CZ243799A3 - Výroba léčiva a farmaceutická kompozice pro léčení roztroušené sklerosy - Google Patents
Výroba léčiva a farmaceutická kompozice pro léčení roztroušené sklerosy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ243799A3 CZ243799A3 CZ19992437A CZ243799A CZ243799A3 CZ 243799 A3 CZ243799 A3 CZ 243799A3 CZ 19992437 A CZ19992437 A CZ 19992437A CZ 243799 A CZ243799 A CZ 243799A CZ 243799 A3 CZ243799 A3 CZ 243799A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- copolymer
- eae
- day
- cells
- fed
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 title 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 15
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 230000037406 food intake Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000002702 enteric coating Substances 0.000 claims description 12
- 238000009505 enteric coating Methods 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 45
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 27
- 101710119334 Ceramide transfer protein Proteins 0.000 description 25
- 102100034166 Vasculin Human genes 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 16
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 15
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 8
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 5
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 5
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 4
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 4
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 4
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 4
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 3
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 3
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 3
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 229920003136 Eudragit® L polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920003137 Eudragit® S polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920003134 Eudragit® polymer Polymers 0.000 description 2
- 108010072051 Glatiramer Acetate Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 2
- 102000002233 Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010000123 Myelin-Oligodendrocyte Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000000479 TCF Transcription Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010016283 TCF Transcription Factors Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 159000000021 acetate salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 2
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 101001018362 Bos taurus Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 206010009696 Clumsiness Diseases 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 229920008712 Copo Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 206010012373 Depressed level of consciousness Diseases 0.000 description 1
- 206010013642 Drooling Diseases 0.000 description 1
- 229920003138 Eudragit® L 30 D-55 Polymers 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010005714 Interferon beta-1b Proteins 0.000 description 1
- 206010022998 Irritability Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 108700028031 Myelin Basic Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000986989 Naja kaouthia Acidic phospholipase A2 CM-II Proteins 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241001282135 Poromitra oscitans Species 0.000 description 1
- 102000016202 Proteolipids Human genes 0.000 description 1
- 108010010974 Proteolipids Proteins 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 208000008630 Sialorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 208000013521 Visual disease Diseases 0.000 description 1
- 206010048232 Yawning Diseases 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N acetic acid;(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound CC(O)=O.C[C@H](N)C(O)=O.NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 FHEAIOHRHQGZPC-KIWGSFCNSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000000599 auto-anti-genic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940038717 copaxone Drugs 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003568 cytokine secretion assay Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- GDCRSXZBSIRSFR-UHFFFAOYSA-N ethyl prop-2-enoate;2-methylprop-2-enoic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O.CCOC(=O)C=C GDCRSXZBSIRSFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229960003776 glatiramer acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000010726 hind limb paralysis Diseases 0.000 description 1
- 229910000042 hydrogen bromide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 229960003161 interferon beta-1b Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000027905 limb weakness Diseases 0.000 description 1
- 231100000861 limb weakness Toxicity 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 1
- 229940100662 nasal drops Drugs 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000010984 neurological examination Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000021670 response to stimulus Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029257 vision disease Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Treatments Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
·· ·· • · * t « • * · 0 • · · « · « ·· ··*· 01-1537-99-Če Výroba léčiva a farmaceutická kompozice pro léčení roztroušené sklerosy
Oblast techniky
Vynález se týká výroby léčiva a farmaceutické kompozice pro léčení roztroušené sklerosy.
Dosavadní stav techniky
Kopolymer-1, který je také znám jako glatiramer-acetát a je prodáván pod ochrannou známkou Copaxone^^, zahrnuje acetátové soli polypeptidů obsahujících L-glutamo-vou kyselinu, L-alanin, L-tyrosin a L-lysin. Průměrný molární zlomek je 0,141 pro L-glutamovou kyselinu, 0,427 pro L-alanin, 0,095 pro L-tyrosin a 0,338 pro L-lysin a průměrná molekulová hmotnost kopolymeru-1 je 4 700 až 11 000 Dalton. Tato látka je ne-autoantigen, o němž bylo prokázáno, že potlačuje experimentální alergickou encefalomyelitis (EAE) indukovanou různými encefalitogeny, jako je například homogenát z myší míchy (MSCH, mouše spinal cord homogenate), který obsahuje všechny myelinové antigeny, jako myelinový základní protein (myelin basic protein, MBP) (Sela M. et al., Bull. Inst. Pasteur (1990), 88 303 až 314), proteo-lipidový protein (PLP) (Teitelbaum D. et al., J. Neuro-immunol. (1996), 64, 209 až 217) a myelinový oligodendro-cytový glykoprotein (MOG) (Ben-Nun A. et al., J. Neurol. (1996) 243 (doplněk 1) S14-322) u různých druhů. EAE je přijímána jako model pro roztroušenou sklerosu.
Bylo prokázáno, že kopolymer-1 je účinný při injekčním, subkutánním, intraperitoneálním, intravenosním 2 •· ««·· • · ·♦ nebo intramuskulárním, podávání (D. Teitelbaum et al., Eur. J. Immunol. (1971) 1: 242 až 248; D. Teitelbaum et al., Eur. J. Immunol. (1973) 3: 273 až 279).
Ve fázi III klinických zkoušek bylo zjištěno, že denní subkutánní injekční podávání kopolymeru-1 zpomaluje progresivní postup invalidity a redukuje relapsní poměr u exacerbující-remitující roztroušené sklerosy (K. P. Johnson, Neurology (1995), i; 65 až 70). Léčení pomocí kopolymeru-1 je v současné době omezeno na denní subkutánní podávání. V současné době všechny konkrétně schválené léčebné postupy u roztroušené sklerosy zahrnují autoinjekce účinné látky. V místech vpichu jsou často pozorovány problémy, jako je podráždění, přecitlivělost, zánět, bolest a dokonce nekrosa (v případě léčení alespoň jedním interferonem β 1-B). Dalším faktorem je nízká komplinace u pacientů. Je tedy žádoucí vyvinout nový způsob podávání. V EP patentu 359 783 je popsán způsob léčení auto-imunitních chorob orálním podáváním autoantigenů. V tomto patentu je popsáno orální podávání MBP za účelem léčení roztroušené sklerosy. Orální podávání autoantigenu bylo označeno jako "orální tolerance". PCT mezinárodní patentové přihlášky č. WO 91/12816, WO 91/08760 a WO 92/06704 popisují léčení dalších antoimu-nitních chorob za použití způsobu "orální tolerance” s různými antoantigeny. V žádném z těchto dokumentů však není popsáno léčení roztroušené sklerosy pomocí orálního podávání ne-autoantigenního kopolymeru-l. Všechny tyto dokumenty jsou zde citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu. - 3 • · · · • · • · Úkolem vynálezu je tedy poskytnout způsob léčení roztroušené sklerosy pomocí orálního podávání kopolymeru-1 požitím nebo inhalací. Přehled obr, na výkresech
Na obr. 1 a 2 je znázorněn účinek kopolymeru-1 na imunitní odpověď na myelinový základní protein morčete (GPBP) u potkanů (obr. 1) a myší (obr. 2) stanovený pomocí proliferace slezinných buněk.
Na obr. 3 a 4 je znázorněn účinek kopolymeru-1 na uvolňování cytokinu.
Na obr. 5 je znázorněno potlačení EAE u myší orálním podáváním kopolymeru-1. Myši (SJL/JxBALB/C) F-j^ se krmí PBS (plné čtverečky), 0,lmg dávkou kopolymeru-1 (prázdné čtverečky), 0,25mg dávkou kopolymeru-1 (plné trojúhelníčky) nebo 0,5mg dávkou kopolymeru-1 (prázdné trojúhelníčky). Každá dávka se podává sedmkrát, ve dny -7, -5, -3, o, 2, 4 a 6. EAE se indukuje v den 0 injekcí MSCH.
Na obr. 6 je znázorněna proliferace a sekrece cytokinu linií T-buněk odvozenou z buněk sleziny potkanů krmených kopolymerem-1. Buňky se kultivují s médiem, kopolymerem-l (50 μg/ml) nebo konkavalinem A (Con A) (5 μg/ml). Jako odpověď na tyto antigeny se měří proliferace a sekrece cytokinu.
Na obr. 7 je znázorněna inhibice EAE linií T-buněk odvozenou z buněk sleziny potkanů krmených kopolymerem-1. Buňky (20 x 106/potkan) se podají intraperitoneální injekcí 3 dny po stimulaci kopolymerem-1 následované indukcí EAE. 4 • ♦♦ ·· · · · • f I ··· ·♦ ·· ···» • « ♦ ♦ ·· • · · · • · · · • · t ♦ • * ♦ · ·· ♦♦
Na obr. 8 je znázorněna inhibice EAE linií T-buněk odvozenou z buněk sleziny myší krmených kopolymerem-1. Buňky (15 x 106/myš) se podají intravenosní injekcí 3 dny po stimulaci kopolymerem-1 následované indukcí EAE.
Na obr. 9 je znázorněn graf, v němž jsou vyneseny výsledky klinického hodnocení proti době podávání kopoly-meru-l po indukci EAE ve dnech u tří makaků Rhesus.
Na obr. 10 je znázorněn graf, kde jsou vyneseny výsledky klinického hodnocení proti době podávání kopoly-meru-l po indukci EAE ve dnech u šesti makaků Rhesus při komparační zkoušce dávkovačích forem s enterickým povlakem a bez enterického povlaku. Počátek osy y byl posunut, aby bylo možno lépe znázornit výsledky.
Podstata vynálezu Předmětem vynálezu je použití kopolymeru-1 pro výrobu léčiva pro léčení roztroušené sklerosy. Léčivo se podává požitím nebo inhalací. Dále je předmětem vynálezu farmaceutická kompozice pro léčení roztroušené sklerosy, která se podává požitím nebo inhalací, obsahující farmaceuticky vhodný nosič a terapeuticky účinné množství kopolymeru-1.
Jak již bylo uvedeno výše, kopolymer-1 obsahuje acetátové soli polypeptidů obsahující L-glutamovou kyselinu, L-alanin, L-tyrosin a L-lysin. Průměrný molární zlomek je 5
0,141 pro L-glutamovou kyselinu, 0,427 pro L-alanin, 0,095 pro L-tyrosin a 0,338 pro L-lysin a průměrná molekulová hmotnost kopolymeru-1 je 4 700 až 11 000 Dalton.
Tento vynález je založen na zjištění, že například orální podání kopolymeru-1 je účinné při potlačování EAE, a má tedy terapeutickou hodnotu při léčbě roztroušené sklerosy. Má se za to, že kopolymer-1 přichází do kontaktu s takovými lymfoidními tkáněmi v mukosální výstelce, které jsou považovány za primární zdroj sensitizace imunitního systému. Mukosální výstelka se může nacházet (nikoliv však výhradně) v dutinách, průdušnici, bronchiálních pasáží (v tomto případě jsou známy jako BALT nebo lymfoidní tkáně spojené s průduškami) a gastrointestinální výstelce (známé jako GALT nebo lymfoidní tkáně spojené se střevem). Podávání kopolymeru-1 tedy zahrnuje postupy, při nichž se kopolymer-1 do těla zavádí požitím nebo inhalací. Kopolymer-1 je například možno podávat požitím, pomocí žaludeční sondy, inhalací do bronchiálních pasáží nebo nasální inhalací.
Podle jednoho příkladního provedení vynálezu se kopolymer podává orálně v množství od 0,1 do 1000 mg za den a tuto denní dávku lze podávat ve formě dávky jediné nebo několika dílčích dávek. Odborníku v tomto oboru je zřejmé, že terapeuticky účinná dávka je obecně funkcí pacientova věku, pohlaví a fyzického stavu a dále též funkcí jiné souběžné léčby. Stanovení optimální terapeuticky účinné dávky spadá do rozsahu působnosti odborníka v tomto oboru. V případě, že je kopolymer-1 podáván orálně, může být smísen s jinými potravinovými formami a konzumován v podobě pevných nebo polotuhých suspenzí nebo emulzí. Může být smísen s farmaceuticky vhodnými nosiči, jako je voda, sus-penzními činidly, emulgačními činidly, modifikátory vůně a chuti apod. Podle jednoho provedení tohoto vynálezu je orální kompozice opatřena enterickým povlakem. Použití enterických povlaků je v tomto oboru dobře známé. Tak například K. Lehman, Acrylic Coatings in Controlled Resease Tablet Manufacturer, Manufacturing Chemist and Aerosol News, str. 39 (červen 1973) a K. Lehman, Programmed Drug Release From Oral Program Forms, Pharma, Int., sv. ISS 3, 1971, str. 34 až 41 popisují enterické povlaky, jako Eudragit S a Eudragit L. V Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2. vydání jsou také vysvětleny aplikace Eudragitu S a Eudragitu L. Jako jeden z produktů řady Eudragit je možno uvést Eudragit L30D55.
Kopolymer-1 v některé z výše uvedených forem je rovněž možno podávat nasálně, inhalací nebo jako nosní kapky. Pro dodávku kopolymeru-1 na mukosální výstelku trachey a bronchiálních pasáží je navíc možno použít inhalace ústy.
Kopolymer-1 lze připravovat postupy známými odborníkům v tomto oboru, například způsobem popsaným v US patentu č. 3 849 550. Při tomto způsobu se N-karboxyan-hydridy tyrosinu, alaninu, gamma-benzylglutamátu a epsí-lon-N-trifluoracetyllysinu polymerují při teplotě místnosti v bezvodém dioxanu za použití diethylaminu jako iniciátoru. Odblokování gamma-karboxyskupiny kyseliny glutamové se provádí za použití bromovodíku v ledové kyselině octové, načež se ze zbytků lysinu 1M piperidinem odstraní trifluoracetylové skupiny.
Jak je popsáno v PCT/W095/31990, je kopolymer-1 s požadovanou průměrnou molekulovou hmotnosti 7±2 kDa možno přednostně připravovat způsobem, při němž se chráněný kopolymer-1 nechá reagovat s kyselinou bromovodíkovou za vzniku trifluoracetylkopolymeru-1, na trifluoracetylkopo- lymer-1 se působí vodným roztokem piperidinu a výsledný kopolymer-1 se přečistí tak, aby se získal kopolymer-1 s požadovanou molekulovou hmotností.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Všechny díly, procentické údaje apod. jsou hmotnostní, pokud není uvedeno jinak. Příklady provedení vynálezu Příklad 1 Antigeny
Kopolymer-1 připravený způsobem popsaným v mezinárodní patentové přihlášce PCT/W095/31990 byl získán od firmy Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Izrael. GPBP se připraví z míchy morčete extrakcí kyselinou a vysrážením síranem amonným, způsobem popsaným v Hirshfeld H. et al., Febs Lett. (1970) 7, 317 až 320.
Zvířata
Samice myši (PL/JxSJL/J) F1 o stáří 8 až 10 týdnů byly získány od firmy Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Samice potkana Lewis o stáří 8 až 12 týdnů byly získány od firmy Harlan-Olac (Bicester, Velká Británie).
Indukce a stanovení EAE
Myším se injekčně podá 200 μg GPBP emulgovaného ve stejném objemu úplného Freundova adjuvans (CFA) obsahujícího 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) (Difco Lab, - 8 •· ···· « · · ·· · • · · • · « · ·♦ ·· #
• · · · «· ··
Detroit, Mich., USA). Potkanům se do všech čtyř tlapek injekčně podá emulze o celkovém objemu 0,1 ml. Bezprostředně poté a po 24 hodinách se potkanům intravenosní injekcí podá toxin Bordetella pertussis (250 ng/myš) (Sigma).
Potkani se imunizují 25 μg GPBP emulgovaného v poměru 1 : 1 v CFA obsahujícím 4 mg/ml H37Ra. Potkanům se do dvou zadních tlapek injekčně podá emulze v celkovém objemu 0,1 ml.
Zvířata se denně po dobu 10 dní po indukci zkoušejí na přítomnost příznaků choroby. EAE se hodnotí následujícím způsobem: 0 - bez choroby, 1 - ochabnutí ocasu, 2 - paralýza zadních končetin, 3 - paralýza všech čtyř končetin, 4 - předsmrtný stav, 5 - smrt.
Indukce orální tolerance
Myši se ve dnech -7, -5, -3, 0, 2, 4 a 6 krmí 250 μg GPBP nebo kopolymerem-1 rozpuštěným ve fosfátem pufro-vaném solném roztoku (PBS) pomocí intubace žaludku za použití sondy z nerezové oceli o velikosti 18 (Thomas). EAE se indukuje v den 0.
Potkani se krmí 1 mg GPBP nebo kopolymerem-1 rozpuštěným v PBS pomocí intubace žaludku za použití sterilní sondy (Uno Plast, Dánsko). Potkani se před indukcí choroby krmí 5 x (celková dávka 5 mg) v intervalech 2 až 3 dnů. EAE se indukuje 2 dny po posledním krmení. Kontrolní myši a potkani se simulované krmí PBS.
Zkouška proliferace
Proliferační odpověď u buněk sleziny se zkouší 10 až 11 dnů po výše popsané indukci EAE. Buňky od 3 zvířat v - 9
I - 9 I • · · · • · · · • · · · • · · · • · · « Μ ·· # · # · · · • · • · • · · · · · ·« ·· ·· každé skupině se spojí a ve trojím provedení kultivují (5 x 105 myších buněk a 2 x 105 potkaních buněk) v mikrotitro-vých plotnách s různými koncentracemi antigenu (GPBP) v konečném objemu 0,2 ml. Mikrotitrové plotny obsahují živné médium RPMI 1640 (dostupné od firmy Sigma Biochemicals, St. Louis, Missouri, USA) doplněné 1 % autologního séra. Po 72-hodinové inkubaci se buňky 18 hodin pulzují 1 μθΐ [3H]-thy-midinu, poté sklidí na filtračních papírech a spočítá se radioaktivita.
Zkouška sekrece cytokinu 10 až 11 dnů po indukci EAE se odeberou sleziny a buňky od 3 myší z každé skupiny se vždy spojí. Buňky (5 x 106/ml) se ve dvojím provedení kultivují ve 24-jamkových plotnách v RPMI 1640 doplněném 10 % FCS (fetálního telecího séra) za přítomnosti nebo za nepřítomnosti antigenu (GPBP 100 Fg/ml). Supernatanty se sklidí po 24 až 40hodinové kultivaci. Za použití párovaných monoklonálních protilátek specifických pro odpovídající cytokiny (Pharmigen, La Jolla, CA, USA) se podle pokynů výrobce provede kvantitativní stanovení ELISA pro IL-2, IFN-gamma, IL-4, IL-6 a IL-10. Výsledky Účinnost orálně podávaného kopolymeru-1 při prevenci klinických projevů EAE u Lewisových potkanů se porovná s účinností GPBP, přičemž zkouška se provádí za podmínek nedávno popsaných pro indukci potlačení pomocí orálního podávání GPBP (P. J. Higgins a H. L. Weiner, J. Immunol (1988), 140, 440 až 445). Výsledky, které jsou souhrnně uvedeny v tabulce 1, demonstrují, že kopolymer-1 je účinnější než GPBP a ve srovnání s výsledky u potkanů krmených PBS, kteří slouží jako kontrola, významně snižuje jak incidenci (54% inhibice), tak i závažnost (57% inhibice) EAE. 1
Tabulka
Potlačení EAE u potkanů orálním podáváním kopolymeru-1
Podaný antigen Incidence Střední maximální hodnocení ± SD Střední doba vypuknutí příznaků (dny) PBS (kontrola) 27/28 (96 %) 1,8 ± 0,5 11,9 GPBP 10/17 (59 %) 0,9 ± 0,5 11,4 (p = 0,0026) Kopolymer-l 13/28 (46 %) 0,78± 0,45 12,6 (p = 0,00005) SD = směrodaná odchylka
Každá hodnota představuje kumulativní výsledek ze 3 až 5 nezávislých experimentů. Hodnota p představuje statistickou významnost rozdílu od kontrolní skupiny (Fisherův exaktní test). Střední maximální hodnocení bylo vypočteno pro celou skupinu.
Účinek orálně podávaného antigenu na imunitní odpověď na GPBP Účinek orálního podávání kopolymeru-1 a GPBP na imunitní odpověď na chorobu indukovanou antigenem GPBP se zkouší na myších a potkanech. Výsledky, které jsou souhrnně znázorněny na obr. 1, ukazují, že každé orální podání sloučenin (kopolymeru-1 nebo GPBP) snížilo buněčnou proliferaci v suspenzi slezinných buněk potkana stimulovaných GPBP (obr. 2 znázorňuje podobné výsledky u myší). Je patrné, že orální podávání kopolymeru-1 u obou druhů zvířat vede k téměř úplné inhibici proliferativní odpovědi na GPBP. U obou těchto druhů je při inhibici odpovědi na GPBP kopolymer-1 účinnější než GPBP. Μ Μ«· - 11 • · · • · · » · · · • · · · ·· ·· • Ο • · • · · · • · · · • · · · • · · · « • · ♦ · Μ» · ·
Hladiny cytokinů se měří v supernatantech kultur buněk sleziny myšího původu (obr. 3 a 4). Kontrolní myši krmené PBS v odpovědi na GPBP vylučovaly IL-2, IFN-gamma a IL-6 (není znázorněno). U myší krmených kopolymerem-1 nebo GPBP byla množství Thl prozánětlivých cytokinů IL-2 a IFN--gamma produkovaná při odpovědi na stimulaci GPBP nižší než u kontrolních skupin, přičemž kopolymer-1 je účinnějším supresantem. IL-4 a IL-10 nebyly detegovány u žádné skupiny. Výsledky ukazují, že kopolymer-1, je-li podáván orálně, je při potlačování EAE účinný. Klinický ochranný účinek orálního podávání kopolymeru-1 je spojen s regulací směrem dolů imunitní odpovědi T buněk na GPBP, jako je proliferace a uvolňování prozánětlivých cytokinů (IL-2 a IFN-gamma). Příklad 2
Na myších a potkanech byly provedeny další zkoušky potlačování EAE pomocí orálního podávání kopolymeru-1. Při těchto studiích se stanoví optimální dávka pro léčení u každého druhu. Za účelem pochopení mechanismu, který je základem orálního potlačení EAE pomocí kopolymeru-1 se ze slezin zvířat krmených kopolymerem-1 izoluje linie T-buněk specifická vůči kopolymeru-1. Zkouší se in vitro reaktivita linií a jejich in vivo účinek na indukci choroby, která je předmětem zkoušky.
Materiály a postupy
Izolace kopolymer-l-specifických linií T-buněk
Potkani Lewis se krmí 5 x 1 mg kopolymeru-1 a myši (SJL/JxBALB/c)Fx 7 x 250 μg kopolymeru-1, v intervalech 2 až • · f ·«· 00 t • 0 09 • · • 0 · 0 0 0 9 0 9 « · • t 0 0 0 · 0 9 • · • ♦ • · 0 • · t 0 0 • · * · • · $ 0 0 9 0 ·· ' t · 0 00 0 0 0 0 3 dnů. Čtyři až dvanáct dní po posledním krmení se zvířata usmrtí a vyjmou se jim sleziny.
Buňky sleziny od tří zvířat se spojí a inkubují C. (50 x 10 /miska) s kopolymerem-1 (500 μ9) v médiu obsahujícím 1 % autologního séra po dobu 4 dnů. Každých 14 až 21 dnů se buňky (4 až 6 x 106/miska) znovu stimulují třídenním vysta- vením kopolymeru-1 (500 μ9) na syngenních ozářených (3000 rad) thymocytech potkana (100 x 106/miska) nebo myších splenocytech (50 x l05/miska). Po stimulaci následuje množení v 10% supernatantu normálních myších slezinných buněk aktivovaných konkavalinem Con A, jako růstovém faktoru T-buněk (TCGF).
Zkouška proliferace
Linie T-buněk (1 x 104 buněk) se kultivují s ozářenými (3000 R) thymocyty (potkan 1 x 106) nebo splenocyty (myš - 5 x 10^) a s uvedenými antigeny (10 μg kopolymeru-1, 1 μg Con A) na mikrotitrových deskách v konečném objemu 0,2 ml. Na konci 48-hodinové inkubace se kultury pulsují s 3H--thymidinem a po 6 až 12 hodinách sklidí.
Cytokinová zkouška T-buňky potkanní linie (0,5 x 106/ml) se inkubují s ozářenými thymocyty (10 x 106) za přítomnosti nebo za nepřítomnosti uvedeného antigenu (50 μg kopolymeru-1, 5 μg Con A) Buňky se kultivují 24 hodin v RPMI 1640 doplněném 10 % fe-tálního telecího séra - za účelem stanovení IL-2, TNFa, IL-4 a IL-10 a v médiu bez séra - DCCM-1 (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Izrael) po dobu 72 hodin - za účelem stanovení TGF3. - 13 - 13 ·· ··♦· «# · «·> *0 • « · * · ·♦ f «I 4 « · · **· II·· • · · · · t ·»··«*· I I · f ·· · lili M It. II «II I* 1«
Hladiny cytokinu v supernatantech se měří pomocí kvantitativního stanovení ELISA za použití párů monoklonál-ních protilátek specifických pro odpovídající cytokiny.
Indukce EAE
Myším (SJL/xBALB/cjFj^ se injekčně do všech čtyřech tlapek podají 2 mg homogenátu myší míchy (MSCH) emulgované v poměru 1 : 1 v CFA obsahujícím 1 mg/ml H37Ra (Difco Lab, Detroit, Mich., USA). Bezprostředně poté a po 48 hodinách se potkanům intravenosní injekcí podá toxin Bordetella pertussis (250 ng/myš) (Sigma). Výsledky 1. Zkouška závislosti odovědi na dávce na potkanech a myších
Potkani se krmí 5 x 0,5, 1 nebo 2 mg kopolymeru-1 podle výše uvedeného protokolu (viz Materiály a postupy) a poté provokují za účelem indukce EAE. Výsledky, které jsou souhrnně uvedeny v tabulce 2, ukazují, že nejúčinnější dávkou je 1 mg kopolymeru-1. Dávky 0,5 mg nebo 2 mg kopolymeru-1 jsou při potlačování EAE účinné méně.
Myši (SJL/JxBALB/c) F^ se krmí 7 x 0,1, 0,25 nebo 0,5 mg kopolymeru-1 ve dnech -7, -5,- 3, 0, 2, 4 a 6 pomocí žaludeční sondy. EAE se indukuje v den 0 injekčním podáním MSCH. Výsledky, které jsou souhrnně znázorněny na obr. 5, ukazují, že orální podání kopolymeru-1 může potlačit tuto chorobu u myší. Nejúčinnější dávkou kopolymeru-1 je 0,1 mg. Dávka kopolymeru-1 0,25 mg je účinná méně a dávka 0,5 mg je zcela neúčiná. Výsledky získané na potkanech i myších ukazují, že křivka závislosti odpovědi na dávce u kopolymer-1 podávaného orálně má optimum a překročení účinné orální dávky vede k neúčinnému potlačení EAE. 14 14 ·· · ·· · • · · · • I · · • · · · · • · · · · « Μ · · • ·· · · · · * · · ♦ * * • · · * · · ♦ • · · · · * 2. Zkoušky s Ts-liniemi specifickými vůči kopolymeru-1 získanými od zvířat krmených kopolymerem-1
Linie supresorových T-buněk specifická vzhledem ke kopolymeru-1 se izoluje ze slezin potkanů a myší, u nichž byla díky krmení kopolymerem-1 potlačena odpověď na EAE. Odpověď, vyjádřená pomocí proliferace a sekrece cytokinu, takové buněčné linie izolované z potkanů je demonstrována na obr. 6. Buňky této linie v odpovědi na kopolymer-1 prolife-rují a uvolňují IL-2, určité množství IL-10 a TGF3, ale neuvolňují TNFa nebo IL-4. Tento cytokinový profil je kompatibilní s buňkami typu Th3, o nichž se ukázalo, že jsou indukovány orálním podáním MBP (Chen et al., Science 265, 1237, 1994).
Zkouší se schopnost linií specifických vzhledem ke kopolymeru-1 zabraňovat EAE in vivo. Buněčné linie se podají injekčně 3 dny po in vivo stimulaci kopolymerem-1 (20 x 106 buněk/potkan, i.p. a 15 x 10 6 buněk/myš, i.v.). Ihned po přenosu buněk se zvířata provokují na indukci EAE. Výsledky, které jsou znázorněny na obr. 7 a 8, ukazují, že u recipi-entních zvířat byla choroba podstatně inhibována. Jak potkanní, tak myší linie T-buněk specifických vzhledem ke kopolymeru-1 přenášejí potlačení odpovědi na EAE indukovanou orálním podáním kopolymeru-1. Tyto buňky účinně snižují patologickou imunitní odpověď in vivo. - 15 ·· · · · • · • ♦ · • * • · • · • · * · · • · • · • ·
Tabulka 2
Zkouška závislosti odpovědi na dávce u potkanů při orálním podávání kopolymeru-1
Podaný antigen Incidence Střední maximální hodnocení + SD Střední doba vypuknutí příznaků Potlačení (%) PBS (kontrola) 10/11 1,32±0,64 13,1 Kopolymer-1 (0,5 mg) 9/11 0,95±0,57 13,5 28 Kopolymer-1 (1 mg) 7/11 0,64±0,50 15,1 51 Kopolymer-1 (2 mg) 8/11 0,91±0,70 13,1 31 vypočteno jako střední hodnota
Každá z hodnot incidence představuje kumulativní výsledky ze 2 individuálních zkoušek. Střední maximum klinického hodnocení se vypočítá za celou skupinu. Příklad 3
Zkouší se účinek orálně podáváného kopolymeru-1 na indukci EAE u makaků Rhesus.
Materiály
Kopolymer-1 pochází od firmy Teva Pharmaceutical Industries Ltd. a je ve formě tvrdých želatinových tobolek s enterickým povlakem, které obsahují dvě úrovně dávek: 1 mg kopolymeru-1 a 20 mg kopolymeru-1. Každá z nich byla při- - 16 • · ··· ♦ • · ·♦ • · t *· ·♦
pravena za použití mannitolu a opatřena povlakem z Eudragitu L30D55. Placebem, či kontrolními tobolkami, jsou tobolky obsahující 5 mg cukru.
Hovězí MPB pochází od firmy Life Technologies,
Grand Island, New York, US. Tento materiál představuje vysoce purifikovaný připravek, který při SDS-PAGE a Silverově barvení vykazuje jediný pás při 18,5 kD.
Režim krmení Tři makakové rhesus se ošetří následujícím způsobem: jedna opice, která slouží jako kontrola, se krmí placebem (tobolky obsahující pouze 5 mg glukosy). Druhá opice se krmí tobolkami obsahujícími kopolymer-1 v dávce 1 mg/krmení a třetí opice se krmí tobolkami obsahujícími kopolymer-1 v dávce 20 mg/krmení. Zvířata se krmí každý další den, celkem desetkrát, z toho pětkrát před indukcí choroby (imunizace v den 0) a pětkrát po imunizaci.
Indukce choroby
Choroba se indukuje v den 0 intradermální injekcí 8 mg hovězího MBP a 3 mg Jí. tuberculosis H37Ra v FCA do zadních tlapek, přičemž celkový objem injekce na tlapku je 0,1 až 0,15 ml. U zvířat se sleduje klinická manifestace EAE, různé sérové a CSF imunologické markéry a míšní a kraniální MRI.
Klinické hodnocení
Symptomy se hodnotí následujícím způsobem: 0 -- normální neurologické vyšetření, 1 - ztráta hmotnosti, anorexie, zívání, pomalá odpověď na stimul, dráždivost nebo letargie, 2 - mírné neurologické příznaky, netečnost, slintání, nemotornost při používání končetin, třas, změněný křik a pohledové poruchy, 3 - středně těžké neurologické příznaky, slepota (pupily nereagují na světlo), akinese, ochabnutí končetin nebo paralýza, 4 - těžké neurologické příznaky, semikóma, kóma, kvadruplegie, 5 - smrt.
Proliferace lymfocytů indukovaná antigenem
Vzorky heparinizované krve se zředí v poměru 1 : 1 Hanksovým vyváženým solným roztokem (BSS) obsahujícím 5% teplotně inaktivované fetální telecí sérum (FCS) a rozdělí v gradientu Hypaque-Ficol. Centrifugací (2000 min-1, 20 minut při teplotě místnosti) se izoluje zředěná plasma a lymfocyty se odstředí na rozhraní. Izolované lymfocyty se promyjí třikrát v Hanksově BSS-5%FCS a resuspendují v RPMI 1640, úplném médiu obsahujícím médium RPMI 1640, 10% FCS a 1% následující činidla: neesenciální aminokyseliny, pyrohroznan sodný, L-glutamin, 2-merkáptoethanol a penicilin/streptomycin. Izolované lymfocyty se spočítají a resuspendují v konečné koncentraci 2 x 106/ml. Kultury obsahující 100 μΐ buněčné suspenze a 100 μΐ MBP (20 μg/jamka), 100 μΐ kopolymeru-1 (10 μg/jamka) nebo 100 μΐ Con A (1 μg/jamka) se navzorkují na desky s 96 jamkami s kulatým dnem. Kultury se udržují 6 dní při 37°C v atmosféře 5% oxidu uhličitého. Pátý den kultivace se každá jamka pulsuje 1 μΟί 3H-thymidinu po dobu 16 až 18 hodin. Šestý den se kultury sklidí za použití automatického zařízení pro sklizeň buněk a spočítají pomocí kapalinové scintilace. Stimulační index se stanoví podle následujícího vzorce počet impulzů za minutu (cpm) pozadí experimentální počet impulzů za minutu (cpm)
Stimulační index = - počet impulzů za minutu (cpm) pozadí - 18 - 18 ····
99 • ·· ·· •t · · » · • * * I · • 9 9 · I · • · · · · 999 *· ··
Klinické hodnocení
Po dobu 24 dní žádné ze zvířat nevykazovalo klinické příznaky. U zvířete 18374, léčeného placebem, 25. den došlo k rozvinutí choroby. Vzhledem k závažné manifestaci EAE (hodnocení stupněm 4+ z pětistupňové stupnice) zvíře bylo 28. den usmrceno. Zvíře 18498, ošetřené vysokou dávkou (20 mg) kopolymeru-1, během šedesátidenního období pozorování nevykázalo žádné významné klinické symptomy. U zvířete 18497 ošetřeného nízkou dávkou kopolymeru-1 se 25. den začaly projevovat minimální symptomy. Na rozdíl od zvířete 18374, ošetřeného placebem, zvíře 18497 vykazovalo pomalejší prohlubování klinických symptomů, které v době mezi 28. až 33. dnem ustálily na stupni hodnocení 2 až 3+. Poté byly zvířeti 18497 obden po dobu 10 dnů, celkem tedy pětkrát, podány 20mg tobolky. Jak je vidět na obr. 9, v průběhu 3 dnů klinické příznaky u zvířete poklesly na stupeň 0 a na tomto stupni zůstaly až do doby, kdy byla obě zvířata ošetřovaná kopolymerem-1, 18497 a 18498, usmrcena za účelem provedení histologických zkoušek (60. den).
Průtoková cytometrie
Pro analýzu lymfocytů v periferní krvi (PBL) a moz-komíšního moku (CSF) shromážděných od každé opice se použije průtokového cytometru Epics C. Červené krvinky se lyžují a zbývající bílé krvinky (WBC) se promyjí a barví vhodnými činidly za použití standardních postupů. V tabulkách 3 a 4 jsou uvedeny údaje z barvení PBL a CSF WBC získané od tří zvířat z tohoto příkladu.
Počet obarvených buněk (CD4+) byl u zvířat krmených kopolymerem-1, 18497 a 18498, mírně vyšší než u kontrolního zvířete 18374. Ukázalo se, že počet buněk CD4+, které byly zároveň CD45RA-, byl jak u kontrolního zvířete 18374, tak - 19 «· · · · · · · « · # · · • · ♦ · · • · · * · · l · « « · · ·· ·· ·· • Μ ·· ·· · · I t • » * · ¥ • · · · · · « i « · · ··· «· ·· u zvířete 18497, ošetřovaného nízkou dávkou kopolymeru-1 zvýšený v době, kdy se u těchto zvířat objevily klinické symptomy (dny +27 až +34). Oproti tomu u zvířete 18498 ošetřovaného vysokou dávkou kopolymeru-1 zůstal tento počet v podstatě konstantní. Počet obarvených buněk CD8+CD45RA+ se u kontrolního zvířete 18374 a zvířete ošetřovaného nízkou dávkou kopolymeru-1 18497 stále snižoval, avšak u zvířete krmeného vysokou dávkou kopolymeru-1 18498 se mírně zvyšoval (což ukazuje produkci nových buněk CD4+).
Počet buněk nalezených v CSF kontrolního zvířete 18374 se ode dne 20+ do dne 28+, kdy zvíře pošlo, stále zvyšoval. Analýza ukázala, že většina buněk CD4+ byla CD45RA-. Buněk shromážděných z CSF zvířete 18497 bylo příliš málo na to, aby je bylo možno spočítat nebo barvit. Buněk shromážděných od zvířete 18498 bylo příliš málo na to, aby je bylo možno spočítat nebo barvit, s výjimkou dne +27. Shromážděné buňky CD4+ byly v tomto případě převážně CD45RA-.
Tabulka 3
Analýza lymfocytů v periferní krvi (PBL) získaných od makaků
rhesus imunizovaných MBP
Opice Den CD4+ CD8+ Poměr CD4+ CD8+ zkoušky CD45RA+ CD45RA+ 18374 (-1) 24 47 0,51 15 45 (kontrolní) (+6) 24 42 0,57 15 40 (+13) 23 40 0,58 12 38 +20 22 45 0,49 10 45 +27 24 27 0,89 10 23 +28 24 24 1,0 10 21 - 20 - • · · ·
Tabulka 3- pokračování
Opice Den zkoušky CD4+ CD8+ Poměr CD4+ CD45RA+ CD8+ CD45RA+ 18497 -1 35 36 0,97 21 33 (1 mg kopo- +6 39 31 1,26 24 29 lymeru-1/ +13 37 34 1,09 16 29 dávka) +20 41 32 1,28 18 25 +27 35 27 1,3 12 18 +34 ND ND ND ND ND 18498 -1 37 40 0,93 23 32 (20 mg kopo- +6 37 42 0,88 23 32 lymeru-1/ +13 41 46 0,89 24 37 dávka) +20 27 57 0,47 12 41 +27 37 52 0,71 22 41 +34 ND ND ND ND ND ND = nestanoveno
Tabulka 4
Analýza mozkomíšního moku makaků rhesus imunizovaných MBP
Opice Den zkoušky Buňky (μΐ) CD4+ CD8+ Poměr CD4+/ CD8+ CD4+ CD45RA+ CD8+ CD45RA+ 18374 0 ND ** +14 28 ** +20 100 61 18 co rl s, CM 2 4 + 28 294 35 35 0,94 4 8 Μ ·«»·
• « • I - 21 • 9 9 0 • 9 • · · ··
Tabulka 4 - pokračování
Opice Den Buňky CD4+ CD8+ Poměr CD4+ CD8+ zkoušky (μΐ) CD4+/ CD45RA+ CD45RA+ CD8+ 18497 0 1 +14 1 +20 1 +27 1 +34 1 18498 0 1 +14 1 +20 1 +27 29,7 +34 1 +41 1 47
ND
8 ND 1 = příliš málo buněk ND = nestanoveno
Analýza induktoru faktoru antigen-specifických supresorových T-buněk (Tcsfi) Údaje z analýzy na MBP-specifický Tsfi v plasmě tří opic z tohoto příkladu jsou uvedeny dále v tabulkách 5 a 6. Do dne +13 po indukci EAE pomocí MBP žádné ze zvířat neprodukovalo MBP-specifický Tsfi. Kontrolní zvíře 18374 neprodukovalo žádný Tsfi do dne +20 a od tohoto dne byla produkovaná hladina těsně nad pozadím. Zvířata krmená kopolymerem-1 18497 a 18498 ode dne +13 shodně produkovala významné hladiny Tsfi až do dne +41, krátce před ukončením zkoušky. - 22 f« «««· ·· * ·· » · · »·«· · · · * » « t · · · · f f * • · · « · · ·*·♦·· ««·· · · * · · · · 4 » · · «* · · * · · · · V tabulce 6 jsou uvedeny údaje ze vzorků plasmy, které neobsahovaly Tsfi a nereagovaly s protilátkou anti-TGF -beta. Plasma, která vykazuje MBP vazbu s protilátkou 3C9 (anti-Tsfi), rovněž reaguje s protilátkou anti-TGF-beta. Rekombinantní lidský TGF-beta reaguje s protilátkou anti-TGF -beta, ale nikoliv s protilátkou 3C9.
Tabulka 5
Analýza induktoru faktoru MBP-specifických supresorových T-buněk (Tcsfi)a
Zvíře -13 -1 +6 +13 +20 +27 +34 +41 číslo 18374 žádný žádný ND ND 0,17 0,21 smrt 18497 žádný žádný žádný 0,60 0,61 0,56 0,66 0,76 18498 žádný žádný žádný 0,32 0,32 0,42 0,40 0,40 a Údaje představují optickou hustotu OD při 405 nm vzorků plasmy při zředění 1 : 20 ND = nestanoveno
Tabulka 6
Spojitost mezi MBP-spefickým Tsfi a TGF-beta v plasmě makaků rhesus
Zvíře Den anti-Tsfia anti-TGF-betab číslo zkoušky (protilátka 3C9) 18374 -1 +27 žádná0,21 žádná žádná •t ··»· 23 ♦ · ♦♦ • · · * · · ♦ · «·· ·· ··
Tabulka 6 - pokračování
Zvíře číslo Den zkoušky anti-Tsfia (protilátka 3C9) anti-TGF-betab 18497 +6 žádná žádná +13 0,60 0,71 + 27 0,56 0,65 +41 0,76 0,85 18498 +6 žádná žádná +13 0,32 0,35 +27 0,42 0,47 +41 rekombinantní 0,40 0,45 lidský TGF-betac 0,72 a Představuje optickou hustotu OD při 405 nm látky, která se vázala se k MBP (2,5 proteinu) a reaguje s anti-humánní Tsfi (3C9) protilátkou. b Představuje optickou hustotu OD při 405 nm látky, která se vázala se k MBP a reaguje s anti-humánní TGF-beta protilátkou . c Představuje jamku potaženou 100 ng rekombinantního lidského TGF-beta. Příklad 4 Šest opic se ošetří a provede se analýza za použití v podstatě stejného postupu, jaký je popsán výše v příkladu 3.
Kontrolní zvíře krmené placebem 18746 se krmí tobolkami obsahujícími glukosu. Zvíře 18586 se krmí 1 mg 24 *♦ · »·#* ···» »·* ··· ·*·» • · · ♦ · · * f · · · · • * # · · t · · · · * kopolymeru-1 v tobolkách s prasklým enterickým povlakem. Zvíře 18639 se krmí 20 mg kopolymeru-1 v tobolkách s praským enterickým povlakem. Zvíře 18724 se krmí l mg kopolymeru-1 v tobolkách s neporušeným enterickým povlakem. Zvíře 18810 se krmí 10 mg kopolymeru-1 v tobolkách s neporušeným enterickým povlakem. Zvíře 18962 se krmí 20 mg kopolymeru-1 v tobolkách s neporušeným enterickým povlakem.
Režim krmení, indukce choroby a sledování dalšího průběhu jsou stejné jako v příkladu 3. Výsledky
Jak je zřejmé z obr. 10, u kontrolní opice 18746 se rozvinula akutní choroba počínaje dnem +21 a opice uhynula v den +23 na projevy této choroby. Zvířata 18586 a 18639, jimž byly podány tobolky s prasklým enterickým povlakem, které se v žaludku otevřely (při obou dávkách) před chorobou nebyla chráněna a uhynula v průběhu 2 až 3 dnů na projevy choroby. Všechny opice krmené kopolymerem-1 v tobolkách s enterickým povlakem byly plně chráněny před chorobou a až do 60. dne, kdy byly usmrceny za účelem provedení histologických zkoušek, se u nich nerozvinuly žádné příznaky EAE.
Claims (8)
- ♦ · · ♦ · • · » · I · i ··· ·# ♦« ♦· ·· • ··· ♦·# · « · · - 25 Μ PATENTOVÉ NÁROKY 1. Použití kopolymeru-1 pro výrobu léčiva pro léčení roztroušené sklerosy, přičemž toto léčivo je podáváno požitím nebo inhalací.
- 2. Použití podle nároku 1, kde léčivo obsahuje 0,1 až 1000 mg/den kopolymeru-1.
- 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde léčivo je ve formě vhodné pro orální nebo nasální podávání.
- 4. Použití podle nároku 3, kde podáváním je inhalace.
- 5. Použití podle nároku 3, kde léčivo je opatřeno enterickým povlakem.
- 6. Farmaceutická kompozice pro léčení roztroušené sklerosy, obsahující terapeuticky účinné množství kopolyme-ru-1 a farmaceuticky vhodný nosič, vyznačuj ící se tím, že je ve formě vhodné pro podávání požitím nebo inhalací.
- 7. Farmaceutická kompozice podle nároku 6, vyznačující se t í i , že je v pevné formě, kapalné formě nebo ve formě aerosolu nebo inhalačního prášku.
- 8. Farmaceutická kompozice podle nároku 7, vyznačující se tím, že pevná forma je opatřena enterickým povlakem.01-1537-99-Če
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL11998997A IL119989A0 (en) | 1997-01-10 | 1997-01-10 | Pharmaceutical compositions for oral treatment of multiple sclerosis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ243799A3 true CZ243799A3 (cs) | 2000-06-14 |
| CZ297983B6 CZ297983B6 (cs) | 2007-05-16 |
Family
ID=11069682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0243799A CZ297983B6 (cs) | 1997-01-10 | 1998-01-12 | Entericky potazená farmaceutická kompozice pro perorální podávání pro lécení roztrousené sklerózy |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0975351B1 (cs) |
| JP (1) | JP4216342B2 (cs) |
| KR (1) | KR20000070058A (cs) |
| CN (1) | CN100528222C (cs) |
| AT (1) | ATE356608T1 (cs) |
| AU (1) | AU737287B2 (cs) |
| BR (1) | BRPI9807076B8 (cs) |
| CA (1) | CA2277365C (cs) |
| CZ (1) | CZ297983B6 (cs) |
| DE (1) | DE69837324T2 (cs) |
| EA (1) | EA003128B1 (cs) |
| HK (1) | HK1025737A1 (cs) |
| HU (1) | HU226612B1 (cs) |
| IL (2) | IL119989A0 (cs) |
| NZ (1) | NZ336690A (cs) |
| PL (1) | PL193300B1 (cs) |
| SK (1) | SK284029B6 (cs) |
| WO (1) | WO1998030227A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA98214B (cs) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL141021A0 (en) | 1998-07-23 | 2002-02-10 | Yeda Res & Dev | Treatment of autoimmune conditions with copolymer 1 and related copolymers |
| AU766498B2 (en) * | 1998-07-23 | 2003-10-16 | President And Fellows Of Harvard College, The | Synthetic peptides and methods of use for autoimmune disease therapies |
| ES2527760T3 (es) | 1998-07-23 | 2015-01-29 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Tratamiento de enfermedad de Crohn con copolímero 1 y polipéptidos |
| US6800287B2 (en) | 1998-09-25 | 2004-10-05 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use |
| US6872739B1 (en) * | 1999-06-04 | 2005-03-29 | Vereniging Voor Christelijk Wetenshappelikjk Onderwijs | Use of riluzole for the treatment of multiple sclerosis |
| DE60017733T2 (de) * | 1999-06-04 | 2006-01-12 | Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs | Verwendung von riluzol zur behandlung multipler sklerose |
| US7022663B2 (en) | 2000-02-18 | 2006-04-04 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Oral, nasal and pulmonary dosage formulations of copolymer 1 |
| CN1221281C (zh) * | 2000-02-18 | 2005-10-05 | 耶达研究与开发有限公司 | 共聚物1的口服、鼻部和肺部用剂型 |
| AU7528001A (en) * | 2000-06-05 | 2001-12-17 | Teva Pharma | The use of glatiramer acetate (copolymer 1) in the treatment of central nervous system disorders |
| US20020077278A1 (en) | 2000-06-05 | 2002-06-20 | Yong V. Wee | Use of glatiramer acetate (copolymer 1) in the treatment of central nervous system disorders |
| WO2002076503A1 (en) | 2000-06-20 | 2002-10-03 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Treatment of central nervous system diseases by antibodies against glatiramer acetate |
| CA2469393C (en) | 2001-12-04 | 2010-05-25 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Processes for the measurement of the potency of glatiramer acetate |
| MXPA04008267A (es) | 2002-02-25 | 2004-11-10 | Elan Pharm Inc | Administracion de agentes para el tratamiento de la inflamacion. |
| MXPA05007843A (es) * | 2003-01-24 | 2005-10-18 | Elan Pharm Inc | Composicion y tratamiento de enfermedades desmielinizantes y paralisis por administracion de agentes de remielinizantes. |
| US7560100B2 (en) | 2004-09-09 | 2009-07-14 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Mixtures of polypeptides, compositions containing and processes for preparing same, for treating neurodegenerative diseases |
| DK2949335T3 (en) | 2009-08-20 | 2017-07-31 | Yeda Res & Dev | LOW FREQUENT GLATIRAMER ACETATE THERAPY |
| USRE49251E1 (en) | 2010-01-04 | 2022-10-18 | Mapi Pharma Ltd. | Depot systems comprising glatiramer or pharmacologically acceptable salt thereof |
| US8759302B2 (en) | 2010-03-16 | 2014-06-24 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Methods of treating a subject afflicted with an autoimmune disease using predictive biomarkers of clinical response to glatiramer acetate therapy in multiple sclerosis |
| US8709433B2 (en) | 2010-10-11 | 2014-04-29 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Cytokine biomarkers as predictive biomarkers of clinical response for Glatiramer acetate |
| TW201326399A (zh) | 2011-10-10 | 2013-07-01 | Teva Pharma | 用於預測對格拉替雷（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ）醋酸鹽之臨床反應之單核苷酸多型性之判定 |
| EP2906719A4 (en) | 2012-10-10 | 2016-11-09 | Teva Pharma | PREDICTIVE BIOMARKER FOR CLINICAL REACTION FOR GLATIRAMERACETATE |
| UY35790A (es) | 2013-10-21 | 2015-05-29 | Teva Pharma | Marcadores genéticos que predicen la respuesta al acetato de glatiramer |
| CN105884866B (zh) * | 2015-01-26 | 2021-04-20 | 漳州未名博欣生物医药有限公司 | 格拉替雷的化学合成方法 |
| US9155775B1 (en) | 2015-01-28 | 2015-10-13 | Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. | Process for manufacturing glatiramer acetate product |
| CN112649537B (zh) * | 2015-04-28 | 2024-03-29 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 多肽混合物高效液相色谱分析方法 |
| US11167003B2 (en) | 2017-03-26 | 2021-11-09 | Mapi Pharma Ltd. | Methods for suppressing or alleviating primary or secondary progressive multiple sclerosis (PPMS or SPMS) using sustained release glatiramer depot systems |
| EP3645029B1 (en) | 2017-06-26 | 2023-01-18 | Institut Pasteur | Treatments to eliminate hiv reservoirs and reduce viral load |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5800808A (en) * | 1994-05-24 | 1998-09-01 | Veda Research And Development Co., Ltd. | Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers |
| US5719296A (en) * | 1995-10-30 | 1998-02-17 | Merck & Co., Inc. | Pseudopeptide lactam inhibitors of peptide binding to MHC class II proteins |
-
1997
- 1997-01-10 IL IL11998997A patent/IL119989A0/xx unknown
-
1998
- 1998-01-12 JP JP53110898A patent/JP4216342B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-12 HU HU0001917A patent/HU226612B1/hu unknown
- 1998-01-12 ZA ZA9800214A patent/ZA98214B/xx unknown
- 1998-01-12 CZ CZ0243799A patent/CZ297983B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-01-12 CN CNB988031221A patent/CN100528222C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-12 NZ NZ336690A patent/NZ336690A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-01-12 PL PL334566A patent/PL193300B1/pl unknown
- 1998-01-12 AT AT98901745T patent/ATE356608T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-01-12 KR KR1019997006278A patent/KR20000070058A/ko active Search and Examination
- 1998-01-12 WO PCT/US1998/000375 patent/WO1998030227A1/en active IP Right Grant
- 1998-01-12 EA EA199900621A patent/EA003128B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-01-12 DE DE69837324T patent/DE69837324T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-12 BR BRPI9807076A patent/BRPI9807076B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-01-12 AU AU58195/98A patent/AU737287B2/en not_active Expired
- 1998-01-12 EP EP98901745A patent/EP0975351B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-01-12 SK SK931-99A patent/SK284029B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-01-12 CA CA2277365A patent/CA2277365C/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-07-06 IL IL130820A patent/IL130820A/en not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-08-01 HK HK00104810A patent/HK1025737A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA98214B (en) | 1999-08-11 |
| EP0975351B1 (en) | 2007-03-14 |
| DE69837324D1 (de) | 2007-04-26 |
| ATE356608T1 (de) | 2007-04-15 |
| JP4216342B2 (ja) | 2009-01-28 |
| JP2001511121A (ja) | 2001-08-07 |
| IL130820A (en) | 2007-03-08 |
| PL334566A1 (en) | 2000-03-13 |
| SK93199A3 (en) | 2000-11-07 |
| HU226612B1 (en) | 2009-04-28 |
| IL119989A0 (en) | 1997-04-15 |
| NZ336690A (en) | 2001-05-25 |
| WO1998030227A1 (en) | 1998-07-16 |
| EP0975351A4 (en) | 2002-05-15 |
| KR20000070058A (ko) | 2000-11-25 |
| BR9807076B1 (pt) | 2013-10-29 |
| AU5819598A (en) | 1998-08-03 |
| CN1249690A (zh) | 2000-04-05 |
| EA003128B1 (ru) | 2003-02-27 |
| CZ297983B6 (cs) | 2007-05-16 |
| HUP0001917A3 (en) | 2001-12-28 |
| PL193300B1 (pl) | 2007-01-31 |
| HUP0001917A2 (hu) | 2000-10-28 |
| CA2277365C (en) | 2011-04-12 |
| AU737287B2 (en) | 2001-08-16 |
| CN100528222C (zh) | 2009-08-19 |
| DE69837324T2 (de) | 2007-11-29 |
| EA199900621A1 (ru) | 2000-02-28 |
| BRPI9807076B8 (pt) | 2021-05-25 |
| SK284029B6 (sk) | 2004-08-03 |
| HK1025737A1 (en) | 2000-11-24 |
| BR9807076A (pt) | 2000-05-02 |
| CA2277365A1 (en) | 1998-07-16 |
| EP0975351A1 (en) | 2000-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ243799A3 (cs) | Výroba léčiva a farmaceutická kompozice pro léčení roztroušené sklerosy | |
| US6214791B1 (en) | Treatment of multiple sclerosis through ingestion or inhalation of copolymer-1 | |
| WO1998030227A9 (en) | Treatment of multiple sclerosis through ingestion or inhalation of copolymer-1 | |
| JP3712260B2 (ja) | 自己免疫疾患のバイスタンダー抑制 | |
| DK175666B1 (da) | Behandling af autoimmune sygdomme ved oral administration af autoantigener | |
| AU651097B2 (en) | Enhancement of the down-regulation of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens | |
| HUT69942A (en) | Treatment of autoimmun diseases by oral administration of autoantigenes | |
| CN106668852B (zh) | 一种治疗和/或预防ⅰ型糖尿病的组合物及其应用 | |
| WO1996039176A1 (en) | USE OF ORAL TOLERANCE TO SUPPRESS BOTH Th1 AND Th2 IMMUNE RESPONSES AND TO SUPPRESS ANTIBODY PRODUCTION | |
| JP2002515853A (ja) | 低投与量の▲ｉｉ▼型コラーゲンによる慢性関節リウマチの治療 | |
| KR20000070460A (ko) | 메토트렉세이트와 공동으로 내성화를 사용한 자기면역질병의 치료 | |
| WO1998032451A9 (en) | Treatment of autoimmune disease using tolerization in combination with methotrexate | |
| AU2003250892A1 (en) | Use of alanyl-aminopeptidase inhibitors and pharmaceutical compositions containing said inhibitors | |
| HUT76101A (en) | Treatment of autoimmune disease using oral tolerization and/or th2-enhancing cytokines | |
| HUT74900A (en) | Treatment of autoimmune disease using oral tolerization and/or type i interferon | |
| KR100435040B1 (ko) | 티세포매개성질환들의치료를위한제제들및방법들 | |
| Sela | Immunomodulatory vaccines against autoimmune diseases | |
| MXPA99006457A (en) | Treatment of multiple sclerosisthrough ingestion or inhalation of copolymer-1 | |
| JPH08500823A (ja) | レトロウィルス関連神経疾患のバイスタンダー抑制 | |
| US20040115217A1 (en) | Bystander suppression of autoimmune diseases |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180112 |