CS276374B6 - Myší lymfocytární hybridóm TSH-116, produkující monoklonální protilátku třídy IgG2a proti lidskému thyreostimulačnímu hormonu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfooytárního hybridómu TSH-116, produkujícího protilátku třídy TgG2a proti lidskému thyreostimulačnímu hormonu. Samotná monoklonální protilátka hyhridomu TSH-116 je vhodná pro senzitivní a specifickou detekci hladiny thyreostimulačního hormonu metodou imunoradiometrické analýzy a příbuzných metod.

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridního jednobuněčného organismu, sestrojeného buněčnou fúzí myší myelomové linie P3-X63-Ag8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti lidskému thyreostimulačnímu hormonu (TSH).

Dosud se protilátky proti 'thy.restimulačnímu hormonu vyrábějí tak, že je thyreostimulační hormon (TSH) opakovaně injikován (zpravidla spolu s adjuvans) pokusným zvířatům, nejčastěji králíkům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebrané po určité době působení antigénu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro stanovení hladiny thyreostimulačního hormonu v séru metodou radioimunoanalýzy (RIA). Tento postup nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé né a neopakovatelné. Výrobní šarže konvenčních antisér se proto dají jen velmi nesnadno standardizovat a vycházejí z výroby v širokém rozmezí kvality. Jednotlivé protilátky antiséra jsou namířeny proti různým aňtigenním determinantám na povrchu molekuly antigénu takže jsou obtížně použitelné v systému imunoradiometrické analýzy (IRMA), který je citlivější než systém radioimunoanalýzy (RIA).

Pro výrobu každé šarže je třeba připravit značně čistý imunizační antigen, který je izolován náročnými technikami z lidských hypofýz.

V ČSFR byly připraveny lymfocytární hybridomy produkující protilátky proti thyreostimulačnímu hormonu. Tyto protilátky však mají příliš nízkou asociační konstantu a proto nejsou použitelné pro imunoradiometrické stanovení hladiny thyreostimulačního hormonu v tělesných tekutinách s dostatečnou citlivostí. Ve světové literatuře jsou popsány hybridomy produkující protilátky proti thyreostimulačnímu hormonu s dostatečnou afinitou.

Rozšíření jejich palety však umožňuje další výhodnější vzájemné kombinace vhodné ke stanovení thyreotropního hormonu například metodou imunoradiometrické analýzy.

Paletu monoklonálních protilátek proti lidskému thyreostimulačnímu hormonu rozšiřuje hybridom, uložený ve sbírce hybridomů Vědeckého střediska pro hormonální proteiny a peptidy lékařdské fakulty University Karlovy v Hradci Králové, Šimkova 870, pod označením TSH-116.

Uvedený hybridom byl získán způsobem známým z odborné literatury (Campbell, A.M.: Monoclonal antibody technology, Elsevier, 1984, Coding, J.W.: Monoclonal antibodies: Principles and practice, Second ed., Academic Press, 1986) klonováním souboru hybrids nich buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie PJěXĎJTAgS.653 a buněk, získaných ze sleziny myší kmene BALB/c, imunizovaných lidským thyreostimulačním hormonem izolovar ným z hypofýz'.

Výhodou lymfocytárního hybridomu TSH-116 je, že produkuje zcela homogenní protilátku, tzv. protilátku monoklonální, která specificky reaguje s jedinou antigenní determinantou na molekule lidského thyreostimulačního hormonu a má vysokou afinitu. Hybrid dom TSH-116 je možno kultivovat in vitro v médiích vhodných pro pěstování živočišných buněk nebo v podmínkách in vivo v peritoneální dutině myší BALB/c. Hybridom TSHslie je vhodný k dlouhodobému uchovávání v konzervách uložených v kapalném dusíku. Produkci monoklonální protilátky je možno zahájit po rozmražení konzervy, aniž by bylo třeba dalšího antigénu. Protilátka produkovaná hybridomem TSH. 116 je schopna vázat se na molekulu antigénu současně s protilátkami TSH-51 i TSH-61, což je nezbytnou podmínkou

CS 276374 Ββ konstrukce systému imunoradiometrické analýzy (IRMA). Asociační konstanta monoklonální protilátky TSH^-lló byla určena za použití systému radioimunpanalýzy s druhou protilátkou tak, Že byla zjišťována vazba snižující se koncentrace mezinárodního standardu thyr reostimulačního hormonu IRP 80/558 s přídavkem značeného hormonu (traceru). Nejprve bylo přidáno ke 100 mIU/L IRP 80/550 takové množství traceru, aby bylo dosaženo aktivity 100 000 cpm. Při stanovení byl použit tento materiál a řada 8 dvojnásobných ředění. Při výpočtu asociační konstanty byla zahrnuta i koncentrace traceru zjištěná metodou vnitřního standardu. Na základě těchto měření byla zjištěna vysoká asociační konstanta 1,1 x x 10¹¹ 1/mol.

Protilátka produkovaná hybridomem TSH-116 umožňuje konstrukci systému imunoradiometrické analýzy (IRMA) pro stanovení hladin thyreostimulačního hormonu v tělesných tekutinách s vysokou citlivostí. Je to umožněno její neobvykle vysokou asociační konstantou a tím, že reaguje s odlišnými antigenními determinantami než protilátky produkované hybridomy TSH-51 a T5H-61. Nízký detekční limit eseje umožní určit i snížené hladiny thyreostimulačního hormonu v lidském séru, což je významně pro diagnostiku funkčních poruch štítné žlázy.

Příklad

Pro pomnožení buněk hybridomu in vivo bylo aplikováno 1 x 10$ buněk do peritoneální dutiny myší kmene BAtB/c.Pro lepší uchycení injikovaných buněk byla myš týden před přenosem hybridomových buněk ovlivněna parafinovým olejem,(0,5 ml intraperitoneálňě). Po 17 dnech růstu hybridomu byla odebrána ascitická tekutina a tento odběr byl opakován ob den třikrát. Celkem bylo získáno 13 ml ascitické tekutiny, která obsahovala 7 mg/ml imunoglobulinu. Z této ascitické tekutiny byla izolována čistá monoklonální protilátka chromatografií na komplexu protein-A-Sepharose CL 4B, roztok převeden dialýzou do 0,01 M natrium fosfátového pufru, pH 7,4 a zďi uštěn ultrafiltrací na koncentraci 1 mg/ml. 10 ul tohoto roztoku bylo označeno radioaktivním jodem takto: 10 ul roztoku protilátky 125 bylo smíseno s 10 ul roztoku izotopu jodu I o aktivitě 0,25 mCi a bylo přidáno 5 ul chloraminu T o koncentraci 1 mg/ml. Po inkubaci po dobu 30 s byla reakce ukončena přidáním 10 ul nasyceného roztoku tyrozinu ve vodě. Reakční směs byla potom přenesena 1 ml pufru s obsahem 0,1 % hmot, bovinního sérového albuminu na kolonu PD-10 Sephadex G-25 Medium a čištěna chromatograficky. Jodovaná monoklonální protilátka produkovaná hybridomem TSH-116 byla použita v systému imunoradiometrické analýzy (IRMA). Do zkumavek se zakotvenou protilátkou produkovanou hybridomem TSH-51 na pevné fázi, bylo pipetováno 200 ul standardů o známé koncentraci thyreostimulačního hormonu nebo vyšetřovaného vzorku, po 1 hodině třepání při pokojové teplotě byl materiál odsát, zkumavka jednou propláchnutá fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS), pH 7,5 a v dalším kroku bylo pipetováno 200 ul roztoku jodované monoklonální protilátky produkované hybridomem TSH-116 v pufru PBS, pH 7,5 s přídavkem albuminu 5 ?ó hmot. Koncentrace značené protilátky produkované hybridomem TSH-116 byla připravena tak, aby poče.t impulzů byl 60 000 za minutu v objemu 200 ul. Po inkubaci přes noc byly zkumavky po odsátí dvakrát promyty pufrem PBS, pH 7,5 a zakotvená radioaktivita měřena na gamapočítači. Výsledky zjištěné se standardy ó známé koncentraci shrnuje kalibrační křivka na obr. 1. Přerušovaná čára udává absolutní počet impulzů značené protilátky vázaných na pevnou fázi, plná čára počet impulzů po odečtení nespecifické vazby nulového vzorku (blanku). Průměrné hodnoty blanku při měření 20 zkumavek a pásmo 2 směrodatných odchylek nad tímto průměrem jsou znázorněny šrafovaným pásem. Radioaktivita odpovídající kalibračnímu bodu 0,05 mIU/1 je na horní hranici tohoto pásma a představuje tak detěkční limit eseje.

CS 276374 Bó

Dále bylo zjišťováno, jaké hodnoty budou v tomto systému imunoradiometrické analýzy (IRMA) zjištěny při použití roztoků dalších hormonů o známé koncentraci a tento přídavek jiných hormonů ovlivní výsledek stanovení hladiny thyreostimulačního hormonu. Výsledky jsou shrunuty v tabulce č. 1. Systém imunoradiometrické analýzy nebýl ovlivněn použitými koncentracemi lidského choriového gonadotropinu a prolaktinu, jedině mezinárodní standard LH IRP 68/40 v koncentraci 160 IU/1 vykazoval odečitatelnou hodnotu thyreostimulačního hormonu (0,09mIU/1). Standard však obsahuje podle údajů 0,1 mlU thyreostimulačního hormonu na 77 IU luteinizačního hormonu, tj. 0,129 % celkového množství luteinizačního hormonu a stanovená hodnota tak odpovídá přítomnosti thyreostimulačního hormonu ve standardu.

Buňky hybridomu TSH-116 mají morfologioký charakter typických myelomových buněk. V podmínkách in vitro rostou v podobě polosuspenzních kultur. Základním kultivačním médiem je Dulbeccova modifikace minimálního esendiálního média (DMEM) doplněná L-glutaminem (2 nM), penicilinem, streptomycinem a inaktivovaným telecím fet álním sérem (10 %). Hybridom je kultivován při 37 °C v atmosféře 5 obj. % kysličníku uhličitého a jeho střední generační čas je 20 hodin. Modální počet chromozomů za 6 měsíců po ustavení byl 88. Produkovaná protilátka je myší monoklonální imunoglobulin třídy IgG2a, vážící lidskýc thyreostimulační hormon s vysokou afinitou (asociační konstanta v systému radioimunoanalýzy je 1,1 x 10^ 1/mol).

Monoklonální protilátka, produkovaná hybridomem TSH-116 je použitelná pro vysoce sensitivní a striktně specifické stanovení koncentrace thyreostimulačního hormonu v lidském séru metodou radioimunoanalýzy a příbuznými imunochemickými technikami. Uplatní se při výrobě kitů pro účely funkční diagnostiky onemocnění štítné žlázy v lékařství.

TABULKA č..1

Standard	Stanovená hodnota TSH mIU/1
HCG 10 000 IU/1 -- + 2 mIU/1 TSH -- + 16 mIU/1 TSH LH 160 IU/1	méně než 0,05 , 2,0 16,0 0,09
t- + 2 mIU/1 .TSH	2,1
-- + 16 mIU/1 TSH PRL 200 ng/ml + 30 mIU/1 TSH	16,0 méně než 0,05 30,0

Použité zkratky: HCG - lidský choriový gonadotropin LH - luteinizační hormon PRL - prolaktin

Claims (1)

1. 9 PATENTOVÉ NÁROKY

   Myší lymfocytární hybridom TSH-116 produkující monoklonální protilátku třídy ?ϊ IgG2a proti lidskému thyreostimulačnímu hormonu.