CS266008B1 - Myii lymfocytární hybridom produkující protilátky proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká myšího lymfocytárního hybridomu produkujícího protilátku proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu (HCG), který je uložen ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV pod označením IMG CZAS H-4D6. Samotná monoklonální protilátka je vhodná pro výrobu nových diagnostických souprav pro časnou diagnostiku gravidity .

Description

Vynález se týká nového hybridomu, tj. hybridní buněčné linie, která byla sestrojena fúzí buněk myelomové linie SP2/0 a myších slezinových buněk produkujících protilátky proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu (HCG). Tento hormon je prokazatelný v krvi a v moči těhotných žen a zcela chybí u netěhotných. Jeho výskyt v organismu začíná po implantaci oplozeného vajíčka (okolo 8 dne po ovulaci) a koncentrace HCG pak prudce stoupá. Na průkazu přítomnosti HCG v organismu jsou založeny diagnostické testy na těhotenství.

Potřeba časné a spolehlivé diagnostiky těhotenství vyvstává nyní zvláště v souvislosti se zaváděním miniinterupcí, jejichž provedení je vázáno na první týdny po početí. S tím také vzrůstávají požadavky na zvýšení citlivosti a spolehlivosti diagnostického testu.

Dosavadní diagnostické testy využívají imunologické reakce konvenčních antisér připravených imunizací králíků purifikovaným HCG. Sérum imunizovaných zvířat je zdrojem protilátek pro imunologické testy. Nevýhodou přípravy těchto konvenčních antisér je požadavek na vysoce purifikovaný hormon pro jejich přípravu a jednotlivé šarše antisér se liší svou aktivitou a obsahují značné heterogenní směs protilátek. Je známo, že HCG a další podobné hormony (LH, FSH) mají vysokou podobnost svého alfa řetězce a části beta řetězce, a proto polyvalentní konvenční protilátky proti HCG reagují i s těmito hormony. Z důvodů určité basální koncentrace LH i u netěhotných žen aglutinační testy využívají konvenční protilátky a proto nejsou schopné specificky prokázat méně než 50 ID HCG/1 a tudíž těhotenství tak nemůže být těmito protilátkami prokázané dříve než za 7 až 10 dnů po vynechání menzes.

Nevýhody variability konvenčních antisér a křížové reaktivity polyvalentních protilátek odstraňuje hydridomová technologie.

Pomocí rozsáhlého vyhledávacího testování je možné vyselektovat takové produkty hybridomů - monoklonální protilátky, které reagují jen s jedinou antigenní determinantou na beta podjednotce HCG, která je specifická pro molekulu HCG, a která chybí na molekulách ostatních hormonů. Taková monoklonální protilátka je využitelná pro specifickou detekci HCG. To umožňuje zcitlivění doposud používaných aglutinačních testů a zavedení nových forem diagnostických testů, jako jsou testy enzymoimunologické a radioimunologické.

Využití monoklonálních protilátek proti HCG umožňuje zcitlivění detekce HCG. Úspěšná příprava monoklonálních protilátek proti HCG byla již v zahraničí popsána a monoklonální protilátky jsou využívány pro citlivou diagnostiku gravidity. Jeden takový hybridom produkující protilátku proti HCG je uložen ve Sbírce hybridomů Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 6, Flemingovo nám. 2 pod označením IMG CZAS H-4D6.

Uvedený hybridom byl získán fúzí slezinných buněk z BALB/c myší opakovaně imunizovaných HCG s buňkami myelomové linie SP2/O způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, s., Scheidigger, D.: Production of monoclonal antibodies: Strategy and tactis. J. Immunol. Methods 35: 1, 1980) a klonováním získané populace hybridních buněk. Hybridom H-4D6 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných pro živočišné buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Buňky hybridomů H-4D6 jsou uchovávány v kapalném dusíku a po jejich rozmražení je možné zahájit produkti monoklonálních protilátek bez dalšího požadavku na antigen.

Základním kultivačním médiem pro buňky hybridomu H-4D6 je Eaglovo monimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí obohacené o neesenciální aminokyseliny. Toto médium (označované H-MEMd - Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pro kultivace hybridomů doplněno antibiotikami (penicilín, streptomycin) a 10% inaktivovaného telecího séra. Hybridom je kultivován při 37 °C a produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulin IgGl. Tato protilátka reaguje v enzymoimunologickému testu (ELISA) s částečně purifikovanou beta podjednotkou HCG, s celou molekulovou HCG, ale nereaguje s preparáty močových proteinů netěhotných žen (obsahujícími LH, FSH a další bílkoviny).

Příprava monoklonální protilátky.

2xl0⁶ hybridomových buněk je aplikováno do peritoneální dutiny myším kmene BALB/c, kterým byl 7 až 10 dnů před podáním hybridomových buněk infikován do peritoneální dutiny 1,0 ml parafinového oleje. Po 10 až 14 dnech růstu hybridomů se u myší vytváří v peritoneální dutině ascitická tekutina (4 až 6 ml/mys), která obsahuje 2 až 4 mg protilátky/ml (Imunoglobulin). Tato může být purifikována z ascitické tekutiny perecipitací síranem amonným.

Protilátka přítomná v ascitické tekutině reaguje v enzymoimunologickém testu (ELISA) s HCG při ředění do titru více než 1:10 000. V radioimunologických testech byla zjištěna Q její afinitní konstanta 2,7x10* 1/nmol a citlivost 25 IU HCG/1.

Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem H-4D6 aflutinuje krvinky s navázaným HCG, a tak může nahradit polyvalentní antiséra v doposud používaných aglutinačních testech sloužících k diagnostice gravidity a může se stát základním reagenciem pro zavedení nových enzymoimunologických a radioimunologických testů pro časnou diagnostiku gravidity.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS H-4D6 produkující monoklonální protilátku podtřídy IgGl proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu (HCG).