CS260066B1 - Myší lymfocytórní hybridom produkující monoklonální imunoglobulín proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu - Google Patents

Abstract

Jedná se o prostředek použitelný k časnému průkazu těhotenství a ke sledování úspěšnosti léčby některých nádorových onemocněni. Podstatou je monoklonální protilátka proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu /HCG/. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS H-3G4 je uložen ve Sbírce hybridomů Ostavu molekulární genetiky ČSAV v Praze.

Description

Vynález se týká myšího mynfooytárního hybridomu produkujícího monoklonální imunoglobulín proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu. Jedná se o hybridní buněčnou linii, která byla sestrojena fúzí buněk myelomové linie SP2/0 a myších slezinných buněk produkujících protilátky proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu /HCG/. Tento hormon je prokazatelný v krvi a v moči těhotných žen a zcela chybí u netěhotných.

Jeho výskyt v organismu začíná po implantaci oplozeného vajíčka /okolo 8. dne po ovulaci/ a koncentrace HCG pak prudce stoupá. Na průkazu přítomnosti HCG v organismu jsou založeny diagnostické testy na těhotenství.

Potřeba časné a spolehlivé diagnostiky těhotenství vyvstává nyní zvláště v souvislosti se zaváděním miniinterupcí, jejichž provedení je vázáno na první týdny po početí. S tím také vzrůstají požadavky na zvýšení citlivosti a spolehlivosti diagnostického testu.

Dosavadní diagnostické testy využívají imunologické reakce konvenčních antisér připravených imunizací králíků purifikovaným HCG. Sérum imunizovaných zvířat je zdrojem protilátek pro imunologické testy. Nevýhodou přípravy těchto konvenčních antisér -ge požadavek na vysoce purifikovaný hormon pro jejich přípravu a jednotlivé šarže antisér se liší svou aktivitou a obsahují značně heterogenní směs protilátek. Je známo, že HCG a další podobné hormony /LH,

FSH/ mají vysokou podobnost svého alfa řetězce a části beta řetězce, a proto polyvalentní konvenční protilákty proti HCG reagují i s těmito hormony. Z důvodů určité basálni koncentrace LH i u netěhotných žen aglutinačni testy využívající konvenčni protilátky nejsou schopné specificky prokázat méně než 50 IU HCG/1 a tudíž těhotenství tak nemůže být těmito protilátkami prokázané dříve než za 7 až 10 dní po vynechání menzes.

Pomoci rozsáhlého vyhledávacího testování je možné vyselektovat takové produkty hybridomů - monoklonální protilátky - které reagují jen s jedinou antigenní determinantou na beta podjednotce HCG, která je specifická pro molekulu HCG a která chybí na molekulách ostatních hormonů. Taková monoklonální protilátka je využitelná pro specifickou detekci HCG. To umožňuje zcitlivění doposud používaných aglutinačních testů a zavedení nových forem diagnostických testů, jako jsou testy enzymoimunologické a radioimunologické.

Využití monoklonálních protilátek proti HCG umožňuje zcitlivění detekce HCG. Úspěšná příprava monoklonálních protilátek proti HCG byla již v zahraničí popsána a monoklonální protilátky jsou využívány pro citlivou diagnostiku gravidity.

Podstatou vynálezu je myši lymfocytární hybridom produkující monoklonální imunoglobulín proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu uložený ve Sbírce hybridomů ÚMG ČSAV v Praze 6, Flemingovo nám. 2, pod označením IMG CZAS H-3G4.

Uvedený hybridom byl získán fúzí slezinných buněk z BALB/c myší opakovaně imunizovaných HCG s buňkami myelomové linie SP2/0 způsobem známým z odborné literatury /Fazekas de St.

Groth, S., Scheidigger, D. : J. Xmmunol. Methods 35: 1, 1980/ a klonováním získané populace hybridních buněk. Hybridom H-3G4 je možné kultivovat in vitro v médiích vhodných'pro živočišné buňky a je adaptován pro růst.in vivo v peritoneální dutině myší kmene BALB/c. Buňky hybridomu H-3G4 jsou uchovávány v kapalném dusíku a po jejich rozmražení je možné zahájit produkci monoklonálních protilátek bez dalšího požadavku na antigen.

Základním kultivačním médiem pro buňky hybridomu H-3G4 je Eaglovo minimální esenciální médium s Hanksovou solnou směsí obohacené o neesenciální aminokyseliny. Toto médium /označované H-MEMd - Ústav molekulární genetiky ČSAV/ je pro kultivace hybridomů doplněno antibiotiky /penicilín, streptomycin/ a 10»inaktivovaného telecího séra. Hybridom je kultivován při 37 °C a produkovaná protilátka je monoklonální imunoglobulín podtřídy IgGl. Tato protilátka reaguje v enzymoimunologickém testu /ELISA/ s částečně purifikovanou beta podjednotkou HCG, s celou molekulou HCG, ale nereaguje s preparáty močových proteinů netěhotných žen /obsahující hormony LH, FSH a další bílkoviny/.

Příprava monoklonální protilátky x 10⁶ hybridomových .buněk je aplikováno do peritoneální dutiny myším kmene BALB/c, kterým byl 7 až 10 dní před podáním hybridomových buněk injikován do peritoneální dutiny 1,0 ml přistanu /2,6,10,14-tetrametylpentadekan/ nebo parafinové oleje. Po 7 až 12 dnech růstu hybridomů se u myší vytváří v peritoneální dutině ascitická tekutina /4-6 ml/myš/, která obsahuje 1 až 3 mg protilátky, na ml. Imunoglobulin může být částečně purifikován z ascitické tekutiny precipitací síranem amonným.

Protilátka přítomná v ascitické tekutině reaguje v enzymoimunologickém testu /ELISA/ s HCG při ředění do titru více než 1:100 000. V radioimunologických testech /RIA/ vykazuje tato protilátka specififckou reaktivitu s HCG při jejím pracovním ředění do titru 1:340 000 a může prokázat méně než 50 mlU HCG/ml. Vykazuje rychlejší ustavení chemické rovnováhy reakce s antigenem než doposud používané polyvalentní protilátky. Monoklonální protilátka produkovaná hybridomem H-3G4 byla již ověřena na souborech pacientek s počátečními stádii gravidity a s nádorovými onemocněními urogenitálního traktu a byla prokázána její vhodnóst pro výrobu souprav RIA a ELISA testů ke klinickému průkazu HCG.

Claims (1)

1. Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS H-3G4, produkující monoklonální imunoglobulin proti lidskému choriogonadotropnímu hormonu.