SK284029B6

SK284029B6 - Farmaceutická kompozícia na liečenie roztrúsenej sklerózy

Info

Publication number: SK284029B6
Application number: SK931-99A
Authority: SK
Inventors: Ruth Arnon; Michael Sela; Dvora Teitelbaum; Adrian Gilbert; Milka Linenberg; Rivka Riven-Kreitman
Original assignee: Yeda Research And Development Co., Ltd-Company Of Israel
Priority date: 1997-01-10
Filing date: 1998-01-12
Publication date: 2004-08-03
Also published as: ZA98214B; EP0975351B1; DE69837324D1; ATE356608T1; JP4216342B2; JP2001511121A; IL130820A; PL334566A1; SK93199A3; HU226612B1; IL119989A0; NZ336690A; WO1998030227A1; EP0975351A4; KR20000070058A; CZ243799A3; BR9807076B1; AU5819598A; CN1249690A; EA003128B1

Abstract

Farmaceutická kompozícia na liečenie roztrúsenej sklerózy, obsahujúca terapeuticky účinné množstvo kopolyméru-1 a farmaceuticky vhodný nosič, ktorá je vo forme vhodnej na podávanie požitím alebo inhaláciou. Táto kompozícia môže byť s výhodou v pevnej forme, kvapalnej forme alebo vo forme aerosólu, alebo inhalačného prášku. Pevná forma je s výhodou opatrená enterickým povlakom. Terapeuticky účinné množstvo kopolyméru-1 je s výhodou 0,1 až 1000 mg.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka farmaceutickej kompozície obsahujúcej terapeuticky účinné množstvo kopolyméru-1 a farmaceutický vhodný nosič. Táto kompozícia je vhodná na liečenie roztrúsenej sklerózy.

Doterajší stav techniky

Kopolymér-1, ktorý je takisto známy ako glatirameracetát a je predávaný pod ochrannou známkou Copaxone®, zahŕňa acetátové soli polypeptidov obsahujúcich L-glutámovú kyselinu, L-alanín, L-tyrozín a L-lyzín. Priemerný molámy zlomok je 0,141 pre L-glutámovú kyselinu, 0,427 pre L-alanín, 0,095 pre L-tyrozín a 0,338 pre L-lyzín a priemerná molekulová hmotnosť kopolyméru-1 je 4 700 až 11 000 Dalton. Táto látka je ne-autoantigén, o ktorom bolo preukázané, že potlačuje experimentálnu alergickú encefalomyelitídu (EAE) indukovanú rôznymi encefa-litogénmi, ako je napríklad homogenát z myšej miechy (MSCH, mouse spínal cord homogenate), ktorý obsahuje všetky myelínové antigény, ako myelínový základný proteín (myclin basic proteín, MBP) (Sela M. et al., Bull. Inst. Pasteur (1990), 88 303 až 314), proteolipidový proteín (PLP) (Teitelbaum D. et al., J. Neuro-immunol. (1996), 64, 209 až 217) a myelínový oligodendrocytový glykoproteín (MOG) (Ben-Nun A. et al., J. Neurol. (1996) 243 (doplnok 1) S14-322) pri rôznych druhoch. EAE je prijímaná ako model pre roztrúsenú sklerózu.

Bolo preukázané, že kopolymér-1 je účinný pri injekčnom, subkutánnom, intraperitoneálnom, intravenóznom alebo intramuskulámom podávaní (D. Teitelbaum et al., Eur. J. Immunol. (1971) 1: 242 až 248; D. Teitelbaum et al., Eur. J. Immunol. (1973) 3: 273 až 279).

Vo fáze III klinických skúšok bolo zistené, žc denné subkutánne injekčné podávanie kopolyméru-1 spomaľuje progresívny postup invalidity a redukuje relapsový pomer pri exacerbujúcej-remitujúcej roztrúsenej skleróze (K. P. Johnson, Neurology (1995), 1: 65 až 70). Liečba pomocou kopolyméru-1 je v súčasnosti obmedzená na denné subkutánne podávanie.

V súčasnosti všetky konkrétne schválené liečebné postupy pri roztrúsenej skleróze zahŕňajú autoinjekcie účinnej látky. V miestach vpichu sú často pozorované problémy, ako je podráždenie, precitlivelosť, zápal, bolesť a dokonca nekróza (v prípade liečby aspoň jedným interferónom β 1-B). Ďalším faktorom je nízka komplanácia u pacientov. Je teda žiaduce vyvinúť nový spôsob podávania.

EP patente 359 783 je opísaný spôsob liečby autoimunitných chorôb orálnym podávaním autoantigénov. V tomto patente je opísané orálne podávanie MBP s cieľom liečiť roztrúsenú sklerózu. Orálne podávanie autoantigénu bolo označené ako „orálna tolerancia“.

PCT medzinárodné patentové prihlášky č. WO 91/12816, WO 91/08760 a WO 92/06704 opisujú liečbu ďalších antoimunitných chorôb pri použití spôsobu „orálnej tolerancie“ s rôznymi antoantigénmi. V žiadnom z týchto dokumentov však nie je opísané liečenie roztrúsenej sklerózy pomocou orálneho podávania neautoantigénneho kopolyméru-1. Všetky tieto dokumenty sú tu citované náhradou za prenesenie celého ich obsahu do tohto textu.

Úlohou vynálezu je teda poskytnúť spôsob liečby roztrúsenej sklerózy pomocou orálneho podávania kopolyméru-1 požitím alebo inhaláciou.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je farmaceutická kompozícia na liečenie roztrúsenej sklerózy, obsahujúca terapeuticky účinné množstvo kopolyméru-1 a farmaceutický vhodný nosič, ktorej podstata spočíva v tom, že je vo forme vhodnej na podávanie požitím alebo inhaláciou.

Vo výhodnom rozpracovaní je táto farmaceutická kompozícia v pevnej forme, kvapalnej forme alebo vo forme aerosólu alebo inhalačného prášku.

V inom výhodnom rozpracovaní je pevná forma vybavená enterickým povlakom.

Prednostné terapeuticky účinné množstvo kopolyméru-1 je 0,1 až 1000 mg.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 a 2 je znázornený účinok kopolyméru-1 na imunitnú odpoveď na myelínový základný proteín morčaťa (GPBP) pri potkanoch (obr. 1) a myšiach (obr. 2) stanovený pomocou proliferácie slezinných buniek.

Na obr. 3 a 4 je znázornený účinok kopolyméru-1 na uvoľňovanie cytokínu.

Na obr. 5 je znázornené potlačenie EAE pri myšiach orálnym podávaním kopolyméru-1. Myši (SJL/JxBALB/C) F, sa kŕmia PBS (plné štvorčeky), 0,1 mg dávkou kopolyméru-1 (prázdne štvorčeky), 0,25 mg dávkou kopolyméru-1 (plné trojuholníčky) alebo 0,5 mg dávkou kopolyméru-1 (prázdne trojuholníčky). Každá dávka sa podáva sedemkrát, v dňoch -7, -5, -3, 0, 2, 4 a 6. EAE sa indukuje v deň 0 injekciou MSCH.

Na obr. 6 je znázornená proliferácia a sekrécia cytokínu líniou T-buniek odvodenou z buniek sleziny potkanov kŕmených kopolymérom-1. Bunky sa kultivujú s médiom, kopolymérom-1 (50 pg/ml) alebo konkavalinom A (Con A) (5 pg/ml). Ako odpoveď na tieto antigény sa mieri proliferácia a sekrécia cytokínu.

Na obr. 7 je znázornená inhibícia EAE líniou T-buniek odvodenou z buniek sleziny potkanov kŕmených kopolymérom-1. Bunky (20 x 10⁶/potkan) sa podajú intraperitoneálnou injekciou 3 dni po stimulácii kopolymérom-1 nasledované indukciou EAE.

Na obr. 8 je znázornená inhibícia EAE líniou T-buniek odvodenou z buniek sleziny myši kŕmených kopolymérom-

1. Bunky (15x10⁶/'myš) sa podajú intravenóznou injekciou 3 dni po stimulácii kopolymérom-1 nasledovanej indukciou EAE.

Na obr. 9 jc znázornený graf, v ktorom sú vynesené výsledky klinického hodnotenia proti času podávania kopolyméru-1 po indukcii EAE v dňoch pri troch makakoch Rhesus.

Na obr. 10 je znázornený graf, kde sú vynesené výsledky klinického hodnotenia proti času podávania kopolyméru-1 po indukcii EAE v dňoch pri šiestich makakoch Rhesus pri komparačnej skúške dávkovacích foriem s enterickým povlakom a bez enterického povlaku. Počiatok osi y bol posunutý, aby bolo možné lepšie znázorniť výsledky.

Ako už bolo uvedené, kopolymér-1 obsahuje acetátové soli polypeptidov obsahujúcich L-glutámovú kyselinu, L-alanín, L-tyrozín a L-lyzín. Priemerný molámy zlomok je 0,141 pre L-glutámovú kyselinu, 0,427 pre L-alanín, 0,095 pre L-tyrozín a 0,338 pre L-lyzín a priemerná molekulová hmotnosť kopolyméru-1 je 4 700 až 11 000 Dalton.

Tento vynález je založený na zistení, že napríklad orálne podanie kopolyméru-1 je účinné pri potlačovaní EAE, a má teda terapeutickú hodnotu pri liečbe roztrúsenej sklerózy.

Predpokladá sa, že kopolymér-1 prichádza do kontaktu s takými lymfoídnými tkanivami v mukozálnej výstelke, ktoré sú považované za primárny zdroj senzitizácie imunitného systému. Mukozálna výstelka sa môže nachádzať (nie však výhradne) v dutinách, priedušnici, bronchiálnych pasážach (v tomto prípade sú známe ako BALT alebo Iymfoidné tkanivá spojené s prieduškami) a gastrointestinálnej výstelke (známe ako GALT alebo lymfoidné tkanivá spojené s črevom). Podávanie kopolyméru-1 teda zahŕňa postupy, pri ktorých sa kopolymér-1 do tela zavádza požitím alebo inhaláciou. Kopolymér-1 je napríklad možné podávať požitím, pomocou žalúdočnej sondy, inhaláciou do bronchiálnych pasáží alebo nazálnou inhaláciou.

Podľa jedného príkladného uskutočnenia vynálezu sa kopolymér podáva orálne v množstve od 0,1 do 1000 mg za deň a túto dennú dávku je možné podávať vo forme dávky jedinej alebo niekoľkých čiastkových dávok. Odborníkovi v tomto odbore je zrejmé, že terapeuticky účinná dávka je všeobecne funkciou pacientovho veku, pohlavia a fyzického stavu a ďalej tiež funkciou inej súbežnej liečby. Stanovenie optimálnej terapeuticky účinnej dávky patrí do rozsahu pôsobnosti odborníka v tomto odbore.

V prípade, že je kopolymér-1 podávaný orálne, môže byť zmiešaný s inými potravinovými formami a konzumovaný v podobe pevných alebo polotuhých suspenzii alebo emulzií. Môže byť zmiešaný s farmaceutický vhodnými nosičmi, ako je voda, suspenznými činidlami, emulgačnými činidlami, modifikátormi vône a chuti a pod. Podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu je orálna kompozícia vybavená enterickým povlakom. Použitie enterických povlakov je v tomto odbore dobre známe. Tak napríklad K. Lehman, Acrylic Coatings in Contro-lled Resease Tablet Manufacturer, Manufacturing Chemist and Aerosól News, str. 39 (jún 1973) a K. Lehman, Programmed Drug Release From Oral Program Forms, Pharma, Int., zv. ISS 3, 1971, str. 34 až 41 opisujú enterické povlaky, ako Eu-dragit S a Eudragit L. V Handbook of Pharmaceutical Exci-pients, 2. vydanie sú tiež vysvetlené aplikácie Eudragitu S a Eudragitu L. Ako jeden z produktov radu Eudragit je možné uviesť Eudragit L30D55.

Kopolymér-1 v niektorej z uvedených foriem je rovnako možné podávať nazálne, inhaláciou alebo ako nosové kvapky. Na dodávku kopolyméru-1 na mukozálnu výstelku trachey a bronchiálnych pasáží je navyše možné použiť, inhaláciu ústami.

Kopolymér-1 je možné pripravovať postupmi známymi odborníkom v tomto odbore, napríklad spôsobom opísaným v US patente č. 3 849 550. Pri tomto spôsobe sa N-karboxyanhydridy tyrozinu, alanínu, gama-benzylglutamátu a epsilon-N-trifluór-acetyllyzínu polymerujú pri teplote miestnosti v bezvodom dioxáne pri použití dietylamínu ako iniciátora. Odblokovanie gama-karboxyskupiny kyseliny glutámovej sa uskutočňuje pri použití bromovodíka v ľadovej kyseline octovej a potom sa zo zvyškov lyzínu 1M piperidínom odstránia trifluóracetylové skupiny.

Ako je opísané v PCT/WO95/31990, je kopolymér-1 s požadovanou priemernou molekulovou hmotnosťou 7 ± 2 kDa možné prednostne pripravovať: spôsobom, pri ktorom sa chránený kopolymér-1 nechá reagovať, s kyselinou bromovodíkovou za vzniku trifluóracetylkopolyméru-1, na trifluóracetylkopolymér-1 sa pôsobí vodným roztokom piperidínu a výsledný kopolymér-1 sa prečistí tak, aby sa získal kopolymér-1 s požadovanou molekulovou hmotnosťou.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch. Tieto príklady majú výhradne ilustrativny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú. Všetky diely, percentuálne údaje a pod. sú hmotnostné, pokiaľ to nie je uvedené inak.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Antigény

Kopolymér-1 pripravený spôsobom opísaným v medzinárodnej patentovej prihláške PCT/WO95/31990 bol získaný od firmy Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Izrael. GPBP sa pripraví z miechy morčaťa extrakciou kyselinou a vyzrážaním síranom amónnym, spôsobom opísaným v Hirshfeld H. et al., Febs Lett. (1970) 7, 317 až 320.

Zvieratá

Samice myši (PL/JxSJL/J) F1 staré 8 až 10 týždňov boli získané od firmy Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA). Samice potkana Lewis staré 8 až 12 týždňov boli získané od firmy Harlan-Olac (Bicester, Veľká Británia).

Indukcia a stanovenie EAE

Myšiam sa injekčné podá 200 pg GPBP emulgovaného v rovnakom objeme úplného Freundovho adjuvans (CFA) obsahujúceho 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) (Difco Lab, Detroit, Mich., USA). Potkanom sa do všetkých štyroch labiek injekčné podá emulzia s celkovým objemom 0,1 ml. Bezprostredne potom a po 24 hodinách sa potkanom intravenóznou injekciou podá toxín Bordetella pertussis (250 ng/myš) (Sigma).

Potkany sa imunizujú 25 pg GPBP emulgovaného v pomere 1 : 1 v CFA obsahujúcom 4 mg/ml H37Ra. Potkanom sa do dvoch zadných labiek injekčné podá emulzia v celkovom objeme 0,1 ml.

Zvieratá sa denne počas 10 dní po indukcii skúšajú na prítomnosť príznakov choroby. EAE sa hodnotí nasledujúcim spôsobom: 0 - bez choroby, 1 - ochabnutie chvostu, 2 - paralýza zadných končatín, 3 - paralýza všetkých štyroch končatín, 4 - predsmrtný stav, 5 - smrť.

Indukcia orálnej tolerancie

Myši sa v dňoch -7, -5, -3, 0, 2, 4 a 6 kŕmia 250 pg GPBP alebo kopolymérom-1 rozpusteným vo fosfátom tlmenom soľnom roztoku (PBS) pomocou intubácie žalúdku pri použití sondy z nehrdzavejúcej ocele s veľkosťou 18 (Thomas). EAE sa indukuje v deň 0.

Potkany sa kŕmia 1 mg GPBP alebo kopolymérom-1 rozpusteným v PBS pomocou intubácie žalúdku pri použití sterilnej sondy (Uno Plast, Dánsko). Potkany sa pred indukciou choroby kŕmia 5 x (celková dávka 5 mg) v intervaloch 2 až 3 dní. EAE sa indukuje 2 dni po poslednom kŕmení. Kontrolné myši a potkany sa simulovane kŕmia PBS.

Skúška proliferácie

Proliferačná odpoveď buniek sleziny sa skúša 10 až 11 dní po opísanej indukcii EAE. Bunky od 3 zvierat v každej skupine sa spoja a v trojitom vyhotovení kultivujú (5 x 10⁵ myších buniek a 2 x 10⁵ potkaních buniek) v mikrotitrových platniach s rôznymi koncentráciami antigénu (GPBP) v konečnom objeme 0,2 ml. Mikrotitrové platne obsahujú živné médium RPMI 1640 (dostupné od firmy Sigma Biochemicals, St. Louis, Missouri, USA) doplnené 1 % autologného séra. Po 72-hodinovej inkubácii sa bunky hodín pulzujú 1 pCi [³H]-tymidmu, potom zoberú na filtračných papieroch a vyráta sa rádioaktivita.

Skúška sekrécie cytokínu až 11 dní po indukcii EAE sa odoberú sleziny a bunky od 3 myší z každej skupiny sa vždy spoja. Bunky (5 x 10⁶/ml) sa v dvojitom vyhotovení kultivujú v 24-jamkových platniach v RPMI 1640 doplnenom 10 % FCS (fetálneho teľacieho séra) v prítomnosti alebo v neprítomnosti antigénu (GPBP 100 Fg/ml). Supematanty sa zoberú po 24 až 40-hodinovej kultivácii. Pri použití párovaných monoklonálnych protilátok špecifických pre zodpovedajúce cytokíny (Pharmigen, La Jolla, CA, USA) sa podľa pokynov výrobca uskutoční kvantitatívne stanovenia ELISA pre IL-2, IFN-gama, IL-4, IL-6 a IL-10.

Výsledky

Účinnosť orálne podávaného kopolyméru-1 pri prevencii klinických prejavov EAE u Lewisových potkanov sa porovná s účinnosťou GPBP, pričom skúška sa vykonáva za podmienok nedávno opísaných pre indukciu potlačenia pomocou orálneho podávania GPBP (P. J. Higgins a H. L. Weiner, J. Immunol (1988), 140, 440 až 445). Výsledky, ktoré sú súhrnne uvedené v tabuľke 1, demonštrujú, že kopolymér-1 je účinnejší ako GPBP a v porovnaní s výsledkami u potkanov kŕmených PBS, ktorí slúžia ako kontrola, významne znižuje tak incidenciu (54 % inhibicie), ako aj závažnosť (57 % inhibicie) EAE.

Tabuľka 1

Potlačenie EAE u potkanov orálnym podávaním kopolyméru-1

Podaný antigén	Incidencia	Stredné maximálne hodnotenie ± SD	Stredný čas vypuknutia príznakov (dni)
PBS (kontrola)	27/28 (96 %)	1,8 ±	0,5	11,9
GPBP	10/17 (59 1) (p = 0,0026)	0,9 ±	0,5	11,4
Xopolynér-1	13/28 (46 1) (p 0,00005)	0,78±	0,45	12,6

SD = smerodajná odchýlka

Každá hodnota predstavuje kumulatívny výsledok z 3 až 5 nezávislých experimentov. Hodnota p predstavuje štatistickú významnosť rozdielu od kontrolnej skupiny (Fisherov exaktný test). Stredné maximálne hodnotenie bolo vyrátané pre celú skupinu.

Účinok orálne podávaného antigénu na imunitnú odpoveď na GPBP

Účinok orálneho podávania kopolyméru-1 a GPBP na imunitnú odpoveď na chorobu indukovanú antigénom GPBP sa skúša na myšiach a potkanoch. Výsledky, ktoré sú súhrnne znázornené na obr. 1, ukazujú, že každé orálne podanie zlúčenín (kopolyméru-1 alebo GPBP) znížilo bunkovú proliferáciu v suspenzii slezinných buniek potkana stimulovaných GPBP (obr. 2 znázorňuje podobné výsledky u myší). Je patmé, že orálne podávanie kopolyméru-1 pri obidvoch druhoch zvierat vedie k takmer úplnej inhibícii proliferativnej odpovedi na GPBP. Pri obidvoch týchto druhoch je pri inhibícii odpovedi na GPBP kopolymér-1 účinnejší ako GPBP.

Hladiny cytokínu sa meria v supematantoch kultúr buniek sleziny myšieho pôvodu (obr. 3 a 4). Kontrolné myši kŕmené PBS v odpovedi na GPBP vylučovali IL-2, IFN-gama a IL-6 (nie je znázornené). Pri myšiach kŕmených kopolymérom-1 alebo GPBP boli množstvá Thl prozápalových cytokinov IL-2 a IFN-gama produkované pri odpovedi na stimulácii GPBP nižšie ako pri kontrolných skupi nách, pričom kopolymér-1 je účinnejší supresant. IL-4 a IL-10 neboli detegované pri žiadnej skupine.

Výsledky ukazujú, že kopolymér-1, keď je podávaný orálne, je pri potlačovaní EAE účinný. Klinický ochranný účinok orálneho podávania kopolyméru-1 je spojený s reguláciou smerom dole imunitnej odpovedi T buniek na GPBP, ako je proliferácia a uvoľňovanie prozápalových cytokinov (IL-2 a IFN-gama).

Príklad 2

Na myšiach a potkanoch boli vykonané ďalšie skúšky potlačovania EAE pomocou orálneho podávania kopolyméru-L Pri týchto štúdiách sa stanoví optimálna dávka pre liečbu pri každom druhu. S cieľom pochopiť mechanizmus, ktorý je základom orálneho potlačenia EAE pomocou kopolyméru-1 sa zo slezín zvierat kŕmených kopolymérom-1 izoluje línia T-buniek špecifická proti kopolyméru-1. Skúša sa in vitro reaktivita línií a ich in vivo účinok na indukciu choroby, ktorá je predmetom skúšky.

Materiály a postupy

Izolácia kopolymér-1-špecifických línií T-buniek

Potkania Lewis sa kŕmia 5 x 1 mg kopolyméru-1 a myši (SJL/JxBALB/c)Fj 7 x 250 pg kopolyméru-1, v intervaloch 2 až 3 dni. Štyri až dvanásť, dni po poslednom kŕmení sa zvieratá usmrtia a vyberú sa nim sleziny.

Bunky sleziny od troch zvierat sa spoja a inkubujú (50 x 10⁶/miska) s kopolymérom-1 (500 pg) v médiu obsahujúcom 1 % autologného séra počas 4 dní. Každých 14 až 21 dní sa bunky (4 až 6 x 10⁶/miska) opäť stimulujú trojdenným vystavením kopolyméru-1 (500 pg) na syngénnych ožiarených (3000 radov) tymocytoch potkana (100 x x 10⁶/miska) alebo myších splenocytoch (50 x 10⁵/miska). Po stimulácii nasleduje množenie v 10 % supematante normálnych myších slezinných buniek aktivovaných konkavalínom Con A ako rastovom faktore T-buniek (TCGF).

Skúška proliferácie

Línie T-buniek (1 x 10⁴ buniek) sa kultivujú s ožiarenými (3000 R) tymocytmi (potkan 1 x 10⁶) alebo splenocytmi (myš - 5 x 10⁵) a s uvedenými antigénmi (10 pg kopolyméru-1,1 pg Con A) na mikrotitrových platniach v konečnom objeme 0,2 ml. Na konci 48-hodinovej inkubácie sa kultúry pulzujú s ³H-tymidínom a po 6 až 12 hodinách zoberú.

Cytokínová skúška

T-bunky línie potkana (0,5 x 10⁶/ml) sa inkubujú s ožiarenými tymocytmi (10 x 10⁶) v prítomnosti alebo v neprítomnosti uvedeného antigénu (50 pq kopolyméru-1, 5 pg Con A). Bunky sa kultivujú 24 hodín v RPMI 1640 doplnenom 10 % fetálneho teľacieho séra - s cieľom stanoviť IL-2, TNFa, IL-4 a IL-10 a v médiu bez séra - DCCM-1 (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Izrael) počas 72 hodín -s cieľom stanoviť TGFP.

Hladiny cytokínu v supematantoch sa meria pomocou kvantitatívneho stanovenia ELISA pri použití párov monoklonálnych protilátok špecifických pre zodpovedajúce cytokíny.

Indukcia EAE

Myšiam (SJL/xBALB/c)F_t sa injekčné do všetkých štyroch labiek podajú 2 mg homogenátu myšej miechy (MSCH) emulgovanej v pomere 1 : 1 v CFA obsahujúcom 1 mg/ml H37Ra (Difco Lab, Detroit, Mich., USA). Bezprostredne potom a po 48 hodinách sa potkanom intrave nóznou injekciou podá toxín Bordetella pertussis (250 ng/myš) (Sigma).

Výsledky

1. Skúška závislosti odpovedi od dávky na potkanoch a myšiach

Potkany sa kŕmia 5 x 0,5, 1 alebo 2 mg kopolyméru-1 podľa uvedeného protokolu (pozri Materiály a postupy) a potom provokujú s cieľom indukcie EAE. Výsledky, ktoré sú súhrnne uvedené v tabuľke 2, ukazujú, že najúčinnejšou dávkou je 1 mg kopolyméru-1. Dávky 0,5 mg alebo 2 mg kopolyméru-1 sú pri potlačovaní EAE účinné menej.

Myši (SJL/JxBALB/c)F| sa kŕmia 7 x 0,1, 0,25 alebo 0,5 mg kopolyméru-1 v dňoch -7, -5,- 3, 0, 2, 4 a 6 pomocou žalúdočnej sondy. EAE sa indukuje v deň 0 injekčným podaním MSCH. Výsledky, ktoré sú súhrnne znázornené na obr. 5, ukazujú, že orálne podanie kopolyméru-1 môže potlačiť túto chorobu u myší. Najúčinnejšou dávkou kopolyméru-1 je 0,1 mg. Dávka kopolyméru-1 0,25 mg je účinná menej a dávka 0,5 mg je celkom neúčinná. Výsledky získané na potkanoch aj myšiach ukazujú, že krivka závislosti odpovedi od dávky pri kopolymére-1 podávaného orálne má optimum a prekročenie účinnej orálnej dávky vedie k neúčinnému potlačeniu EAE.

2. Skúšky s Ts-líniami špecifickými proti kopolyméru-1 získanými od zvierat kŕmených kopolymérom-1

Línia supresorových T-buniek špecifická vzhľadom na kopolymér-1 sa izoluje zo slezín potkanov a myší, pri ktorých bola vďaka kŕmeniu kopolymérom-1 potlačená odpoveď na EAE. Odpoveď, vyjadrená pomocou proliferácie a sekrécie cytokínu, takej bunkovej línie izolovanej z potkanov je demonštrovaná na obr. 6. Bunky tejto línie v odpovedi na kopolymér-1 proliferujú a uvoľňujú JL-2, určité množstvo IL-10 a TGFfi, ale neuvoľňujú TNFa alebo IL-4. Tento cytokínový profil je kompatibilný s bunkami typu Th3, o ktorých sa ukázalo, že sú indukované orálnym podaním MBP (Chen et al., Science 265, 1237, 1994).

Skúša sa schopnosť línií špecifických vzhľadom na kopolyméru-1 zabraňovať EAE in vivo. Bunkové línie sa podajú injekčné 3 dni po in vivo stimulácii kopolymérom-1 (20 x 10⁶buniek/potkan, i. p. a 15 x 10⁶ buniek/myš, i. v.). Ihneď po prenose buniek sa zvieratá provokujú na indukciu EAE. Výsledky, ktoré sú znázornené na obr. 7 a 8, ukazujú, že pri recipientných zvieratách bola choroba podstatne inhibovaná. Tak potkanie, ako aj myšie línie T-buniek špecifických vzhľadom na kopolymér-1 prenášajú potlačenie odpovedi na EAE indukovanú orálnym podaním kopolyméru-1. Tieto bunky účinne znižujú patologickú imunitnú odpoveď in vivo.

Tabuľka 2

Skúška závislosti odpovedi od dávky u potkanov pri orálnom podávaní kopolyméru-1

Podaný Incidencia antigén	Stredné maximálne hodnotenie ± SD	Stredný čas vypuknutia príznakov	Potlačenie* (%)
PBS
(kontrola)	10/11	1,3210,64	13,1
Kopolynér-1
(0,5 mg)	9/11	0,9510,57	13,5	28
KopoLymér-1
(1 mg)	7/11	0,6410,50	15,1	51
Kopolynér-i
(2 mg)	8/11	0,9110,70	13,1	31

* vyrátané ako stredná hodnota

Každá z hodnôt incidencie predstavuje kumulatívne výsledky z 2 individuálnych skúšok. Stredné maximum klinického hodnotenia sa vyráta za celú skupinu.

Príklad 3

Skúša sa účinok orálne podávaného kopolyméru-1 na indukciu EAE u makakov Rhesus.

Materiály

Kopolymér-1 pochádza od firmy Teva Pharmaceutical Industries Ltd. a je vo forme tvrdých želatínových toboliek s enterickým povlakom, ktoré obsahujú dve úrovne dávok: 1 mg kopolyméru-1 a 20 mg kopolyméru-1. Každá z nich bola pripravená pri použití manitolu a vybavená povlakom z Eudragitu L30D55. Placebom, alebo kontrolnými tobolkami obsahujúcimi 5 mg cukru.

Hovädzí MPB pochádza od firmy Life Technologies, Grand Island, New York, US. Tento materiál predstavuje vysoko purifikovaný prípravok, ktorý pri SDS-PAGE a Silverovom farbení má jediný pás pri 18,5 kD.

Režim kŕmenia

Tri makaky Rhesus sa ošetria nasledujúcim spôsobom: jedna opica, ktorá slúži ako kontrola, sa kŕmi placebom (tobolky obsahujúce iba 5 mg glukózy). Druhá opica sa kŕmi tobolkami obsahujúcimi kopolymér-1 v dávke 1 mg/kŕmenie a tretia opica sa kŕmi tobolkami obsahujúcimi kopolymér-1 v dávke 20 mg/kŕmenie. Zvieratá sa kŕmia každý ďalší deň, celkom desaťkrát, z toho päťkrát pred indukciou choroby (imunizácia v deň 0) a päťkrát po imunizácii.

Indukcia choroby

Choroba sa indukuje v deň 0 intradermálnou injekciou 8 mg hovädzieho MBP a 3 mg M. tuberculosis H37Ra v FCA do zadných labiek, pričom celkový objem injekcie na labku je 0,1 až 0,15 ml. Pri zvieratách sa sleduje klinická manifestácia EAE, rôzne sérové a CSF imunologické markéry a miechová a kraniálna MRI.

Klinické hodnotenie

Symptómy sa hodnotia nasledujúcim spôsobom: 0 - normálne neurologické vyšetrenie, 1 - strata hmotnosti, anorexia, zívanie, pomalá odpoveď na stimul, dráždivosť alebo letargia, 2 - mierne neurologické príznaky, netcčnosť, slinenie, nemotornosť pri používaní končatín, tras, zmenený krik a pohľadové poruchy, 3 - stredne ťažké neurologické príznaky, slepota (pupily nereagujú na svetlo), akinéza, ochabnutie končatín alebo paralýza, 4 - ťažké neurologické príznaky, semikóma, kóma, kvadruplégia, 5 - smrť.

Proliferácia lymfocytov indukovaná antigénom

Vzorky heparinizovanej krvi sa zriedia v pomere 1 : 1 Hanksovým vyváženým soľným roztokom (BSS) obsahujúcim 5 % teplotné inaktivované fetálne teľacie sérum (FCS) a rozdelia v gradiente Hypaque-Ficol. Centrifugáciou (2000 min’¹, 20 minút pri teplote miestnosti) sa izoluje zriedená plazma a lymfocyty sa odstredia na rozhraní. Izolované lymfocyty sa premyjú trikrát v Hanksovom BSS-5 %FCS a resuspendujú v RPMI 1640, úplnom médie obsahujúcom médium RPMI 1640, 10 % FCS a 1 % nasledujúcom činidle: neesenciálne aminokyseliny, pyrohroznan sodný, L-glutamín, 2-merkaptoetanol a penicilín/streptomycín. Izolované lymfocyty sa spočítajú a resuspendujú v konečnej koncentrácii 2 x 10⁶/ml. Kultúry obsahujúce 100 μί bunkovej suspenzie a 100 μί MBP (20 μg/jamka), 100 μΐ kopolyméru-1 (10 pg/jamka) alebo 100 pl Con A (1 pg/jamka) sa navzorkujú na platne s 96 jamkami s guľatým dnom. Kultúry sa udržujú 6 dní pri 37 °C v atmosfére 5 % oxidu uhličitého. Piaty deň kultivácie sa každá jamka pulzuje 1 pCi ³H-tymidínu počas 16 až 18 hodín. Šiesty deň sa kultúry zoberú pri použití automatického zariadenia pre zber buniek a spočítajú pomocou kvapalinovej scintilácie. Stimulačný index sa stanoví podľa nasledujúceho vzorca experimentálny počet impulzov za minútu (cpm) Stimulačný index · --------------počet impulzov za minútu (cpm) pozadia počet impulzov za minútu (cpm) pozadia

Tabuľka 3

Analýza lymfocytov v periférnej krvi (PBL) získaných od makakov Rhesus imunizovaných MBP

Opica	Deň skúšky	CD4 +	CD8+	Pomer	CD4 + CD45RA+	CD8+ CD45RA+
10374	(-1)	24	47	0,51	15	45
(kontrolná)	(+6)	24	42	0,57	15	40
	(+13)	23	40	0,58	12	38
	+ 20	22	45	0,49	10	45
	+ 27	24	27	0,89	10	23
	+ 28	24	24	1,0	10	21

Klinické hodnotenie

Počas 24 dni žiadne zo zvierat nemalo klinické príznaky. U zvieraťa 18374, liečeného placebom, 25. deň došlo k rozvinutiu choroby. Vzhľadom na závažnú manifestáciu EAE (hodnotenie stupňom 4+ z päťstupňovej stupnice) bolo zviera 28. deň usmrtené. Zviera 18498, ošetrené vysokou dávkou (20 mg) kopolyméru-1, počas šesťdesiatdenného obdobia pozorovania nemalo žiadne významné klinické symptómy. U zvieraťa 18497 ošetreného nízkou dávkou kopolyméru-1 sa 25. deň začali prejavovať minimálne symptómy. Na rozdiel od zvieraťa 18374, ošetreného placebom, zviera 18497 malo pomalšie prehlbovanie klinických symptómov, ktoré sa medzi 28. až 33. dňom ustálili na stupni hodnotenia 2 až 3+. Potom boli zvierati 18497 každý druhý deň počas 10 dní, celkom teda päťkrát, podané 20 mg tobolky. Ako je vidieť na obr. 9, počas 3 dní klinické príznaky u zvieraťa poklesli na stupeň 0 a na tomto stupni zostali až dovtedy, keď boli obidve zvieratá ošetrované kopolymérom-1, 18497 a 18498, usmrtené s cieľom uskutočniť histologické skúšky (60. deň).

Prietoková cytometria

Pre analýzu lymfocytov v periférnej krvi (PBL) a mozgovomiechového moku (CSF) zhromaždených od každej opice sa použije prietokový cytometer Epics C. Červené krvinky sa lyžujú a zvyšné biele krvinky (WBC) sa premyjú a farbia vhodnými činidlami pri použití štandardných postupov. V tabuľkách 3 a 4 sú uvedené údaje z farbenia PBL a CSF WBC získané od troch zvierat z tohto príkladu.

Počet ofarbených buniek (CD4+) bol pri zvieratách kŕmených kopolymérom-1, 18497 a 18498, mierne vyšší ako pri kontrolnom zvierati 18374. Ukázalo sa, že počet buniek CD4+, ktoré boli súčasne CD45RA-, bol tak pri kontrolnom zvierati 18374, ako aj pri zvierati 18497, ošetrovaného nízkou dávkou kopolyméru-1 zvýšený v čase, keď sa pri týchto zvieratách objavili klinické symptómy (dni +27 až +34). Oproti tomu pri zvierati 18498 ošetrovaného vysokou dávkou kopolyméru-1 zostal tento počet v podstate konštantný. Počet ofarbených buniek CD8+CD45RA+ sa pri kontrolnom zvierati 18374 a zvierati ošetrovaného nízkou dávkou kopolyméru-1 18497 stále znižoval, ale pri zvierati kŕmeným vysokou dávkou kopolymčru-1 18498 sa mierne zvyšoval (čo ukazuje produkciu nových buniek CD4+).

Počet buniek nájdených v CSF kontrolného zvieraťa 18374 sa od dňa 20+ do dňa 28+, keď zviera uhynulo, stále zvyšoval. Analýza ukázala, že väčšina buniek CD4+ bola CD45RA-. Buniek zhromaždených z CSF zvieraťa 18497 bolo príliš málo na to, aby ich bolo možné spočítať alebo farbiť. Buniek zhromaždených od zvieraťa 18498 bolo príliš málo na to, aby ich bolo možné spočítať alebo farbiť, s výnimkou dňa +27. Zhromaždené bunky CD4+ boli v tomto prípade prevažne CD45RA-.

Tabuľka 3- pokračovanie

Opica	Deň skúšky	CD4+	CD8+	Pomer	CD4 + CD45RA+	CD8+ CD45RA+
18497	-1	35	36	0,97	21	33
(1 mg kopo-	+6	39	31	1,26	24	29
lyméru-1/	+13	37	34	1,09	16	29
dávka)	+20	41	32	1,28	18	25
	+27	35	27	1/3	12	18
	+34	ND	ND	ND	ND	ND
18498	-1	37	40	0,93	23	32
(20 mg kopo-	+6	37	42	0,80	23	32
lyméru-1/	+13	41	46	0,89	24	37
dávka)	+20	27	57	0,47	12	41
	+27	37	52	0,71	22	41
	+34	ND	ND	ND	ND	ND

ND = nestanovené

Tabuľka 4

Analýza mozgovomiechového moku makakov Rhesus imunizovaných MBP

Opica	Deň skúšky	Bunky (μΐ)	CD4 +	CD8+	Pomer CD4+/ CD8+	CD4+ CD45RA+	CD8+ CD45RA+
18374	0	ND	**
	+14	28	**
	+20	100	61	18	2,18	2	4
	+ 28	294	35	35	0,94	4	8

Tabuľka 4 - pokračovanie

Opica	Deň skúšky	Bunky (μΐ)	CD4+ CD8+ Pomer CD4+/ CD8+	CD4+ CD45RA+	CD8+ CD45RA+
18497	0	tt
	+14	AA
	+20	AA
	+27	AA
	+34	AA
18498	0	A*
	+14	AA
	+20	AA
	+ 27	29,7	47 ND	8	ND
	+34	AA
	+41	AA

** = príliš málo buniek ND = nestanovené

Analýza induktoru faktoru antigén-špecifických supresorových T-buniek (Tcsfi)

Údaje z analýzy na MBP-špecifický Tsfi v plazme troch opíc z tohto príkladu sú uvedené ďalej v tabuľkách 5 a 6. Do dňa +13 po indukcii EAE pomocou MBP žiadne zo zvierat neprodukovalo MBP-špecifický Tsfi. Kontrolné zviera 18374 neprodukovalo žiadny Tsfi do dňa +20 a od tohto dňa bola produkovaná hladina tesne nad pozadím. Zvieratá kŕmené kopolymérom-1 18497 a 18498 od dňa +13 zhodne produkovali významné hladiny Tsfi až do dňa +41, krátko pred ukončením skúšky.

V tabuľke 6 sú uvedené údaje zo vzoriek plazmy, ktoré neobsahovali Tsfi a nereagovali s protilátkou anti-TGF-beta. Plazma, ktorá má MBP väzbu s protilátkou 3C9 (anti-Tsfí), rovnako reaguje s protilátkou anti-TGF-beta. Rekombinantný ľudský TGF-beta reaguje s protilátkou antiTGF-beta, ale nie s protilátkou 3C9.

Tabuľka 5

Analýza induktoru faktoru MBP-špecifických supresorových T-buniek (Tcsfi)^a

Zviera	-13	-1	+6	+13	+ 20	+ 27	+34 +41
číslo
18374	žiadny	žiadny	ND	ND	0,17	0,21	snrí
18497	žiadny	žiadny	žiadny	0,60	0,61	0,56	0,66 0,76
18498	žiadny	žiadny	žiadny	0,32	0,32	0,42	0,40 0,40

^a Údaje predstavujú optickú hustotu OD pri 405 nm vzoriek plazmy pri zriedení 1 : 20

ND = nestanovené

Tabuľka 6

Spojitosť medzi MBP-špefickým Tsfi a TGF-beta v plazme makakov Rhesus

Zviera číslo	Deň skúšky	anti-Tsfi^a(protilátka 3C9)	anti-TGF-beta^
18374	-1	žiadna	žiadna
	+27	0,21	žiadna

Tabuľka 6 - pokračovanie

Zviera číslo	Deň skúšky	anti-Tsfi^a(protilátka 3C9)	anti-ICT-beta^b
18497	+6	žiadna	žiadna
	+13	0,60	0,71
	+27	0,56	0,65
	+41	0,76	0,85
18498	+6	žiadna	žiadna
	+13	0,32	0,35
	+27	0,42	0,47
	+41	0,40	0,45
	rekombinantný
	ľudský TGF-beta^o	0,72

Príklad 4

Šesť opíc sa ošetrí a vykoná sa analýza pri použití v podstate rovnakého postupu, aký je opísaný v príklade 3.

Kontrolné zviera kŕmené placebom 18746 sa kŕmia tobolkami obsahujúcimi glukózu. Zviera 18586 sa kŕmi 1 mg kopolyméru-1 v tobolkách s prasknutým enterickým povlakom.

Zviera 18639 sa kŕmi 20 mg kopolyméru-1 v tobolkách s prasknutým enterickým povlakom. Zviera 18724 sa kŕmi 1 mg kopolyméru-1 v tobolkách s neporušeným enterickým povlakom. Zviera 18810 sa kŕmi 10 mg kopolyméru-1 v tobolkách s neporušeným enterickým povlakom. Zviera 18962 sa kŕmi 20 mg kopolyméru-1 v tobolkách s neporušeným enterickým povlakom.

Režim kŕmenia, indukcie choroby a sledovania ďalšieho priebehu sú rovnaké ako v príklade 3.

Výsledky

Ako je zrejmé z obr. 10, pri kontrolnej opici 18746 sa rozvinula akútna choroba začínajúca dňom +21 a opica uhynula v deň +23 na prejavy tejto choroby. Zvieratá 18586 a 18639, ktorým boli podané tobolky s prasknutým enterickým povlakom, ktoré sa v žalúdku otvorili (pri obidvoch dávkach) pred chorobou neboli chránené a uhynuli počas 2 až 3 dní na prejavy choroby. Všetky opice kŕmené kopolymérom-1 v tobolkách s enterickým povlakom boli celkom chránené pred chorobou a až do 60. dňa, keď boli usmrtené s cieľom uskutočniť histologické skúšky, sa u nich nerozvinuli žiadne príznaky EAE.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozícia obsahujúca glatiramer acetát a farmaceutický vhodný nosič, vyznačuj úca sa t ý m , že je vo forme vhodnej na podávanie požitím alebo inhaláciou.
2. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 1, v y z n a í u j ú c a sa tým, že je v pevnej forme, kvapalnej forme alebo vo forme aerosólu alebo inhalačného prášku.
3. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 2, v y z n a č u j ú c a sa t ý m , že je v pevnej forme.
4. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 3, v y značujúca sa tým, že pevná forma je vybavená enterickým povlakom.
5. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov laž 4, vyznačujúca sa tým, že obsahuje glatiramer acetát v množstve 0,1 až 1000 mg.
6. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 1 až 5 na použitie na liečenie roztrúsenej sklerózy.