSOMl, pSOM2 ... až pSOMlO. V kontrolnom pokuse sa nezískali žiadne transformanty. Štyri z 10 transformantov obsahovali plazmidy s miestom pôsobenia pre Eco RI i pre Bam Hl. Rozmer malého fragmentu Eco RI a Bam Hl v týchto rekombinantných plazmidoch bol vo všetkých štyroch prípadoch podobný veľkosti DNA somatostatínu, pripravenej in vitro. Analýza sledu zásad sa vykonala spôsobom podľa publikácie Maxam a Gilbert Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977) a preukázala, že plazmid pSOMl obsahuje požadovaný DNA fragment somatostatínu.

Analýza sekvencie DNA v klone, ktorý nesie plazmid pSOMl napovedá, že by mal vzniknúť peptid, ktoty zodpovedá somatostatínu. V extraktoch supematantu kultúry však nebolo možné rádioimunologickým spôsobom stanoviť žiaden somatostatín, somatostatín sa nedal dokázať ani v prípade, keď sa rastúca kultúra pridala priamo k 70 % kyseline mravčej s brómkyánom. Extrakty E. coli kmeňa RR1 veľmi rýchlo degradujú exogénne somatostatíny. Neprítomnosť somatostatínovej účinnosti v klonoch, nesúcich plazmid pSOMl môže byť spôsobená vnútrobunečnou degradáciou endogénnymi proteolytickými enzýmami. Plazmid pSOMl sa použil na konštrukciu plazmidového kódu pre bielkovinu, ktorá je prekurzorom somatostatínu a je dostatočne veľká, aby mohla odolať proteolytickému štiepeniu.

E. Konštrukcia plazmidu pSOMl 1 a pSOMl 1-3.

Bol skonštruovaný plazmid, v ktorom somatostatínový gén môže byť uložený na C-zakončení génu pre 0-galaktozidázu, pričom celá štruktúra tohto génu je zachovaná. Pretože gén obsahuje v blízkosti uvedeného zakončenia miesto, vhodné pre pôsobenie enzýmu Eco RI a vzhľadom na sekvenciu aminokyselín v tejto bielkovine, (B. Polisky a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 73, 3900 (1976), A. V. Fowlar a koľ, Id, 74, 1507 (1976), A. I. Bukhari a kol., Náture New Biology 243, 238 (1973) a K. E. Langley. J. Biol. Chem. 250, 2587 (1975) bolo možné včleniť somatostatínový gén so zakončeniami z miest pre pôsobenie enzýmov Eco Rl Bam Hl do miesta pre pôsobenie enzýmu Eco RI, pričom súčasne bolo možné udržať požadovaný sled štruktúr. Pri konštrukcii tohto plazmidu sa 50 mikro9

SK 278170 Β6 gramov pSOMl DNA podrobilo pôsobeniu reštrikčných enzýmov Eco RI a Pst I v konečnom objeme 100 mikrolitrov. Na oddelenie veľkých fragmentov Pst-Eco RI so somatostatínovým génom od malých fragmentov s lac riadiacimi elementárni sa použilo 5 % polyakrylamidového gélu. Z gélu sa vyrezal široký pás a DNA sa vymyla narezaním gélu na malé kúsky s následnou extrakciou DNA cez noc pri teplote 65°C. Podobným spôsobom sa 50 mikrogramov plazmidu pBR322 podrobilo pôsobeniu reštrikčných endonukleáz Pst í a Eco RI a obidva výsledné fragmenty sa čistili preparatívnou elektroforézou na 5 % polyakrylamidovom géli. Potom sa malé množstvo (2 mikrogramy) malých fragmentov Pst I - Eco RI z pBR322 viazané s 5 mikrogramami veľkého fragmentu Pst I - Eco Ri z pSOM 1 v konečnom objeme 50 mikrolitrov v prítomnosti 1 jednotky T4 DNA ligázy pri teplote 12°C počas 12 hodín. Zmes sa po väzbe použila pre transformáciu E. coli RRI a transformanty sa analyzovali na svoju odolnosť proti ampicilínu na prostredí X-gal. Ako sa dalo očakávať, takmer všetky Ap^r transformanty (95 %) poskytovali biele kolónie na prostredí X-gal, čím sa dokázala neprítomnosť lac operátora. Výsledný plazmid pSOMl 1 bol určený pre konštrukciu plazmidu pSOMl 1-3. Zmes 5 mikrogramov pSOMll DNA a 5 mikrogramov plač⁵ DNA sa podrobila pôsobeniu 10 jednotiek enzýmu Eco RI počas 30 minút pri teplote 37°C. Pôsobenie reštrikčnej endonukleázy sa ukončilo extrakciou, ktorá sa uskutočnila zmesou fenolu a chloroformu. DNA sa potom vyzrážala etanolom a znova sa zaviedla do suspenzie v 50 mikrolitroch pufra, vhodného pre pôsobenie T4 DNA ligázy. Potom sa k zmesi pridala 1 jednotka T4 DNA ligázy a zmes sa inkubovala počas 12 hodín pri teplote 12°C. Po uskutočnenej väzbe sa zmes dialyzovala proti 10 mmol Tris-pufra s kyselinou chlorovodíkovou s pH 7,6 a použila na transformáciu E. coli RRI. Transformanty sa analyzovali na Ap' na prostredí X-gal s obsahom ampicilínu a taktiež sa skúmali na možnosť produkcie β-galaktozidázy. Približne 2 % kolónií malo modrú farbu (pSOMl 1-1, 11-2 atd’.). Analýza plazmidovej DNA, získanej z týchto klonov reštrikčnými enzýmami ukázala, že všetky plazmidy obsahovali nový Eco RI fragment a približne 4,4 megadaltony, tento fragment obsahoval väčšinu génov pre p-galaktozidázu a miesto pre pôsobenie lac operónu. V zásade sú možné dve orientácie fragmentov Eco Rl, takže sa použilo asymetrické uloženie miesta pre pôsobenie reštrikčnej endonukleázy Hind III pre stanovenie kolónii, ktoré obsahovali fragment Eco RI zodpovedajúci somatostatínovému génu. Po pôsobení enzýmov Hind III a Bam Hl sa dokázalo, že iba klony, ktoré obsahujú plazmidy pSOMl 1-3, pSOMl 1-5, pSOMl 1-6 a pSOMl 1-7 obsahovali fragment Eco RI v uvedenej orientácii.

4. Rádioimunologické skúšky na účinnosť somatostatínu.

Štandardné rádioimunologické skúšky (RIA) na somatostatín opísané v publikácii A. Arimuta a kol., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975) sa modifikovali zníženým objemom a použitím fosfátového pufru. Tyr somatostatín sa jódoval použitím chloramínu T. Pri uskutočňovaní skúšok na somatostatín sa vzorka, zvyčajne v roztoku 70 % kyseliny mravčej s obsahom 3_mg/ml brómkyánu vysušila v kónickej polypropylénovej skúmavke o obsahu 0,7 ml (Sarstedt) nad zvlhčeným K.OH vo vákuu. Potom sa pridalo 30 mikrolitrov pufra PBSA (75 mmol NaCl, 75 mmol fosforečnanu sodného s pH 7,3, 1 mg/ml sérového albumínu hovädzieho dobytka a 0,2 mg/ml azidu sodíka) a potom sa pridalo ešte 40 mikrolitrov ¹²⁵l-somatostatínu a 20 mikrolitrov 1000 násobného zriedenia imúnneho séra S39 proti somatostatínu v pufre PBSA (Vale a kol., Metabolism 25, 1491 (1976)). Značený ^l25I-somatostatín obsahoval v 1 ml 5 pufra PBSA 250 mikrogramov normálneho králičieho gamaglobulínu (Antibodies, Inc.), 1500 jednotiek inhibítora proteázy (Tasylol, Calbiochem) a približne 100 000 impulzov ^l2SI Tyr¹¹- somatostatínu. Po najmenej 16 hodinách státia pri laboratórnej teplote sa pridalo lo do skúmaviek 0,333 ml kozieho gamaglobulínu, imúnneho proti králičiemu séru (Antibodies, Inc., p = = 0,03) a zmes sa ikubovala pri teplote 37°C, potom sa ochladila na teplotu 5°C a odstredila pri 10 000 otáčok za minútu. Supematant sa odstránil a rádioaktivita 15 segmentu sa stanovila na počítači pre gama-žiarenie.

Pri použitom množstve antiséra sa vyzrážalo 20 % rádioaktívnej látky a žiaden neznačený somatostatín. Pozadie pri použití 20 ng somatostatínu bolo zvyčajne 3 %. Polovica maximálnej kompetície sa stanovila pri 20 použití 10 pg somatostatínu. Počiatočné pokusy s extraktmi E. coli RRI ukazovali, že sa dá ľahko stanoviť i menej ako 10 pg somatostatínu v prítomnosti 16 mikrogramov alebo väčšieho množstva bakteriálnej bielkoviny po spracovaní brómkyánu. Viac ako 2 mikro25 gramy bielkoviny z bakteriálneho extraktu po pôsobení kyseliny mravčej je v podstate na závadu v tom zmysle, že sa zvýši pozadie, táto nevýhoda sa však do značnej miery odstráni štiepením brómkyánom. Ďalšie pokusy ukázali, že v extraktoch po pôsobení brómkyánu je so30 matostatín stály.

A. Kompetícia s bakteriálnymi extraktmi.

Kmene E. coli RRI (pSOMl 1-5) a E. coli RRI (pSOMl 1-4) sa kultivovali pri teplote 37°C v prostredí 35 Luria broth po koncentráciu 5 x 10⁸ buniek. Potom sa pridal IPTG po koncentráciu 1 mmol a kmene sa kultivovali počas ďalších 2 hodín. Potom sa vzorky s obsahom 1 ml niekoľko sekúnd odstreďovaíí a segmenty sa znova uviedli do suspenzie v 500 mikrolitroch 70 % 40 kyseliny mravčej s obsahom 5 mg/ml brómkyánu. Po státí počas 4 hodín pri laboratórnej teplote sa vzorky 10 x zriedili vodou a objemy, znázornené na krivke 4 obr.

sa analyzovali na somatostatín. Každá skúška sa vykonala trikrát. Na obr. 6 znamená údaj na osi poradníc 45 pomer B/B_o, čo je pomer ¹²⁵l-somatostatínu, viazaného v prítomnosti vzorky k somatostatínu, ktorý sa viaže v neprítomnosti somatostatínu, ktorý je príčinou kompetície. Každý bod je priemerom z troch stanovení. Na osi úsečiek je uvedený objem v mikrolitroch. Obsah biel50 koviny v nezriedenej vzorke bol 2,2 mg/ml pre E. coli

RRI (pSOMl 1-5) a 1,5 mg/ml pre E. coli RRI (pSOMl 1-4).

B. Počiatočná analýza klonov pSOMl 1 na somatosta55 tín.

Extrakty z 11 klonov (pSOMl 1-2, pSOMl 1-3, atď.) po pôsobení brómkyánu sa pripravili spôsobom, ktorý bol uvedený vyššie pre materiál z krivky A obr. 6. Potom sa z každého extraktu odobralo 30 mikrolitrov 60 pre trojnásobnú rádioimunologickú skúšku (RIA). Výsledky sú zrejmé z krivky B obr. 6. Je tiež znázornená oblasť jednotlivých bodov. Hodnoty pre somatostatín v pG sa dajú odčítať zo štandardnej krivky, získanej v priebehu toho istého pokusu.

Výsledky vyššie opísaných rádioimunologických skúšok sa dajú zhrnúť nasledujúcim spôsobom. V porovnaní s výsledkami dosiahnutými pri použití pSOMl sa zistilo, že štyri klony (pSOMl 1-3, 11-5, 11-6 a 11-7) obsahujú ľahko preukázateľnú rádioimunologickú účinnosť, ktorá sa dá pripísať prítomnosti značeného somatostatínu, ako je zrejmé z obr. 6. Analýza fragmentov po pôsobení reštrikčných endonukleáz ukázala, že klony pSOMl 1-3, pSOMl 1-5, pSOMl 1-6 a pSOMl 1-7 majú požadovanú orientáciu lac operónu, zatiaľčo klony pSOMl 1-2 a 11-4 majú orientáciu opačnú. Jestvuje teda zhoda medzi správnou orientáciou lac operónu a produkciou somatostatínu pri rádioimunologických skúškach.

C. Vplyv indukcie IPTC a štiepenia brómkyánom na pozitívne a negatívne klony.

Štruktúra somatostatínového plazmidu predpokladá, že syntéza somatostatínu bude riadená lac operónom. Gén lac represora nie je v plazmide obsiahnutý a kmeň. E. coli RR1 obsahuje divoký typ chromozomálneho génu s obsahom lac represora, ktorý produkuje iba 10 až 20 molekúl represora v jednej bunke (15). Počet lac operátorov je približne 20 až 30 v jednej bunke, takže úplná depresia je nemožná. Ako je znázornené v nasledujúcej tabuľke III, účinnosť somatostatínu v E. coli sa zvýšila IPTG, induktorom lac operónu. Ako by sa dalo očakávať, úroveň indukcie bola nízka 2,4 až 7 násobná. V pokuse 7 z tabuľky III je zrejmé, že α-aktivita ktorá závisí od prvých 92 aminokyselín β-galaktozidázy, bola taktiež dvakrát indukovaná. V niektorých pokusoch sa nedala dokázať žiadna rádioimunologická účinnosť pre somatostatín pred štiepením brómkyánom. Pretože antisérum, použité v rádioimunologickom pokuse, t.j. antisérum S39 vyžaduje voľný N-terminálny alanín, nedala sa ani očakávať účinnosť pred štiepením brómkyánom.

Tabuľka III

Špecifická rádioimunologická aktivita somatostatínu.

čf sLo pokusu	Knteft	Prostredí·	IPTG	GNBr	pg SS/ng bielkoviny
1	11-2	LB	+	+	0,1
	11-3		+	+	12
	11-4	LB	+	+	0, 4
	11-5	LB	+		15
2	11-3	LB	+	+	12
	11-3	LB		-	0,1
3	11-3	LB	+		61
	11-3	LB	+	+	B
	11-3	LB		-	0,1
4	11-3	LB	+	+	71
	11-3	VB +	+	+	62
		glycerol*
5	11-3	LB +	+	+	250
		glycerol	+	<-
6	11-3	LB	+	+	320
	11-2	LB	4-	+	< 0,1
7	11-3	LB	+	+	24
	11-3	LB	+	+	10

* Vogel-Bonnarovo minimálne prostredie s glycerolom. Skratky: LB - živné prostredie Luria broth, IPTG - izopropyltiogalaktozid, CNBr - brómkyán, SS - somatostatín

Bielkovina sa stanovila metódou, opísanou v publikácii Bradford, Anál. Biochem 72, 248 (1976).

D. Filtrácia extraktov, spracovaných pôsobením brómkyánu na géli.

Extrakty pozitívnych klonov (pSOMl 1-3, 11-5, 11-6 a 11-7) po pôsobení kyseliny mravčej a brómkyánu sa spo ja na celkový objem 250 mikrolitrov, vysušia sa a znova sa zavedú do suspenzie v 0,1 ml 50% kyseline octovej. Pridá sa ³H-elucín a vzorka sa nanesie na stĺpec s rozmermi 0,7 x 47 cm s obsahom Sephadexu G-50 v 50% kyseline octovej. Z frakcií sa odoberajú vzorky s obsahom 50 mikrolitrov a tieto vzorky sa analyzujú na somatostatín. Rovnakým spôsobom sa spracovávajú extrakty, spojené z negatívnych klonov (11-2, 11-4 a 11-11). Výsledky sú uvedené na obr. 5C. Z obr. 5C vyplýva, že sa na tom istom stĺpci zachytáva i známy somatostatín (Beckman Corp.) V tomto systéme sa somatostatín dobre izoluje od veľkých peptidov a malých molekúl. Len extrakty klonov, pozitívnych na somatostatín, mali rádioimunologickú účinnosť a táto aktivita bola vymývaná v tej istej polohe stĺpca ako chemicky syntetizovaný somatostatín.

Súhrn

Údaje o syntéze polypeptidu, ktorý obsahuje sekvenciu aminokyselín, typickú pre somatostatín, sa dá zhrnúť nasledujúcim spôsobom:

1) Rádioimunologická aktivita pre somatostatín sa dá dokázať v bunkách E. coli s obsahom plazmidu pSOMl 1-3, ktorý obsahuje somatostatínový gén so správnou sekvenciou a má správnu orientáciu fragmentu lac Eco RI DNA. Bunky príbuzné plazmidu pSOMl 1-2, ktorý obsahuje ten istý somatostatínový gén, avšak obrátenú orientáciu fragmentu lac Eco RI neprodukujú stanoviteľný somatostatín.

2) Ako sa dá predpokladať, nie je možné dokázať rádioimunologickú aktivitu pre somatostatín pred spracovaním bunečného extraktu brómkyánom.

3) Aktivita pre somatostatín je riadená lac operónom, ako sa dá dokázať indukciou IPTG, ktorý je induktorom lac operónu.

4) Aktivita pre somatostatín v súčasne uskutočňovaných chromatogramoch s použitím známeho somatostatínu na Sephadexe G-50.

5) Sekvencia DNA v klonovanom somatostatínovom géne je správna. V prípade, že sa translácia neuskutočni v správnej fáze, je výsledkom peptid, ktorý je odlišný od somatostatínu vo všetkých polohách. Rádioimunologická aktivita poukazuje na prítomnosť peptidu, blízko príbuzného somatostatínu, pričom translácia sa musí uskutočniť vo fáze. V tomto prípade vzhľadom na genetický kód musí nastať produkcia peptidu s presným sledom pre somatostatín.

6) Vyššie uvedené vzorky extraktu E. coli RR1 (pSOMl 1-3) inhibujú uvoľňovanie rastového hormónu z podmozgovej žľazy krýs, zatiaľ čo vzorky extraktov

E. coli RR1 (pSOMl 1-2) nemajú v tej istej koncentrácii vplyv na uvoľňovanie rastového hormónu.

Stálosť, výťažok a čistenie somatostatínu.

Kmene, nesúce fragment Eco RI lac operónu (pSOMl 1-2, pSOMl 1-3, atď.) sa rozlišujú podľa plazmidového fenotypu. Napríklad po 15 generáciách približne v polovici kultúr E. coli RR1 (pSOMl 1-3) bola schopná produkovať β-galaktozidázu, to znamená, že obsahovala lac operátor a z týchto kultúr bola polovica odolná voči ampicilínu. Kmene, pozitívne (pSOMl 1-3) a negatívne (pSOMl 1-2) na somatostatín sú nestále, táto rastová nestálosť zrejme spočíva v príliš vysokej produkcii veľkých molekúl neúplnej a neúčinnej galaktozidázy. Výťažok somatostatínu sa menil v rozmedzí 0,001 až 0,03 z celkovej bunečnej bielkoviny, ako je zjavné z tabuľky 1, pravdepodobne v dôsledku selekcie buniek v kultúre na základe plazmidov s poru šenou lac oblasťou. Najvyššie výťažky somatostatínu sa získali z línií, v ktorých sa začalo kultivovanie z jedinej kolónie, odolnej proti ampicilínu. I v týchto prípadoch sa dali pozorovať v 30 % buniek pri izolácii poruchy v lac oblasti. Skladovaním v zamrznutom stave (lyofilizáciou) s rastom z jedinej kolónie sa dala dokázať správnosť uvedených predpokladov. Výťažky sa dajú zvýšiť napríklad použitím bakteriálnych kmeňov, ktoré majú veľmi vysokú produkciu lac represora, inak sa dá tiež postupovať tak, že sa použije tryptofán alebo iný systém operátor-promótor, ktorý je bežne celkom potlačený, ako už bolo uvedené vyššie.

V surovom extrakte, ktorý sa získa po rozrušení buniek (napríklad v prístroji Eaton Press) je bielkovina, ktorá je prekurzorom pre somatostatin a obsahuje β-galaktozidázu, nerozpustná a je možné ju nájsť v prvom sedimente pri najvyššej rýchlosti odstreďovania. Bielkovinu možno rozpustiť v 70% kyseline mravčej, 6 M guanidíniumhydrochloridu alebo 2% dodecylsírane sodnom. Výhodne sa surový produkt extrahuje 8 M močovinou a zvyšok po extrakcii sa štiepi brómkyánom. V počiatočných pokusoch bolo možné zvýšiť aktivitu somatostatinu, získanú z E. coli RR1 (pSOMll-3) približne 100 x tak, že sa odštiepený produkt extrahoval alkoholom a chromatografoval na prípravku Sephadex G-50 s 50% kyselinou octovou. Pri ďalšej chromatografii výsledného produktu na Sephadexe G-50 s následnou vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou sa dal získať v podstate čistý somatostatin.

II. Ľudský inzulín.

Vyššie opísaný postup sa aplikoval na výrobu ľudského inzulínu. Boli identifikované gény pre reťazec B inzulínu (104 párov báz) a pre reťazec A inzulínu (77 párov báz). Tieto skutočnosti sa zistili zo sekvencií aminokyselín v polypeptidoch ľudského pôvodu, z ktorých každý mal miesta, vhodné pre pôsobenie reštrikčných endonukleáz Eco RI a Bam Hl a každý z nich bol určený oddelene pre včlenenie do plazmidov pBR322. Syntetické fragmenty, a to dekanukleotidy až pentadekanukleotidy sa syntetizovali fosfotriesterovou metódou, pričom ako stavebné kamene sa použili trinukleotidy, čistenie sa uskutočňovalo kvapalinovou chromatografiou pri vysokom tlaku (HPLC). Reťazce A a B ľudského inzulínu, a to ich syntetické gény sa potom oddelene klonovali v plazmidoch pBR322. Klonované syntetické gény sa spojili s β-galaktozidázovým génom E. coli vyššie uvedeným spôsobom, čím sa dosiahla účinná transkripcia, translácia a vznik stáleho prekurzora bielkoviny. Peptidy inzulínu sa odštiepili od β-galaktozidázového prekurzora, stanovili rádioimunologickým spôsobom a ďalej čistili. Aktivita inzulínu sa stanovila rádioimunologickými metódami v zmesi produktov z E. coli.

1) Štruktúra a syntéza génov ľudského inzulínu.

Gény ľudského inzulínu sú znázornené na obr. 9. Štruktúra génov reťazcov B a A ľudského inzulínu sa stanovila zo sekvencií aminokyselín v polypeptidoch ľudského pôvodu. Zakončenie každého génu v polohe 5' obsahuje zakončenie pre pôsobenie enzýmu Eco RI a Bam Hl s jednoduchým reťazcom, aby bolo možné správne včleniť každý gén do plazmidu pBR322. Do strednej časti génu pre reťazec B sa včlenilo miesto pre pôsobenie endonukleázy Hind III, a to v úseku pre sekvenciu aminokyselín Glu-Ala, tak aby bolo možné overiť každú polovicu génu oddelene pred konštrukciou celého génu pre reťazec B. Gény pre reťazec B a pre reťazec A sa vytvorili z 29 rôznych oligodezoxyribonukleotidov, a to z dekamérov až pentadekamérov. Každá šípka znázorňuje fragment, syntetizovaný zlepšeným fosfotriesterovým spôsobom, a to Hl až H8 a BI až B12 pre reťazec B a Al až Al 1 pre reťazec A.

2) Ľudská syntéza oligodezoxyribonukleotidov.

Použili sa materiály a metódy pre syntézu oligodezoxyribonukleotidov, opísané v publikáciách Itakura,

K. a kol., J. Biol. Chem. 250,4592 (1975) a Itakura, K. a kol., J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327 (1975) s výnimkou týchto modifikácií.

a) Úplne chránené mononukleotidy, 5'-O-dimetoxytrityl-3'-p-chlórfenyl^-kyanoetylfosfáty sa syntetizovali z nukleozidových derivátov pri použití monofunkčného fosforylačného činidla p-chlórfenyl^-kyanoetylfosfochloridu (1,5 molámeho ekvivalentu) v acetonitrile v prítomnosti 1-metylimidazolu spôsobom podľa publikácie Van Boom, J. H. a kol, Tetrahedron 21, 2953 (1975). Produkty sa izolovali vo väčšom množstve (100 až 300 g) preparatívnou kvapalinovou chromatografiou. (Prep. 500LC, Waters Associates).

b) Bifunkčné triméry sa syntetizovali s použitím extrakcie rozpúšťadlom (Hirose, T. a kol., Tetrahedron Letters, 2449 (1978)) v množstve 5 až 10 mmol, ďalších 13 trimérov, 3 tetraméry a 4 diméry ako koncové bloky v polohe 3' sa syntetizovali v množstve 1 mmol. Homogenita plne chránených trimérov sa kontrolovala chromatografiou na tenkej vrstve silikagélu v dvoch zmesiach metanolu a chloroformu. Rozpúšťadlo a) obsahovalo 5% metanolu a rozpúšťadlo b) obsahovalo 10 objemových % metanolu, ako je uvedené v tabuľke IV. Týmto spôsobom sa syntetizovalo 29 oligodezoxyribonukleotidov s definovanou sekvenciou, z toho 18 pre reťazec Ba 11 pre reťazec A.

Základnými jednotkami pre konštrukciu polynukleotidov boli dva typy trimémych blokov, t. j. bifunkčné bloky trimérov z tabuľky IV a zodpovedajúce 3' terminálne triméry, chránené zvyškom kyseliny anizolovej na hydroxyskupine v polohe 3'. Bifunkčný trimér sa hydrolyzoval na zodpovedajúcu 3'-fosfodiesterovú zložku zmesou pyridínu, trietylamínu a vody v objemovom pomere 3:1:1 a tiež na zodpovedajúcu 5 -hydroxylovú zložku pôsobením 2% roztoku kyseliny benzénsulfónovej. Vyššie uvedený 3-terminálny blok sa spracoval pôsobením 2% roztoku kyseliny benzénsulfónovej za vzniku zodpovedajúceho 5'-hydroxylového zakončenia. Reakcia 1,5 molárnych ekvivalentov, t. j. prebytku 3 '-fosfodiesterového triméru s 1 molárnym ekvivalentom 5 -hydroxylovej zložky v prítomnosti 3 až 4 ekvivalentov 2,4,6-triizopropylbenzénsulfonyltetrazolidu (TPSTe) sa takmer ukončila v priebehu 3 hodín. Aby bolo možné odstrániť prebytok 3'-fosfodiesterovej zložky, reakčná zmes sa vložila na vrchol krátkeho silikagélového stĺpca, uloženého na syntrovanom sklenenom filtri. Stĺpec sa premýval najskôr chloroformom, aby sa vymyli niektoré vedľajšie produkty a reakčné činidío, a potom zmesou chloroformu a metanolu v objemovom pomere 95 : 5, čím sa vymyl takmer všetok plne chránený oligomér. Pri týchto podmienkach zostáva 3'-fosfodiesterová zložka, nesúca náboj, na stĺpci. Podobným spôsobom sa vykonávali ďalšie syntézy tak dlho, až sa dosiahla požadovaná dĺžka oligoméru. Výsledky sú znázornené v nasledujúcej tabuľke IV.

SK 278170 Β6

Tabuľka 4

Sytéza trimemých blokov.

Cíalo	Zlúčenina	** Výťažok		Bf	«** *** Čistota	Na obr.9 obsiahnutá v
		(*)	e·	b.	(»)
	MS	47	0,15	0,40	93	BI, B6
a	AAT	49	0,25	0,52	95	Hl, Al, A6
3	MC	52	0,28	0,55	93	«5, 86, A2, A8
4	iK	4)	0,27	0,53	91	B4, 85, A6
9	ACC	56	0,33	0,60	96	B7
6	A00	39	0,18	0,45	90	H5, B7
7	100	45	0,10	0,26	89	H6, H7, B9
β	AQT	33	0,14	0,40	96	89, A2, All
9	aqc	50	0,19	0,48	92	118, BI, A5, A10
10	ÍOÁ	48	0,24	0,50	91	A9
11	no	44	0,26	0,52	95	B4, B7, A3
12	no	49	0,11	0,31	94	H3, 115, A2, A3, A5
13	TCT	58	0,24	0,49	96	A4
14	TO*	45	0,28	0,53	92	Hl, 112, H4, Al
19	TOfl	39	0,12	0,34	91	A2
16	τοα	32	0,10	0,28	87	>13, Al, A10
17	τοα	51	0,18	0,47	93	H6, B2, Λ4, A?, A8
u	TGA	46	0,12	0,37	94	H7
19	TAC	61	0,22	0,50	90	B4, AU
20	TAA	55	0,17	0,44	95	B5, Λ10
21	CCI	53	0,30	0,55	97	H3, H4, B10
82	CAC	47	0,25	0,51	92	A3
23	CM	58	0,25	0,51	93	Hí, H6, 116, A7
24	CIT	41	0,28	0,54	92	B2, B9, A4
29	COA	40	0,27	0,52	93	A7
24	COT	75	0,25	0,50	89	H2, 84, BJ, BI
87	00T	35	0,09	0,26	90	B3
28	CIT	46	0,18	0,45	93	B2
29	OTA	38	0,25	0,50	95	06, B8, A6
30	QAA	39	0,15	0,39	88	H7, B3, B8, A5
31	OAT	52	0,22	0,49	89	ΒΙΟ, A9
32	QCA	42	0,14	0,39	93	A9

* plne chránené tridezoxynukleotidy, 5-09-dimetoxytrityl-3'-p-chlórfenyl-P-kyanoetylfosfát ** celkový výťažok, vypočítaný z 5’-hydroxymonomérov *** HPLC analýza

V priebehu syntézy oligonukleotidov sa použila vysokotlaková kvapalinová chromatografia (HPLC)

a) pre analýzu každého trimémeho a tetramérneho bloku,

b) pre analýzu medziproduktov, a to hexamérov, dekamérov a nonamérov,

c) pre analýzu priebehu reakcie a

d) pre čistenie výsledných produktov.

Vysokotlaková kvapalinová chromatografia sa vykonáva pri použití prístroja Spectra-Physics 35OOB. Po odstránení všetkých chránených skupín koncentrovaným amoniakom pri teplote 50°C počas 6 hodín a AcOH pri laboratórnej teplote počas 15 minút sa výsledné zlúčeniny analyzovali na stĺpci prípravku Permaphase AAX (DuPont) (Van Boom, J. a kol., J. Chromatography 131, 169 (1977) (1 m x 2 mm) pri použití lineárneho gradientu rozpúšťadla B, ktoré pozostáva z 0,05 mol KH₂PO₄ a 1,0 mol KC1 pri pH 4,5 v rozpúšťadle A, ktoré pozostáva z 0,01 mol KHjPO₄ s pH 4,5. Gradient bol vytvorený tak, že najskôr sa použilo rozpúšťadlo A a potom sa pridávalo 3% rozpúšťadla B za minútu. Eluovanie sa uskutočňovalo pri teplote 60°C pri prietokovej rýchlosti 2 ml za minútu. Čistenie 29 výsledných oligonukleotidov sa taktiež uskutočňovalo na prostriedku Permaphase AAX pri rovnakých vyššie uvedených podmienkach. Požadované frakcie sa zliali, soli sa odstránili dialýzou a frakcie sa lyofilizovali. Po označení 5'-zakončení pomocou (τ-³²P)ATP pri použití T₄ polynukleotidkinázy sa homogenita každého oligonukleotidu kontrolovala elektroforézou na 20% polyakrylamidovom géli.

3) Konečná väzba a klonovanie reťazcov A a B génu.

Gén pre reťazec B inzulínu má miesto pre pôsobenie enzýmu Eco RI na ľavom konci, miesto pre pôsobenie enzýmu Hind III v strednej časti a miesto pre pôsobenie enzýmu Bam Hl na pravom konci. Obidve polovice, ľavá polovica Eco RI - Hind III (BH) a pravá polovica Hind III - Bam Hl (BB) sa oddelili klonovaním na vhodnom plazmide pBR322 a po overení svojej sekvencie sa obidve polovice spojili na úplný gén pre reťazec B, ako je znázornené na obr. 10. Polovica BB bola zostavená z 10 oligodezoxyribonukleotidov, ktoré sú na obr. 9 označené BI až B10 a získali sa fosfotriesterovým spôsobom. BI až B10 neboli fosforylované, čím sa vylúčila nežiaduca polymerizácia týchto fragmentov na kohezívnych zakončeniach Hind III a Bam Hl. Po čistení preparatívnou elektroforézou na akrylamidovom géli s eluovaním najširšieho pruhu DNA, fragment BB sa včlení do plazmidu pBR322 po štiepení enzýmami Hind III a Bam Hl. Približne 50% kolónií, odolných voči ampicilínu a odvodených od uvedenej DNA bolo citlivých na tetracyklín, čo znamená včlenenie neplazmidového fragmentu Hind III - Bam Hl. Malé fragmenty Hind III - Bam Hl z týchto 4 kolónií pBBlOl až pBB104 sa analyzovali a zistilo sa, že majú správnu sekvenciu.

Fragment BH sa pripravil podobným spôsobom a bol rovnako včlenený do plazmidu pBR322 po rozštiepení reštrikčnými endonukleázami Eco RI a Hind III. Analyzovali sa plazmidy z troch transformantov pBHl až pBH3, ktoré boli rezistentné voči ampicilínu a citlivé na tetracyklín. Malé fragmenty Eco RI - Hind III mali očakávanú sekvenciu nukleotidov.

Reťazec A bol zostavený z troch častí, 4 oligonukleotidy z ľavej časti, 4 oligonukleotidy z pravej časti a 4 stredné oligonukleotidy boli viazané oddelene a potom boli viazané navzájom, tak ako je znázornené na obr. 9.

Oligonukleotidy Al a A12 neboli fosforylované. Zostavený gén pre reťazec A sa fosforyloval, prečistil elektroforézou na géle a klonoval na pBR322 v úseku Eco RI - Bam Hl. Úseky Eco RI - Bam Hl z dvoch klonov pAlO, pAll, odolných voči ampicilínu a citlivých na tetracyklín obsahovali požadovanú sekvenciu génov pre reťazec A.

4) Konštrukcia plazmidov pre expresie génov reťazcov A a B ľudského inzulínu.

Na obr. 10 je znázornená konštrukcia plazmidu lacinzulínu B (pIBl), plazmidy pBHl a pBBlOl sa podrobili pôsobeniu endonukleáz Eco RI a Hind III. Malé fragmenty plazmidu pBHl a veľké fragmenty plazmidu pBBlOl, obsahujúce fragmenty BB a väčšinu plazmidu pBR322 sa čistili elektroforézou na géli, zmiešali a viazali v prítomnosti λ lac 5 po štiepení Eco RI. Veľký fragment Eco RI λ plač 5 obsahuje lac - riadiacu oblasť a väčšinu β-galaktozidázového Štrukturálneho génu. Konfigurácia miest pre pôsobenie reštrikčných endonukleáz zabezpečuje správnu väzbu fragmentov BH a BB. Fragment lac Eco RI sa môže včleniť v dvoch orientáciách. Z tohto dôvodu pravdepodobne iba jedna polovica klonov, získaných po transformácii, by mala mať požadovanú orientáciu. Orientácia 10 klonov, odolných voči ampicilínu a schopných produkovať β-galaktozidázu sa analyzovala pomocou reštrikčných endonukleáz. Päť z týchto kolónií obsahovalo celú sekvenciu pre gén reťazca B a správnu sekvenciu na prechode β-galaktozidázového génu do génu pre reťazec B. Jeden z týchto klonov pIBl sa zvolil pre ďalšie pokusy.

Pri podobnom pokuse sa 4,4 megadaltonový fragment lac z λ plač 5 včlenil do plazmidu pAl 1 v mieste Eco RI za vzniku pIAl. pIAl je identický s pIBl s tým rozdielom, že fragment génu pre reťazec A je umiestnený namiesto fragmentu pre reťazec B. Pri analýze sekvencie DNA sa dokázalo, že obidva plazmidy pIA 1 a pIBl majú správnu sekvenciu nukleotidov pre reťazec A a B.

5) Expresia.

Kmene, ktoré obsahujú gény inzulínu v správnej väzbe na gén β-galaktozidázy, produkujú veľké množstvá bielkoviny rozmeru β-galaktozidázy. Približne 20 % celkovej bunečnej bielkoviny je hybrid reťazca A a B s β-galaktozidázou. Hybridné bielkoviny sú nerozpustné a dajú sa oddeliť už odstredením pri nízkej rýchlosti, kedy tvoria 50% celkovej oddelenej bielkoviny.

Na detekciu expresie reťazcov A a B ľudského inzulínu sa použili rádioimunologické metódy, založené na rekonštitúcii úplného inzulínu z oddelených reťazcov. Inzulín sa rekonštituoval spôsobom podľa publikácie Katsoyannisa a kol, Biochemistry 6, 2642-2655 (1967), ktorý sa adaptoval sa objem 27 mikrolitrov, čím sa získala veľmi vhodná metóda. Aktivita inzulínu sa dá ľahko preukázať po zmiešaní a rekonštitúcii S-sulfónovaných derivátov inzulínových reťazcov. Oddelené

S-sulfónované reťazce inzulínu nereagujú významne po redukcii a oxidácii s použitou protilátkou proti inzulínu.

Pre použitie v pokuse na rekonštitúciu bolo potrebné čiastočne čistiť bielkovinu, ktorá je hybridom reťazca A alebo reťazca B inzulínu s β-galaktozidázou, potom sa vykonalo štiepenie brómkyánom a napokon sa syntetizovali S-sulfónované deriváty.

Skutočnosť, že sa dosiahla správna expresia z chemicky syntetizovaných génov ľudského inzulínu sa dá dokázať nasledujúcimi spôsobmi:

a) Pre obidva reťazce bolo možné dokázať aktivitu pri rádioimunologickom sledovaní.

b) Sekvencie DNA, získané po klonovaní a po konštrukcii plazmidu, bolo možné priamo overiť a dokázať ich správnosť. Pretože pri rádioimunologických skúškach sa dá dokázať aktivita, translácia musí byť vo fáze. To znamená, že podľa genetického kódu sa produkujú peptidy so sekvenciou, ktorá zodpovedá ľudskému inzulínu.

c) Produkty z E. coli sa správajú ako reťazce inzulínu po štiepení brómkyánom v troch rôznych chromatografických systémoch, ktorými sa uskutočňuje delenie na odlišnom princípe, a to pri filtrácii na géli, pri chromatografii na iónexe a pri vysokotlakovej chromatografii.

d) Reťazec A, produkovaný E. coli sa čistil v malom meradle vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a dokázalo sa, že má správnu sekvenciu aminokyselín.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantný plazmid vhodný pre transformáciu bakteriálneho hostiteľa, vyznačujúci sa tým, že obsahuje homológny regulón a heterológnu DNA, kde heterológna DNA kóduje požadovaný funkčný cicavčí polypeptid, ktorým je enzým, polypeptid krvného séra, polypeptid s analgetickým účinkom alebo hormón, alebo jeho medziprodukt, pričom tento cicavčí polypeptid alebo jeho medziprodukt je nedegradovateľný endogénnymi proteolytickými enzýmami, ktorej predchádza štart-kodón a po ktorej nasleduje jeden alebo viac terminačných alebo stop-kodónov a nepredchádza jej a/alebo ju nenasleduje ďalší protein, kde uvedená DNA je umiestnená v správnom čítacom rámci s uvedeným homológnym regulónom medzi uvedeným regulónom a terminačným kodónom alebo kodónmi, a pri translácii transkripčného produktu heterológnej DNA vo vhodnej baktérii je výsledným produktom expresie uvedený požadovaný funkčný cicavčí polypeptid alebo jeho medziprodukt v získateľnej forme.
2. 2. Rekombinantný plazmid podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že regulón je v podstate identický s regulónom zvyčajne prítomným v chromozomálnej DNA bakteriálneho hostiteľa.
3. 3. Rekombinantný plazmid podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená heterológna DNA zahrňuje cDNA.
4. 4. Rekombinantný plazmid podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedená heterológna DNA zahrňuje DNA získanú organickou syntézou.
5. 5. Rekombinantný plazmid podľa nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že ide o bakteriálny plazmid.
6. 6. Rekombinantný plazmid podľa nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že regulón zahrňuje Escherichia coli lac alebo Escherichia coli tryptofán promótor-operátor systém.
7. 7. Rekombinantný plazmid podľa nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že heterológna DNA kóduje funkčný cicavčí polypeptid samotný a tejto heterológnej DNA kódujúcej uvedený cicavčí polypeptid bezprostredne predchádza translačný štart-kodón.
8. 8. Rekombinantný plazmid podľa nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že cicavčím polypeptidom je cicavčí hormón alebo jeho medziprodukt.
9. 9. Spôsob výroby rekombinantného plazmidu nárokov laž 8, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje spracovanie dvojreťazovej DNA, obsahujúcej intaktný replikón a v sekvencii a) regulón pre riadenie transkripcie a translácie v bakteriálnom hostiteľovi a b) miesto rozpoznávané reštrikčnou endonukleázou pomocou reštrikčnej endonukleázy za vzniku DNA fragmentu, ktorý obsahuje replikón a regulón, a jeho ligáciu v správnom čítacom rámci s uvedeným regulónom heterológnej DNA, kódujúcej funkčný cicavčí polypeptid alebo jeho medziprodukt, kde tento cicavčí polypeptid alebo jeho medziprodukt nie sú degradovateľné endogénnymi proteolytickými enzýmami, pričom je predradený štart-kodón a bezprostredne nasleduje jeden alebo viac terminačných alebo stop-kodónov a nepredchádzajú a/alebo bezprostredne nenasleduje ďalší proteín, a uvedená heterológna DNA má terminálne nukleotidové zoskupenie pripojiteľné k uvedenému DNA-fragmetu, pri poskytnutí uvedeného rekominantného plazmidu.
10. 10. Baktéria, vyznačujúca sa tým, že je transformovaná rekombinantným plazmidom podľa nárokov 1 až 8.
11. 11. Bakteriálna kultúra, vyznačujúca sa tým, že obsahuje transformované baktérie podľa nároku 10.
12. 12. Spôsob bakteriálnej produkcie vyššie definovaného funkčného cicavčieho polypeptidu alebo jeho medziproduktu, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje bakteriálna kultúra podľa nároku 11, na vyvolanie expresie uvedeného polypeptidu alebo medziproduktu v získateľnej forme a uvedený polypeptid alebo medziprodukt sa izoluje.