CZ100596A3

CZ100596A3 - Dna fragment, vector and micro-organism containing genes for metabolic transformation of butyrobetaine/crotonobetaine-l-carnitine and process for preparing l-carnitine

Info

Publication number: CZ100596A3
Application number: CZ961005A
Authority: CZ
Inventors: Thomas Zimmermann; Josef Werlen
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1993-10-08
Filing date: 1994-10-07
Publication date: 1996-10-16
Also published as: CA2173115C; PL313968A1; KR100346293B1; NO961385D0; NO961385L; ATE257515T1; CN1058523C; PL180300B1; JP3708543B2; CN1282791A; FI961537A; CA2173115A1; WO1995010613A1; NO319058B1; US5759824A; HUT74825A; DE59410350D1; HU220798B1; FI118568B; FI961537A0

Description

Oblast techniky £ -i ' wt

Předložený vynález se týká ťekomblnaritního materiálu pro expresi genů látkové přeměny butyrobetain/kroE<Jlre»4 betain-L-karnitinu, mikroorganismů, které obsahují tento rekombinantní genetický materiál a použití takových mikroorganismů při biotechnologickém způsobu přípravy L-karnitinu.

L-karnitin je přírodní látka podobná vitaminu s velkým významem při látkové přeměně u člověka. Podstatný je L-karnitin při zpracování mastných kyselin jako přenosná látka mitochondiální membrány a tím jako přenašeč metabolické energie. Jestliže organismus syntetizuje L-karnitin v nedostatečném množství, musí se nutně dodávat v potravě pro zamezení nedostatečného výskytu. Zejména při výživě malých dětí , které ještě nejsou schopné samostatné biosyntesy L-karnitinu, představuje L-karnitin podstatnou živinu.

Praparáty s L-karnitinem se používají jako aktivní složky farmaceutických produktů. Prospěšné je doplnění L-karnitinem při nedostatku karnitinu a dalších terapeutických indikacích, speciálně při onemocněních srdce. atd.

Dosavadní stav techniky

Biosyntesa L-karnitinu ve výšších organismech je známá, další funkce při látkové přeměně a význam pro látkovou přeměnu jsou předmětem intensivního zkoumání. Vedle sledu reakcí látkové přeměny, který je popsána pro mikroorganismy speciálně rodu Pseudomonas (katalýza -butyrobetainhydroxylasy, Lindstedt a spol., Biochemistry 16, 2181-2188, 1977), tvoří se L-karnitin jako intermediát látkové přeměny určitých mikroorganismů, například Agrobacterium/Rhizobium sp.

Z evropské patentové přihlášky EP-A-0 158 194 je znám způsob mikrobiologické přípravy L-karnitinu, kdy se vychází například z ^-butyrobetai nu. při kterém se získá pomocí tradičních mikrobiologických selekčních postupů negativní produkční mutant L-karnityldehydrogenasy. S tímto mutantera se získají relativně dobré výtěžky L-karnitinu během reakční doby 20 až 30 hodin. Další zlepšení tohoto postupu s ohledem na objem-/čas-výtěžky není však při této klasické mikrobiologické metodě možné.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je tedy poskytnout hospodárný biotechnologický způsob výroby L-karnitinu, při kterém se získá L-karnitin za podstatně kratší reakční dobu s ještě lepšími výtěžky.

Pokusy související s látkovou přeměnou ^-butyrobetain/krobetainu vedly k identifikaci pěti genů. bcaA/B. bcoC. bcoD. bcoE a bcoT. které kódují enzymy reakčního sledu při látkové přeměně $2 -butyrobetain/krotonobetainu a obecně jsou obsaženy v operonu, tzv. butyrobetain-L-karnitinovém operonu Cbco). Zde znamená bcoA/EL gen 9?-butyrobetain-CoA-syntetasyCbcoA)/krotonobetain-CoA-syntetasyCbcoB), tzn. jediný gen. který kóduje enzymový produkt, který má aktivitu jak -butyrobetain-CoA-syntetasy, tak také aktivitu krotonobetain-CoA-syntetasy.

bcoC: gen -butyrobetain-CoA-dehydrogenasy bcoD: gen krotonobetain-CoA-hydrolasy bcoE: gen L-karnityldehydrogenasy a bcoT^: potenciální gen transportního systému.

Zjistilo se. že genové produkty genů bcoA/B, bcoC a bcoD jsou zodpovědné za biosyntesu L-karnitinu. zatímco bcoE kóduje karnitindehydrogenasu, která ovlivňuje odbourání intermediátu látkové přeměny L-karnity 1-CoA na betain. U bcoT se asi jedná o gen. který kóduje přenašečový protein transportního systému patřícího k látkové přeměně butyrobetainu. Tento gen není pro biosyntesu L-karnitinu podstatný.

Předměten předloženého vynálezu jsou fragmenty DNA a vektory, zahrnující jeden nebo více genů bcoC. bcoA/B a bcoD, které kódují enzymy biosyntesy L-karnitinu při látkové přeměně ^-butyrobetain/krotonobetainu a obsahující popřípadě dále potencionální přenašečový gen bcoT.

Předmětem vynálezu jsou dále mikroorganismy, které obsahují tyto fragementy DNA, popřípadě vektory. Dalším předmětem je biotechnologický způsob výroby L-karnitinu za použití mikroorganismů podle vynálezu.

□značení bcoA/B. bcoC. bcoD. bcoE a bcoT. jak jsou zde v popise a v nárocích používána, zahrnují p^dle definice jak geny organismů divokého typu, které kódují enzymy látkové přeměny -butyrobetain/krotonobetain-L-karnitinu s výše uvedenými enzymovými aktivitami, zejména geny operonu butyrobetain-L-karnitinCbco), tak také jejich funkčně ekvivalentní genetické varianty a mutanty, tzn. geny, které se odvozují od genů organismů divokého typu a jejichž genetické produkty jsou v podstatě ve své biologické funkci nezměněné. Funkčně ekvivalentní genetické varianty a mutanty tak zahrnují například záměny baží v rámci známých degenerací genetického kódu, jak mohou být například vytvořeny uměle, aby se genetická sekvence přizpůsobila pro výhodné použití kodonu určitého mikroorganismu, ve kterém se má uskutečnit exprese. Varianty a mutanty dále zahrnují delece, inserce a substituce baží nebo kodonů, dokud ponechají genovým produktům takto změněných genů jejich biologické funkce v podstatě nezměněné. Tím jsou zahrnuty například genové sekvence, které prokazují velkou horaologii k sekvencím divokého typu, například větší než 70 % a za přísných hybridizačních podmínek, například při teplotách mezi 50 a 70 9C a při 0.5 až 1,5 M podílu soli, jsou schopné hybridizace s komplementem sekvence divokého typu.

Pod pojmem transkripční jednotka, jak se zde používá, se rozumí sekvence DNA, ve kterých jsou geny uspořádány v jednom transkripčním směru a při společné kontrole transkripce jsou přepisovány do průběžného transkriptu, přičemž sekvence DNA mají vedle genů ještě genetické kontrolní prvky potřebné pro genovou expresi, jako promotory a vazebná místa ribosomů.

Vynález je blíže objasněn následujícími výkresy.

Obr. 1 ukazuje enzymy* reakčniho sledu látkové přeměny y-butyrobetain- popřípadě krotonobetain-L-karnitinu.

Obr. 2 znázorňuje restrikční mapa 10.6 kb fragmentu DNA z Rhizobiura/Agrobacterium s operonem bco.

Obr. 3 a Obr. 4 znázorňují plasmid pVK 1011 popřípadě pAZlOl; šipky naznačují polohu a orientaci genů bco a genů beu (geny zužitkující betain; EP-A- Q, 543 344). Insertovaná část plasmidů je znázorněna tučně.

Obr. 5 znázorňuje plasmid pCC49 jako možný výchozí materiál pro přípravu hostitelského kmene recA“.

Obr. 6 ukazuje konstrukční schéma pro plasmidy pVKlOll. pAZlOl. pVK 100q a pAZ7.

Obr. 7 ukazuje konstrukční schéma pro hostitelský kmen recft*.

Jako výchozí materiál pro izolaci genů bcoA/B. bcoC. bcoD. a bcoT pro sled reakcí při látkové přeměně ^-butyrobetain/krotonobetain-L-karnitinu mohou sloužit všechny mikrorganismy. které látkově přeměňují butyrobetain a/nebo krotonobetain podle Obr. 1. Příklady vhodných kmenů jsou mikroorganismy rodů Escherichia. Pseudomonas. Agrobac ter i um. Rhizobium a Agrobacterium/ /Rhizobium. přičemž výhodné jsou posledně jmenované. Příkladem výhodného mikroorganismu rodu Agrobacterium/Rhizobium je mikroorganismus druhu Agrobacterium/Rhizobium sp. HK4 (DSM 2938), jak je již popsán v EP-A-0 158 194. Obvzláště výhodně se používají mikroorganismy. které jsou negativní vzhledem ke karnitindehydrogenase. tedy například nemají žádný nebo mají jen defektní gen bcoE (následně označovaný také jako bcoE ). Příklady pro výhodné mikroorganismy s negativní karnitindehydrogenasou jsou mikroorganismy druhu Agrobacterium/Rhizobi um sp. HK 13 (DSM

2903) a HK1331b (DSM 3225). které jsou již popsané v EP-A-0 158 194. nebo druhu Agrobacterium/Rhizobi um sp. HK1349 (DSM 3944), který je popsán v EP-A-0 543 344.

Geny bcoA/B. bcoC. bcoD. a bcoT pro sled reakcí při látkové geny se mohou pak klonovat ných restrikčních enzymů.

mapovat pomocí přeměně ^-butyrobetain/krotonobetain-L-karnitinu mohou být lokalizovány v chromosomu mikroorgansimu. tím že se mikroorganismy podrobí například transposon-inserční mutagenesi a tím se geny látkové přeměny ^-butyrobetain/krotonobetain-L-karnitirtu označí vhodným markérem. například kanamycin-CKm)-rezistencí. Tím se následně mohou Isolovat takto označené mutanty. které již nemohou zužitkovat intermadiáty látkové přeměny butyrobetainu. Takto lze geny látkové přeměny ^-bu ty robe tain/krotonobetain-L^karnltlnu idetiflkovat a přiřadit jim jejich funkci. Označené a blíže charakterizovat pomocí vhodIzolaci intaktních genů, popřípadě fragmentů DNA podle vynálezu lze pak uskutečnit tím. že se vyjde z genové banky odpovídajícího nemutovaného mikroorganismu, že které se mohou geny bco nebo fragmenty z toho známým způsobem izolovat a identifikovat pomocí hybridizace se shora získanými klonovanými geny kmene podrobeného mutagenesi. Získané geny se pak mohou do žádoucích vektorů klonovat a restrikčních enzymů.

Za biosyntesu L-karnltinu jsou zodpovědné jen geny bcoA/B, bcoC a bcoD. Proto je také pro produkci L-karnitinu nutná jen přítomnost těchto genů. V závislosti na zvolených výchozích podmínkách, například na zvoleném výchozím materiálu nebo na zvoleném produkčním kmenu, mohou fragmenty DNA nebo vektory použité při produkci L-karnitinu obsahovat jeden nebo více genů biosyritesy L-karnitinu.

Pokud je to žádoucí, mohou DNA fragmenty a vektory podle vynálezu vedle genů bcoA/B. bcoC a bcoD také zahrnovat potencionální transportní gen bcoT.

Přítomnost genu L-karnityldehydrogenasy. tedy genu bcoE. je nežádoucí, protože v jeho přítomnosti se uskutečňuje odbouráni L-karnitinu. Přítomnost defektního bcoE genu <bcoE ) je však neškodná.

Účelně se nacházejí geny pro biosyntesu L-karniti nutotiž bcoC. bcoA/B a bcoD a popřípadě potenciální transportní gen bcoT. pro použití při výrobě L-karnitinu společně na jednom fragmentu DNA nebo molekule vektoru. Výhodně se nacházejí v konvencioná1ním 5 -3 -směru po směru genověregulačních prvků v pořadí bcoC. bcoA/B a bcoD. popřípadě bcoC. bcoA/B a bcoD a bcoT a v Jediné shora definované transkripční jednotce, odpovídající uspořádání v přírodním operonu butyrobetain-L-karnitinu. Geny bcoC. bcoA/B a bcoD a bcoT takové transkripční jednotky se mohou charakterizovat například odpovídajícími štěpy restrikční mapy Obr. 2.

Transkripce popřípadě exprese genů bco se účelně uskutečňuje pod kontrolou výhodně silného vhodného promotoru. Volba promotoru závisí na žádoucích podmínkách exprese, například na tom, zda je žádoucí konstitutivní nebo indukovaná exprese, nebo závisí na mikroorganismu, ve kterém se má exprese uskutečnit. Vhodným promotorem je například promotor Pbco přírodního operonu butyrobetain-L-karnitinu. Jestliže se uskutečňuje izolace genů bco odpovědných za biosyntesu L-karnitinu například z mikroorganismu s defektním genem bcoE CbcoE ), může se například výhodně z těchto mikroorganismů isolovat a klonovat celý bco-operon s bcoE -genem a příslušnými genověregulačními prvky a pak se použije pro produkci L-karnitinu ve vhodných mikroorganismech. Taková transkripční jednotka s mutovaným bcoE-genem, která se může izolovat například z Rhizobium/Agrobacterium HK1349, se popřípadě rovněž může charakterizovat pomocí restrikční mapy uvedené na Obr. 2, když je defekt v bcoE způsoben například pouze bodovou mutací a netýká se žádného místa štěpení. Dalšími promotory vhodnými pro expresi jsou například promotory Pním , Psi CM. Labes a spol.. Gene, 89, 37-46, 1990), trp-promotor

CAraann a spol.. Gene, 25, 167-178, a spol., Gene, 25, 167-178. 1983) jmenovaných trp- a 1ac-promotorů.

konstitutivní nebo indukovatelný promotor CRussell Gene, 20. 231-243, 1982).

použití při výrobě L-karnitinu ve vhodném produkčním fragmenty DNA podle vynálzu. které zahrnují jmenované bco-geny, výhodně společně v jediné transkripční jednotce, zabudují účelně pomocí známých technik do známých vhodných vektorů, zejména do expresních vektorů, například fágů nebo plasmidů. Jako vektory se mohou použít autonomně a samorep1 i kující vektory nebo také tzv. integrační vektory. Pod integračním vektorem se přitom rozumí vektor, například plasmid. který má alespoň jednu homologní sekvenci ke genoraické sekvenci kmene recipienta

1983), lac-promotor CAraann a tac-promotor , hybrid ze který se může použít jako a Bennett,

Pro kmenu se a pomocí homologové rekombince s touto sekvencí dovolí propašování cizích genů do genomu kmene recipienta. Výhodně se používají autonomně a samoreplikující vektory.

V závislosti na druhu zvolených vektorů se mohou geny pro enzymy biosentesy L-karnitinu exprimovat v různých organismech. Jako vektory se hodí jak vektory se specifickým hostitelským spektrem, tak také vektory se širokým hostitelským spektrem (broad host range) a shora popsané integrační vektory.

Jako vektory broad host range se mohou použít všechny vektory, které jsou vhodné pro gram-negativní bakterie. Příklady takových broad host range- vektorů jsou pVKlOO CKnauf a Nester^ Plasmid. 8. 45-54. 1982), pME285 (Haas a Itoh, Gene. 36. 27-36. 1985) a pTK240 CBagdasarian a spol.. Gene. 26. 273-282. 1983) nebo jejich deriváty. Jako derivát pVKlOO se může například použít pVKlOOl. jako derivát pME285 například pAZlO a jako derivát pKT240 například pL032 Cjak je popsané v EP-á 0 543 344).

V případě Rhizobium/Agrobacterium se jako integrační vektory mohou použít vektory na bázi pACYC184 nebo pBR322 CComai a spol.. Plasmid. 10. 21-30. 1983).

Tímto způsobem se například získaly plasmidy pVKlOOg, pVKlOll CObr. 3). pAZ7. pAZ7beu. pAZlOl CObr. 4) a pL041. Plasmid pVKlOOq byl uložen 16.11.1993 u Německé sbírky pro mikroorganismy a buněčné kultury GmbH, D-38124 Braunschweig, Mascheroderveg lb. v Rhizobium/Agrobacterium HK1349 pod depositním číslem DSM 8726.

Pro přípravu produkčních kmenů pro fermentaci. tzn. kmenů pro výrobu L-karnitinu. se musí DNA fragmenty, popřípadě vektory podle vynálezu vpravit do žádoucích a pro expresi vhodných hostitelských kmenů. Účelně se k tomu mikroorganismy transformují obvyklým a o sobě známým způsobem pomocí vektorů obsahujících fragmenty DNA podle vynálezu. Mikroorganismy mohou pak mít fragment DNA podle vynálezu buď na molekule vektoru nebo integrovaný ve svém chromosomu.

Jako produkční kmeny jsou vhodné všechny mikroorganismy, které jsou schopné z krotonbetai nu a/nebo -butyrobetai nu produkovat L-karnitin a jejichž schopnost obourávat Ckatabolizovat) L-karnitin je úplně nebo částečně zabráněna. Mikroorganismy.

které mají zabráněný kababolismus L-karnitinu. jsou například kmeny. které jsou karnitindehydrogesa-negativní. Jsou to tedy kmeny, ve kterých je karnitindehydrogenasový gen bcoE vyřazen například mutací nebo delecí, a/nebo kmeny, které jsou L,D-karnitinracemasa-negativní a L-karnitindehydratasa-negativní

Vhodné hostitelské kmeny, výhodně kmeny velkou substrátovou a eduktovou tolerancí jsou například mikroorganismy

Pseudomonas, rodů Escherichia, Comamonas výhodné.

Agrobacterium. Rhizobium, a Rhizobium/Agrobacterium, přičemž poslední jsou Mikroorganismy již shora uvedeného druhu

Rhizobium/Agrobacterium sp. KH13. HK1331b a HK1349, jakož i druhu HK1349.4 (jak je popsáno v EP-A-0 543 344) jsou obvzláště výhodné.

Navíc se zjistilo, že se výtěžek L-karnitinu může ještě zlepšit, jestliže se schopnost rekombinace hostitelského kmene, tedy jeho rekombinační tendence a frekvence je snížena. Tím se omezí rekombinace s vektorem na základě chromosomální homologie. Rekombinační schopnost hostitelského kmene se může snížit například známým způsobem cílenou mutací jeho recA-genu (rec-mutace). Obvzláště výhodné mikroorganismy se sníženou rekombinační schopností jsou mikroorganismy druhu

Rhizobium/Agrobacterium sp. například kmeny podle vynálezu získané jak je dále popsáno druhu

HK1349.49.

Rhizobium/Agrobacterium

Vhodnými produkčními kmeny jsou tak například mikroorganismy druhu Rhizobium/Agrobacterium HK1349, HK1349.4 a HK1349.49, které právě obsahují plasmid pVKlOOq, pVKlOOl, pAZ7, pAZ7=:beu, pAZlOl nebo pL041.

Isolace transformovaných hostitelských kmenů (produkčních kmenů) se může uskutečnit ze selektivního živného media, ke kterému se přidá antibiotikum, vůči kterému jsou kmeny resistentní, pomocí markerového genu na vektoru nebo fragmentu DNA. Jestliže se jako produkční kmeny použijí mikroorganismy podle EP-A-0 543 344, tzn. mikroorganismy, které jsou ve svém chromosomálním genu, který kóduje zužitkování betainu. mutovány a transformovány plasmidem, který obsahuje gen kódující zužitkování betainu. může se provádět selekce také vzhledem k zužitkování betainu. Příklady raikroorgansimů schopných selekce vzhledem k zužitkování ^-butyrobetainu v přítomnosti Jako zdroj uhlíku a dusíku betainu jsou již zmíněné HK1349.4 a HK1349.49, které například obsahují plasmid pL041. pAZlOl, pAZ7·beu nebo pVKlOll.

Biotechnologická příprava L-karnitinu se uskuteční za použití mikroorganismů, které obsahují fragmenty DNA, popřípadě vektory podle vynálezu. Způsob přípravy L-karnitinu se uskuteční o sobě známými postupy, například jak jsou popsané v EP-A-0 158 194, kdy se vychází například z vhodného zdroje uhlíku a dusíku, se mohou použít například glutamat, acetat betain, nebo glycerin a betain. Jestliže se biotechnologická příprava provádí pomocí mikroorganismů selekciovatelných vzhledem k zužitkování betainu, použije se betain jako jediný zdroj dusíku.

Fermentace a následná Izolace L-karnitinu se může uskutečnit způsobem podobným jako je popsán v EP-A-0 15B 194.

Obměnou živin v médiu a přizpůsobením fermentačních podmínek obvyklým způsobem na právě použitý mikroorganismus se může dále zvýšit výtěžek L-karnitinu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba trabsposon-inserčních rautantů CTn5) a jejich fenotypická identif ikace

158

Divoký kmen Rhizobium-ZAgrobacterium HK4 CDSM 2938, EP-B-0 194) se přiměje selekčním tlakem k vyvinutí spontánrtí resistence k streptomycinu CSm, 1000 byla stabilní prokazatelně pres 50 použila se jako markér.

0,2 ml Tn5-donorové kultury z EL Simon a spol., Biotechnology, 1983. 1, ml recipientově kultury HK4 a odstředí.

roztoku NaCl a resuspendují v 100 Konjugace recipientového kmene s donorovým přes noc při 30 °C na suchém živném agaru.

zředěních rozprostřely na selekční médium pro recipient CSm^B) a transposon Cneomycinová resistence Nm^B)).

ugZml). Tato resistence generací bez selekce a coli S17-l/pSUP2021 CR 784-790) se smíchají s 2 Buňky se promyjí v 0,9 % ul 0.9 % roztoku NaCl kmenem se uskuteční Sebrané buňky se ve

Získají se Tn5-mutanty na živném agaru s Sm <1000 jug/ml) a Nm <100 pg/ml). Fenotypická indetlfikace mutantů se uskuteční pomocí průkazu nezužitkování intermediátů látkové přeměny butyrobetainu podle Obr. í jako zdroje uhlíku v minimálním médiu.

Příklad 2

Klonování Tn5-značených fragmenty DNA z HK4-genorau

Isolovaná genomická DNA z Tn5-mutovaného HK4 <5 pg) se úplně štěpí pomocí EcoRI <4 U/pg. U znamená jednotku). pBR325 <2.5 ug) <Gene, 1977. 2. 95-113) se po úplném štěpení s EcoRI zpracuje s alkalickou fosfatasou. Po smíchání genomické DNA a pBR325 s T4-DNA-1igasou <0.2 U/pg DNA) ve 400 pl ligačního pufru <20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM DTT <dithiothreitol). 10 mM MgCl₂, 0.6 mM ATP) a inkubaci přes noc při 12 °C se získají hybridní plasmidyAlikvotní části ligační směsi se použijí pro transformaci <Cohen a spol.. 1972, PNAS 69. 2110-2114) E.coli ED 8654 <Barek a spol.. Mol. Gen. Genet., 146, 199-207. 1976). Transformanty se podrobí selekci na živném médiu na resistenci k ampicilinu <Ap, 100 pg/ml) a kanamycin <Km, 25 pg/ml). Všechny selekcionované hybridní plasmidy mají HK4-insert, který je označen Tn5. Inserty se mapují pro různé restrikční enzymy podle restrikční mapy na Obr. 2. Srovnání restrikčních map doložila transposonovou inserci ve stejném genomickém fragmentu u řady Tn5-mutantfl s rozdílným fenotypem.

Potvrzení tohoto pozorování lze získat pomocí Southern Blot-hybridisace (Gentechnische Methoden, vydané S. Bertramem a H.G. Gassenem, nakladatelství G. Fischer 1991, 219 a další) identicky štěpené plasmidové DNA a následující elektroforetickým rozdělením. Jako sondy slouží subfragmenty této klonované DNA z transposonrautantů.

Příklad 3

Vytvoření genomické HK4-genové banky v lambda-fázích

DNA potřebuje být velká 40 - 52 kb a místo cos-slte”, aby mohla být sbalena do lambda-fágů. Pro vytvoření genomické HK4-genové banky v lambda-fázích se použije cosmidvektor pVKlOO CKnauf a Nester, 1982. Plasmid 8. 45-54). který je velký 23 kb a tím dovolí klonování fragmentů DNA mezi 17-29 kb.

pVKlOO se štěpí s EcoRI. defosforyluje a líguje s HK4-DNA. která je částečně rozštěpena s EcoRI. Ideální koncentrace Eco-RI pro parciální štěpení HK4-DNA se zjistila pomocí testu štěpení jal-p 0,58 U/pg DNA, popřípadě 0,02 Ιί/μΐ reakční směsi, přičemž se použilo 8.5 ug HK4-DNA v reakční směsi. Fragmenty DNA se v rozsahu velikostí větším než 17 kb isolují z elektroforětických agarosových gelů. Ligace se uskuteční v 10 μΐ objemu s obsahem 100 ng cosmid-vektoru a 400 ng passenger-DNA. Pak se uskuteční Tn vřtro-Packing podle návodu výrobce v mixu firmy Promega Biotec. během 2 hod. při 25 °C. Po transfekci E. coli S17-1 se podrobí selekci na Km-resistenci cosmid-vektoru. Jedním, nasazení se získá ca. 5500 kolonií Cindividuální klony). Kolonié genové banky se uchovávají v 5 batches po ca. 1000 klonů v mrazícím médiu CNutrient Yeast Broth Ckvasinkové živné prostředí). NYB, Oxoid a 50 % glycerin) při -70 °C. Amplifikace genové banky se uskuteční s vždy 50 μΐ těchto batches v 10 ml NYB-kultury přes noc a porcováním.

Příklad 4

Screening genové banky HK4-cosmid, Identifikace cosmidových klonů nesoucích bco-geny přes hybridisaci kolonií, hybridisace dot-blotting nebo přímá kompleraentace na HK-mutantech

Jako sondy hybridisace se mohou přímo použít klonované Tn5 značené fragmenty DNA.

Klony s odpovídajícími sekvencemi DNA ukazují hybridlsačni signály a vedou ke komplementaci právě defektního genu v HK4-mutantu. Křížové hybridisace DNA z různých mutantů dokládají nahromadění více genů látkové přeměny butyrobetai nu na fragmentu DNA o 10.6 kb (Obr. 2).

Hybridisace kolonií se provádí obvyklým způsobem CS. Bertram a H.G. Gassen. 1991, tamtéž. 221 a další). Dot-blotting se rovněž provádí známým způsobem <S. Bertram a H.G. Gassen, 1991, tamtéž, 217 a další).

Příklad 5

Komplementace HK-mutantů

Po přesné lokalizaci jednotlivých genů látkové přeměny butyrobetainu s ohledem na molekulární velikosti na základě indetifikovaných peptidových řetězců se mohla docílit komplementace jednotlivých mutantů pomocí právě se vyskytujících genových štěpů.

Právě expresní plasmid pVKlOO::HK-DNA se vpraví konjugací z E.coli S17-1 do kmenů Rhizobium-ZAgrobacterium sp. HK4 podle příkladu 1, které mají mutace pro rozdílné kroky látkové přeměny íviz Obr. 1). Selekce se uskuteční vůči prolinové <pro)-auxotrof i i donoru a na resistenci vektoru na antibiotika <Km^RTc Ctetracyklin)^R).

Příklad 6

6.1 Klonování bco-fragmentu z kmene HK1349 CDSM 3944) a potomků

Pro dosažení genově-dávkových účinků a zvýšení produktivity na produkčním kmenu se klonuje bco-operon z HK 1349 CDSM 3944, EP-A-0 543 344). V tomto kmeni je celý bco-operon úplně obsažený. avšak první gen, bcoE, pro karnitin-CoA-dehydrogenasu je mutován. Fragment DNA získaný z tohoto kmenu s bco-operonem je tím ideální pro zvyšování produktivity z důvodu velkého počtu kopií expresních vektorů.

Klonování se uskutečnila známým způsobem v E.coli S17-1 podle příkladu 3 EP-A-0 543 344. K tomuto účelu se izoluje bco-operon 10,6 kb velký z genové banky HK1349 a ligu je do pVKlOO. Z toho vznikne plasmid pVKlOOq Cviz konstrukční schéma podle Obr. 6). Selekce se uskuteční v E.co 1 i S17-1 na NYB Km <25 pg/ml). Identifikace správného insertu se daří na HK-mutantech podle metody popsané v příkladě 5. DNA z HK1349 štěpená EcoRI se rozdělí elektroforeticky a z gelu se isolují fragmenty v rozmezí velikosti 10,6 kb. Isolované fragmenty se ligují do pVKlOO štěpeném v EcoRI.

Touto směsí hybridních plasmidů se transformuje E.coli S17-1 Cprolin-auxotrofní) a podrobí selekci na živném agaru Km <25 pg/ml). Identifikování správného klonu hybridního plasmidů ž vektoru a fragmentu DNA 10,6 kb nesoucího bco-operon se docílí pomocí patch-mating na trávníku butyrobetain-CoA-syntetasa-negativním mutantu <HK4V4) na minimálním médiu s 0,2 % <hmotnost/objera) butyrobetainu jako zdroje uhlíku a dusíku^ Správný klon je sto po takovém konjugativním přenosu do mutantu komplementovat buňky v zužitkování tohoto zdroje uhlíku. Takto identifikovaný klon pVKlOOq slouží přímo jako produkční plasmid nebo jako rezervoár fragmentu DNA s bco-operonera pro další subklonování.

6.2 Vytvoření pAZlOl, pAZ7 , pVKlOll a pVKlOOq, pL041 a pAZ Ujeu pAZlOl, pAZ7, pVKlOll a pVKlOOq se uskuteční vytvoření na Obr. 6. Při vytvoření pL041 se <EP-A-0 543 344) a použije se inserce bco-genů Při vytvoření plasmidů 6) a použije se inserce EP-A-0 543 344). PoužiVytvoření podle schématu vychází z pL032 <10,6 kb velký fragment EcoRI/EcoRI). pAZ7 — beu se vychází z pAZ7 <0br. beu-genfl <3 kb velký fragment Pstl/Pstl jí se odpovídající restrikční enzymy s 3-5 U/pg DNA podle údajů výrobců. Plasmid pVKlOOq se získá insercí bco-genů do pVKlOQ (Knauf a Nester, tamtéž). Výchozí plasmid PVKlOOsl (schéma vyá tvoření Obr. 6) se získá EcoRI-delečními klonováními plasmidů pVKlOOs <EP-A-0 543 344).

Příklad 7

Vpravení recA-mutace do HK1349.4

7.1 Identifikace klonu genové banky kódujícího recA

Pomocí metody hybrldizace kolonií Gassen, 1991. tamtéž. 221 a další) <S. Bertram a H.G. se zkoumá genomická

HK4-cosmid-genová banka na recA-kodu j fc í klony. Jako sonda pro hybridizaci slouží klonovaný rec-gen z Rhizobium leguminosarum <V. Selbitschka a spol., Mol. Gen. Genet., 299, 1991, 86-95). Označený cosmidklon se isoluje a EcoRI-DNA-insertfragmenty získané po štěpení EcoRI se zkoumají pomocí Southern Blot-hybridizace vůči recft-sondě <S. Bertram a H.G. Gassen, 1991, tamtéž, 219 a další) na recA-homologní sekvence. Takto označený EcoRI-fragment se ligu je do stejně štěpeného vektoru pVKlOO. Se vzniklým hybridním plasmidem pVKlOOrl se pro namnožení DNA transformují buňky E.col1 S17-1.

7.2 Vpravení genu pro kanamycin-resistenci do HK1349.4 pro inaktivaci chromosomálního recA-genu

EcoRI-fragment 11,0 kb velký se preklonuje z pVKlOOrl do pACYC184 CA.C.Y. Chang a S.N. Cohen, J. Bacteriol., 134, 1978, 1141-1156), který byl štěpen EcoRI.

Podle zjištěné restrikční mapy se klonuje štěpený BglII-NruI subfragment velký 3,1 kb, který se při Southern Blot-hybridizaci označil vůči recA-sondě, do vektoru pWS233, štěpený BamHI-HindlII. pVS233 je gene replacement” vektor (vektor výměny genů) a je popsaný autory V. Selbitschka a spol., Appl. Mlcrobiol. Biotechnol. 38, 1993. 615-618.

Do místa štěpení Xhol výsledného plasraidu pCC45 se vklonuje fragment Xhol-DNA z Tn5 <pSUP2021, R. Simon a spol., Blotechnology, 1. 1983, tamtéž), který kóduje Km-resistenci. Z toho vznikne pCC49. Podle postupu V. Selbitschka a spol., 1993 tamtéž, se uskuteční gene replacement následovně:

ml exponenciální kultury HK1349.4 se dají dohromady s 1 ml exponenciální donorové kultury <S17-l/pCC49), odstředí a promyjí s 0.9 % roztokem NaCI. Buňky se inkubují v 50 μΐ NYB na živném agaru pres noc při 30 °C. Pak se buňky resuspendované v 0,9 % roztoku NaCI nanesou na selektivní média ve vhodném zředění. Získají se transkonjugáty Sra-resistentního recipientu HK1349.4 na živném agaru s Sm <1000 ug/ml) a Nm <150 ug/ml) a ty vykazují sensitivitu k 5 % sacharose v komplexním médiu což odpovídá genům sacRB na replacement vektoru.

Získají se dvojnásobné rekombinace po kultivaci selekciovaných transkonjugátů bez selekčního tlaku na živném agaru s malou frekvencí (10^-8): Po ca. 1 týdnu se mohou isolovat buňky. které tolerují 5 % sacharosu v médiu, zůstaly Nm-resistentní. ale opět se staly gentamycin (Gm)-sensitivní (vektorový markér).

Tento fenotyp potvrzuje alelovou markerovou výměnu á ukazuje na recfl-mutaci v HK1349.4. Je pozorovatelný typický fenotyp (např. UV-sensitivita atd.) recfl-mutantfl.

V takto získaném kmeni HK1349.49 je výrazně snížená tendence chromosomální integrace plasmidů s ^homologními sekvencemi (homologová rekombinace). Kmen je proto vhodným hostitelem pro hybridní plasmidy připravené v příkladu 6.2.

Příklad 8

Biotransformace

Biotransformace se provádí v trepacích baňkách (100 ml) s bezdusíkatým minimálním médiem (MM, Kulla a spol.. Arch. Microbiol., 1983. 135, str. 1-7). které obsahuje 0.2 % (hmotnost/objem) -butyrobetalnu (edukt) a jako zdroj uhlíků 0.4 % (hmotnost/objem) glycerinu. Jako zdroj dusíku a dodatkový zdroj uhlíku se přidá 0,2 % (hmotnost/objem) L-glutamatu (u negativních kmenů pro zužitkování betainu) nebo 0.2 % (hmotnost/objem) betainu.

Jako produkční kemny se použijí kmeny podle vynálezu. HK1349.4/_PL041. HK1349.4/pVK1011. HK1349.4/pAZ7-· : beu. HK1349.4/ /pAZlOl. HK1349/pVK100q a HK1349/pAZ7.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1 ve srovnání s HK13-potomky HK1349 (DSM 3944) a HK1349.4. které jsou známé z EP-A-0 543 344.

Tvorba L-karnitinu z -butyrobetainu se stanoví pomocí DTNB (5-5 -dithiobis-(2-nitrobenzoat)-metody popsané Bergmeyerem (H.K.Bergmeyer. 1974. Methoden der enzymatischen Analyse, nakladatelství Chemie. Weinheim. 1810 a další).

Kmeny	1 \|Médium	i Spec. aktivita
	JMM & glycerin	mmol/l/h/OD j
HK1349 Cne podle vynálezu)	i \|& betain	0,24 i
HK1349/pVK 100q	\|& betain	0,36 \|
HK1349/pAZ	\|& betain I	0,49 j »
HK1349 Cne podle vynálezu)	1 ,& L-glutamat	1 0,14 j
HK1349.4 Cne podle vynálezu)	\|& L-glutamat	o.ii. I
HK1349.4/pL041	\|& L-glutamat !	0,29 \| • i
HK1349.4 Cne podle vynálezu)	& amonium	1 0,12 \|
HK1349.4/pVK1011	& betain	0,54 \|
HK1349.4/pAZ7:-beu	& beta in	0,47 i
HK1349.4/pAZ101	& betain	1,08

JA.L□ IN lSVI*. □ Η3ΛΠ', 3 ' .'i avy o

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Isolovaný fragment DNA obsahující jeden nebo

I víc^

9 6 |ίΙΛ ;s L οΐξοα

K gen bcoA/B a bcoD biosyntesy L-karnitinu, které kódují ^-butyrobetain-CoA-dehydrogenasu (bcoC), -butyrobetain/krotonobetain-CoA-syntetasu (bcoA/B). popřípadě krotonobetain-CoA-hydrolasu (bcoD), přičemž je tento fragment DNA zvolen %

a) z 10,6 kb-EcoRI-fragmentu jak je inserován v plasmidu pVKlOOq, uloženém v Rhizobium/Agrobacterium HK1349 .pod deposltním číslem DSM 8726, nebo subfragmentů z toho: a

b) z fragmentů, které hybridisují s tímto 10,6 kb-EcoRI-fragmentem nebo se subragmenty z toho a kódují enzymy s aktivitami $-butyrobetain-CoA-dehydrogenasy, -butyrobetain//krotonobetain-CoA-syntetasy, a/nebo krotonobetain-CoAhydrolasy.
2. Fragment DNA podle nároku 1 dodatečně obsahující gen bcoT přirazený pro látkovou přeměnu P^-butyrobetainu/krotonobetainu který kóduje potencionální transportní protein.
3. Fragment DNA podle některého z nároků 1 a 2, bcoC. bcoA/B. bcoD a popřípadě bcoT odvozují z rodů Escherichia. Pseudomonas, Agrobac ter1 um

Rhizoblum/ Agrobacter i um.

v němž se gen mikroorganism Rhizobium
4. Fragment DNA podle některého z nároků 1 až 3, v němž jsou geny operativně spojeny s genetickými kontrolními prvky potřebnými pro expresi.
5. Fragment DNA podle některého z nároků 1 až 4, v němž jsou geny biosyntesy L-karnitinu uspořádány v poradí bcoC, bcoA/B a bcoD nebo, popřípadě, bcoC. bcoA/B. bcoD a bcoT a jsou .jako jediná transkripční jednotka.
6. Fragment DNA podle některého z nároků 4 a 5. v němž genověregulaění prvek obsahuje promotor přírodního bco-operonu. Pbco
7. Fragment DNA podle některého z nároků 1 až 6. v němž jsou geny bcoC. bcoA/B. bcoD a bcoT charakterizovány následující restrikční mapou:

bcoC bcoA/B bcoD bcoT
8. Vektor, obsahující fragment DNA podle některého z nároků 1 až 7.

199. Vektor podle nároku 8. totiž plasmid pVKlOOq, jak je uložen Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 pod depositním číslem DSM 87 plasmid pVKlOll, jak je charakterizován restrikční mapou pod Obr. 3. a plasmid pAZlOl, jak je charakterizován restrikč mapou podle Obr. 4.

. v

26.

le ní
10. Rekombinantní mikroorganismus obsahující fragment DNA nebo vektor podle některého z nároků 1 až 9.
11. Mikroorganismus podle nároku 10. vyznačující se tím. že je jeho schopnost katabolisovat L-karnitin úplně nebo částečně omezena.
12. Mikroorganismus podle některého z nároků 10 a 11. vyznačující se tím. že je jeho schopnost rekomblnace snížena.
13. Mikroorganismus podle některého z nároků 10 až 12 vybraný’ z mikrorganismů rodů Escher ichia. Pseudomonas. flgrobacter i um.

Rhizobi um. Comamonas a Rhizobium/Agrobacterium.
14. Mikroorganismu Rhizobium/Agrobacterium HK 1349 obsahující plasmid pVKlOOq, jak je uložen pod depozitním Číslem DSM 8726. plasmid pVKlOll. jak je charakterizován restrikční mapou podle

I

Obr. 3, nebo plasmid pAZlOl. jak je charakterizován restrikční mapou podle Obr. 4, jakož i z takových mikroorganismů odvozené genetické varianty a mutanty se schopností k biosyntese L-karnitinu.
15. Mikroorganismu Rhizobium/Agrobacterium HK 1349.4 obsahující plasmid pVKlOOq, jak je uložen v Rh i zob i um/Aqrobac ter i um HK 1349 pod depositním číslem 8726, plasmid pVKlOll. jak je charakterizován restrikční mapou podle Obr. 3, nebo plasmid pAZlOl, jak je charakterizován restrikční mapou podle Obr. 4. jakož i z takových mikroorganismů odvozené genetické varianty:a mutanty se schopností k biosyntese L-karnitinu.
16. Způsob biotechnologické výroby L-karnitinu. vyznačující se tím, že se krotonbetain a/nebo ,^-butyrobetaln v přítomnosti vhodného zdroje uhlíku a dusíku fermentuje pomocí mikroorganismu podle některého z nároků 10 až 15 a L-karnitin se isoluje.

1/7

Fig. 1

Sled reakcí látkové přeměny pro butyrobetain

Butyrobetain bcoA Enzym: y-Butyro- atp.hscoa betain-CoAsynthetasa

Crotonobetain